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CN104004001B - 含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体及其制备方法 - Google Patents

含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体及其制备方法 Download PDF

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CN104004001B CN201410231697.3A CN201410231697A CN104004001B CN 104004001 B CN104004001 B CN 104004001B CN 201410231697 A CN201410231697 A CN 201410231697A CN 104004001 B CN104004001 B CN 104004001B
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Abstract

本发明公开了一种含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体及其制备方法。所述环碳酸酯单体能够简单高效的合成，无需保护和脱保护过程；利用本发明所述的环碳酸酯单体可开环聚合得到分子量和分子量分布可控的聚碳酸酯，其具有生物可降解性和还原敏感可逆交联的性质。可用于药物控制释放的载体、生物组织支架或者生物芯片。

Description

含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种环状碳酸酯单体，涉及一种含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备及应用。
背景技术
环状碳酸酯单体具有非常独特的性能，例如它们可以简单地合成得到高产量高纯度的产物，并且可以通过小分子或大分子引发得到生物可降解的聚碳酸酯，其聚合物具有非常优异的性能，例如它们通常具有良好的生物相容性，能在体内降解，降解产物可被人体吸收或通过人体正常生理途径排出体外，和脂肪族聚酯一样被广泛应用于生物医学的各个领域，如手术缝合线、骨固定器械、生物组织工程支架材料、和药物控制释放载体等。其中，合成的生物可降解聚合物由于其免疫原性较低、其性能含如降解性能和机械性能等均可方便得到控制等而尤其受到关注。常用的生物可降解聚合物是通过环状碳酸酯单体如三亚甲基环碳酸酯（TMC），或环酯单体如乙交酯（GA）、丙交酯（LA）、己内酯（CL）等开环聚合制备得到，已获得美国食品药物管理部门（FDA）的许可。
但是，现有的环碳酸酯或环酯单体如TMC、GA、LA和CL等结构比较单一，缺乏可用于修饰的官能团，故制备的聚合物往往难以后修饰、难以满足医学需求，例如，基于这些传统碳酸酯单体的聚合物的药物载体或是表面修饰涂层存在稳定性差的致命弱点。如何提高其体内稳定性是亟待解决的问题。
另外，现有技术中，在制备环状碳酸酯单体、和/或开环聚合过程过程中，其结构中存在易于反应的基团，多数情况都需要通过保护和脱保护步骤，这导致制备过程繁琐。
发明内容
本发明的目的是，提供一种含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体。
为达到上述目的，本发明具体的技术方案为：一种含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体，其化学结构式如下：
。
上述环碳酸酯单体的制备方法包括以下步骤：将二溴新戊二醇与一水合硫氢化钠在极性溶剂中反应得到化合物A；然后将化合物A在空气中氧化得到化合物B；最后在氮气气氛中，在环醚类溶剂中，将化合物B与氯甲酸乙酯反应得到所述的含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体。
上述技术方案中，所述二溴新戊二醇与一水合硫氢化钠的摩尔比为(2.5～10)∶1；化合物B与氯甲酸乙酯的摩尔比为1∶(2～4)。
优选的技术方案中，上述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备方法为：
(1)将一水合硫氢化钠溶解在极性溶液中，将二溴新戊二醇用恒压滴液漏斗缓慢滴加，50℃件下反应48小时，得到化合物A；
所述化合物A的化学结构式如下：
(2)化合物A在空气中氧化，得到化合物B，所述化合物B的化学结构式如下：
(3)氮气气氛中，将化合物B与氯甲酸乙酯溶解在环醚类溶剂中，然后用恒压滴液漏斗缓慢滴加三乙胺，在冰水浴中反应4小时，得到含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体，所述环状碳酸酯单体的化学结构式如下：
。
优选的技术方案中，所述极性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；所述醚类溶剂为四氢呋喃。
优选的技术方案中，化合物A先溶于醚类溶剂，再在空气中氧化得到化合物B；增加了化合物A的氧化速率。醚类溶剂可以为四氢呋喃、1，4-二氧六环。为了简化反应过程、纯化反应条件，步骤（2）用于溶解化合物A的溶剂与步骤（3）用于溶解化合物B的溶剂一致。
优选的技术方案中，上述步骤（1）、步骤（3）完成后进行提纯处理，具体为：
ⅰ、化合物A的提纯：反应结束后，反应物减压蒸馏除去溶剂，然后用蒸馏水稀释，再用乙酸乙酯萃取，最后旋蒸有机相得到黄色粘稠状化合物A；
ⅱ、含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的提纯：反应结束后，过滤，滤液经旋转浓缩，再用乙醚重结晶，得到黄色晶体，即含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体。
上述减压蒸馏、萃取、旋蒸、旋转浓缩以及重结晶都属于现有技术，本领域技术人员可以根据需要自行选择。本发明优选在化合物A提纯时，用乙酸乙酯萃取四次；在环状碳酸酯提纯时，用乙醚重结晶3-5次。
上述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备过程可如下表示：
上述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体可开环聚合得到侧链含双硫五元环的聚碳酸酯，由于该双硫五元环基团不影响开环聚合，无需保护和脱保护过程。例如，上述环碳酸酯单体在二氯甲烷中可以以聚乙二醇为引发剂、双（双三甲基硅基）胺锌为催化剂开环聚合，形成嵌段聚合物，其结构式如下：
上述环碳酸酯单体还可以和其他环酯、环碳酸酯单体进行开环共聚反应，制备无规和嵌段共聚物；所述其他环碳酸酯包括三亚甲基环碳酸酯(TMC)，所述其他环酯单体包括己内酯(ε-CL)、丙交酯(LA)或乙交酯(GA)。
该侧链含双硫五元环的功能性聚碳酸酯可以在催化量的还原剂如二硫代苏糖醇或谷胱甘肽催化下形成稳定的化学交联，但在细胞内还原环境下会快速解交联。因此该侧链含双硫五元环的功能性聚碳酸酯具有优良的实用价值，例如可以用于制备循环稳定的药物载体，在靶细胞内可以快速释放药物。
由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.本发明首次公开了一种含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体，只需三步即可便捷高效制备，无需现有技术中的保护和脱保护过程。
2.本发明公开的含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体，由于双硫五元环基团不影响环碳酸酯单体的开环聚合，因此无需现有技术中的保护和脱保护过程，即可开环聚合得到侧链含双硫五元环的功能性聚碳酸酯；
3.本发明公开的环碳酸酯单体制备简单，由其可以方便的开环聚合得到具有还原敏感可逆交联特性的碳酸酯聚合物；该聚合物可进一步进行自组装用于控制药物释放体系、组织工程和生物芯片，在生物材料方面，具有良好的应用价值。
附图说明
图1为实施例一中含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的核磁谱图；
图2为实施例一中含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的质谱图；
图3为实施例一中含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的紫外吸收图谱；
图4为实施例三中嵌段聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k的核磁谱图；
图5为实施例四中嵌段聚合物PEG5k-P(CDC2.5k-co-CL3.9k)的核磁谱图；
图6是实施例六中聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k交联纳米粒子对Raw264.7（小鼠巨噬细胞）和MCF-7细胞（人乳腺癌细胞）的毒性结果图；
图7为实施例七中载有阿霉素的聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k交联纳米粒子的体外释放结果图；
图8是实施例七中载药的聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k交联纳米粒子对Raw264.7细胞的毒性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：
实施例一含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体（CDC）的合成：
1、一水合硫氢化钠（28.25g，381.7mmol）溶在400mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，50℃加热至完全溶解，逐滴加入二溴新戊二醇（20g，76.4mmol），反应48小时。反应物减压蒸馏除去溶剂DMF，然后用200mL蒸馏水稀释，用250mL乙酸乙酯萃取四次，最后有机相旋蒸得到黄色粘稠状化合物A，产率：70%；
2、溶解在400mL的四氢呋喃（THF）中的化合物A在空气中放置24小时，分子间巯基氧化成硫硫键，得到化合物B，产率；>98%；
3、在氮气保护下，化合物B（11.7g，70.5mmol）溶于干燥过的THF（150mL）中，搅拌至完全溶解。接着冷却到0℃，加入氯甲酸乙酯（15.65mL，119.8mmol），然后逐滴加入Et3N（22.83mL，120.0mmol）。待滴加完毕后，该体系在冰水浴条件下继续反应4h。反应结束后，过滤掉产生的Et3N·HCl，滤液经旋转浓缩，最后用乙醚进行多次重结晶，得到黄色晶体，即含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体（CDC），产率：64%。
附图1为上述产物CDC的核磁图谱，1HNMR(400MHz,CDCl3):δ3.14(s,4H),4.51(s,4H)。元素分析为：C:41.8%,H:4.20%,O:24.3%（理论：C:41.67%,H:4.17%,O:25%，S：33.3%），CDC单体的质谱分析：MS:192.5（理论分子量：192），见图2。附图3为不同浓度上述产物单体CDC四氢呋喃溶液的紫外图谱，单体中硫硫五元环在330nm处有吸收，且吸收强度随着单体浓度的增大而增强。
实施例二含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体（CDC）的合成：
1、一水合硫氢化钠（28.25g，381.7mmol）溶在400mL二甲亚砜（DMSO）中，40℃加热至完全溶解，逐滴加入二溴新戊二醇（20g，76.4mmol），反应48小时。反应物减压蒸馏除去溶剂DMSO，然后用200mL蒸馏水稀释，用250mL乙酸乙酯萃取四次，最后有机相旋蒸得到黄色粘稠状化合物A，产率：42%；
2、溶解在400mL的1，4-二氧六环中的化合物A在空气中放置，分子间巯基氧化成硫硫键，得到化合物B，产率；>98%；
3、在氮气保护下，化合物B（11.7g，70.5mmol）溶于干燥过的1，4-二氧六环（150mL）中，搅拌至完全溶解。接着冷却到0℃，加入氯甲酸乙酯（15.65mL，119.8mmol），然后逐滴加入Et3N（22.83mL，120.0mmol）。待滴加完毕后，该体系在冰水浴条件下继续反应4h。反应结束后，过滤掉产生的Et3N·HCl，滤液经旋转浓缩，最后用乙醚进行多次重结晶，得到黄色晶体，即含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体（CDC），产率：32%。
实施例三两嵌段聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k的合成
式中，m=114，n=14.6。
在氮气环境下，将0.3g（1.56mmol）含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体（CDC）、2mL二氯甲烷加入密封反应器里，然后加入分子量为5000的聚乙二醇0.5g（0.1mmol）和1mL的催化剂双（双三甲基硅基）胺锌的二氯甲烷溶液（0.1mol/L），接着把反应器密封好，转移出手套箱，放入40℃油浴中反应1天后，用冰乙酸终止反应，在冰乙醚中沉淀，最终经过过滤、真空干燥得到产物环碳酸酯聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k。
附图4为上述环碳酸酯聚合物的核磁图谱：1HNMR(400MHz,CDCl3):3.08(s,-CCH2),3.30(m，-OCH3)，4.05(s,-CH2OCOCHCH2-),4.07(s,-OCH2CCH2O-),4.31(m,-CCH2)。
实施例四两嵌段聚合物PEG5k-P(CDC2.5k-co-CL3.9k)的合成
式中，m=114，x=21.9，y=13.0，n=34.9。
在氮气环境下，0.28g（1.46mmol）CDC单体和0.4g（3.51mmol）的己内酯（ε-CL）溶在3mL二氯甲烷中，加入密封反应器里，然后加入分子量5000的聚乙二醇0.5g（0.1mmol）和1m的催化剂双（双三甲基硅基）胺锌的二氯甲烷溶液（0.1mol/L），接着把反应器密封好，转移出手套箱，放入40℃油浴中反应1天后，用冰乙酸终止反应，在冰乙醚中沉淀，最终经过过滤、真空干燥得到产物环碳酸酯聚合物PEG5k-P(CDC2.5k-co-CL3.9k)。
附图5为上述环碳酸酯聚合物的核磁图谱：1HNMR(400MHz,CDCl3):1.40(m,-COCH2CH2CH2CH2CH2-),1.65(m,-COCH2CH2CH2CH2CH2-),2.30(t,-COCH2CH2CH2CH2CH2-),3.08(s,-CCH2),3.30(m，-OCH3)，4.03(t,-COCH2CH2CH2CH2CH2O-),4.05(s,-CH2OCOCHCH2-),4.07(s,-OCH2CCH2O-),4.31(m,-CCH2);GPC测的分子量：14.0kDa，分子量分布：1.56。
实施例五聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k纳米粒子的制备
采用透析法制备聚合物纳米粒。聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k溶解在N，N-二甲基甲酰胺（2mg/mL）中，取200μL滴加到800μL磷酸盐缓冲溶液（10mM，pH7.4，PB）中，装入透析袋（MWCO3500）中透析过夜，换五次水，透析介质为PB（10mM，pH7.4）。最终得到的聚合物纳米粒的浓度为0.2mg/mL。
实施例六聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k纳米粒子的交联、解交联、细胞毒性
纳米粒的交联按加催化量的二硫代苏糖醇（DTT）进行。将聚合物纳米粒水溶液通氮气10分钟，尽量将空气赶净。然后向密闭反应器中的纳米粒溶液（1mL，0.25mg/mL，3.21×10-5mmol）中加入10μL溶解在二次水中的二硫代苏糖醇（DTT）（0.007mg，4.67×10-5mmol，硫辛酸官能团摩尔数10%），密闭室温搅拌反应1天。测定粒子的尺寸为150纳米，和没有交联的粒径相比较少约15%。交联后的纳米粒子在浓度稀释100倍以后其粒径和粒径分布几乎没有变化；在生理条件下稳定，由此可以看出，双硫交联可以很大程度上提高纳米粒的稳定性。
二硫键可以很容易在还原剂如谷胱甘肽（GSH）作用下断裂。在氮气保护和37℃条件下，将交联纳米粒溶液通氮气10分钟后，加入GSH使其在聚合物纳米粒子溶液中的最终浓度为10mM。交联纳米粒子粒径随着时间的推移逐步被破坏，说明聚合物中双硫环在大量还原物质存在下会断裂。在细胞质中也存在高浓度的还原物质GSH，因此制备的纳米药物载体循环稳定，但被细胞内吞后能快速解离，释放药物。
采用MTT法对交联纳米粒子的细胞毒性进行测试。使用到的细胞为MCF-7（人乳腺癌细胞）细胞和Raw264.7（小鼠巨噬细胞）细胞。以1×104个/mL将HeLa细胞或Raw264.7细胞接种于96孔板，每孔100μL，培养至细胞贴壁后，实验组加入含有不同浓度的聚合物纳米粒的培养液，另设细胞空白对照孔和培养基空白孔，平行4个复孔。培养箱中培养24小时后取出96孔板，加入MTT（5.0mg/mL）10μL，继续培养4小时后每孔加入150μLDMSO溶解生成的结晶子，用酶标仪于492nm处测其吸光度值（A），以培养基空白孔调零，计算细胞存活率。
式中AT为试验组490nm处的吸光度，AC为空白对照组492nm处的吸光度。聚合物浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/mL。附图6为纳米粒的细胞毒性结果，从图6中可以看出，当聚合物纳米粒的浓度从0.1mg/mL增大到0.5mg/mL时，Raw264.7细胞和MCF-7细胞的存活率仍高于85%，说明PEG5k-b-PCDC2.8k聚合物纳米粒具有良好的生物相容性。
实施例七PEG5k-b-PCDC2.8k交联纳米粒的载药、体外释放及细胞毒性
以阿霉素作为药物。由于抗癌药物阿霉素是荧光敏感物质，整个操作在避光条件下进行。首先除去阿霉素的盐酸盐，其操作为：1.2mg(0.002mmol)阿霉素溶解在225μL的DMSO中，加三乙胺0.58mL(m=0.419mg,0.004mmol)搅拌12小时，吸走上层清液。阿霉素的DMSO溶液浓度为5.0mg/mL。将纳米聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k纳米粒溶解在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中。将阿霉素的二甲亚砜溶液与聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k纳米粒子的DMF溶液按预定的药物与聚合物质量比混合均匀，搅拌下缓慢向其中加入4倍于其体积的二次水（15s/d），滴完后对一次水透析。
载药纳米粒子的交联也按实施例五的交联方法进行。将100μL交联载阿霉素的聚合物纳米粒子溶液冷冻干燥，然后溶解于3.0mLDMSO中，利用荧光分光光谱仪测试，结合阿霉素的标准曲线计算包封率。
载药量（DLC）和包封率（DLE）根据以下公式计算：
载药量（wt.%）=（药物重量/聚合物重量）×100%
包封率（%）=（装载药物重量/药物总投入量）×100%
表1为上述计算结果，可以看出，聚合物PEG5k-b-PCDC2.8k纳米粒子对小分子抗癌药物阿霉素具有高效的包埋作用。
表1交联载阿霉素的聚合物纳米粒子中载药量、包封率的结果
阿霉素的释放实验是在37℃恒温摇床中震荡（200rpm）进行。药物释放是用二组平行样进行对比的，每组各有二个平行样：第一组，交联载阿霉素的聚合物纳米粒子在加入10mM谷胱甘肽（GSH）模拟细胞内还原环境PB(10mM,pH7.4)中的释放；第二组，交联载阿霉素的聚合物纳米粒子在PB(10mM,pH7.4)中的释放；载药聚合物纳米粒子浓度为25mg/L，取0.5mL放入释放用透析袋（MWCO:12,000-14,000）中，每个试管中加入相应的透析溶剂25mL，在预定的时间间隔，取出5.0mL透析袋外部介质用作测试，同时向试管中补加5.0mL相应介质。使用EDINBURGHFLS920荧光仪测定溶液中药物浓度。附图7为阿霉素累积释放量与时间的关系。从图中可以看出，加入模拟肿瘤细胞的还原性物质谷胱甘肽（GSH）后，其释放明显要快于没有加GSH组分，说明载药的交联纳米粒子具有10mM还原物质GSH的存在下，能有效的释放药物。
载DOX的PEG5k-b-PCDC2.8k交联纳米粒子用MTT法测试其对Raw264.7细胞、MCF-7细胞等的毒性，载药未交联纳米粒及游离药物作为对照。以Raw264.7细胞为例，将Raw264.7细胞以1×104个/mL接种于96孔板，每孔100μL，培养至细胞贴壁后，实验组分别加入含有0.01、0.1、1、5、10、50和100μg/mL的载阿霉素交联纳米粒子溶液，载阿霉素未交联纳米粒子溶液及游离阿霉素的新鲜培养液，另设细胞空白对照孔和培养基空白孔，每孔设4个复孔。培养箱中培养48小时后取出96孔板，加入MTT（5.0mg/mL）10μL，继续培养4h后每孔加入150μLDMSO溶解生成的结晶子，用酶标仪于492nm处测其吸光度值（A），以培养基空白孔调零，计算细胞存活率。见附图8，从结果可以看出，载阿霉素的交联纳米粒子对Raw264.7细胞的半致死浓度为4.89μg/mL，所以载DOX的PEG5k-b-PCDC2.8k交联纳米粒子能有效的在细胞内释放药物并杀死癌细胞。

Claims (8)

1.一种含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体，其特征在于：所述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的化学结构式如下：
。
2.一种权利要求1所述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将二溴新戊二醇与一水合硫氢化钠在极性溶剂中反应得到化合物A；然后将化合物A在空气中氧化得到化合物B；最后在氮气气氛中，在环醚类溶剂中，将化合物B与氯甲酸乙酯反应得到所述的含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体。
3.根据权利要求2所述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备方法，其特征在于：所述二溴新戊二醇与一水合硫氢化钠的摩尔比为(2.5～10)∶1；化合物B与氯甲酸乙酯的摩尔比为1∶(2～4)。
4.根据权利要求2所述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备方法，其特征在于：制备化合物A时的反应温度为50℃，反应时间为48小时；制备化合物B时化合物A的氧化时间为24小时；制备环碳酸酯单体时的反应条件为冰水浴，反应时间为4小时。
5.根据权利要求2所述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备方法，其特征在于：所述极性溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；环醚类溶剂为四氢呋喃或者1，4-二氧六环。
6.根据权利要求2所述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备方法，其特征在于：化合物A先溶于醚类溶剂，再在空气中氧化得到化合物B。
7.根据权利要求6所述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备方法，其特征在于：所述醚类溶剂为四氢呋喃或者1，4-二氧六环。
8.根据权利要求2所述含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的制备方法，其特征在于，还包括提纯处理，具体为：
ⅰ、化合物A的提纯：反应结束后，反应物减压蒸馏除去溶剂，然后用蒸馏水稀释，再用乙酸乙酯萃取，最后旋蒸有机相得到黄色粘稠状化合物A；
ⅱ、含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体的提纯：反应结束后，过滤，滤液经旋转浓缩，再用乙醚重结晶，得到黄色晶体，即含双硫五元环功能基团的环状碳酸酯单体。
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