CN103966132B

CN103966132B - 一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株及其应用

Info

Publication number: CN103966132B
Application number: CN201410195252.4A
Authority: CN
Inventors: 金玉兰; 王玉荣; 肖�琳
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2014-05-09
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2034-05-09
Also published as: CN103966132A

Abstract

本发明提供了一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株(Vibrio？sp.S-3)及其应用，该短蛸胃肠道产蛋白酶菌株于2013年9月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.8299。本发明的短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产洗涤剂添加剂方面以及生产酶解豆粕的蛋白酶方面的应用。本发明筛选到的产蛋白酶菌株Vibrio？sp.S-3能高效地产生蛋白酶，用于洗涤剂添加剂，酶解豆粕，提高了资源利用率，降低了生产成本。

Description

一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株及其应用。

背景技术

蛋白酶是作用于蛋白质或多肽催化肽键水解的水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，具有催化能力高、反应条件温和、底物专一性等特点。蛋白酶的销售额约占全球酶制剂市场的60％，对经济的发展起着重要的作用。蛋白酶广泛分布于动物、植物、微生物中。通过微生物发酵产生的蛋白酶我们把它称之为微生物蛋白酶，与菠萝、木瓜、猪胰脏等传统的动植物资源相比，微生物蛋白酶资源具有无法比拟的优势。随着基因工程的加入、发酵技术的发展、酶制剂的广泛应用及新型发酵设备的发明，微生物成为工业用蛋白酶的主要来源。蛋白酶的用途非常广泛，最大的用途是洗涤剂，其次用于饲料、食品工业、酿酒酿造，以及制革工业和医药。全世界洗涤剂的年产量已达1.3亿吨，在欧洲加酶洗衣粉的比例达到80％左右，美国45％的洗涤剂加酶，日本加酶的洗衣粉比例也达60％以上，全世界碱性蛋白酶的销售额约占世界酶制剂市场的25％。

我国是世界上最大的养殖生产国、饲料原料(特别是蛋白质原料)需求大国之一，但是我国饲料工业生产中蛋白质饲料资源的严重不足，鱼粉等高品质动物蛋白原料主要依赖国际进口，而目前全球性鱼类资源的日趋减少直接导致鱼粉价格上涨，动物蛋白价格高涨使得人们将视线逐渐转向了植物蛋白。豆粕作为一种质量稳定的植物蛋白原料，一直是饼粕消费的主体，加之动物性蛋白资源日益短缺，价格居高不下，促使豆粕植物性蛋白原料需求的扩大。但由于豆粕中抗营养因子的存在以及其适口性差等问题限制了豆粕的应用价值。

目前，我国的蛋白酶研究还存在蛋白酶种类单一、微生物来源较少等问题，因此寻找和开发新的微生物蛋白酶来源是目前科研的重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株及其应用，旨在解决我国蛋白酶研究还存在蛋白酶种类单一、微生物来源较少等问题。

本发明是这样实现的，一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株(Vibriosp.S-3)，于2013年9月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.8299，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该短蛸胃肠道产蛋白酶菌株的16SrRNA序列如序列表中SEQIDNO：1所示，该菌株为革兰氏阴性菌，菌落为乳白色、圆形、平整、边缘整齐湿润的光滑小菌落。

本发明进一步提供上述短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产洗涤剂添加剂方面的应用。

本发明进一步提供上述短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产酶解豆粕的蛋白酶方面的应用。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明从短蛸胃肠道内筛选了一种产蛋白酶菌株Vibriosp.S-3，高效地产生蛋白酶，用于洗涤剂添加剂，酶解豆粕，提高了资源利用率，降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例1中各菌株发酵液的蛋白酶活力图；

图2为本发明实施例1中Vibriosp.S-3系统发育树；

图3为本发明实施例2中不同碳源对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响图；

图4为本发明实施例2中不同氮源对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响图；

图5为培养基起始pH值对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响图；

图6为本发明实施例2中培养温度对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶活力的影响图；

图7为本发明实施例2中培养时间对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶活力的影响图。

具体实施方式

以往人们多从土壤、温泉水中采集样本筛选产蛋白酶微生物，近年来，人们逐渐将开发利用的眼光投向海洋。海洋特有的环境造就了海洋生物的多样性与独特性，低温、高压、高盐量使得海洋生物中一些酶、激素以及其他代谢产物有着极高的活性，海洋生物也将成为各国学者研究的主要对象。章鱼属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、八腕目(Octopoda)、章鱼科(octopodidae)，学名“蛸”。其体短，卵圆形，无鳍，头上生八腕，腕长短不等，腕间有膜相连，腕上吸盘无柄。根据腕的长短，章鱼主要分为8种，分别为短蛸、卵蛸、双点蛸、真蛸、环蛸、长蛸、纺锤蛸、嘉庚蛸。本发明所选用的章鱼为短蛸(Octopusocellatus)，属软体动物门、头足纲、八腕目、章鱼科、蛸属，主要栖居于温带偏北海域，是我国北方沿岸蛸类中最重要的经济种。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：Vibriosp.S-3菌株的制备：

一、材料与培养基：

1、材料短蛸

2、培养基

选择培养基：2216E培养基，培养基的制备方法详见文献：ChristerO.IntestinalColonizationPotentialofTurbot(Scophthalmusmaximus)-andDab(Limandalimanda)-AssociatedBacteriawithInhibitoryEffectsagainstVibrioanguillarum[J].APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,1992(58):551-556.；

酪蛋白培养基：酪蛋白1％，酵母膏0.1％，琼脂1.5％，pH7.2，海水配制，以上为质量浓度，即酪蛋白为1g/100mL；

液体发酵培养基：淀粉0.5％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，磷酸高铁0.01％，培养基起始pH8.0，该培养基用海水配制，以上为质量浓度，即淀粉为0.5g/100mL；

固体培养基：称取4gLB营养琼脂培养基溶解于100ml海水中。

二、短蛸胃肠道产蛋白酶菌的筛选：

选用酪蛋白培养基作为筛选培养基的原理是产蛋白酶菌种在酪蛋白培养基中生长时，产的蛋白酶可水解培养基中的酪蛋白，产生透明圈。因此，以酪蛋白水解透明圈的大小可进行产蛋白酶菌株的筛选。

1、初筛

将活短蛸解剖，取其胃肠道，去掉肠道杂物，用无菌海水冲洗数次，匀浆，得到菌液原液，将原液稀释成10^-1，10^-2浓度梯度，分别涂布于2216E培养基，于25℃恒温培养箱中培养。

挑取培养基上的单菌落，稀释划线培养于固体培养基上，25℃培养1d，得到纯的单菌落，将单菌落点种于酪蛋白培养基上，观察各菌株产透明圈情况。

结果：酪蛋白培养基上水解透明圈直径与菌落直径的比值(D/d值)越大说明产酶能力越强。菌株的初筛共得到10株在酪蛋白培养基上产透明圈的菌株，记为S-1，S-2，······，S-10，其中，菌株S-1、S-2、S-3和S-8所产透明圈直径和菌落直径比值较大。

2、复筛：

将产透明圈的菌株接种于液体发酵培养基上，于25℃摇瓶培养3d，在4℃，10000r/min条件下离心10min，取上清液，测定其蛋白酶活力，筛选出产蛋白酶活力最高的菌株，作为出发菌株。

三、蛋白酶活力测定方法:

参照《SBT10317-1999蛋白酶活力测定法》的福林酚法，配制质量分数为2％酪蛋白溶于0.2mol/LPBS(pH7.2)缓冲液中作为底物，将0.2ml酪蛋白底物和0.2ml样品分别在37℃预热10min，充分混匀后，37℃水浴反应10min。反应结束后加入0.4mlTCA终止反应，放入37℃水浴锅中静置20min，10000r/min离心5min，取上清液0.2ml，向上清液中加入1mlNa₂CO₃和0.2ml福林试剂，37℃静置水浴20min，结束后660nm下测吸光值，计算酶活力。

酶活力定义为在40℃，每毫升酶液每分钟催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸的酶量为1个单位(U/mL)。

将初筛得到的10株菌株分别接种至液体发酵培养基，进行摇瓶培养，测定其粗酶液的蛋白酶活力，结果见图1所示，S-3菌株产的蛋白酶活性最高，其次为S-1菌株和S-8菌株，蛋白酶活力分别为52，49和35U/mL，综合水解透明圈和酶活力两个因素，选择S-3菌株为出发菌株，进行后续试验。

四、S-3菌株的鉴定：

1、形态特征：

观察S-3菌株在固体培养基上的生长状况，记录形态特征，通过革兰氏染色观察菌株的个体形态等。

对培养24h的S-3菌株进行革兰氏染色，在显微镜下观察其形态，S-3菌株为革兰氏阴性菌，短杆状。菌落为乳白色、圆形、平整、边缘整齐湿润的光滑小菌落。

2、生理生化鉴定

对S-3菌株进行生理生化鉴定试验，结果如表1所示：

表1生理生化实验结果

注：表中“+”表示阳性反应，“－”表示阴性反应。

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，依据其形态和生理生化特征对S-3进行分类鉴定，经鉴定与弧菌属生理生化特性相似。

3、16SrDNA全序列分析：

S-3菌株的16SrDNA的全序列测定步骤如下：

(1)基因组的提取；

(2)PCR反应；

(3)DNA琼脂糖切胶纯化；

(4)目的片断TA克隆；

(5)质粒提取；

(6)DNA测序；

经PCR扩增获得菌株16SrDNA基因片段的长度为1403bp左右，序列如SEQIDNO：1所示。

将菌株S-3的16SrDNA的序列提交GenBank(AccessionNo.KF589848)进行Blastn比对，结果显示，S-3与灿烂弧菌(EU091325)相似性为99％，采用Clustalx软件进行序列比对，Mega5软件进行系统发育分析，以Neighbour-Joining方法构建进化树，并通过Bootstrap稳定性检验，如图2。

实施例2：Vibriosp.S-3菌株最适发酵条件：

一、不同碳源对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响

考察不同碳源对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响；在实施例1中的液体培养基中采用质量浓度为0.5g/100mL的不同碳源即葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉、蔗糖，培养条件为25℃，180r/min摇瓶培养3天，结束后在4℃，10000r/min条件下离心10min，除去菌体，得上清液，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法:”中的方法测定上清液的蛋白酶活力。

不同碳源对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响，结果如图3所示，以淀粉为碳源时酶活力最高，可达52.9/mL，其次是蔗糖，说明该菌株能有效利用多糖。

二、不同氮源对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响：

考察不同氮源对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响；在实施例1中的液体培养基中采用质量浓度为0.5g/100mL的不同氮源即蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸钾、硫酸铵，培养条件为25℃，180r/min摇瓶培养3天，结束后在4℃，10000r/min条件下离心10min，除去菌体，得上清液，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法:”中的方法测定上清液的蛋白酶活力。

不同氮源对Vibriosp.S-3菌株产酶的影响结果如图4所示，酵母膏作为氮源时菌株所产蛋白酶活力最高，可达58.2U/mL，其次是牛肉膏，硫酸铵等无机氮源作为氮源时，蛋白酶的合成量很低，说明菌株能较好的利用营养物质丰富的有机氮源而对无机氮源利用率不高。

三、培养基起始pH值对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响：

将实施例1中的液体培养基的起始pH值分别调节为6、7、8、9以及10，在25℃、180r/min条件下摇瓶培养3天，在4℃、10000r/min条件下离心10min，除去菌体，得上清液，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法：”中的方法测定测定上清液的蛋白酶活力。

培养基不同起始pH值对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶的影响结果如图5所示，培养基的起始pH值为8.0时，粗酶液中蛋白酶活力达108.4U/mL，Vibriosp.S-3菌株可以在较广的pH值范围内产蛋白酶，pH值在中性和偏碱性的条件下菌株所产蛋白酶活力均很高。

四、培养温度对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶活力的影响：

将菌株接于实施例1中的液体培养基中，分别在20～40℃的条件下摇瓶培养，在4℃，10000r/min条件下离心10min，除去菌体，得上清液，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法:”中的方法测定上清液的蛋白酶活力。

培养温度对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶活力的影响结果如图6所示，Vibriosp.S-3菌株可在20～40℃范围内生长，最适培养温度为20℃，属于中温菌，菌株的最适温度与短蛸生长的水温及饮食均有关系。

五、培养时间对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶活力的影响：

将菌株接于实施例1中的液体培养基中，在25℃，180r/min条件下摇瓶培养7d，无菌条件下隔12h取样，4℃，10000r/min离心10min，除去菌体，得上清液，即为粗酶液，依照实施例1中“三、蛋白酶活力测定方法：”中的方法测定上清液的蛋白酶活力。

培养时间对Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶活力的影响结果如图7所示，发酵第0～2天为S-3菌株生长期，蛋白酶量较低，发酵第2.5天时菌株蛋白酶产量显著增加，第3.5天时酶活力最高且之后趋于稳定，因此Vibriosp.S-3菌株的最适培养时间为3.5天。

综上，Vibriosp.S-3菌株的产酶条件进行了研究，结果显示，Vibriosp.S-3菌株在以淀粉为碳源，酵母膏为氮源，培养基初始pH8.0，培养温度20℃的条件下振荡培养3.5天时，所产蛋白酶活力最高。

实施例3：Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶作为洗涤剂添加剂的实验:

将产透明圈的菌株接种于液体发酵培养基上，于25℃摇瓶培养3d，在4℃，10000r/min条件下离心10min，得上清液，即为粗酶液。在40℃下，将粗酶液与不同浓度的表面活性剂(SDS、tritonX-100、吐温-20)和H₂O₂中保温20～60min，间隔20min取样，测剩余蛋白酶活性。将未做处理的粗酶液做空白对照，活性记为100％。

将商业洗衣粉，雕牌、汰渍、立白配制为7mg/mL的溶液，模拟洗衣环境，80℃下保温30min，使洗涤剂中的蛋白酶失活，将粗酶液与洗涤剂溶液40℃下等体积混合，间隔20min取样，测剩余蛋白酶活性。以不加洗涤剂溶液，相同条件下处理的粗酶液为对照，活力记为100％。

菌株S-3产蛋白酶在氧化剂和表面活性剂中不仅具有较强的稳定性，甚至不同浓度的氧化剂、表面活性剂还可提高蛋白酶的活性，如下表2所示：

表2粗蛋白酶在不同表面活性剂和氧化剂中的稳定性

从表2中可以看出，菌株S-3产蛋白酶在0.5％SDS中保温20min后，活性增加到157.23％，60min后活性仍为153.26％。在10％的H₂O₂中保温60min后，剩余酶活力为99.47％。来源于放线菌的蛋白酶在10％H₂O₂中保温60min后，剩余酶活力为87％。

应用于洗涤剂的理想蛋白酶除具有较好的氧化剂、表面活性剂的兼容性外，在洗涤液中还需保持较好的稳定性。如下表3所示：

表3粗蛋白酶在商业洗涤剂中的稳定性

从表3中可以看出，蛋白酶在商业洗衣粉，中40℃保温1h后，可保持85％以上的活力。在洗涤剂中，剩余酶活力最高为90.61％。影响酶活性的因素有很多，包括洗衣粉的成分。是洗衣粉市场的三大品牌，与占据全国洗衣粉市场的60％。

实施例4：Vibriosp.S-3菌株产蛋白酶对豆粕的酶解实验

将Vibriosp.S-3菌株接种于液体实施例1中的液体培养基上，在培养基起始pH8.0、20℃、180r/min条件下培养3.5d，在4℃、10000r/min条件下离心10min，得上清液，即为粗酶液。加硫酸铵进行盐析，最后浓度达到80％，过夜，4℃、10000r/min离心10min，得粗酶沉淀，装入透析袋透析去盐，3d后，冷冻干燥。

称取豆粕5.0g，加入蒸馏水75mL，调节pH8.0，加酶量为0.2mg/g原料，不加酶的作为空白对照，在50℃，120r/min条件下酶解6h，发酵结束后在5000r/min条件下离心10min，得上清液，即为酶解液。

采用BCA法测定酶解液中多肽含量，将BSA标准品(5mg/ml)用0.9％Nacl配成0.5mg/ml的稀释液，然后进行梯度稀释分别稀释，分别为0.5mg/ml，0.4mg/ml，0.3mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml。分别取标准液20μL加BCA工作液200μL，37℃水浴1h，562nm下测吸光值，绘制标准曲线。取酶解液20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，于37℃水浴中放置1h，于562nm下测吸光值，参照标准曲线得出样品中多肽含量为11.2mg/mL，比空白提高1.6倍。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种短蛸胃肠道产蛋白酶菌株(Vibriosp.S-3)，于2013年9月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.8299。

2.权利要求1所述的短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产洗涤剂添加剂方面的应用。

3.权利要求1所述的短蛸胃肠道产蛋白酶菌株在生产酶解豆粕的蛋白酶方面的应用。