CN103969445B - 亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备及其用于检测人IgG的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备及其用于检测人IgG的方法。本发明将亚铁血红素在氨水作用下溶于磷酸盐缓冲溶液，再依次加入MnAc2溶液和NaOH溶液反应，制得亚铁血红素—二氧化锰复合物(Hemin-MnO2)；Hemin-MnO2具有过氧化物酶活性，能催化双氧水氧化TMB使其由无色变为蓝色，通过传统的“三明治”夹心结构法，以Hemin-MnO2作为兔抗人IgG标记物，来进行人体免疫球蛋白IgG抗原的检测，使用Hemin-MnO2的比色免疫法检测具有稳定性好、灵敏度高、选择性好、重现性优、分析速度快等优点；该免疫传感方法简单，价格低廉，肉眼即可观察其颜色变化，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备及其用于检测人IgG的方法，属于生物传感领域。
背景技术
近年来，新型生物传感技术的构建及应用发展迅速，在临床早期诊断、环境监测、食品检测等领域得到了广泛应用。而很多传感方法及其应用受仪器及相关技术专业人员的限制而无法在许多发展中国家普及，所以构建一种简单、经济且无需借助精密仪器设备的传感方法成为科研热门研究领域。基于颜色变化来实现检测的生物免疫传感方法，因其反应迅速、方便经济、操作简单等特点而受到众多科研工作者亲睐。
现有的定量检测人IgG的方法包括电化学检测法，荧光检测法、化学发光法等。但这些方法依赖于一定的仪器设备，而且不能同一时间检测多种样品，所耗时间较长。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种结构稳定、具有过氧化物酶活性的亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备方法，该制备方法简单、成本低。
本发明的另一个目的是在于提供了一种基于亚铁血红素—二氧化锰复合物的检测人IgG的方法，该方法利用亚铁血红素—二氧化锰复合物催化双氧水氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)产生颜色变化，实现了人IgG检测，该方法相对传统的酶联免疫法相比，不需要使用酶作为抗体标记物，具有稳定性好、简单、灵敏度高、选择性好、价格低廉等优点，实现了人体内免疫球蛋白IgG的高通量检测。
本发明提供了一种亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备方法，该制备方法是将亚铁血红素与磷酸盐缓冲溶液混合后，加入氨水促使亚铁血红素溶解，再在混合溶液中依次加入过量的MnAc2溶液和过量的NaOH溶液，搅拌均匀，再离心处理后，除去未反应完的MnAc2和NaOH，即得。
本发明的亚铁血红素—二氧化锰复合物的制备方法包括以下优选方案：
所述的离心处理是在8000～10000rpm的速率下离心15～25min。
所述的磷酸盐缓冲溶液pH为7.4。
所制得的亚铁血红素—二氧化锰复合物PBS缓冲溶液清洗2～3遍，于不大于4℃的环境下储存备用。
本发明还提供了一种基于亚铁血红素—二氧化锰复合物的检测人IgG的方法，该方法是在聚苯乙烯96孔板的各个孔的底表面先固定羊抗人IgG，并用牛血清白蛋白将所述各个孔的底表面封闭；再在所述牛血清白蛋白封闭过的各个孔的底表面分别组装不同摩尔量的人IgG后，进一步组装亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG；组装完成后，在各个孔中加入等量的含H2O2和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的柠檬酸缓冲液进行反应，反应完成后，用酶标仪测定各个孔中3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的氧化产物在652nm的吸光度值，进行比色分析。
本发明的基于亚铁血红素—二氧化锰复合物的检测人IgG的方法还包括以下优选方案：
优选的方法是先在聚苯乙烯96孔板的各个孔中加入羊抗人IgG静置8～12h，除去多余的羊抗人IgG，再在所述的各个孔中加入牛血清白蛋白静置2～3h，除去多余的牛血清白蛋白；再在各个孔中分别加入等体积不同浓度的人IgG溶液，在37℃下温育0.8～1.2h，除去各孔中的剩余人IgG溶液，再在各个孔中加入亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG，在37℃下温育1.2～1.7h，除去各孔中的剩余亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG；最后在各个孔中加入等量的含H2O2和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的柠檬酸缓冲液进行反应10～20min后，用酶标仪测定各个孔中3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的氧化产物在652nm的吸光度值，进行比色分析。
所述的亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG通过以下方法制备得到，将所述的亚铁血红素—二氧化锰复合物依次置于壳聚糖溶液、戊二醛溶液和 兔抗人IgG中反应、离心处理，即得。
所述的亚铁血红素—二氧化锰复合物依次置于0.3～0.8wt％的壳聚糖溶液中反应1.8～2.2h，离心3～7min，于0.2～0.3wt％的戊二醛溶液中反应0.4～0.6h，离心3～7min，于40～60μg mL-1的兔抗人IgG中0.8～1.2h，离心处理后，将离心物分散到磷酸盐缓冲溶液中，得到亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG溶液。所述的磷酸盐缓冲溶液pH值优选为pH＝7.4。所述的亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG溶液浓度为1mg mL-1。
本发明的有益效果：本发明首次通过简单的方法合成了亚铁血红素—二氧化锰复合物(Hemin-MnO2)，发现其具有过氧化物酶活性，能催化双氧水氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)使其由无色变为蓝色；本发明申请进一步将亚铁血红素—二氧化锰复合物作为抗体标记物应用于人IgG的检测，具有较高灵敏度，用肉眼即可辨别其颜色变化。本发明采用传统的“三明治”夹心结构法，在聚苯乙烯96孔微量滴定板上固定羊抗人IgG，用所合成的Hemin-MnO2复合物作为兔抗人IgG标记物，来进行人体免疫球蛋白IgG抗原的检测，发现随着抗原浓度增大，最终氧化的产物颜色也出现有规律的变化(无色—浅蓝—深蓝)，可以借助酶标仪测定的吸光度值实现人IgG的定量分析。使用Hemin-MnO2复合物的比色免疫法检测相对现有技术中传统的酶联免疫法，不需要使用酶作为抗体标记物，具有稳定性好、灵敏度高、选择性好、重现性优、分析速度快等优点。该免疫传感方法简单，价格低廉，肉眼即可观察其颜色变化，在生物技术、生物测定和生物医学方面具有潜在的应用前景。
附图说明
【图1】为本发明实施例1制备的Hemin-MnO2复合物的透射电子显微镜图像。
【图2】为本发明实施例1制备的Hemin-MnO2复合物的能量色散X射线光谱图。
【图3】为本发明实施例1制备的Hemin-MnO2复合物以及Hemin、MnO2和TMB催化双氧水氧化TMB的显色变化图以及相应的吸光度—波长曲线图；1为TMB；2为MnO2，3为Hemin，4为Hemin-MnO2复合物；显色变化图从上到下依次对应曲线4、3、2和1。
【图4】为不同浓度的本发明实施例1制备的Hemin-MnO2复合物催化氧化等量TMB的显色变化图以及相应的吸光度—波长曲线图；曲线9、8、7、6和5依次对应Hemin-MnO2复合物浓度到由高到低，显色变化图从上到下依次对应9、8、7、6和5。
【图5】为是本发明实施例1制备的Hemin-MnO2复合物采用双抗夹心法修饰后的免疫传感器测定不同浓度人IgG抗原所得的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明的保护范围。
实施例1
新型亚铁血红素—二氧化锰复合物(Hemin-MnO2)的合成：将15mg的Hemin与10mL pH＝7.4的PBS缓冲溶液混合后，加入50μL的氨水，搅拌溶解，然后边搅拌边加入1.6mL100mM的MnAc2溶液，室温下搅拌5min，然后加入100μL1M的NaOH溶液，继续搅拌6～8h，最终得到Hemin-MnO2复合物，然后在9000rpm下离心20min，除去多于的MnAc2和NaOH，再用PBS缓冲溶液清洗2～3遍，最后将离心得到的产物储存在4℃的冰箱中备用。
本发明的亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG合成方法：将合成的Hemin-MnO2复合物分散到0.5wt％的壳聚糖溶液中，反应2h，离心5min；再用0.25wt％的戊二醛分散0.5h，离心5min；然后用50μg mL-1的兔抗人IgG与之反应1h，离心；最后将其分散到pH＝7.4的PBS中，制得1mg mL-1的溶液，储存在4℃的冰箱中备用。
本发明的亚铁血红素—二氧化锰复合物用于免疫分析检测对免疫球蛋白IgG的检测方法：将150μL羊抗人IgG(用缓冲液稀释至10μg mL-1)加入聚苯乙烯96孔微量滴定板中，在4℃下孵育一整夜，将抗体固定到孔中。未固定的羊抗人IgG溶液用300μL洗涤缓冲液冲洗三次洗去。接着在37℃下，加入250μL封闭缓冲液，温育2.5h，减少人IgG的非特异吸附，过量的BSA则用300μL的洗涤缓冲液冲洗三次。以pH＝7.4的PBS溶液分别配制不同浓度的IgG溶液(0，1，2，5，10，50，100，500，1000pg mL-1)，然后分别将150μL所配不同浓度的人IgG溶液加入孔中，孵育1h，再冲洗三次。随后加入150μLHemin-MnO2修饰兔抗人 IgG，孵育1.5h。在用300μL的洗涤缓冲液冲洗四次。最后，在每个孔中加入150μL含4.3mM双氧水的柠檬酸缓冲液配制的2.5mM TMB，反应15min，继而用酶标仪测定TMB氧化产物的吸光度值，制得的标准曲线如图5所示。
实施例2
利用亚铁血红素—二氧化锰复合物用于临床免疫分析检测对人血清中人IgG回收率的测定：将人血清样品用pH＝7.4的PBS缓冲液逐级稀释到10-10倍，然后加入不同浓度的0pg mL-1、10pg mL-1、50pg mL-1、100pg mL-1和500pgmL-1的人IgG溶液。以加入0pg mL-1人IgG的纯血清溶液为空白参比溶液，按照实施例1的具体操作测定TMB氧化产物的吸光度值，制得回收率如表1，从表1数据可以看出人IgG回收率高，可以证明实施例1的检测方法的可行性和准确性。
表1.人血清中人IgG回收率的测定(pg mL-1)
。
Claims (6)
1.基于亚铁血红素—二氧化锰复合物检测人IgG的方法，其特征在于，在聚苯乙烯96孔板的各个孔的底表面先固定羊抗人IgG，并用牛血清白蛋白将所述各个孔的底表面封闭；再在所述牛血清白蛋白封闭过的各个孔的底表面分别组装不同摩尔量的人IgG后，进一步组装亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG；组装完成后，在各个孔中加入等量的含H2O2和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的柠檬酸缓冲液进行反应，反应完成后，用酶标仪测定各个孔中3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的氧化产物在652nm的吸光度值，进行比色分析；
所述的亚铁血红素—二氧化锰复合物通过如下制备方法得到：将亚铁血红素与磷酸盐缓冲溶液混合后，加入氨水促使亚铁血红素溶解，再在混合溶液中依次加入过量的MnAc2溶液和过量的NaOH溶液，搅拌均匀，再离心处理后，除去未反应完的MnAc2和NaOH，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心处理是在8000～10000rpm的速率下离心15～25min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲溶液pH为7.4。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，先在聚苯乙烯96孔板的各个孔中加入羊抗人IgG静置8～12h，除去多余的羊抗人IgG，再在所述的各个孔中加入牛血清白蛋白静置2～3h，除去多余的牛血清白蛋白；再在各个孔中分别加入等体积不同浓度的人IgG溶液，在37℃下温育0.8～1.2h，除去各孔中的剩余人IgG溶液，再在各个孔中加入亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG，在37℃下温育1.2～1.7h，除去各孔中的剩余亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG；最后在各个孔中加入等量的含H2O2和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的柠檬酸缓冲液进行反应10～20min后，用酶标仪测定各个孔中3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的氧化产物在652nm的吸光度值，进行比色分析。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG通过以下方法制备得到，将所述的亚铁血红素—二氧化锰复合物依次置于壳聚糖溶液、戊二醛溶液和兔抗人IgG中反应、离心处理，即得。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的亚铁血红素—二氧化锰复合物依次置于0.3～0.8wt％的壳聚糖溶液中反应1.8～2.2h，离心3～7min，于0.2～0.3wt％的戊二醛溶液中反应0.4～0.6h，离心3～7min，于40～60μg mL-1的兔抗人IgG中0.8～1.2h，离心处理后，将离心物分散到磷酸盐缓冲溶液中，得到亚铁血红素—二氧化锰复合物修饰兔抗人IgG溶液。
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