CN103966355A - 人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，试剂盒包括RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、引物探针、阴性对照、HIV-1B亚型阳性对照和HIV-1AE亚型阳性对照。本发明可对提取好的HIV-1进行一步法基因分型检测：FAM通道检测HIV-1B亚型，HEX通道检测HIV-1AE亚型，并利用UNG酶预防产物污染，避免假阳性。本发明的试剂盒一步法扩增方法简单、程序简短、操作简便、预防污染，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰、可信度高，用于血清中人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B亚型和AE亚型的基因检测。

Description

人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA的基因分型检测试剂盒。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒（Retrovirus）的一种。该病毒破坏人体的免疫功能，导致免疫系统的失去抵抗力，从而导致各种疾病病原体得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（即获得性免疫缺陷综合征，Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS），为一种至今无有效疗法的致命性传染病。自1981年在美国首次发现和确认以来，艾滋病已夺取超过3000万人的性命，使它成为史上最具破坏力的全球性流行病之一，截至2011年5月底世界上约有6400万人感染艾滋病毒，每天平均有7000宗新病例。目前，南亚和东南亚成为继撒哈拉以南非洲之后的第二重灾区。中国CDC估计，截止至2011年底，我国存活HIV携带者及艾滋病患者约78万人，全年新发感染者4.8万人，死亡2.8万人。疫情已覆盖全国所有省、自治区、直辖市，目前我国面临艾滋病发病和死亡的高峰期，且已由吸毒、暗娼等高危人群开始向一般人群扩散，防艾、抗艾形势严峻。

根据基因差异，可将HIV分为HIV-1型和HIV-2型。一般，HIV-1病毒是绝大多数HIV感染的病原体，HIV-2病毒主要出现在非洲，尤其是在西非地区。HIV-2的传播方式与HIV-1相同，都会发生机会性感染和AIDS，但HIV-2所致的免疫缺陷发展得较为缓慢和温和。不同地区流行的亚型不同，同一亚型在不同地区的流行态势也存在一定差异。目前，世界范围内流行的主要为HIV-1型。在美国，因为HIV-2较为少见，所以HIV-2未被列为常规检测。

医学临床上将这个过程分为四个时期：急性感染期、潜伏期、艾滋病前期和典型艾滋病期。通常采用CD4细胞计数和病毒载量作为衡量AIDS进展的指标。对于不同亚型在病毒进展方面是否存在差异还存有异议。有的研究认为不同亚型HIV感染进展为AIDS的速率不同。如塞内加尔一项研究表明，在女性感染C、D、G亚型的比感染A亚型进展为AIDS的可能性高8倍。乌干一项研究发现，成年感染者中D亚型比A亚型的CD4细胞数量更低，更易进展为死亡。也有研究认为不同亚型在疾病进展方面无明显差异。根据HIV-1基因亚型与疾病进展的相关性，可预测AIDS进展，这对于药物治疗有重要意义。在药物治疗方面，目前使用的抗逆转录病毒药物包括核苷酸逆转录酶抑制剂（RNTIs）、非核苷酸逆转录酶抑制剂（NRNTIs）和蛋白酶抑制剂（PIs）三类，主要针对欧美发达国家的HIV-1 B亚型pol基因编码的逆转录酶和蛋白酶研制设计，而其他亚型病毒株可能对该药物的敏感性上存在差异而影响疗效。

目前，中国境内流行的HIV主要为M组HIV-1型（目前境内尚未见HIV-1 N组和O组的报道，HIV-2型感染病例的报道极少），其基因型主要为B/B’、BC重组型（包括CRF 07_BC重组型和CRF 08_BC重组型）以及AE重组型（CRF 01_AE重组型）。因此，结合HIV-1不同亚型在中国的流行态势，各亚型HIV-1对艾滋病发病进程的影响等因素，对HIV-1 B亚型和AE亚型的基因分型检测具有重要的现实意义。

HIV-1的检测方法总体可分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养（病毒分离）、p24抗原检测和病毒核酸检测。早期对HIV-1的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV-1的抗体，间接地诊断HIV-1感染。目前，使用较多的HIV-1亚型分型方法有直接测序法、异源双链泳动分析法、血清学分型法和核酸检测方法等。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV-1的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了HIV-1实验室诊断的发展方向。

传统的核酸检测方法是采用核酸杂交技术对目的核酸进行检测，虽然采用放射性标记的探针可以提高检测的敏感性，但仍然偏低，不能满足临床需要。最近几年核酸检测技术发展迅速，主要是采用各种扩增放大技术提高检测的灵敏度。随着扩增技术的成熟，可以将低拷贝的靶序列成对数级放大扩增，同时采用比放射性探针更灵敏的非放射性检测系统（如电化学发光系统等），明显提高核酸检测的灵敏度，并减少放射性物质的污染。检测HIV-1 RNA病毒载量的方法主要有分支DNA检测（bDNA）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和核酸序列扩增检测（NASBA）等，其中，基于TaqMan探针技术的荧光定量RT-PCR方法已发展成为成熟、常用而有效的检测手段。

TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’-末端，淬灭基团在探针3’-末端。当探针完整或与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在进行PCR反应延伸过程时，TaqDNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性将探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了PCR污染等问题。HIV-1荧光定量检测正是基于这种原理设计，为HIV-1早期感染诊断、大规模筛查、疗效动态分析、新药开发等提供良好的技术支持。目前，国外上市的HIV-1分型检测试剂均基于TaqMan探针技术，产品有ViroSeq HIV-1 Genotyping System with the 3700 Genetic Analyzer（Celera公司，2003）和Trugene HIV-1 Genotyping Kit and Open Gene DNA Sequencing System（Siemen公司，2002）等，国内尚无HIV-1分型检测产品上市。

同时为避免反应结果的假阳性，利用UNG酶防污染的特性，在PCR扩增反应中用dUTP代替dTTP，这样仅在扩增片段中含有dUTP；而dUTP使污染的扩增子在扩增靶DNA前易于被UNG酶降解：这种含有dUTP的PCR产物与UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可从单链或双链DNA中消除dUTP而阻止Taq DNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG酶在50℃以上即失去活性，这样经过热循环不会破坏病人HIV-1 RNA。UNG酶对不含dUTP的模板无任何影响，因此，反应体系中只有从HIV-1阳性病人样本血清中提取的HIV-1 RNA因不被UNG酶降解而直接进行RT-PCR反应。

该技术通过对HIV-1各基因型序列比对分析，获得针对HIV-1 B亚型和AE亚型的通用引物及各自特异性的荧光探针，通过检测各种HIV-1标准血清及临床血清，确定该试剂盒的各种检测指标，确定该试剂盒检测的特异性、灵敏度，为HIV-1的确诊、大规模筛选、病情程度判断、疗效评价、新药开发等提供一个方便、廉价的检测手段。其关键技术为获得针对各种HIV-1 B亚型和AE亚型的通用引物及各自特异性的荧光探针，制备高特异性、搞敏感性、重复性好的HIV-1基因分型RT-PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种精确简便的用于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA基因分型检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。

本发明的技术方案为：提供一种人类免疫缺陷病毒1型基因分型检测方法及试剂盒，采用一步法基因分型RT-PCR技术对人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B亚型和AE亚型进行基因分型检测。在使用上海星耀医学科技发展有限公司柱法纯化试剂（硅胶膜吸附法）对HIV-1阳性血清样本进行核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，无需多次重复循环、防止产物污染。本发明方法操作简便、敏感度高、结果明晰、可靠性高。

本发明提供的试剂盒包括：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、引物探针、阴性对照、HIV-1 B亚型阳性对照和HIV-1 AE亚型阳性对照。本发明提供的试剂盒所检测的核酸需通过使用上海星耀医学科技发展有限公司柱法纯化试剂（硅胶膜吸附法）对HIV-1阳性血清样本进行核酸提取，对提取好的HIV-1 RNA直接进行基因分型RT-PCR检测，其中所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl (pH8.3) 20 mM、KCl 100 mM、明胶0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4 mM、MgCl₂ 6 mM的混合液；所述的酶混合物为逆转录酶、TaqDNA聚合酶和UNG酶的混合物（逆转录酶3 U/ul，Taq DNA聚合酶2 U/ul，UNG酶1 U/ul）；所述的引物探针为一对HIV-1特异性引物、一条HIV-1 B亚型特异性探针和一条HIV-1 AE亚型特异性探针的混合液（引物各6.25 uM，HIV-1 B亚型特异性探针2.5 uM，HIV-1 AE亚型特异性探针2.5 uM）；所述的阴性对照为无HIV-1 RNA的正常人血清；所述的HIV-1 B亚型阳性对照为含有HIV-1 B亚型基因片段的慢病毒的人血清；所述的HIV-1 AE亚型阳性对照为含有HIV-1 AE亚型基因片段的慢病毒的人血清。检测用的HIV-1特异性通用扩增引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列〈SEQ ID No.3〉为：5’- AGACAGGATCAGAAGAACTTA -3’，

下游引物序列〈SEQ ID No.4〉为：5’-TCTAAAGCTTCCTTGGTGTCTTTTA -3’，

HIV-1 B亚型特异性探针序列〈SEQ ID No.5〉为：5’-FAM-ATAATATCAGTAGCAACCCTCTATTG-TAMRA-3’，

HIV-1 AE亚型特异性探针序列〈SEQ ID No.6〉为：5’-JOE-TTAATATCARTAGCAACCCTCTGGTG-TAMRA-3’。

本发明提供的试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阴性对照、HIV-1 B亚型阳性对照和HIV-1 AE亚型阳性对照，扩增检测方法如下：

a、按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品3个＋1）n 配制反应液：取RT-PCR反应液n×12.5 μl、引物探针n×2 μl、RT-PCR酶混合物 n×0.5 μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按15 μl/管分装到反应管中；

b、取样本提取物、对照品提取物各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上；

c、反应程序为：37℃反应10 min，50℃反应15 min，然后95℃保温2 min，再按 94℃ 10 s→60℃ 45 s，循环45次，并于60℃分别采集FAM、JOE荧光通道的信号；

d、仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。在双通道（FAM和JOE）下检测反应始终扩增产物的荧光强度：Ct值为0或空白：人类免疫缺陷病毒1型呈阴性；FAM通道检测Ct值小于等于40：人类免疫缺陷病毒1型呈阳性，病人HIV-1 B亚型感染；JOE通道检测Ct值小于等于40：人类免疫缺陷病毒1型呈阳性，病人HIV-1 AE亚型感染。

本发明方法原理是基于TaqMan水解探针荧光PCR原理，以病毒HIV-1 RNA为模板，采用病毒基因组特异性引物探针，辅以逆转录酶、TaqDNA聚合酶和UNG酶，经一步法荧光RT-PCR实验，可快速、准确对人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA模板进行基因分型分析；从逆转录到荧光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、结果明晰、可靠性高，可用于血清中人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B亚型和AE亚型的基因检测。

具体实施方式

实施例1 一种人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒。

1. 人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA的提取

使用上海星耀医学科技发展有限公司柱法纯化试剂（硅胶膜吸附法）对HIV-1阳性血清样本进行核酸提取。

2. 逆转录及荧光RT-PCR扩增（每人份25ul体系）

a、一步法荧光定量RT-PCR反应液的配制：

b、一步法荧光定量RT-PCR反应程序：

[1] 37℃ 10 min

[2] 50℃ 15 min

[3] 95℃ 2 min

[4] 94℃ 10 s

[5] 60℃ 45 s

[6] Go to [4] ，45 cycles

在第五步采集FAM和JOE通道荧光信号，

[7] End。

3. 检测：

本发明适用于ABI StepOne、ABI 7500型和ABI 7300型荧光定量PCR仪进行荧光定量检测。

4. 结果判断：

仪器PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。以取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。在双通道（FAM和JOE）下检测反应始终扩增产物的荧光强度：Ct值为0或空白：人类免疫缺陷病毒1型呈阴性；FAM通道检测Ct值小于等于40：人类免疫缺陷病毒1型呈阳性，病人HIV-1 B亚型感染；JOE通道检测Ct值小于等于40：人类免疫缺陷病毒1型呈阳性，病人HIV-1 AE亚型感染。

实施例2 临床检测

用上述方法对200例临床样品进行基因分型检测，其中人类免疫缺陷病毒1型患者48例，检出阳性率24%，其中，HIV-1 B亚型检出阳性率为39.58%（19/48），HIV-1 AE亚型检出阳性率为60.42%（29/48）。本发明的检测方法及试剂盒特异性强、敏感度高、操作简便、可重复度高，可对人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA进行快速基因分型检测。本发明使用上海星耀医学科技发展有限公司柱法纯化试剂（硅胶膜吸附法）对HIV-1阳性血清样本进行核酸提取，保证了模板的纯度。同时，利用一步法荧光分型RT-PCR技术。在核酸提取结束后直接将核酸加入到反应体系中，cDNA的合成和PCR反应在一管，无需增加额外步骤；并使用UNG酶避免扩增产物污染。该操作既确保了扩增结果的准确性，灵敏度，又缩短了时间、减少了污染，提高了荧光定量PCR检测方法的简便性，不仅可用于HIV-1 B亚型和AE亚型的基因分型检测，也可作为临床实验室对HIV-1感染的辅助诊断方法和临床治疗效果的监测手段。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 上海星耀医学科技发展有限公司

上海复星医药（集团）股份有限公司

迟, 大利

吴, 大治

夏, 懿

<120> 一种人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒

<130> HIV-1分型

<140> cn

<141> 2012-12-21

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> Human immunodeficiency virus type 1

<400> 1

agacaggatc agaagagatt aaatcattat acaatacagt agcaaccctc tattgtgtac 60

atcaaaggat agaggtaaaa gacaccaagg aagctttaga 100

<210> 2

<211> 100

<212> DNA

<213> Human immunodeficiency virus type 1

<400> 2

agacaggatc agaagaactt aaatcattat ttaacacagt agcagtcctt tggtgcgtac 60

accagaggat agagataaaa gacaccaaag aagctttaga 100

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial sequence

<400> 3

agacaggatc agaagaactt a 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial sequence

<400> 4

tctaaagctt ccttggtgtc tttta 25

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial sequence

<220>

<221> HIV-1 genotyping SEQ ID No.5

<222> (2)..(27)

<223> b=FAM; d=TAMRA

<400> 5

bataatatca gtagcaaccc tctattgd 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> artificial sequence

<220>

<221> HIV-1 genotyping SEQ ID No.6

<222> (2)..(27)

<223> b=JOE; d=TAMRA

<400> 6

bttaatatca rtagcaaccc tctggtgd 28

Claims (5)

1.一种人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：本发明通过考察人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）基因组全序列，并对检索所得HIV-1各基因亚型序列之间的特异性位点进行差异比对分析，设计出一对特异性扩增引物、一条HIV-1 B亚型特异性荧光探针和一条HIV-1 AE亚型特异性荧光探针，采用实时荧光定量RT-PCR方法扩增并分型检测目的基因。

2.权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：丙型肝炎病毒特异性PCR扩增的基因序列为：

〈SEQ ID No.1〉

5'-AGACAGGATCAGAAGAGATTAAATCATTATACAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTACATCAAAGGATAGAGGTAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGA-3'，

〈SEQ ID No.2〉

5'-AGACAGGATCAGAAGAACTTAAATCATTATTTAACACAGTAGCAGTCCTTTGGTGCGTACACCAGAGGATAGAGATAAAAGACACCAAAGAAGCTTTAGA-3'，

人类免疫缺陷病毒1型基因分型检测试剂盒扩增序列全长100 bp，属HIV-1 gag结构基因区，为单拷贝序列。

3.如权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，一对HIV-1特异性扩增引物序列中的一条序列与SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2中所示的部分序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2中所示的部分序列互补；HIV-1 B亚型特异性探针与SEQ ID No.1中所示的部分序列相同或互补；HIV-1 AE亚型特异性探针与SEQ ID No.2中所示的部分序列相同或互补，其中，所述的一对HCV特异性引物，其序列可以选自SEQ ID No. 3和SEQ ID No.4，

〈SEQ ID No.3〉为：5'- AGACAGGATCAGAAGAACTTA-3'，

〈SEQ ID No.4〉为：5'- TCTAAAGCTTCCTTGGTGTCTTTTA-3'；

一对HIV-1特异性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10~20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的HIV-1 B亚型特异性探针，可以选自SEQ ID No.5的序列，

〈SEQ ID No.5〉为：5'-FAM-ATAATATCAGTAGCAACCCTCTATTG- TAMRA-3'，

其中探针5'-端标记FAM荧光基团，探针3'-端均标记淬灭基团（如，TAMRA），HIV-1片段特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10~20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的HIV-1 AE亚型特异性探针，可以选自SEQ ID No.6的序列，

〈SEQ ID No.6〉为：5'-JOE-TTAATATCARTAGCAACCCTCTGGTG- TAMRA-3'，

其中探针5'-端标记JOE荧光基团，探针3'-端均标记淬灭基团（如，TAMRA），HIV-1片段特异性探针序列也可以是上述序列向前或向后延伸10~20个核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。

4.如权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、引物探针、阴性对照、HIV-1 B亚型阳性对照和HIV-1 AE亚型阳性对照，其中，RT-PCR反应液为Tris-HCl (pH8.3) 20 mM、KCl 100 mM、明胶0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4 mM、MgCl₂ 6 mM的混合液；所述的酶混合物为逆转录酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶的混合物（逆转录酶3 U/ul，Taq DNA聚合酶2 U/ul，UNG酶1 U/ul）；所述的引物探针为一对HIV-1特异性引物、一条HIV-1 B亚型特异性探针和一条HIV-1 AE亚型特异性探针的混合液（引物各6.25 uM，HIV-1 B亚型特异性探针2.5 uM，HIV-1 AE亚型特异性探针2.5 uM）；所述的阴性对照为无HIV-1 RNA的正常人血清；所述的HIV-1 B亚型阳性对照为含有HIV-1 B亚型基因片段的慢病毒的人血清；所述的HIV-1 AE亚型阳性对照为含有HIV-1 AE亚型基因片段的慢病毒的人血清。

5.如权利要求1中所述的人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应液的配制和扩增程序如下：

a、一步法基因分型RT-PCR反应液的配制：

将RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、引物探针按照12.5: 0.5: 2的比例混合，反应液体积为25 ul；

b、一步法基因分型RT-PCR反应程序：

[1] 37℃ 10 min

[2] 50℃ 15 min

[3] 95℃ 2 min

[4] 94℃ 10 s

[5] 60℃ 45 s

[6] Go to [4] ，45 cycles

在第五步采集FAM和JOE通道荧光信号，

[7] End 。