CN103981101B - 一种dse菌株及其在甘蔗生产上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DSE菌株及其在甘蔗生产上的应用，所述菌株为德弗霉菌属<i>Devriesia</i>？sp.菌株24L-4，保藏登记号为CGMCC？No.9098。利用该菌接种甘蔗组培苗30d后植株生物量比空白对照增加了57.44％，接种盆栽甘蔗苗120d后植株生物量比空白对照增加了24.69%，株高增加了14.44%，茎径增加了3.53%，鲜重增加了26.26%。本发明的有益效果是：该菌株可应用于具有促生微生物菌剂的生产和生物有机肥的开发，对保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及能促进作物生长的一种DSE菌株24L-4及其在甘蔗生产上的应用。
背景技术
近年来由于大量施用化肥对粮食安全、生态环境和资源利用产生的危害已经引起全世界的广泛重视。减少化肥施用和提高化肥的利用率是当前农业生产中需解决的重要问题。目前，利用自然界中植物共生微生物促进农作物生长,正在成为农业环境保护、可持续性发展的一个重要方向。
一直以来我国甘蔗成本高，缺乏国际竞争力。在甘蔗种植的农资投入中，化肥所占的比重最大，对甘蔗产量的影响也最为显著。此外，我国甘蔗主产区蔗地90％以上为旱坡地，土壤保水保肥能力差，化肥利用率低。因此，充分发挥自然生态系统中的共生微生物的促生潜力，提高我国甘蔗的生产能力，保护和改善蔗地的生态环境，对促进我国甘蔗产业的可持续性发展具有重要意义。目前，已有学者开展了关于固氮菌、丛枝菌根能促进甘蔗生长的报道。
深色有隔内生真菌(Darkseptateendophyte，DSE)是植物共生真菌的典型代表之一，刘茂军等(深色有隔内生真菌(DSE)研究进展[J].菌物学报，2009,28(6):888-894)及JumpponenAandTrappe(Dark-septaterootendophytes:areviewwithspecialreferencetofacultativebiotrophicsymbiosis[J].NewPhytol，1998.140:295-310)研究表示，它们能够定居在植物根部但对宿主无致病性，菌丝深色有分隔，能够在根部形成“微菌核”等结构特征。MandyamandJumpponenA(2005.Seekingtheelusivefunctionoftheroot-colonisingdarkseptateendophyticfungi[J].StudiesinMycology，53:173-189.)、张玉洁(2010.植物深色有隔内生真菌(DSE)的研究进展[J].文山学院学报，23(1):145-150.)、刘茂军等研究表明DSE与宿主互惠共生，赋予植物优良生长性状，能提高宿主抗病虫能力及在胁迫环境中的抗逆性，还能促进玉米(张杰，2010.云南两个重金属矿区(暮乃、个旧)深色有隔内生真菌(DSE)的研究[D])等作物生长。因此，通过筛选获得能促进甘蔗生长的DSE菌株，建立“甘蔗-DSE”高效共生体系，可用于微生物菌肥的开发，对于甘蔗种植是具有广阔前景的。
发明内容
本发明提供一种DSE菌株及其在甘蔗生产上的应用。
本发明所述的DSE菌株为Devriesiasp.，该菌株已于2014年4月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为：CGMCCNo.9098。
该菌株从茶花叶部组织分离获得，通过观察其在宿主植物的定殖特征确定其为DSE菌株，菌株命名为24L-4。经菌株形态学和18SrDNA序列分析，该菌株鉴定为德弗霉菌属Devriesiasp.真菌。
其中，所述DSE菌株24L-4的分离方法包括以下步骤：
步骤A：取茶花叶片，清洗和表面消毒后吸干表面水分后置于玉米粉培养基培养至菌落长出；
步骤B：将叶片组织置于平板上，于生化培养箱中培养，直至叶片组织周围长出菌丝体，挑取菌丝尖端置于CMMY培养基，得到纯化菌株。
优选的，所述步骤A中玉米粉培养基包括：玉米粉6-10g/L，琼脂粉7-8g/L。
优选的，所述步骤B中CMMY培养基包括：麦芽提取物8-12g/L,酵母浸膏1.5-3g/L,玉米粉琼脂7-9g/L，琼脂7-9g/L。
所述DSE菌株在甘蔗组培苗生长上的应用，包括以下步骤：
步骤A′：将供试菌株活化后接种于燕麦培养基中，待菌落长大后备用；
步骤B′：选择长势一致的无菌甘蔗组培苗移栽至培养皿平板的菌落上，置于培养瓶中培养，将根部培养基洗净后干燥后称量干重。
优选的，所述步骤A′中，燕麦培养基包括：燕麦粉8-12g/L，琼脂15-18g/L，MgSO4·7H2O1-2g/L，KH2PO41-2g/L，NaNO31-2g/L。
优选的，所述步骤B′中，培养的条件为：温度为23-28℃，光照强度为180μmolm-2s-2，光照时间为12-16h，培养时间为30-45d。
所述DSE菌株在甘蔗盆栽苗生长上的应用，包括以下步骤：
步骤A″：甘蔗组培苗炼苗后，选取长势一致的甘蔗苗，修剪叶片待种；
步骤B″：将甘蔗苗移栽至花盆中，培养基质为蔗地土；
步骤C″：在马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中接入菌丝块，振荡培养后将培养物打碎制备成菌液用于甘蔗苗的灌根。
优选的，所述步骤C″中马铃薯葡萄糖液体培养基包括马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。
优选的，所述步骤C″中培养条件为：温度为23-28℃，于转速为100-200rpm的摇床中振荡培养，培养时间为10-15d。
本发明的有益效果是：该菌株可应用于生产具有促生微生物菌剂和生物有机肥的开发，对保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明中菌株24L-4的菌落形态。
图2是本发明中菌株24L-4在甘蔗根部定殖的深色有隔菌丝。
图3是本发明中盆栽甘蔗接种菌株24L-4接种120天后长势对照。
图4是本发明中盆栽甘蔗接种菌株24L-4接种120天后根部组织长势对照。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
本发明菌株的分离。
取茶花叶片，用自来水冲洗表面的灰层及附着物，凉干表面水份，将叶片剪成边长约为0.5-1.0cm的正方片，在超净工作台上先用70％酒精浸10-20s，再用1％次氯酸钠浸1-2min，无菌水洗3-5次，用灭菌滤纸吸干表面水分后置于玉米粉培养基(玉米粉6-10g，琼脂粉7-8g)上，于22-28℃生化培养箱中培养，直至叶片组织周围长出菌丝体，挑取菌丝置于CMMY培养基(麦芽提取物8-12g/L,酵母浸膏1.5-3g/L,玉米粉琼脂7-9g/L，琼脂7-9g/L)上，获得纯化菌株。
实施例2
本发明菌株的形态学特征。
将菌株接种于CMMY培养基上，23℃培养3周后观察菌株形态学特征，结果见图1。
实施例3
本发明菌株的18SrDNA序列分析。
菌株培养用马铃薯葡萄糖液体培养基PDB，在28℃、120r/min的摇床上振荡培养10d后，过滤收集菌丝。菌丝体总DNA采用Saghaietal.的CTAB法提取。18SrDNA区域PCR扩增分别采用Whiteetal.的通用引物NS1/NS4进行扩增。PCR反应体系为：TIANgel一管便捷式MasterMix(成分：10mMTris-HClpH8.3、50mMKCl、1.5mMMgCl2、250uMdNTPeach、0.05UPolymerase/μL、ddH2O)9μL,20umol/L正反引物各1μL,模板DNA1μL,用超纯水定容至25μL。PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性1min,53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成，测序结果在GenBank登录和比对分析。
菌株24L-4的18SrDNA部分区域的核苷酸序列：
CAGTTCTCGCCGTGAGGCGGACCGGCCAACCCGGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTACCAGACCCTAACGAGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAGTCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGACACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGATGCATCGCCGGCTCGAGGCCCTGCCATTCCTTCAATTATTATGATTCAATCAGGATCCCCGAGAGGACGCTGGTTTTTCTCTTTATATATACACTGCTTCCCAACCTCGGAAGTCTTTAGTATGTATTAGCTACTAGATCTACCACTACTGTCGATGTACTGAATATCTATCACATCAACCAAACCAGATCTGATTAACCGTTCCATTCTTCAGCTGTCAAAGTTGCTATTACTTAAACCTTGCATGGCGCATGCTTAAACAG。
结合菌株24L-4的形态学特征及18SrDNA序列分析结构，将本发明菌株鉴定为德弗霉菌属(Deriviesiasp.)真菌。
实施例4
发明菌株对甘蔗组培苗的接种效应。
将供试菌株活化后接种于燕麦培养基(燕麦粉8-12g/L，琼脂15-18g/L，MgSO4·7H2O1-2g/L，KH2PO41-2g/L，NaNO31-2g/L)上，每培养皿接种3个菌块，培养7-10d待菌落长大后备用。选择长势一致的无菌甘蔗组培苗移栽至菌落上，在每培养皿平板的每个菌落上分别移栽1株组培苗，置于组培瓶中，于25℃光照强度为180μmolm- 2s-2，光照时间为16h每天的培养箱中共培养30d后，将根部培养基洗净后在50℃烘箱中烘烤3d以上称量干重。以未接种菌株的处理为对照，结果见表1。
表1
| 处理 | 干重(mg) |
| 24L-4 | 72.1 |
| 24L-4 | 69.0 |
| 24L-4 | 81.3 |
| 对照 | 43.0 |
实施例5
发明菌株对甘蔗盆栽苗的接种效应。
甘蔗组培苗在沙地中炼苗长至5-7叶后，选取长势一致的甘蔗苗，修剪叶片待种。将甘蔗苗移栽至宽20cm高19cm的塑料花盆中，每盆种植3株甘蔗苗，培养基质为体积比为1:3的食用菌废菌渣和蔗地土，浇定根水后用塑料膜覆盖保湿7天，移栽10d成活后浇菌液。
在马铃薯葡萄糖液体培养基中接入菌丝块，于25℃转速为100rpm摇床中振荡培养14d后，用灭菌纱布过滤收集菌丝团，用灭菌水冲洗数次后，将菌丝团打碎配制成浓度为5×105cfu/mL的菌液。每株甘蔗苗灌根50mL菌液，每隔15d灌根一次，总共灌根3次，灌根结束后4个月调查株高、干重等生长。以未浇菌液的处理为对照，结果见图2至图4和表2。表2
| 处理 | 株高(cm) | 茎径(cm) | 芽数 | 鲜重 | 干重(g) |
| 24L-4 | 199.3 | 13.0 | 10 | 359.0 | 109.4 |
| 24L-4 | 205.0 | 13.9 | 9 | 420.0 | 131.9 |
| 24L-4 | 213.1 | 15.5 | 9 | 390.0 | 109.0 |
| CK | 161.9 | 12.1 | 5 | 284.3 | 87.7 |
因此可以得出，该菌株能显著促进植物的生长。利用该菌接种甘蔗组培苗30d后植株生物量比空白对照增加了57.44％，接种盆栽甘蔗苗120d后植株生物量比空白对照增加了24.69％，株高增加了14.44％，茎径增加了3.53％，鲜重增加了26.26％。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>广西壮族自治区农业科学院微生物研究所
<120>一种DSE菌株及其在甘蔗生产上的应用
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>648
<212>DNA
<213>Devriesiasp.
<400>1
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tgtcaaagttgctattacttaaaccttgcatggcgcatgcttaaacag648
Claims (8)
1.DSE菌株24L-4在促进甘蔗组培苗生长上的应用，所述DSE菌株24L-4的分类名为德弗霉菌（Devriesiasp.），保藏编号为：CGMCCNo.9098。
2.DSE菌株24L-4在促进甘蔗盆栽苗生长上的应用，所述DSE菌株24L-4的保藏编号为：CGMCCNo.9098。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A′:将供试菌株活化后接种于燕麦培养基中，待菌落长大后备用；
步骤B′:选择长势一致的无菌甘蔗组培苗移栽至培养皿平板的菌落上，置于培养瓶
中培养，将根部培养基洗净后干燥后称量干重。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤A′中，燕麦培养基包括：燕麦粉8-12g/L，琼脂15-18g/L，MgSO4·7H2O1-2g/L，KH2PO41-2g/L，NaNO31-2g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤B′中培养条件为：温度为
23-28℃，光照强度为180μmolm-2s-2，光照时间为12-16h/d，培养时间为30-45d。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A″：甘蔗组培苗炼苗后，选取长势一致的甘蔗苗，修剪叶片待种；
步骤B″：将甘蔗苗移栽至花盆中，培养基质为蔗地土；
步骤C″：在马铃薯葡萄糖液体培养基PDB中接入菌丝块，振荡培养后将培养物打碎制备成菌液用于甘蔗苗的灌根。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤C″中马铃薯葡萄糖液体培养基包括马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤C″中培养条件为：温度为23-28℃，于转速为100-200rpm的摇床中振荡培养，培养时间为10-15d。
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