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CN103958675A - 具有木聚糖酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

具有木聚糖酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸 Download PDF

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CN103958675A
CN103958675A CN201280059072.2A CN201280059072A CN103958675A CN 103958675 A CN103958675 A CN 103958675A CN 201280059072 A CN201280059072 A CN 201280059072A CN 103958675 A CN103958675 A CN 103958675A
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CN
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acid
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CN201280059072.2A
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N.斯波德斯伯格
T.沙加西
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Novo Nordisk AS
Novozymes Inc
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Novozymes Biotech Inc
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Abstract

本发明涉及具有木聚糖酶活性、催化结构域、和碳水化物结合结构域的多肽，以及编码这些多肽、催化结构域、和碳水化物结合结构域的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及生产和使用这些多肽、催化结构域、和碳水化物结合结构域的方法。

Description

具有木聚糖酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
关于在联邦政府资助的研究与开发下完成的发明的权利声明
本发明是在受到政府资助的、在由能源部授予的合作协议DE-FC36-08GO18080下做出的。政府在本发明中拥有一定权利。
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有木聚糖酶活性、催化结构域、和碳水化物结合结构域的多肽，以及编码这些多肽、催化结构域、和碳水化物结合结构域的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及生产和使用这些多肽、催化结构域、和碳水化物结合结构域的方法。
相关技术说明
作为世界上最大规模的可再生生物质资源的木质纤维素主要由木质素、纤维素、以及半纤维素组成，其中后者中大部分是木聚糖。木聚糖酶(例如，内切-1,4-β-木聚糖酶，EC3.2.1.8)水解木聚糖中的内部β-1,4-木糖苷键(xylosidic linkage)，以产生较小分子量的木糖和木-低聚体。木聚糖是由1,4-β-糖苷-连接的D-吡喃木糖形成的多糖。β-木糖苷酶催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除。
纤维素是由β-1,4-键连接的葡萄糖的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在任意位置消化纤维素聚合物，使其易受纤维二糖水解酶的攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶性β-1，4-连接的二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将木质纤维素原料转化为乙醇具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的可取性、以及乙醇燃料的清洁性。现在认为木材、农业残余物、草本作物、和城市固体废物是生产乙醇的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将木质纤维素转化为可发酵糖(例如，葡萄糖)，就容易通过酵母将这些可发酵糖发酵成乙醇。
在本领域中存在通过补充另外的酶来改进纤维素分解酶组合物的需求，以为木质纤维素的降解增加效益并且为其提供具成本效益的酶溶液。
本发明提供了具有木聚糖酶活性的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。
发明内容
本发明涉及具有木聚糖酶活性的分离的多肽，这些多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的一种多肽；
(b)由在至少高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；
(d)在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及
(e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的多肽的一个片段。
本发明还涉及包括选自下组的催化结构域的分离的多肽，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸23至342具有至少80％序列一致性的一个催化结构域；
(b)由在至少高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列；或其全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列具有至少80％序列一致性的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
(d)在一个或多个位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸23至342的变体；以及
(e)具有增强纤维素分解活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的催化结构域的一个片段。
本发明还涉及包括可操作地连接至一个催化结构域的碳水化物结合结构域的分离的多肽，其中该结合结构域选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸366至400具有至少80％序列一致性的一个碳水化物结合结构域；
(b)由在至少非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435或其全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个碳水化物结合结构域；
(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435具有至少80％的序列一致性的一种多核苷酸编码的一个碳水化物结合结构域；
(d)在一个或多个位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸366至400的变体；以及
(e)具有结合活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的碳水化物结合结构域的一个片段。
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、和重组宿主细胞；以及生产这些多肽的方法。
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料或包含木聚糖的材料的方法，这些方法包括：在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料或包含木聚糖的材料。在一个方面中，这些方法进一步包括回收降解的或转化的纤维素材料或包含木聚糖的材料。
本发明还涉及生产发酵产物的方法，这些方法包括：(a)在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物糖化纤维素材料或包含木聚糖的材料；(b)用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料或包含木聚糖的材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。
本发明还涉及发酵一种纤维素材料或包含木聚糖的材料的方法，这些方法包括：用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵该纤维素材料或包含木聚糖的材料，其中该纤维素材料或包含木聚糖的材料在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下被一种酶组合物糖化。在一个方面中，发酵该纤维素材料或包含木聚糖的材料来生产一种发酵产物。在另一个方面中，这些方法进一步包括从发酵中回收该发酵产物。
本发明还涉及一种编码信号肽的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至22或由其组成，该信号肽被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因，其中该蛋白质对该信号肽而言是外源的；包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体、以及重组宿主细胞；以及生产一种蛋白质的方法。
附图简要说明
图1示出了胶囊青霉(Penicillium capsulatum)GH10木聚糖酶(P244K1)对研磨过筛的碱性预处理的玉米芯在50℃-60℃下由一种酶组合物水解为葡萄糖的作用。
图2示出了胶囊青霉GH10木聚糖酶(P244K1)对研磨过筛的碱性预处理的玉米芯在50℃-60℃下由一种酶组合物水解为木糖的作用。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”是指一种催化乙酰基基团从聚合木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、α-萘基乙酸酯、以及对-硝基苯基乙酸酯上水解的羧酸酯酶(EC3.1.1.72)。出于本发明的目的，在50mM包含0.01％TWEENTM20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的乙酸钠(pH5.0)中，使用0.5mM对-硝基苯基乙酸酯作为底物确定乙酰木聚糖酯酶活性。将一单位的乙酰木聚糖酯酶定义为在pH5下、在25℃下，能够每分钟释放1微摩的对-硝基苯酚阴离子的酶量。
等位变体：术语“等位变体”是指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可变形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无改变)，或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”是指一种催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基水解的α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水解酶(arabinofuranohydrolase)(EC3.2.1.55)。这种酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿聚糖、阿糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、聚糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的，使用5mg的中等粘度小麦阿糖基木聚糖(爱尔兰麦格酶国际有限公司(Megazyme International Ireland,Ltd.)，布雷，威克洛郡，爱尔兰(Bray,Co.Wicklow,Ireland))/ml的100mM乙酸钠(pH5)，总体积为200μl，在40℃下持续30分钟，随后通过HPX-87H柱色谱法(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国(Hercules,CA,USA))进行阿拉伯糖分析来确定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
α-葡萄糖醛酸酶：术语“α-葡萄糖醛酸酶”是指一种催化α-D-葡萄糖醛酸苷(glucuronoside)向D-葡萄糖醛酸酯和乙醇的水解的α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶(glucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)。出于本发明的目的，根据de Vries(德弗里斯)，1998，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)180:243-249确定α-葡萄糖醛酸酶活性。一单位的α-葡萄糖醛酸酶等于在pH5下、在40℃下，能够每分钟释放1微摩的葡萄糖醛酸或4-O-甲基葡萄糖醛酸的酶量。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”是指一种催化末端非还原β-D-葡萄糖残基水解而释放β-D-葡萄糖的β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)。出于本发明的目的，根据Venturi(文图里)等人，2002，Extracellular beta-D-glucosidasefrom Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification andsome biochemical properties(来自嗜热毛壳菌变种嗜粪毛壳菌的细胞外β-D-葡糖苷酶：生产、纯化以及一些生化特性)，J.Basic Microbiol.(《基础微生物学杂志》)42:55-66的程序，使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物确定β-葡糖苷酶活性。将一单位的β-葡糖苷酶定义为在50mM包含0.01％20的柠檬酸钠中，在25℃下、在pH4.8下，由1mM作为底物的对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生的1.0微摩的对-硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”是指一种催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除的β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。出于本发明的目的，将一单位的β-木糖苷酶定义为在100mM包含0.01％20的柠檬酸钠中，在40℃下、在pH5下，由1mM作为底物的对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生的1.0微摩的对-硝基苯酚阴离子。
碳水化物结合结构域：术语“碳水化物结合结构域”是指介导酶结合至纤维素底物的非晶区域的酶的区域。碳水化合物结合结构域(CBD)典型地发现于酶的N末端处或C末端的端点处。
催化结构域：术语“催化结构域”是指含有酶的催化机构的酶的区域。
cDNA:术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的，从成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”是指一种催化纤维素、纤维寡糖、或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从这条链的还原端(纤维二糖水解酶I)或非还原端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖的1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)(Teeri(泰利)，1997，Crystalline cellulose degradation:New insightinto the function of cellobiohydrolases(结晶纤维素降解：纤维二糖水解酶功能的新见解)，Trends in Biotechnology(《生物技术趋势》)15:160-167；泰利等人，1998,Biochem.Soc.Trans.(《生化学会学报》)26:173-178)。根据由Lever(莱韦尔)等人，1972，Anal.Biochem.(《分析生物化学》)47:273-279；van Tilbeurgh(范泰白勒夫)等人，1982，FEBS Letters(《欧洲生化学会联合会快报》)，149:152-156；范泰白勒夫和Claeyssens(克莱伊森)，1985，《欧洲生化学会联合会快报》，187:283-288；以及Tomme(多姆)等人，1988，Eur.J.Biochem.(《欧洲生物化学杂志》)170:575-581描述的程序确定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”是指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本途径包括：如在Zhang(张)等人，Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies(纤维素酶改进展望：筛选和选择策略)，2006，Biotechnology Advances(《生物技术进展》)24:452-481中所综述，(1)测量总纤维素分解活性，以及(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)。通常使用不溶性底物测量总纤维素分解活性，这些不溶性底物包括瓦特曼№1滤纸(Whatman №1filter paper)、微晶纤维素、细菌性纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定是将瓦特曼№1滤纸用作底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(Ghose(高斯)，1987，Measurement of cellulase activities(纤维素酶活性的测量)，Pure Appl.Chem.(《纯粹与应用化学》)59:257-68)。
出于本发明的目的，通过测量在下述条件下由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS(或其他预处理的纤维素材料)中纤维素在适合的温度(例如，50℃、55℃、或60℃)持续3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型的条件是：1ml反应，洗涤的或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，由HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”是指包含纤维素的任何材料。在生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，并且第三丰富的是果胶。细胞停止生长之后产生的次生细胞壁也包含多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如具有一系列取代基的复杂分支结构的木聚糖、木葡聚糖、阿糖基木聚糖、以及甘露聚糖。虽然纤维素通常是多形的，但在植物组织中发现的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶性结晶基体。半纤维素通常与纤维素以及其他半纤维素以氢键结合，这帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常发现于例如植物的茎、叶、壳、皮、和穗轴，或树的叶、枝、和木材中。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸、和木材(包括森林残余物)(参见例如，Wiselogel(维塞劳格尔)等人，1995，在Handbook on Bioethanol(《生物乙醇手册》)(Charles E.Wyman(查尔斯E.怀曼)，编辑)，第105-118页，Taylor(泰勒)&Francis(弗朗西斯)，华盛顿；怀曼，1994，BioresourceTechnology(《生物资源技术》)50:3-16；Lynd(林德)，1990，Applied Biochemistryand Biotechnology(《应用生物化学与生物技术》)24/25:695-719；Mosier(莫西尔)等人，1999，Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics(木质纤维素生物转化的最新进展),Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology(《生化工程/生物技术进展》)，T.Scheper(斯科皮尔)，总编辑，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag(施普林格出版社)，纽约)中)。在此应该理解的是，纤维素可以处于木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素、和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。在一个优选方面中，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选方面中，该纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包括纤维素、半纤维素、以及木质素。
在一个方面中，该纤维素材料是农业残余物。在另一个方面中，该纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面中，该纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面中，该纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面中，该纤维素材料是废纸。在另一个方面中，该纤维素材料是木材(包括森林残余物)。
在另一个方面中，该纤维素材料是芦竹属植物。在另一个方面中，该纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面中，该纤维素材料是竹子。在另一个方面中，该纤维素材料是玉米芯。在另一个方面中，该纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面中，该纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面中，该纤维素材料是芒属植物。在另一个方面中，该纤维素材料是橙皮。在另一个方面中，该纤维素材料是稻秸。在另一个方面中，该纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面中，该纤维素材料是麦秸。
在另一个方面中，该纤维素材料是山杨。在另一个方面中，该纤维素材料是桉树。在另一个方面中，该纤维素材料是冷杉。在另一个方面中，该纤维素材料是松树。在另一个方面中，该纤维素材料是白杨。在另一个方面中，该纤维素材料是云杉。在另一个方面中，该纤维素材料是柳树。
在另一个方面中，该纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面中，该纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面中，该纤维素材料是棉短绒。在另一个方面中，该纤维素材料是滤纸。在另一个方面中，该纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面中，该纤维素材料是经磷酸处理过的纤维素。
在另一个方面中，该纤维素材料是一种水生生物质。如在此使用，术语“水生生物质”是指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法经受预处理，如在此所描述。在一个优选方面中，该纤维素材料是经预处理的。
编码序列：术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接明确多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放读码框确定，其以起始密码子例如ATG、GTG或TTG开始，并以终止密码子例如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列:术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。各个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是原生的(native)(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这样的控制序列包括但不局限于前导子，聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入特定限制性位点的目的，这些控制序列可以提供有接头，以促进这些控制序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”是指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，它催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖)中的β-1,4键，以及包含纤维素组分的其他植物材料的内切水解。可以通过测量底物粘度的减小，或通过还原糖测定确定还原端增加来确定内切葡聚糖酶活性(张等人，2006，《生物技术进展》24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯，1987，《纯粹与应用化学》59:257-268的程序，在pH5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括产生多肽涉及的任何步骤，包括但不局限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的控制序列相连接的线性或环状DNA分子。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”是指根据Henrissat(亨利萨塔)B.,1991，A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities(基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类)，Biochem.J.(《生物化学杂志》)280:309-316，和亨利萨塔B.,和Bairoch(巴洛赫)A.,1996，Updating the sequence-based classification ofglycosyl hydrolases(糖基水解酶的基于序列的分类的更新)，《生物化学杂志》316:695-696，落入糖苷水解酶家族61中的一种多肽。基于一个家族成员的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值，将这一家族中的酶类最初分类为一个糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用方式是非典型性的并且不能认为它们是真正的糖苷酶。然而，根据当与一种纤维素酶或纤维素酶的混合物结合时，它们能够增强木质纤维素的分解，仍将它们保留在CAZy分类中。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶”是指一种催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰(feruloyl))基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常是阿拉伯糖)上水解的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)还被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰酯酶、FAE-III、肉桂酰酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。出于本发明的目的，在50mM乙酸钠(pH5.0)中，使用0.5mM对-硝基苯基阿魏酸酯作为底物确定阿魏酸酯酶活性。一单位的阿魏酸酯酶等于在pH5下、在25℃下，能够每分钟释放1微摩的对-硝基苯酚阴离子的酶量。
片段：术语“片段”是指具有不存在于成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的一种多肽或一个催化结构域或碳水化合物结合结构域；其中该片段具有木聚糖酶活性或碳水化合物结合活性。在一个方面中，一个片段包含SEQ ID NO:2的至少320个氨基酸残基,例如至少340个氨基酸残基或至少360个氨基酸残基。
半纤维素分解酶或半纤维素酶:术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”是指一种或多种(例如，若干种)水解半纤维素材料的酶。参见例如，Shallom(沙鲁姆)，D.和Shoham(沙哈姆)，Y.Microbial hemicellulases(微生物的半纤维素酶).Current Opinion In Microbiology(《微生物学当前观点》)，2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是在植物生物量的降解中关键的组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖醛酸酶，葡萄糖醛酸(glucuronoyl)酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶，以及木糖苷酶。这些酶(半纤维素酶)的底物是一异质组的支链的以及线性的多糖，这些多糖经由氢键连接至植物细胞壁中的纤维素微丝，从而将其交联成一个强健的网络。半纤维素酶还被共价地附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。用于其完全降解，半纤维素酶的可变结构和组织需要许多酶的协同作用。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)或水解乙酸酯的酯键或阿魏酸侧基的碳水化合物酯酶(CE)。基于其一级序列的同源性，可以将这些催化模块分成GH和CE家族。一些具有总体类似的折叠的家族可以被进一步分组为按字母顺序标记的亲族(clan)(例如，GH-A)。这些酶以及其他碳水化合物活性酶的最翔实并更新的分类在碳水化合物-活性酶(CAZy)数据库中是可获得的。可以根据高斯和Bisaria(比萨拉)，1987，Pure&AppI.Chem.(《纯粹和应用化学》)59:1739-1752，在适合的温度(例如，50℃、55℃、或60℃)、和pH(例如，5.0或5.5)下测量半纤维素分解酶活性。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”是指对转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型，其具有包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”是指处于非天然发生的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)任何物质，包括但不局限于从与其性质上相关的一种或多种或所有天然发生的组分至少部分除去的任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然中发现的物质，由人手工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的一种多肽。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至22是一个信号肽的SignalP程序(Nielsen(尼尔森)等人，1997，Protein Engineering(《蛋白质工程》)10:1-6)，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸23至400(P244K1)。在本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端的氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有木聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至66编码一个信号肽的SignalP程序(尼尔森等人，1997，同上)，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸67至1435(D72Z3A)或其cDNA序列。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链或双链的核酸分子，它包含一个或多个控制序列。
可操作地连接的:术语“可操作地连接的”是指其中一个控制序列位于相对于一个多核苷酸的编码序列的适当位置处，这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的配置。
具有增强纤维素分解活性的多肽：术语“具有增强纤维素分解活性的多肽”是指催化由具有纤维素分解活性的酶水解纤维素材料的增强的GH61多肽。出于本发明的目的，通过测量在以下条件下来自由纤维素分解酶对纤维素材料的水解的还原糖的增加或纤维二糖和葡萄糖的总和的增加来确定增强纤维素分解活性：1-50mg的总蛋白/g的预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素在适合的温度(例如40℃-80℃，如50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)和适合的pH(例如，4-9，如5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续1-7天，其中总蛋白由50-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5-50％w/w具有增强纤维素分解活性的GH61多肽的蛋白组成，与不具有增强纤维素分解活性的相等的总蛋白负载的对照水解(1-50mg的纤维素分解蛋白/g的PCS中的纤维素)进行比较。在一个优选方面中，将在2-3％的总蛋白重量米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014，重组产生于米曲霉中)或2-3％的总蛋白重量烟曲霉β-葡糖苷酶(如描述于WO2002/095014中，重组产生于米曲霉中)的纤维素酶蛋白负载的存在下的1.5L(诺维信公司，巴格斯韦德丹麦)的混合物用作纤维素分解活性的来源。
具有增强纤维素分解活性的GH61多肽通过将达到相同程度的水解所需的纤维素分解酶优选地减少至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”是指来源于由加热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理的玉米秸秆的纤维素材料。
序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件套件)，Rice(赖斯)等人，2000，Trends Genet.(《遗传学趋势》)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle(尼德尔)程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔(Needle)标记为“最长一致性”的输出(使用–nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：
(一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(欧洲分子生物学开放软件套件)，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle(尼德尔)标记为“最长一致性”的输出(使用–nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列:术语“子序列”是指具有从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有木聚糖酶活性的片段。在一个方面中，子序列包含SEQ ID NO:1的至少960个核苷酸，例如至少1020个核苷酸或至少1080个核苷酸。
变体：术语“变体”是指具有木聚糖酶活性的、包含一个改变(即在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代是指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代；缺失是指占据一个位置的氨基酸的移除；并且插入是指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
包含木聚糖的材料：术语“包含木聚糖的材料”是指包含含有β-(1-4)-连接的木糖残基的主链的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物，该主链由短的碳水化合物链支化。它们包括D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，这些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖组成。可以将木聚糖类型的多糖分成同源木聚糖(homoxylan)和异源木聚糖(heteroxylan)，异源木聚糖包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯糖)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿糖基木聚糖、阿糖基木聚糖、以及复杂的异源木聚糖。参见例如，Ebringerova(艾柏林格劳威)等人，2005，Adv.Polym.Sci.(《聚合物科学进展》)186:1-67。
在本发明的工艺中，可以使用任何包含木聚糖的材料。在一个优选方面中，该包含木聚糖的材料是木质纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”是指水解包含木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本途径包括：(1)测量总的木聚糖分解活性，并且(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如，内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶的测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括Biely(别雷)和Puchard(普查德)，2006，Journal of the Science of Food andAgriculture(《食品与农业科学杂志》)86(11):1636-1647；Spanikova(斯帕尼克娃)和别雷，2006，《欧洲生化学会联合会快报》580(19):4597-4601；Herrmann(赫尔曼)，Vrsanska(娃赞斯卡)，Jurickova(朱莉科瓦)，Hirsch(赫施)，别雷，和Kubicek(库比切克)，1997，Biochemical Journal(《生物化学杂志》)321:375-381。
可以通过确定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦斯卑尔脱(oat spelt)、山毛榉木材、以及落叶松木材木聚糖)形成的还原糖或通过光度确定由不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段测量总木聚糖降解活性。最常见的总木聚糖分解活性测定基于由聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生的还原糖，如描述于别雷，别雷，Poutanen(坡泰恩)，1992，Interlaboratory testingof methods for assay of xylanase activity(用于木聚糖酶活性测定的多个实验室测试方法)，Journal of Biotechnology(《生物技术杂志》)23(3):257-270中。还可以在37℃下，用0.2％AZCL-阿糖基木聚糖作为底物在0.01％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中确定木聚糖酶活性。将一单位的木聚糖酶活性定义为在200mM磷酸钠(pH6)中，在37℃下、在pH6下，由作为底物的0.2％AZCL-阿糖基木聚糖每分钟产生1.0μ摩尔的可可碱乙酸钠。
出于本发明的目的，通过测量在以下典型条件下由一种或多种木聚糖降解酶水解桦木木聚糖(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，圣路易斯市，密苏里州，美国)的增加确定木聚糖降解活性：1ml反应，5mg/ml底物(总固体)，5mg的木聚糖分解蛋白/g的底物，50mM乙酸钠pH5，50℃，24小时，使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定进行糖分析，如由莱韦尔，1972，A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates(用于碳水化合物的比色测定的新反应)，《分析生物化学》47:273-279描述。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”是指催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内部水解的1,4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。出于本发明的目的，在37℃下，用0.2％AZCL-阿糖基木聚糖作为底物在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中确定木聚糖酶活性。将一单位的木聚糖酶活性定义为在200mM磷酸钠(pH6)中，在37℃下、在pH6下，由作为底物的0.2％AZCL-阿糖基木聚糖每分钟产生1.0μmole的可可碱乙酸钠。
本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的木聚糖酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％。
发明详细说明
具有木聚糖酶活性的多肽
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽，这些多肽具有木聚糖酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体，或由其组成；或为其具有木聚糖酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面中，该多肽包括SEQ IDNO:2的氨基酸23到400或由其组成。
在另一个实施例中，本发明涉及在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的具有木聚糖酶活性的分离多肽：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补体(Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，Molecular Cloning,A LaboratoryManual(分子克隆实验指南)，第二版，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽、其成熟多肽或其片段可以根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有木聚糖酶活性的多肽的DNA。具体地说，可以使用此类探针，遵循标准DNA印迹程序，与感兴趣细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定并分离出其中对应的基因。这样的探针可以大大短于整个序列，但是长度应该至少为15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)。本发明涵盖此类探针。
可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有木聚糖酶活性的多肽的DNA对由这类其他株系制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自这类其他株系的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、其成熟多肽编码序列或其子序列杂交的克隆或DNA，将该载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交是指，在非常低到非常高严谨度条件下，多核苷酸杂交到对应于以下的标记的核酸探针上：(i)SEQ ID NO:1；(ii)其成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补体；或(v)其一个子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
在一个方面中，该核酸探针是以下多核苷酸，该多核苷酸编码SEQ IDNO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一个方面中，该核酸探针是SEQID NO:1；其成熟多肽编码序列；或其cDNA序列。
在另一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的具有木聚糖酶活性的分离多肽。
在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如若干个)位置处包含一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个方面中，引入进SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个。这些氨基酸变化可具有一个微小的性质，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代或者插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小氨基或羧基末端扩展，例如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20至25个残基的一个小接头肽；或者通过改变净电荷或另一种功能来促进纯化的一个小扩展，例如一个多组氨酸束(tract)、一个抗原表位或者一个结合结构域。
保守取代的实例是在以下各组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath(诺伊拉特)和R.L.Hill(希尔)1979年描述于TheProteins(《蛋白质》)中，Academic Press(学术出版社)，纽约。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变本质是多肽的物理化学特性的改变。例如，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最佳值等。
可以根据本领域已知程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham(坎宁安)和Wells(威尔斯)，1989，Science(《科学》)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每一残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的木聚糖酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见Hilton(希尔顿)等人，1996，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)，271:4699-4708。酶活性位点或其他生物学相互作用也可以通过对结构进行物理学分析来进行确定，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记，与假定接触位点氨基酸的突变相结合来进行确定。参见例如de Vos(德福斯)等人，1992，Science(《科学》)255:306-312；Smith(史密斯)等人，1992，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)224:899-904；Wlodaver(沃勒达尔)等人，1992，FEBS Lett.(《欧洲生物化学学会联盟通讯》)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson(瑞德哈尔-奥尔森)和Sauer(萨奥尔)，1988，《科学》241:53-57；Bowie(鲍依)和萨奥尔，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)86:2152-2156；WO95/17413；或者WO95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman(洛曼)等人，1991，《生物化学》30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及定区诱变(Derbyshire(德比希尔)等人，1986，Gene(《基因》)46:145；Ner(内尔)等人，1988，《DNA》7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness(内斯)等人，1999，NatureBiotechnology(《自然生物技术》)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
本发明的多肽可以是一种杂合多肽，其中一个多肽的一个区域在另一个多肽的一个区域的N末端或C末端处融合。
本发明的多肽可以是一种融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一个多肽是在本发明多肽的N末端或C末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽,其中在翻译后产生融合多肽(Cooper(库珀)等人，1993，EMBO J.(《欧洲分子生物学学会杂志》)12:2575-2583；Dawson(道森)等人，1994，《科学》266:776-779)。
融合多肽可以进一步包括两个多肽之间的一个切割位点。在分泌融合蛋白时，该位点被切割，从而释放这两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于以下各项中披露的位点：Martin(马丁)等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.(《工业微生物学与生物技术杂志》)3:568-576；Svetina(斯韦蒂纳)等人，2000，J.Biotechnol.(《生物技术杂志》)76:245-251；Rasmussen(拉斯马森)-Wilson(威尔逊)等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.(《应用与环境微生物学》)63:3488-3493；Ward(华德)等人，1995，Biotechnology(《生物技术》)13:498-503；以及Contreras(孔特拉斯)等人，1991，Biotechnology(《生物技术》)9:378-381；Eaton(伊顿)等人，1986，Biochemistry(《生物化学》)25:505-512；Collins(柯林斯)-Racie(莱斯)等人，1995，Biotechnology(《生物技术》)13:982-987；Carter(卡特)等人，1989，Proteins:Structure,Function,and Genetics(《蛋白质:结构、功能和遗传学》)6:240-248；以及Stevens(史蒂文斯)，2003，Drug Discovery World(《世界药物发现》)4:35-48。
具有木聚糖酶活性的多肽的来源
本发明的具有木聚糖酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。为了本发明的目标，结合给定来源，如在此使用，术语“获得自”应指由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的株系产生的多核苷酸编码的多肽。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
在一个方面中,该多肽是一种青霉属多肽。在一个方面中,该多肽是一种胶囊青霉多肽。在一个方面中,该多肽是一种胶囊青霉IBT4903多肽。
将理解的是，对于上述种类而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态两者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而忽略它们为人所知的种类名称。本领域普通技术人员将容易地识别鉴定适当等效物。
公众可在许多培养物保藏中心易于获得这些种类的菌株，如美国种质保存中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)及美国农业研究局专利菌种保藏中心，北方地区研究中心(NRRL)。
该多肽可以从其他来源鉴别并获得，这些其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或者使用上述探针直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品。用于直接地从天然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中众所周知的。然后，可通过类似地对另一种微生物的基因组DNA或cDNA库，或混合的DNA样品进行筛选来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码一个多肽的一种多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见，例如萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
催化结构域
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸23到342具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的催化结构域。在一个方面中，这些催化结构域包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸23到342具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该催化结构域优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸23到342或其等位变体或由其组成；或为其具有增强纤维素分解活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下(如上所定义)与SEQ ID NO:1的核苷酸67到1261；其cDNA序列；或其全长互补体杂交的多核苷酸编码的催化结构域(萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的催化结构域，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸67到1261或其cDNA序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
编码该催化结构域的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:1的核苷酸67到1261或其cDNA序列或由其组成，或为包含在胶囊青霉IBT4903中的序列。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸23到342的催化结构域变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含一个取代、缺失和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:2的氨基酸23到342的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
结合结构域
在一个实施例中，本发明还涉及与SEQ ID NO:2的氨基酸366到400具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的碳水化物结合结构域。在一个方面中，这些碳水化物结合结构域包括的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸366到400具有多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)氨基酸的差异。
该碳水化合物结合结构域优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸366到400或其等位变体或由其组成；或为其具有碳水化合物结合活性的片段。
在另一个实施例中，本发明还涉及在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下(如上所定义)与SEQ ID NO:1的1331到1435或其全长互补体杂交的多核苷酸编码的碳水化物结合结构域(萨拉布鲁克等人，1989，同上)。
在另一个实施例中，本发明还涉及由以下多核苷酸编码的碳水化物结合结构域，这些多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1331到1435具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
编码该碳水化物结合结构域的多核苷酸优选地包括SEQ ID NO:1的核苷酸1331到1435或由其组成，或为包含在胶囊青霉IBT4903中的序列。
在另一个实施例中，本发明还涉及SEQ ID NO:2的氨基酸366到400的碳水化物结合结构域变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含一个取代、缺失和/或插入。在一个方面中，引入SEQ ID NO:2的氨基酸366到400的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、8个、9个、或10个。
可操作地连接到该碳水化合物结合结构域的催化结构域可以来自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。编码催化结构域的多核苷酸可以从任何原核、真核或其他来源获得。
多核苷酸
本发明还涉及编码如在此描述的本发明的多肽、催化结构域、以及碳水化合物结合结构域的分离的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以是有效的，例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选，以检测具有共享的结构特征的克隆DNA片段。参见例如Innis(英尼斯)等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application(PCR：方法和应用指导)，Academic Press(学术出版社)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自青霉属株系或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位变体或物种的变体。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽在一些工程化方式方面可以不同于从其天然来源分离的多肽，例如具体活性、热稳定性、最佳pH、等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列呈现的多核苷酸，通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford(福特)等人，1991，Protein Expression and Purification(《蛋白表达与纯化》)2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接到一个或多个(例如，若干个)控制序列的本发明的多核苷酸，这个或这些控制序列指导该编码序列在与这些控制序列可相容的条件下在适合宿主细胞中进行表达。
该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。在插入载体之前对多核苷酸操作的适当性或必需性取决于表达载体。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短的及杂合启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏芸金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse(阿盖斯)和Lereclus(里瑞克拉斯)，1994，Molecular Microbiology(《分子微生物学》)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon(埃贡)等人，1988，Gene(《基因》)69:301-315)，天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(Villa(维拉)-Kamaroff(卡玛诺夫)等人，1978，《美国国家科学院院刊》75:3727-3731)，连同tac启动子(DeBoer(德波尔)等人，1983，《美国国家科学院院刊》80:21-25)。另外的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用蛋白)”，Gilbert(吉尔伯特)等人，1980，Scientific American(《科学美国人》)，242:74-94；以及萨姆布鲁克等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶–样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变的、截短的、和杂交的启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，Yeast(《酵母》)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
该控制序列还可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子获得自克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延伸因子。
酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3磷酸去氢酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定区，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue(化)等人，1995，Journalof Bacteriology(《细菌学杂志》)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导子，即一种对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'末端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
酵母宿主细胞的合适的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO1)、酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
Guo(郭)和Sherman(谢尔曼)，1995，Mol.Cellular Biol.(《分子与细胞生物学杂志》)15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列。
控制序列也可以是编码与多肽的N端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可包含在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。该编码序列不天然地包含一个信号肽编码序列时，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，指导所表达的多肽进入宿主细胞的分泌通路中的任何信号肽编码序列都可以使用。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen(西蒙纳)和Palva(帕尔瓦)，1993，Microbiological Reviews(《微生物学评论》)57:109-137描述了另外的信号肽。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列是紧跟在多肽的N末端之后定位，并且该信号肽序列是紧跟在该前肽序列的N末端之后定位。
还可以希望添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调控多肽的表达。调控序列的实例是使得基因表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而打开或关闭的那些。在原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例为允许基因扩增的那些调控序列。在真核系统中，这些调控序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一种重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(例如，若干个)便利的限制性位点以允许在这些位点处进行编码该多肽的多核苷酸的插入或取代。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入供表达的适当载体中来进行表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
载体优选地包含一个或多个(例如，若干个)允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供针对杀生物剂或病毒的抗性、提供针对重金属的抗性、为营养缺陷型提供原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括，但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不局限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖-氨基咪唑合成酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。
选择性标记可以是在W02010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地包含允许该载体整合到宿主细胞的基因组或允许该载体在细胞中独立于基因组而自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应该包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。
对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞内使用的复制起点的实例是2微米的复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems(格姆斯)等人，1991，Gene(《基因》)98:61-67；Cullen(卡伦)等人，1987，《核酸研究》15:9163-9175；WO00/24883)。根据WO00/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个额外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个可扩增的选择性标记基因与该多核苷酸可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含扩增的选择性标记基因拷贝和由此额外的多核苷酸拷贝的细胞。
用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员来说是熟知的(参见，例如Sambrook(萨拉布鲁克)等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包括可操作地连接到一个或多个(例如，若干个)控制序列的本发明的多核苷酸，这个或这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是在重组产生本发明的多肽中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不局限于似马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰链丝菌、以及变铅青链霉菌细胞。
通过原生质体转化(参见例如，Chang(常)和Cohen(科恩)，1979，Mol.Gen.Genet.(《分子遗传学与基因组》)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，Young(杨格)和Spizizen(斯皮兹曾)，1961，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)81:823-829；或者Dubnau(杜博楠)和Davidoff-Abelson(大卫多夫-阿贝尔森)，1971，《分子生物学杂志》56:209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa(茂川)和Dower(道尔)，1988，Biotechniques(《生物技术》)6:742-751)、或者轭合(参见，例如Koehler(凯勒)和Thorne(索恩)，1987，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)169:5271-5278)可以实现将DNA引入到芽孢杆菌细胞之中。通过原生质体转化(参见例如，Hanahan(哈那汗)，1983,J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower(道尔)等人，1988，《核酸研究》16:6127-6145)可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。通过原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong(宫)等人，2004，Folia Microbiol.(《微生物学报》)(Praha(布拉格))49:399-405)、轭合(参见，例如，Mazodier(马佐迪耶)等人，1989，《细菌学杂志》171:3583-3585)、或转导(参见，例如，Burke(布尔克)等人，2001，《美国国家科学院院刊》98:6289-6294)可以实现将DNA引入到链霉菌细胞中。通过电穿孔(参见例如，Choi(崔)等人，2006,J.Microbiol.Methods(微生物学方法杂志)64:391-397)或轭合(参见例如，Pinedo(皮内多)和Smets(斯梅茨)，2005，Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌细胞中。通过天然感受态(参见例如，Perry(佩里)和Kuramitsu(仓光)，1981，Infect.Immun.(《感染与免疫》)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt(卡特)和Jollick(朱力克)，1991，Microbios(《微生物》)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley(巴克利)等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.(《应用与环境微生物学》)65:3800-3804)、或者轭合(参见，例如，Clewell(克拉维尔)，1981，Microbiol.Rev.(《微生物学评论》)45:409-436)可以实现将DNA引入到链球菌细胞中。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到宿主细胞中。
该宿主细胞还可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
该宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目)、产担子酵母，以及属于半知菌(芽生菌)的酵母。由于酵母的分类未来可能改变，故出于本发明的目的，酵母应当如Biology andActivities of Yeast(《酵母生物学与活性》)(Skinner(斯金纳)，Passmore(帕斯莫)及Davenport(达文波特)编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium(《应用细菌学学会》)，第9辑，1980)中所描述进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞，例如乳酸克鲁维酵母、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁费酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母、或亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的细分真菌门和卵菌门(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人，1995，同上所定义)。丝状真菌的特征一般在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长来进行的并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而进行的，并且碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球酵母属、Filibasidium、镰刀菌属、腐质霉属、大毁壳属、毛霉菌属、蚀丝霉属、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳菌属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及以本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉和木霉宿主细胞的合适程序描述于EP238023，Yelton(约尔顿)等人，1984，《美国国家科学院院刊》81:1470-1474,以及Christensen(克里斯滕森)等人，1988，Bio/Technology(《生物/技术》)6:1419-1422中。Malardier(马拉迪耶)等人，1989，Gene(《基因》)78:147-156和WO96/00787描述了用于转化镰刀菌物种的合适方法。可以使用Becker(贝克尔)和Guarente(瓜伦特)在Abelson,J.N.(阿贝尔森)和Simon,M.I.(西蒙)编辑，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology(对酵母遗传学和分子生物学的指导)，Methods inEnzymology(《酶学方法》)，第194卷，pp182-187，Academic Press,Inc.(学院出版社有限公司)，纽约；Ito(伊藤)等人，1983，J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)153:163；以及Hinnen(希南)等人，1978，《美国国家科学院院刊》75:1920中描述的程序来转化酵母。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一个方面中,该细胞是一个青霉属细胞。在一个方面中,该细胞是一个胶囊青霉细胞。在另一个方面中,该细胞是一个胶囊青霉IBT4903细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。
这些细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中于适合的培养基中并且在允许该多肽表达和/或分离的条件下进行的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养这些细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合的营养培养基中发生的，该培养基包括碳源和氮源及无机盐。适合的培养基从商业供应商处可获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面中，回收包括本发明的多肽的全发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽，以获得大致上纯的多肽，这些程序包括，但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如Protein Purification(《蛋白纯化》)，Janson(詹森)和Ryden(赖登)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，该多肽未被回收，而是使用表达该多肽的本发明的宿主细胞作为该多肽来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，该分离的植物、植物部分或植物细胞包含本发明的多核苷酸，以用来按可回收的量表达并且产生多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或植物部分回收。可替代地，可以像这样使用含有多肽或结构域的植物或植物部分，以改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值，适口性和流变性质，或破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，例如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草例如剪股颖属(Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草，豆类，例如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花的植物(十字花科)、例如花椰菜、油菜籽，以及紧密相关的模式生物拟南芥。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎连同包含这些部分的单个组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样，植物部分，例如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
还包括在本发明的范围内的是这类植物、植物部分、和植物细胞的后代。
可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建该植物或植物细胞。
该表达构建体便利地为一种核酸构建体，该核酸构建体包含了对与在选择的植物或植物部分中表达多核苷酸所需的适当调控序列可操作地连接的一种多肽或结构域进行编码的多核苷酸。此外，该表达构建体可以包括一种适用于对已经整合入该表达构建体的植物细胞进行鉴别的选择性标记，及将该构建体引入所讨论的植物中必需的DNA序列(后者取决于待使用的DNA引入方法)。
调控序列(如启动子和终止子序列及可任选的信号或转运序列)的选择例如基于何时、在何处并且如何表达所希望的多肽或结构域来决定。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成性的或可诱导的，或可以为发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，例如种子或叶。例如，由Tague(塔格)等人，1988，Plant Physiology(《植物生理学》)86:506描述的调控序列。
对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉蜀黍泛素1、或水稻肌动蛋白1启动子(Franck(弗兰克)等人，1980，Cell(《细胞》)21:285-294；Christensen(克里斯滕森)等人，1992，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)18:675-689；Zhang(张)等人，1991,Plant Cell(《植物细胞》)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990,Ann.Rev.Genet.(《遗传学年鉴》)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994,Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白，或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998，Plant Cell Physiol.(《植物与细胞生理学》)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998，J.Plant Physiol.(《植物生理学杂志》)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998，Plant Cell Physiol.(《植物与细胞生理学》)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka(京冢)等人，1993，Plant Physiol.(《植物生理学》))，102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra(密特拉)和Higgins(希金斯)，1994，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)26:85-93)，来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya(加贺)等人，1995，Mol.Gen.Genet.(《分子和普通遗传学》)248:668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu(徐)等人，1993，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)22:573-588)。同样，启动子可通过非生物处理，例如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加激活启动子的物质，例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脱落酸、和赤霉酸、以及重金属来诱导。
还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如，启动于增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。例如Xu(徐)等人，1993，同上，披露了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser(加塞尔)等人，1990,Science(《科学》)244:1293；Potrykus(波特里库斯)，1990,Bio/Technology(《生物/技术》)8:535；Shimamoto(岛本)等人，1989，Nature(《自然》)338:274)。
根癌土壤杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(有关评述，参看霍伊卡(Hooykas)和斯查珀特(Schilperoort)，1992，《植物分子生物学》19:15-38)和用于转化单子叶植物的方法，尽管其他转化方法也可以用于这些植物。一种用于产生转基因单子叶植物的方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包衣的微观金或钨颗粒)(Christou(克里斯托)，1992,Plant J.(《植物杂志》)2:275-281；Shimamoto(岛本)，1994，Curr.Opin.Biotechnol.(《生物技术新见》)5:158-162；Vasil(瓦西尔)等人，1992，Bio/Technology(《生物/技术》)10:667-674)。如Omirulleh(奥米如列)等人，1993，Plant Molecular Biology(《植物分子生物学》)21:415-428中所述，单子叶植物转化的替代方法基于原生质体转化。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
在转化之后，根据本领域中熟知的方法对并入了该表达构建体的转化株进行选择并且使其再生成为完整植物。通常转化程序被设计成通过使用例如用两种分开的T-DNA构建体共转化或通过特异性重组酶进行的选择基因的位点特异性切除，在再生期间或在后代中选择性清除选择基因。
除了用本发明的构建体直接转化具体的植物基因型之外，可以通过将具有构建体的植物与缺乏构建体的第二植物杂交来制成转基因植物。例如，可以通过杂交将编码多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
可以通过回交转换过程产生植物。例如，植物包括被称为回交转换的基因型、系、近交、或杂交的植物。
遗传标记可以用于协助将本发明的一种或多种转基因从一种遗传背景渗入到另一种遗传背景中。相对于常规育种，标记辅助选择提供了很多优点，它可以用于避免由表型变异引起的错误。此外，遗传标记可以提供在一次特定杂交的个体子代中优异种质的相对程度的数据。例如，当具有希望的性状(否则会具有非农艺学上希望的遗传背景)的植物与精英亲本杂交时，遗传标记可以用于选择不仅拥有感兴趣的性状、而且还具有较大比例的希望的种质的后代。以此方式，将一个或多个性状渗入特定的遗传背景所需的世代数被最小化。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养一个转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且可任选地(b)回收该多肽或结构域。
木聚糖酶活性的消除或降低
本发明还涉及产生亲本细胞的突变体的方法，该方法包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，这导致突变体细胞比在相同条件下培养的亲本细胞产生的多肽少。
可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该多核苷酸的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选方面中，将该多核苷酸失活。例如，待修饰或失活的多核苷酸可以是活性必需的编码区或其部分，或编码区的表达所需的调控元件。这种调控或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活因子。
该多核苷酸的修饰或失活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。所述诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适宜的物理或化学诱变剂、通过使用适宜的寡核苷酸、或通过对DNA序列PCR产生诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，邻甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，诱变一般是在适宜条件下在所选的诱变处理试剂的存在下通过保温用于诱变的亲本细胞并稀选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。
该多核苷酸的修饰或失活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调控元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或消除核苷酸从而形成終止密码子的引入、起始密码子的消除、或开放读码框的改变。这些修饰或失活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管大体上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。
便利的消除或降低多核苷酸的表达的方法的实例是基于基因替换、基因缺失、或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷的核酸序列替换内源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标记。在一个方面中，用例如在此描述的那些选择性标记来破坏该多核苷酸。
本发明还涉及抑制具有木聚糖酶活性的多肽在细胞中的表达的方法，这些方法包括向该细胞给予或在其中表达一种双链RNA(dsRNA)分子，其中该dsRNA包括本发明的多核苷酸的一个子序列。在一个优选方面中，该dsRNA长约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个双核苷酸。
该dsRNA优选是一个小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一个优选方面中，该dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选方面中，该dsRNA是用于抑制翻译的微小RNA。
本发明还涉及此类双链RNA(dsRNA)分子，包括用于抑制该多肽在细胞中的表达的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsRNA可以进入一个细胞并且导致相似的或相同的序列的单链RNA(ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当细胞被暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地被一种叫做RNA干扰(RNAi)的过程所降解。
本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面中，本发明提供了使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面中，可以使用这些dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用选择性降解RNA的dsRNA分子的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；以及6,515,109。
本发明进一步涉及在编码该多肽的多核苷酸或其控制序列或编码该多肽的沉默基因中包含破坏或缺失的亲本细胞的突变体细胞，这导致与亲本细胞相比，该突变体细胞产生的多肽少或不产生多肽。
这些多肽缺陷的突变体细胞作为用于天然和异源多肽的表达的宿主细胞尤其有用。因此，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养该突变体细胞；并且(b)回收该多肽。术语“异源多肽”是指对该宿主细胞来说不是天然的多肽，例如天然蛋白质的变体。该宿主细胞可以包括多于一个拷贝的编码该天然或异源多肽的多核苷酸。
可使用本领域已知的方法进行培养和目的产物的纯化。
本发明用于生产基本上不含木聚糖酶的产物的方法在真核多肽的生产中特别有利，尤其是真菌蛋白质，例如酶。木聚糖酶缺陷的细胞还可用于表达药学感兴趣的异源蛋白，例如激素、生长因子、受体等。术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，还包括经过氨基酸替代、缺失或添加的修饰或用以增强活性、热稳定性、pH耐受性等的其他此类修饰的多肽，例如酶。
在另一个方面中，本发明涉及通过本发明的方法生产的基本上不含木聚糖酶活性的蛋白产物。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包括本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包括用于发酵过程的另外的成分，例如像细胞(包括，含有用来产生感兴趣的多肽的编码本发明的多肽的基因的宿主细胞)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是包含一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片、以及培养基的细胞被杀死的全发酵液。
如在此使用，术语“发酵液”是指一种由不经历或最少经历回收和/或纯化的细胞发酵产生的制剂。例如，当微生物培养株在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞的酶表达)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳受限的条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括在例如通过离心除去微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)后存在的耗尽的培养基和细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含耗尽的细胞培养基、胞外酶、以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐、或两种或更多种前述酸的混合物并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐、或两种或更多种前述酸的混合物。
在一个方面中，该组合物包含一种或多种有机酸并且可任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，将杀死的细胞和/或细胞碎片从细胞被杀死的全发酵液中除去以提供一种没有这些组分的组合物。
该发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括一种防腐剂和/或抗微生物剂(例如，抑菌剂)，包括但不限于，山梨糖醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他防腐剂和/或抗微生物剂。
该发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括多种酶活性，例如选自下组的一种或多种(如，若干种)酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、具有增强纤维素分解活性的GH61多肽、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素(swollenin)。该发酵液配制品或细胞组合物还可以包括一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
细胞被杀死的全发酵液或组合物可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，细胞被杀死的全发酵液或组合物包含在允许蛋白质合成(例如，纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶的表达)的碳受限的条件下孵育微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长到饱和后存在的耗尽的培养基和细胞碎片。在一些实施例中，细胞被杀死的全发酵液或组合物包含耗尽的细胞培养基、胞外酶、以及被杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，存在于细胞被杀死的全发酵液或组合物中的微生物细胞可以使用本领域已知的方法进行透化和/或裂解。
如在此描述的全发酵液或细胞组合物典型地是一种液体，但是可以包含不溶性组分，例如被杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分，以提供一种澄清的液体组合物。
可以通过描述于WO90/15861或WO2010/096673中的方法生产本发明的全发酵液配制品和细胞组合物。
下面给出了本发明的组合物的优选用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
酶组合物
本发明还涉及包括本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这样的一种多肽。术语“富含”指示该组合物的木聚糖酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。
这些组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，例如选自下组的一种或多种(如，若干种)酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、具有增强纤维素分解活性的GH61多肽、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。这些组合物还可以包括一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
下面给出了本发明的组合物的优选用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
用途
本发明还针对用于使用具有木聚糖酶活性的多肽或其组合物的以下工艺。
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料或包含木聚糖的材料的方法，这些方法包括：在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料或包含木聚糖的材料。在一个方面中，这些方法进一步包括回收降解的或转化的纤维素材料或包含木聚糖的材料。可以使用本领域中已知的方法将纤维素材料或包含木聚糖的材料的降解或转化的可溶性产物与不溶性纤维素材料或包含木聚糖的材料分开，这些方法是例如像离心、过滤、或重力沉降。
本发明还涉及生产发酵产物的方法，这些方法包括：(a)在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物糖化纤维素材料或包含木聚糖的材料；(b)用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料或包含木聚糖的材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。
本发明还涉及发酵一种纤维素材料或包含木聚糖的材料的方法，这些方法包括：用一种或多种(例如，若干种)发酵微生物发酵该纤维素材料或包含木聚糖的材料，其中该纤维素材料或包含木聚糖的材料在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下被一种酶组合物糖化。在一个方面中，发酵该纤维素材料或包含木聚糖的材料生产一种发酵产物。在另一个方面中，这些方法进一步包括从发酵中回收该发酵产物。
可以使用本发明的工艺将纤维素材料或包含木聚糖的材料糖化为可发酵糖并且将这些可发酵糖转化为许多有用的发酵产物，例如燃料、可饮用的乙醇、和/或平台化学制剂(例如，酸、醇、酮、气体等)。由纤维素材料或包含木聚糖的材料生产所希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、以及发酵。
可以使用本领域常规的方法完成对根据本发明的纤维素材料或包含木聚糖的材料的处理。此外，可以使用被配置为根据本发明进行操作的任何常规的生物质处理装置进行本发明的工艺。
分开的或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于：分开的水解和发酵(SHF)；同时的糖化和发酵(SSF)；同时的糖化和共发酵(SSCF)；混合的水解和发酵(HHF)；分开的水解和共发酵(SHCF)；混合的水解和共发酵(HHCF)；以及直接的微生物转变(DMC)，有时也被叫做整合生物加工(CBP)。SHF使用分开的处理步骤，以首先将纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，将纤维素材料的酶水解和糖向乙醇的发酵合并在一个步骤中(Philippidis(菲利皮迪斯)，G.P.,1996，Cellulose bioconversion technology(纤维素生物转化技术)，在Handbook on Bioethanol:Production and Utilization(《生物乙醇：生产与利用手册》)中，Wyman(怀曼)，C.E.，编辑，Taylor(泰勒)&Francis(弗朗西斯)，华盛顿特区，179-212)。SSCF涉及多种糖的共发酵(Sheehan(希恩)，J.,和Himmel(希默尔)，M.,1999，Enzymes,energy and theenvironment:A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s researchand development activities for bioethanol(酶，能源与环境：美国能源部的生物乙醇的研究和开发活动的战略视角)，Biotechnol.Prog.(《生物技术进展》)15:817-827)。HHF涉及分开的水解步骤并且另外涉及可以在同一反应器中进行的同时的糖化和水解步骤。在HHF工艺中的步骤可以在不同温度下进行，即高温酶促糖化，随后是在发酵菌株可以忍受的较低温度下的SSF。DMC在一个或多个(例如，若干个)步骤中合并了所有的三个工艺(酶生产、水解、和发酵)，其中使用相同的生物生产用于将纤维素材料转化为可发酵糖的酶并且用于将可发酵糖转化为终产物的酶(Lynd(林德)等人，2002，Microbial celluloseutilization:Fundamentals and biotechnology(微生物纤维素利用：基本原理和生物技术),Microbiol.Mol.Biol.Reviews(《微生物学与分子生物学评论》)66:506-577)。在此应该理解的是，可以在本发明的工艺的实践中使用本领域已知的包括预处理、酶水解(糖化)、发酵或其组合的任何方法。
常规的装置可以包括一个补料分批搅拌反应器、一个批式搅拌反应器、一个具有超滤作用的连续流搅拌反应器、和/或一个连续活塞流柱式反应器(continuous plug-flow column reactor)(Fernanda de Castilhos Corazza(费尔南达德卡斯特胡斯克拉兹)，Flávio Faria de Moraes(弗拉维奥法利亚德莫赖斯)，Gisella Maria Zanin(格塞尔拉玛丽亚扎宁)和Ivo Neitzel(伊沃奈特赛尔)，2003，Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis(用于纤维二塘水解的补料分批反应器的优化控制)，Acta Scientiarum.Technology(《技术学报》)25:33-38；Gusakov(古萨考瓦)，A.V.,，和Sinitsyn(斯尼特森)，A.P.，1985，Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1.Amathematical model for a batch reactor process(纤维素的酶水解动力学：1.用于批式反应器过程的数学模型)，Enz.Microb.Technol.(《酶学与微生物学技术》)7:346-352)、一个碾磨反应器(Ryu(刘)和Lee(李)，1983，Bioconversionof waste cellulose by using an attrition bioreactor(通过使用碾磨生物反应器的废料纤维素的生物转化)，Biotechnol.Bioeng.(《生物技术与生物工程》)25:53-65)、或一个具有由电磁场诱导的强烈搅拌作用的反应器(Gusakov(古萨考瓦)等人，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a noveltype of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field(使用具有由电磁场诱导的强烈搅拌作用的新型生物反应器增强酶纤维素水解)，Appl.Biochem.Biotechnol.(《应用生物化学与生物技术》)56:141-153)。另外的反应器类型包括流化床，升流包覆层(blanket)，固定化、以及用于水解和/或发酵的挤出机类型的反应器。
预处理。在实践本发明的工艺中，可以使用本领域中已知的任何预处理工艺来破坏纤维素材料或包含木聚糖的材料的植物细胞壁组分(Chandra(钱德拉)等人，2007，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.(《生化工程/生物技术进展》)108:67-93；Galbe(盖尔贝)和Zacchi(赛琪)，2007，Pretreatment oflignocellulosic materials for efficient bioethanol production(用于有效的生物乙醇生产的木质纤维素材料的预处理)，《生化工程/生物技术进展》108:41-65；Hendriks(亨德里克斯)和Zeeman(塞曼)，2009，Pretreatments to enhance thedigestibility of lignocellulosic biomass(预处理以增强木质纤维素生物质的可消化性)，Bioresource Technol.(《生物资源技术》)100:10-18；Mosier(马塞尔)等人，2005，Features of promising technologies for pretreatment oflignocellulosic biomass(用于木质纤维素生物质的预处理的有前景的技术的特征)，《生物资源技术》96:673-686；Taherzadeh(泰和拉德)和Karimi(卡里米)，2008，Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol andbiogas production:A review(木质纤维废弃物的预处理以提高乙醇和沼气产量：评论)，Int.J.of Mol.Sci.(《分子科学国际杂志》)9:1621-1651；Yang(杨)和怀曼，2008，Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol(预处理：开放低成本纤维素乙醇的钥匙)，Biofuels Bioproducts andBiorefining-Biofpr.(《生物燃料，生物产品和生物精制Biofpr.》)2:26-40)。
在使用本领域中已知的方法预处理之前，纤维素材料或包含木聚糖的材料还可以经受粒度缩减、筛分、预浸泡、湿润、洗涤、和/或调节。
常规的预处理包括，但不限于：蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿法氧化、湿法爆炸(wetexplosion)、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声波、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子液体、以及γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料或包含木聚糖的材料进行预处理。预处理优选地是在水解之前进行。可替代地，预处理可以与酶水解同时进行，以释放可发酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在大部分情况下，预处理步骤本身造成一些生物质向可发酵糖的转化(甚至在没有酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，将纤维素材料或包含木聚糖的材料加热以破坏植物细胞壁组分(包括木质素、半纤维素、以及纤维素)，以使得纤维素以及其他部分(例如半纤维素)可接触到酶。使纤维素材料或包含木聚糖的材料到达或通过一个反应锅，在该反应锅中注入蒸汽以将温度增加至所需的温度和压力并且将纤维素材料或包含木聚糖的材料保留在其中，持续所希望的反应时间。蒸汽预处理优选在140℃-250℃(例如，160℃-200℃或170℃-190℃)下进行，其中最适温度范围取决于添加的化学催化剂。蒸汽预处理的停留时间优选是1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4-10分钟，其中最适停留时间取决于温度范围和添加的化学催化剂。蒸汽预处理允许相对高的固体负载，这样使得在预处理过程中纤维素材料或包含木聚糖的材料通常仅仅是潮湿的。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料(explosive discharge)合并，这被称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和材料的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff(迪福)和Murray(默里)，1996，《生物资源技术》855:1-33；盖尔贝和赛琪，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物学与生物技术》)59:618-628；美国专利申请号20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基团被裂解，并且所得酸自催化半纤维素部分水解为单糖和低聚糖。仅在有限的程度上除去木质素。
化学预处理：术语“化学处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学预处理。这样的一种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿法氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子液体、以及有机溶剂预处理。
经常在蒸汽预处理之前添加一种催化剂(例如H2SO4或SO2)(典型地是0.3至5％w/w)，该催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改进酶水解(Ballesteros(巴列斯特罗斯)等人，2006，《应用生物化学与生物技术》129-132:496-508；Varga(瓦尔加)等人，2004，《应用生物化学与生物技术》113-116:509-523；Sassner(塞斯尼尔)等人，2006，Enzyme Microb.Technol.(《酶与微生物技术》)39:756-762)。在稀酸预处理中，将该纤维素材料或包含木聚糖的材料与稀酸(典型地是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至所希望的温度，并且在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流式反应器、或连续逆流式收缩床反应器(迪福和默里，1996，同上；Schell(谢尔)等人，2004，《生物资源技术》91:179-188；Lee(李)等人，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.(《生化工程与生物技术进展》)65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的若干预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于：氢氧化钠、石灰、湿法氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙在85℃-150℃的温度下进行石灰预处理，并且停留时间从1小时到若干天(怀曼等人，2005，《生物资源技术》96:1959-1966；马塞尔等人，2005，《生物资源技术》96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900、以及WO2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是一种热预处理，典型地在180℃-220℃进行5-15分钟，同时添加氧化剂(例如过氧化氢或过压氧)(Schmidt(施密特)和Thomsen(汤姆森)，1998，《生物资源技术》64:139-151；Palonen(帕隆恩)等人，2004，《应用生物化学与生物技术》117:1-17；瓦尔加等人，2004，《生物技术与生物工程》88:567-574；Martin(马丁)等人，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.(《化学技术与生物技术杂志》)81:1669-1677)。预处理优选地在1％-40％干物质，例如2％-30％干物质或5％-20％干物质下进行，并且经常通过添加碱(例如碳酸钠)来增加初始pH。
湿法氧化预处理方法的修改，被称为湿法爆炸(湿法氧化和蒸汽爆炸的组合)能够处理高达30％的干物质。在湿法爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度(例如90℃-150℃)和高压(例如17-20bar)下，用液体或气体氨处理该纤维素材料或包含木聚糖的材料5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli(高拉帕里)等人，2002，《应用生物化学与生物技术》98:23-35；Chundawat(卡达瓦特)等人，2007，《生物技术与生物工程》96:219-231；Alizadeh(Alizadeh)等人，2005，《应用生物化学与生物技术》121:1133-1141；Teymouri(泰木里)等人，2005，《生物资源技术》96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木素-碳水化合物复合物被裂解。
有机溶剂预处理通过用水性乙醇(40％-60％乙醇)在160℃-200℃萃取30-60分钟而将该纤维素材料或包含木聚糖的材料去木质素化(Pan(帕恩)等人，2005，《生物技术与生物工程》90:473-481；帕恩等人，2006，《生物技术与生物工程》94:851-861；Kurabi(卡拉比)等人，2005，《应用生物化学与生物技术》121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，除去大部分半纤维素和木质素。
适合的预处理方法的其他实例由谢尔等人，2003，《应用生物化学与生物技术》A105-108:69-85，和马塞尔等人，2005，《生物资源技术》96:673-686，以及美国专利申请2002/0164730进行描述。
在一个方面中，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸典型地是硫酸，但是也可以使用其他酸，例如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理优选在1-5(例如，，1-4或1-2.5)的pH范围内进行。在一个方面中，酸浓度优选在从0.01至10wt％酸，例如0.05至5wt％酸或0.1至2wt％酸的范围内。酸与该纤维素材料或包含木聚糖的材料接触并且优选在140℃-200℃，例如165℃-190℃的温度范围内保持从1到60分钟范围内的时间。
在另一个方面中，预处理以水性浆料形式发生。在优选方面中，在预处理过程中，该纤维素材料或包含木聚糖的材料优选以10-80wt％之间，例如20-70wt％或30-60wt％(如大约40wt％)的量存在。预处理的纤维素材料或包含木聚糖的材料可以不被洗涤或可以使用本领域中已知的任何方法进行洗涤，例如用水洗涤。
机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒的大小缩减的任何预处理。例如，此类预处理可以涉及不同类型的研磨(grinding)或碾磨(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
该纤维素材料或包含木聚糖的材料可以物理地(机械地)且化学地进行预处理。机械预处理或物理预处理可以与汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)、或其组合相结合。在一个方面中，高压是指优选在约100至约400psi，例如约150至约250psi范围内的压力。在另一个方面中，高温是指在约100℃至约300℃，例如约140℃至约200℃范围内的温度。在一个优选方面中，机械预处理或物理预处理在使用如上所定义的高压和高温的蒸汽枪水解器系统的分批过程中进行，例如可购自顺智公司(Sunds Defibrator AB)，瑞典的Sunds水解器。根据需要，可以顺序或同时进行物理预处理和化学预处理。
因此，在一个优选方面中，使该纤维素材料或包含木聚糖的材料经受物理(机械)或化学预处理或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从该纤维素材料或包含木聚糖的材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见例如，Hsu(舒)，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass(生物质的预处理)，在生物乙醇：生产与利用手册中，怀曼，C.E.,编辑，泰勒&弗朗西斯，华盛顿特区，179-212；Ghosh(高希)和Singh(辛格)，1993,Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass(用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学和生物处理)，Adv.Appl.Microbiol.(《应用微生物学进展》)39:295-333；McMillan(麦克米伦)，J.D.,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:a review(预处理木质纤维素生物质：评论)，在Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production(用于燃料生产的生物质的酶转化)中，Himmel(西默尔)，M.E.,Baker(贝克)，J.O.，和Overend(欧沃尼)，R.P.，编辑，ACS Symposium Series(研讨会丛刊)566，美国化学学会，华盛顿特区，第15章；Gong(宫)，C.S.,Cao(曹)，N.J.,Du(杜)，J.，和Tsao(查奥)，G.T.,1999,Ethanol production from renewableresources(从可再生资源生产乙醇)，在Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology(《生化工程/生物技术进展》)中，Scheper(斯卡皮尔)，T.，编辑，Springer-Verlag(施普林格出版社)柏林海德堡，德国，65:207-241；Olsson(奥尔森)和Hahn-Hagerdal(哈恩-海格达尔)，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production(用于乙醇生产的木质纤维素水解产物的发酵)，Enz.Microb.Tech.(《酶与微生物技术》)18:312-331；以及Vallander(瓦兰德)和Eriksson(埃里克森)，1990，Productionof ethanol from lignocellulosic materials:State of the art(从木质纤维素材料生产乙醇：最先进的技术)，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.(《生化工程/生物技术进展》)42:63-95)。
糖化。在水解(也被称作糖化)步骤中，将例如预处理的纤维素材料或包含木聚糖的材料水解以将纤维素和/或半纤维素分解成可发酵糖，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性低聚糖。水解由如在此描述的一种酶组合物在本发明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下酶促地进行。这些组合物的酶组分可以同时地或顺序地添加。
酶水解优选在易于由本领域的普通技术人员确定的条件下，在适合的水性环境中进行。在一个方面中，水解在适于酶组分的活性，即，对于酶组分最佳的条件下进行。水解能以分批补料或连续的过程进行，其中将该纤维素材料或包含木聚糖的材料逐渐补入，例如，包含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌罐反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。适合的处理时间、温度和pH条件可以由本领域的普通技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是典型地进行优选地约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。温度优选在约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃、约40℃至约60℃、或约50℃至约55℃的范围。pH优选在约3至约8，例如约3.5至约7、约4至约6、或约5.0至约5.5的范围。干燥固体含量优选在约5至约50wt％，例如约10至约40wt％或约20至约30wt％的范围。
这些酶组合物可以包括可用于降解或转化该纤维素材料或包含木聚糖的材料的任何蛋白质。
在一个方面中，该酶组合物包括或进一步包括选自下组的一种或多种(如，若干种)蛋白质，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有增强纤维素分解活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。在另一个方面中，纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。在另一个方面中，半纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
在另一个方面中，该酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括或进一步包括一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶以及一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种或多种(例如，若干种)选自纤维素分解酶和半纤维素分解酶的组的酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种纤维二糖水解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶以及一种具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种纤维二糖水解酶以及一种具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种β-葡糖苷酶以及一种具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶以及一种纤维二塘水解酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶以及一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种纤维二糖水解酶以及一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种纤维二塘水解酶、以及一种具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有增强纤维素分解活性的多肽。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种纤维二塘水解酶、以及一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种内切葡聚糖酶、一种纤维二塘水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有增强纤维素分解活性的多肽。
在另一个方面中，该酶组合物包括一种乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种阿拉伯聚糖酶(例如，α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种阿拉伯呋喃糖苷酶(例如，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种香豆酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种阿魏酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种葡萄糖醛酸酶(例如，α-D-葡萄糖醛酸酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种葡萄糖醛酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种甘露聚糖酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种甘露糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种木聚糖酶。在一个优选方面中，该木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种木糖苷酶(例如，β-木糖苷酶)。
在另一个方面中，该酶组合物包括一种酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种扩张蛋白。在另一个方面中，该酶组合物包括一种漆酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种木质素分解酶。在另一个优选方面中，该木质素分解酶是一种锰过氧化物酶。在另一个优选方面中，该木质素分解酶是一种木质素过氧化物酶。在另一个优选方面中，该木质素分解酶是一种产H2O2酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种果胶酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种过氧化物酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种蛋白酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种膨胀素。
在本发明的工艺中，可以在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或过程中添加一种或多种酶。
该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白、或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如，若干种)组分可以是一种细胞的天然蛋白质，将该细胞用作重组地表达该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)其他组分的宿主细胞。该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以作为单组分来产生，然后将其合并以形成该酶组合物。该酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。
在本发明的工艺中使用的酶可以处于任何适于使用的形式，例如像发酵液配制品或细胞组合物、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化的或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。该酶组合物可以是干粉或颗粒，无粉尘的颗粒、液体、稳定的液体、或稳定的受保护的酶。液体酶制剂可以例如根据确定的工艺通过添加稳定剂例如糖、糖醇或另一种多元醇，和/或乳酸或另一种有机酸得以稳定。
酶和具有木聚糖酶活性的多肽的最佳量取决于若干因素，包括但不限于：纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶组分的混合物、纤维素材料或包含木聚糖的材料、纤维素材料或包含木聚糖的材料的浓度、纤维素材料或包含木聚糖的材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH、以及包含的发酵生物(例如，用于同时糖化和发酵的酵母)。
在一个方面中，对于纤维素材料或包含木聚糖的材料来说的纤维素分解酶或半纤维素分解酶的有效量是约0.5至约50mg，例如约0.5至约40mg、约0.5至约25mg、约0.75至约20mg、约0.75至约15mg、约0.5至约10mg、或约2.5至约10mg/g的纤维素材料或包含木聚糖的材料。
在另一个方面中，对于纤维素材料或包含木聚糖的材料来说的具有木聚糖酶活性的多肽的有效量是约0.01至约50.0mg，例如约0.01至约40mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.025至约1.5mg、约0.05至约1.25mg、约0.075至约1.25mg、约0.1至约1.25mg、约0.15至约1.25mg、或约0.25至约1.0mg/g的纤维素材料或包含木聚糖的材料。
在另一个方面中，对于纤维素分解酶或半纤维素分解酶来说的具有木聚糖酶活性的多肽的有效量是约0.005至约1.0g，例如约0.01至约1.0g、约0.15至约0.75g、约0.15至约0.5g、约0.1至约0.5g、约0.1至约0.25g、或约0.05至约0.2g/g的纤维素分解酶或半纤维素分解酶。
具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽连同其他可用于该纤维素材料或包含木聚糖的材料的降解的蛋白质/多肽，例如具有增强纤维素分解活性的GH61多肽(此后共同地是“具有酶活性的多肽”)可以衍生自或获得自任何适合的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物、或哺乳动物来源。术语“获得”在此还指该酶可以在宿主生物中利用在此描述的方法重组地产生,其中重组产生的酶对于该宿主生物来说是天然的或异源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如，若干个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或片段或通过本领域已知的氨基酸重排方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖天然变体，并且异源酶的含义中涵盖重组(例如通过定点诱变或重排)获得的变体。
具有酶活性的多肽可以是一种细菌多肽。例如，该多肽可以是具有酶活性的革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽抱杆菌属、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、嗜酸栖热菌属(Acidothermus)、Thermobifidia或海洋芽抱杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或具有酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，例如大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属、或脲原体属多肽。
在一个方面中，该多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一方面中，该多肽是具有酶活性的马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。
在另一方面中，该多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链丝菌、或变铅青链霉菌多肽。
具有酶活性的多肽还可以是一种真菌多肽，并且更优选是一种酵母多肽，例如具有酶活性的假丝酵母、克鲁维酵母、毕赤酵母、子囊菌、裂殖酵母、或亚罗酵母多肽；或更优选是一种丝状真菌多肽，例如具有酶活性的支顶孢、落叶松蕈、支链孢、曲霉、短梗霉、一种轮纹病菌(Botryospaeria)、拟蜡菌、毛喙壳属菌、金孢子菌、麦角菌、旋孢腔菌、拟鬼伞属菌、家白蚁、棒囊孢壳菌、栗疫属菌、隐球酵母、壳色单隔孢属菌、黑耳属菌、一种真菌(Filibasidium)、镰刀菌、赤霉菌、全鞭毛虫、腐质霉、耙齿菌、香菇、小球腔菌、大毁壳属菌、一种嗜热菌(Melanocarpus)、亚灰树花菌、毛霉菌、蚀丝霉属菌、新美鞭菌、脉孢菌、拟青霉属菌、青霉菌、平革菌、梨囊鞭菌属、一种真菌(Poitrasia)、假黑盘菌、一种鞭毛虫(Pseudotrichonympha)、根毛霉、裂褶菌、柱顶孢霉、踝节菌、嗜热子囊菌、梭孢壳菌、弯颈霉、木霉属菌、长毛盘菌、轮枝孢属菌、小包脚菇、或炭角菌多肽。
在一个方面中，该多肽是具有酶活性的卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁费酵母、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母多肽。
在另一个方面中，该多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌、热带金孢子菌、粪状金孢子菌、狭边金孢子菌、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌、褐薄金孢子菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳、一种真菌(Thielaviaalbomyces)、一种真菌(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳、一种真菌(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、一种真菌(Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、耐热梭孢壳、太瑞斯梭孢壳霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉多肽、或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
也可以使用具有酶活性的多肽的化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。
该酶组合物的一种或多种(例如，若干种)组分可以是一种重组组分，即通过克隆编码该单一组分的DNA序列并且随后用该DNA序列转化并且在宿主中表达而产生(参见例如，WO91/17243和WO91/17244)。该宿主优选是一种异源宿主(酶对宿主来说是外源的)，但该宿主在一定条件下也可以是一种同源宿主(酶对宿主来说是天然的)。还可以通过纯化来自发酵液的这样一种蛋白质来制备单组份纤维素分解蛋白质。
在一个方面中，一种或多种(例如，若干种)纤维素分解酶包括一种商业化纤维素分解酶制剂。适用于在本发明中使用的商业化纤维素分解酶制剂的实例包括例如CTec(诺维信公司)、CTec2(诺维信公司)、CTec3(诺维信公司)、CELLUCLASTTM(诺维信公司)、NOVOZYMTM188(诺维信公司)、CELLUZYMETM(诺维信公司)、CEREFLOTM(诺维信公司)、以及ULTRAFLOTM(诺维信公司)、ACCELERASETM(杰能科公司(Genencor Int.))、LAMINEXTM(杰能科公司)、SPEZYMETMCP(杰能科公司)、NL(DSM)；S/L100(DSM)、ROHAMENTTM7069W(罗姆公司(GmbH))、LDI(并矢国际公司(Dyadic International,Inc.))、LBR(并矢国际公司)、或150L(并矢国际公司)。将纤维素酶以从约0.001至约5.0wt％的固体，例如约0.025至约4.0wt％的固体或约0.005至约2.0wt％的固体的有效量添加。
可以在本发明的工艺中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括，但不限于：嗜酸栖热纤维素分解菌(Acidothermus cellulolyticus)的内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO93/15186；美国专利号5,275,944；WO96/02551；美国专利号5,536,655，WO00/70031，WO05/093050)；嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；以及嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。
可以在本发明中使用的真菌内切葡聚糖酶的实例包括，但不限于里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila(潘提拉)等人，1986，Gene(《基因》)45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)、里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo(萨洛黑莫)等人，1988，《基因》63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)、里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada(冈田)等人，1988，《应用与环境微生物学》64:555-563，GENBANKTM登录号AB003694)、里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，《分子微生物学》13:219-228，GENBANKTM登录号Z33381)、棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi(黄)等人，1990，《核酸研究》18:5884)、白曲霉内切葡聚糖酶(Sakamoto(坂本)等人，1995，Current Genetics(《当代遗传学》)27:435-439)、欧文杆菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti(萨利拉特)等人，1990，《基因》90:9-14)、尖孢镰刀菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)、腐质霉嗜热变种(Humicola grisea var.thermoidea)内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)、热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)、粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶、担子菌CBS495.95内切葡聚糖酶、担子菌CBS494.95内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶、一种真菌(Cladorrhinum foecundissimum)ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶、以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括，但不限于：棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO2011/059740)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(WO2009/042871)、赫卡尼亚梭孢壳霉(Thielavia hyrcanie)纤维二糖水解酶II(WO2010/141325)、太瑞斯梭孢壳霉纤维二糖水解酶II(CEL6A、WO2006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO2010/057086)。
可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括，但不限于来自以下各项的β-葡糖苷酶：棘孢曲霉(Kawaguchi(川口)等人，1996，《基因》173:287-288)、烟曲霉(WO2005/047499)、黑曲霉(Dan(丹)等人，2000，《生物化学杂志》275:4973-4980)、米曲霉(WO2002/095014)、巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888(WO2007/019442和WO2010/088387)、太瑞斯梭孢壳霉(WO2011/035029)、以及褐孢长毛盘菌(WO2007/019442)。
该β-葡糖苷酶可以是一种融合蛋白。在一个方面中，该β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶变异体BG融合蛋白(WO2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)。
其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶使用根据Henrissat(亨利萨塔)B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities(基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类)，Biochem.J.(《生物化学杂志》)280:309-316，和亨利萨塔B.，和Bairoch(巴洛赫)A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases(糖基水解酶的基于序列的分类的更新)，《生物化学杂志》316:695-696的分类披露于许多糖基水解酶家族中。
可以在本发明中使用的其他纤维素分解酶描述于WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025847、WO99/031255、WO2002/101078、WO2003/027306、WO2003/052054、WO2003/052055、WO2003/052056、WO2003/052057、WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980、WO2004/048592、WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050、WO2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO2007/071818、WO2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美国专利号5,457,046、美国专利号5,648,263、以及美国专利号5,686,593中。
在本发明的工艺中，具有增强纤维素分解活性的任何GH61多肽可以被用作该酶组合物的组分。
可用于本发明的工艺中的具有增强纤维素分解活性的GH61多肽的实例包括，但不限于来自以下各项的GH61多肽：太瑞斯梭孢壳霉(WO2005/074647、WO2008/148131、和WO2011/035027)、橙色嗜热子囊菌(WO2005/074656和WO2010/065830)、里氏木霉(WO2007/089290)、嗜热毁丝霉(WO2009/085935、WO2009/085859、WO2009/085864、和WO2009/085868)、烟曲霉(WO2010/138754)、嗜松青霉(WO2011/005867)、嗜热子囊属(Thermoascus sp.)(WO2011/039319)、青霉属(WO2011/041397)、以及硬皮嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO2011/041504)。
在一个方面中，根据WO2008/151043，具有增强纤维素分解活性的GH61多肽在一种可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。
在另一个方面中，具有增强纤维素分解活性的GH61多肽在以下各项的存在下使用：二氧基化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或一种获得自经预处理的纤维素材料(例如预处理的玉米秸秆(PCS))的液体。
二氧基化合物可以包括包含两个或更多个氧原子的任何适合化合物。在一些方面，二氧基化合物包含一个如在此所述的被取代的芳基部分。二氧基化合物可以包括一个或多个(例如，若干个)羟基和/或羟基衍生物，而且还包括缺乏羟基和羟基衍生物的、经取代的芳基部分。二氧基化合物的非限制性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；连苯三酚；没食子酸；3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；丹宁酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基富马酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4'-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；丙烯醛乙缩醛；4-羟基苯甲酸甲酯；4-羟基苯甲酸；以及3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯；或其盐或溶剂化物。
双环化合物可以包含如在此所述的任何适合被取代的稠环系统。这些化合物可以包含一个或多个(例如，若干个)另外的环，并且除非另有说明，否则不限于具体数目的环。在一个方面中，双环化合物是一种类黄酮。在另一个方面中，双环化合物是一种任选地被取代的异黄酮。在另一个方面中，双环化合物是一种任选地被取代的花色羊离子(flavylium ion)，如一种任选地被取代的花色素或任选地被取代的花色素苷，或其衍生物。双环化合物的非限制性实例包括表儿茶素；槲皮酮；杨梅黄酮；紫杉叶素；堪非醇；桑色素；刺槐素；柚皮素；异鼠李素；芹黄素；矢车菊素；矢车菊素苷(cyanin)；黑豆多酚(kuromanin)；花青素鼠李葡糖苷；或其盐或溶剂化物。
杂环化合物可以是如在此所述的任何适合化合物，如包含一个杂原子的一种任选地被取代的芳香族或非芳香族环。在一个方面中，杂环是包含一个任选地被取代的杂环烷基部分或一个任选地被取代的杂芳基部分的一种化合物。在另一个方面，任选地被取代的杂环烷基部分或任选地被取代的杂芳基部分是一个任选地被取代的5元杂环烷基或一个任选地被取代的5元杂芳基部分。在另一个方面，任选地被取代的杂环烷基或任选地被取代的杂芳基部分是一个选自以下的任选地被取代的部分：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氢噻吩并吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异唑基、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮呯基、氮呯基、噻呯基、哌啶基以及氧呯基。在另一个方面中，任选地被取代的杂环烷基部分或任选地被取代的杂芳基部分是一个任选地被取代的呋喃基。杂环化合物的非限制性实例包括(1,2-二羟基乙基)-3,4-二羟基呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟基乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己糖醛酸(aldohexuronicaldohexuronic acid)γ-内酯；葡萄糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟基甲基)糠醛；联糠醛；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；以及5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或其盐或溶剂化物。
含氮化合物可以是具有一个或多个氮原子的任何适合化合物。在一个方面中，含氮化合物包含一个胺、亚胺、羟胺或氮氧化物部分。含氮化合物的非限制性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；以及顺丁烯酰胺酸；或其盐或溶剂化物。
醌化合物可以是包含一个如在此所述的醌部分的任何适合化合物。醌化合物的非限制性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-吲哚啉二酮或肾上腺素红；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌；或其盐或溶剂化物。
含硫化合物可以是包括一个或多个硫原子的任何适合化合物。在一个方面中，含硫化合物包含一个选自以下的部分：亚硫酰基、硫醚、亚磺酰基、磺酰基、硫酰胺、磺酰胺、磺酸以及磺酸酯。含硫化合物的非限制性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫酚；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；蛋氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或其盐或溶剂化物。
在一个方面中，对于作为纤维素材料与纤维素的葡糖基单位的摩尔比例来说的上述的这样一种化合物的有效量是约10-6至约10，例如约10-6至约7.5、约10-6至约5、约10-6至约2.5、约10-6至约1、约10-5至约1、约10-5至约10-1、约10-4至约10-1、约10-3至约10-1、或约10-3至约10-2。在另一个方面中，上述的这样一种化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。
术语“液体”是指在如在此描述的条件下，由木质纤维素和/或半纤维素材料或其单糖(例如，木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)在浆料中的处理产生的水性、有机、或其组合的溶液相，及其可溶性内容物。可以通过加热和/或施压，可任选地在一种催化剂(例如，酸)的存在下，可任选地在一种有机溶剂的存在下，并且可任选地与该材料的物理破坏组合来处理木质纤维素或半纤维素材料(或原料)，并且然后将该溶液与剩余固体分离来生产GH61多肽的纤维素分解增强的液体。此类条件决定了在由纤维素酶制剂水解纤维素底物的过程中，通过液体和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。可以使用本领域中的标准方法将液体与所处理的材料分离，例如过滤、沉降、或离心。
在一个方面中，对于纤维素来说的液体的有效量是约10-6至约10g/g的纤维素，例如约10-6至约7.5g、约10-6至约5g、约10-6至约2.5g、约10-6至约1g、约10-5至约1g、约10-5至约10-1g、约10-4至约10-1g、约10-3至约10-1g、或约10-3至约10-2g/g的纤维素。
在一个方面中，一种或多种(例如，若干种)半纤维素分解酶包括一种商业化半纤维素分解酶制剂。适于在本发明中使用的商业化半纤维素分解酶制剂的实例包括例如SHEARZYMETM(诺维信公司)、HTec(诺维信公司)、HTec2(诺维信公司)、HTec3(诺维信公司)、(诺维信公司)、(诺维信公司)、HC(诺维信公司)、木聚糖酶(杰能科公司)、XY(杰能科公司)、XC(杰能科公司)、TX-200A(AB酶公司(AB Enzymes))、HSP6000木聚糖酶(DSM)、DEPOLTM333P(生物催化剂有限公司(Biocatalysts Limit)，威尔士，英国)、DEPOLTM740L.(生物催化剂有限公司，威尔士，英国)、以及DEPOLTM762P(生物催化剂有限公司，威尔士，英国)。
可用于本发明的工艺中的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下各项的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790；WO94/21785)、烟曲霉(WO2006/078256)、嗜松青霉(WO2011/041405)、青霉属(WO2010/126772)、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126(WO2009/079210)、以及褐孢长毛盘菌GH10(WO2011/057083)。
可用于本发明的工艺中的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β-木糖苷酶：粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、以及埃默森篮状菌(SwissProt登录号Q8X212)。
可用于本发明的工艺中的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下各项的乙酰木聚糖酯酶：棘孢曲霉(WO2010/108918)、球毛壳菌(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉DSM1800(WO2009/073709)、红褐肉座菌(WO2005/001036)、嗜热毁丝霉(Myceliophtera thermophila)(WO2010/014880)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号q7s259)、颖枯壳针孢(Uniprot登录号Q0UHJ1)、以及太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126(WO2009/042846)。
可用于本发明的工艺中的阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，ferulic acidesterase)的实例包括但不限于来自以下各项的阿魏酸酯酶：特异腐质霉DSM1800(WO2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、黄灰青霉(WO2009/127729)、以及太瑞斯梭孢壳霉(WO2010/053838和WO2010/065448)。
可用于本发明的工艺中的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的阿拉伯呋喃糖苷酶：黑曲霉(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉DSM1800(WO2006/114094和WO2009/073383)、以及巨芒(M.giganteus)(WO2006/114094)。
可用于本发明的工艺中的α-葡萄糖醛酸酶的实例包括但不限于来自以下各项的α-葡萄糖醛酸酶：棒曲霉(UniProt登录号alcc12)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(WO2010/014706)、黄灰青霉(WO2009/068565)、埃默森篮状菌(UniProt登录号Q8X211)、以及里氏木霉(Uniprot登录号Q99024)。
用于本发明的工艺中的具有酶活性的多肽可以通过在含有适合的碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上，使用本领域已知的程序发酵上面指出的微生物菌株来产生(参见例如，Bennett(班尼特)，J.W.和LaSure(拉素尔)，L.(编辑)，More Gene Manipulations in Fungi(《真菌中的更多基因操作》)，Academic Press(学术出版社)，加州，1991)。合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。适于生长和酶生产的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(参见例如，Bailey(贝利)，J.E.,和Ollis(奥利斯)，D.F.,Biochemical EngineeringFundamentals(《生化工程基础》)，McGraw-Hill Book Company(麦格劳-希尔图书公司)，纽约，1986)。
发酵可以是导致酶或蛋白质的表达或分离的培养细胞的任何方法。所以，可以将发酵理解为包括摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并且在允许表达或分离该酶的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。通过上述方法产生的所得酶可以从发酵培养基回收并且通过常规程序纯化。
发酵。可以通过一种或多种(例如，若干种)能够将糖直接或间接发酵为所希望的发酵产物的发酵微生物来发酵自水解的纤维素材料或包含木聚糖的材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵过程”是指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵过程还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵奶制品)、皮革工业、以及烟草工业的发酵过程。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物体，并且可以由本领域的普通技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果的由纤维素材料或包含木聚糖的材料释放的糖，由发酵生物体(例如酵母)发酵为产物，如，乙醇。如在此描述，水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。
在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的水解的纤维素材料或包含木聚糖的材料。通常根据所希望的发酵产物(即，要从发酵获得的物质)和利用的方法来选择材料，如本领域中所熟知的。
术语“发酵培养基”在此应被理解为是指添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，例如，由糖化过程产生的培养基，以及在同时进行糖化和发酵工艺(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”是指适用于所希望的发酵过程以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体、或其组合。己糖和戊糖发酵生物体在本领域中都是熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或低聚糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。生产乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例由Lin(林)等人，2006，《应用微生物学与生物技术》69:627-642进行了描述。
可以发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，例如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母菌属、以及酿酒酵母属(Saccharomyces)的菌株，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、马克思克鲁维酵母、以及酿酒酵母。
可以发酵处于其天然状态的戊糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，例如一些酵母。优选的发酵木糖的酵母包括假丝酵母属的菌株，优选是休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)；以及毕赤酵母属的菌株，优选是树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS5773。优选的发酵戊糖的酵母包括管囊酵母属的菌株，优选是嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)。不能发酵戊糖(例如木糖和阿拉伯糖)的生物体可以通过本领域中已知的方法进行遗传修饰以能够发酵戊糖。
可以将己糖和戊糖有效地发酵为乙醇的细菌的实例包括例如凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭杆菌、热纤维梭菌、弗陶菲尔门塔斯梭菌(Clostridiumphytofermentans)、土芽孢杆菌属、嗜热厌氧糖分解菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(Philippidis(菲利普斯)，1996，同上)。
其他发酵生物体包括以下各项的菌株：芽孢杆菌属，例如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母、麦斯诺索巴萨假丝酵母(C.methanosorbosa)、狄敦思假丝酵母(C.diddensiae)、近平滑假丝酵母、内德顿卓假丝酵母(C.naedodendra)、布朗克假丝酵母(C.blankii)、恩脱墨菲利亚假丝酵母(C.entomophilia)、芸苔假丝酵母、拟热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、产朊假丝酵母(C.utilis)、以及休哈塔假丝酵母；梭菌属，例如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、以及弗陶菲尔门塔斯梭菌(C.phytofermentans)；大肠杆菌属，特别是已经进行遗传修饰以改进乙醇产量的大肠杆菌菌株；土芽孢杆菌属；汉逊酵母属，例如异常汉森酵母；克雷白氏杆菌属，例如产酸克雷伯菌(K.oxytoca)；克鲁维酵母菌属，例如马克思克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；嗜热厌氧杆菌属，例如嗜热厌氧糖分解杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)；以及发酵单胞菌属，例如运动发酵单胞菌。
在一个优选方面中，该酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面中，该酵母是克劳森酒香酵母。在另一个优选方面中，该酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种布朗克假丝酵母(Candidablankii)。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种芸苔假丝酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种嗜虫假丝酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种拟热带假丝酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种休哈塔假丝酵母(Candida scehatae)。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种产朊假丝酵母。在另一个优选方面中，该酵母是棒孢酵母属。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种葡萄牙棒孢酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是一种仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选方面中，该酵母是克鲁维酵母菌属。在另一个更优选的方面中，该酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是马克思克鲁维酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是耐热克鲁维酵母。在另一个优选方面中，该酵母是管囊酵母属。在另一个更优选的方面中，该酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选方面中，该酵母是毕赤酵母属。在另一个优选方面中，该酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选方面中，该酵母是酿酒酵母属。在另一个更优选的方面中，该酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是糖化酵母。在另一个更优选的方面中，该酵母是葡萄汁酵母。
在一个优选方面中，该细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面中，该细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个优选方面中，该细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面中，该细菌是丙酮丁醇梭杆菌。在另一个更优选的方面中，该细菌是弗陶菲尔门塔斯梭菌(Clostridium phytofermentan)。在另一个更优选的方面中，该细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面中，该细菌是Geobacilus属。在另一个更优选的方面中，该细菌是嗜热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面中，该细菌是嗜热厌氧糖分解杆菌。在另一个优选方面中，该细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面中，该细菌是运动发酵单胞菌。
可商购的适合乙醇生产的酵母包括例如，BIOFERMTMAFT和XR(NABC-北美生物产品股份有限公司(North American BioproductsCorporation)，佐治亚州，美国)、ETHANOL REDTM酵母(弗曼迪斯/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALITM(弗莱希曼氏酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、FERMIOLTM(DSM专业公司(DSMSpecialties))、GERT STRANDTM(格特特兰德AB公司(Gert Strand AB)，瑞典)、以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)。
在一个优选方面中，发酵微生物已经进行遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，例如如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆进不同发酵微生物已经构建了能够将己糖和戊糖转化为乙醇(共发酵)的生物体(Chen(陈)和Ho(胡)，1993，Cloning andimproving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomycescerevisiae(在酿酒酵母中克隆树干毕赤酵母木糖还原酶基因并改进其表达),《应用生物化学与生物技术》39-40:135-147；胡等人，1998，Geneticallyengineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose andxylose(能够有效地共发酵葡萄糖和木糖的遗传工程化的酿酒酵母)，《应用与环境微生物学》64:1852-1859；Kotter(科特)和Ciriacy(斯莱斯)，1993，Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母对木糖的发酵)，《应用微生物学与生物技术》38:776-783；Walfridsson(沃夫迪森)等人，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase(过量表达编码戊醣磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TAL1基因的代谢木糖的酿酒酵母)，《应用与环境微生物学》61:4184-4190；Kuyper(凯博)等人，2004，Minimal metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof ofprinciple(用于高效厌氧发酵木糖的酿酒酵母的最小的代谢工程研究：原理的证明)，FEMS Yeast Research(《FEMS酵母研究》)4:655-664；Beall(比尔)等人，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose and othersugars by recombinant Escherichia coli(由重组大肠杆菌从木糖和其他糖类生产乙醇的参数研究)，Biotech.Bioeng.(《生物技术与生物工程》)38:296-303；Ingram(英格拉姆)等人，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanolproduction(用于生产乙醇的细菌的代谢工程研究)，《生物技术与生物工程》58:204-214；Zhang(张)等人，1995，Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis(产乙醇的运动发酵单胞菌中的戊糖代谢途径代谢工程研究)，Science(《科学》)267:240-243；Deanda(戴安达)等人，1996，Development of an arabinose-fermentingZymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering(发酵阿拉伯糖生物运动发酵单胞菌株的代谢途径工程的发展)，《应用与环境微生物学》62:4465-4470；WO2003/062430，木糖异构酶)。
在一个优选方面中，该遗传修饰的发酵微生物是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个优选的方面中，该遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面中，该遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯菌。在另一个优选的方面中，该遗传修饰的发酵微生物是马克思克鲁维酵母。在另一个优选的方面中，该遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面中，该遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
在本领域中熟知的是，上述生物体还能用于生产其他物质，如在此所描述。
典型地向降解的纤维素材料或包含木聚糖的材料或水解产物中添加发酵微生物，并且进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度典型地在约26℃至约60℃之间，例如约32℃或50℃，并且典型地在约pH3至约pH8之间，例如pH4-5、6、或7。
在一个方面中，向降解的纤维素材料或包含木聚糖的材料中施用酵母和/或另一种微生物并且发酵进行约12至约96小时，例如典型地是24-60小时。在另一个方面中，温度优选在约20℃至约60℃之间，例如约25℃至约50℃、约32℃至约50℃、或约32℃至约50℃，并且pH通常是从约pH3至约pH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体(例如，细菌)具有较高的发酵最适温度。优选地以以下量施用酵母或另一种微生物，大约105至1012，优选是从大约107至1010，尤其是大约2×108活细胞计数/ml的发酵液。关于使用酵母用于发酵的另外的指导可以发现于例如“The Alcohol Textbook(乙醇教科书)”(编辑K.Jacques(雅克)，T.P.Lyons(里昂)和D.R.Kelsall(凯尔瑟尔)，NottinghamUniversity Press(诺丁汉大学出版社)，英国1999)中，将其通过引用而特此结合。
可以将一种发酵刺激剂与在此描述的任何的工艺组合使用以进一步改进发酵过程，并且特别是改进发酵微生物的性能，例如，提高速度和乙醇产量。“发酵刺激剂”是指发酵微生物(特别是酵母)生长刺激剂。优选的发酵生长刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、以及维生素E。参见例如，Alfenore(奥芬诺拉)等人，Improving ethanol production and viability of Saccharomycescerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process(在补料分批工艺过程中通过维生素补料策略改进乙醇生产和酿酒酵母的生存力)，Springer-Verlag(施普林格出版社)(2002)，将其通过引用而特此结合。矿物质的实例包括那些能提供含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于：醇(例如，阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、丙三醇、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇(propylene glycol)]、丁二醇、甘油、山梨糖醇、以及木糖醇)；链烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)、环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)、链烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、乙酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸)；以及聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选方面中，该发酵产物是一种醇。将理解的是，术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基部分的物质。在一个更优选的方面中，醇是正丁醇。在另一个更优选的方面中，醇是异丁醇。在另一个更优选的方面中，醇是乙醇。在另一个更优选的方面中，醇是甲醇。在另一个更优选的方面中，醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面中，醇是丁二醇。在另一个更优选的方面中，醇是乙二醇。在另一个更优选的方面中，醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面中，醇是丙三醇(glycerol)。在另一个更优选的方面中，醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面中，醇是山梨糖醇。在另一个更优选的方面中，醇是木糖醇。参见例如，Gong(宫)等人，1999，Ethanol production from renewableresources(由可再生资源生产乙醇)，在《生化工程/生物技术进展》中，斯卡皮尔，T.，编辑，施普林格出版社柏林海德堡，德国，65:207-241；Silveira(西尔维拉)和Jonas(乔纳斯)，2002，The biotechnological production of sorbitol(山梨糖醇的生物技术生产)，《应用生物化学与生物技术》59:400-408；Nigam(尼加姆)和辛格，1995，Processes for fermentative production of xylitol–a sugar substitute(木糖醇-一种糖替代物的发酵生产工艺)，ProcessBiochemistry(《加工生物化学》)30(2):117-124；Ezeji(埃塞吉)等人，2003，Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101andin situ recovery by gas stripping(由拜氏梭菌BA101生产丙酮，丁醇和乙醇并通过气提进行原位回收)，World Journal of Microbiology and Biotechnology(《微生物与生物技术世界杂志》)19(6):595-603。
在另一个优选方面中，该发酵产物是一种链烷烃。该链烷烃可以是直链的或支链的链烷烃。在另一个更优选的方面中，该链烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面中，该链烷烃是己烷。在另一个更优选的方面中，该链烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面中，该链烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面中，该链烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面中，该链烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面中，该链烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面中，该链烷烃是十二烷。
在另一个优选的方面中，该发酵产物是一种环烷烃。在另一个更优选的方面中，该环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面中，该环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面中，该环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面中，该环烷烃是环辛烷。
在另一个的优选方面中，该发酵产物是一种链烯烃。该链烯烃可以是直链的或支链的链烯烃。在另一个更优选的方面中，该链烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面中，该链烯烃是己烯。在另一个更优选的方面中，该链烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面中，该链烯烃是辛烯。
在另一个优选的方面中，该发酵产物是一种氨基酸。在另一个更优选的方面中，该氨基酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面中，该氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面中，该氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面中，该氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面中，该氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面中，该氨基酸是苏氨酸。参见例如，Richard(理查德)，A.，和Margaritis(马加里蒂斯)，A.,2004,Empirical modeling of batch fermentationkinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers(聚(谷氨酸)生产和其他微生物的生物聚合物的分批发酵动力学的经验性建模)，Biotechnology and Bioengineering(《生物技术与生物工程》)87(4):501-515。
在另一个优选的方面中，该发酵产物是一种气体。在另一个更优选的方面中，该气体是甲烷。在另一个更优选的方面中，该气体是H2。在另一个更优选的方面中，该气体是CO2。在另一个更优选的方面中，该气体是CO。参见例如，Kataoka(片冈)等人，1997，Studies on hydrogen production by continuousculture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria(对产氢厌氧细菌的连续培养系统的产氢研究)，Water Science and Technology(《水科学与技术》)36(6-7):41-47；以及Gunaseelan(古纳森兰)，1997，Biomass and Bioenerg(生物质与生物能源)13(1-2):83-114，Anaerobic digestion of biomass for methaneproduction:A review(用于生产甲烷的生物质的厌氧消化：评论)。
在另一个优选的方面中，该发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选的方面中，该发酵产物是一种酮。将理解的是，术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选的方面中，该酮是丙酮。参见例如，Qureshi(库雷希)和Blaschek(布拉斯科)，2003，同上。
在另一个优选的方面中，该发酵产物是一种有机酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是乙酮酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是富马酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是戊二酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是草酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面中，该有机酸是木糖酸。参见例如，Chen(陈)和Lee(李)，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lacticacid production from cellulosic biomass(用于从纤维素生物质生产乳酸的膜介导的萃取发酵)，《应用生物化学与生物技术》63-65:435-448。
在另一个优选的方面中，该发酵产物是聚酮化合物。
回收。可以使用本领域中已知的任何方法可任选地从发酵培养基回收一种或多种发酵产物，这些方法包括但不限于，色谱法、电泳程序、溶解度差异(differential solubility)、蒸馏、或萃取。例如，通过蒸馏的常规方法将醇与发酵的纤维素材料或包含木聚糖的材料分离并纯化。可以获得纯度高达约96vol.％的乙醇，可以将其用作例如燃料乙醇、饮用乙醇(即可饮用的中性烈酒)、或工业乙醇。
信号肽
本发明还涉及一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQ IDNO:2的氨基酸1到22或由其组成。该多核苷酸可以进一步包括一个编码蛋白质的基因，该蛋白质可操作地连接到该信号肽。该蛋白质优选地对于该信号肽来说是异源的。在一个方面中，编码该信号肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1到66。
本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
本发明还涉及生产蛋白质的方法，包括(a)对包含被可操作地连接至编码该蛋白质的基因的这样一种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且可任选地(b)回收该蛋白质。
该蛋白质对于宿主细胞来说可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在此不意图是指一种特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽及多肽。术语“蛋白质”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。
优选地，该蛋白质是一种激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告子。例如，该蛋白质可以是一种水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
本发明进一步通过以下实例进行描述，这些实例不应被解释成限制本发明的范围。
实例
株系
将胶囊青霉株系IBT4903用作具有木聚糖酶活性的多肽的来源。将米曲霉MT3568株系用于编码具有木聚糖酶活性的多肽的胶囊青霉基因的表达。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO2002/40694)，其中通过破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因修复pyrG营养缺陷体。
培养基和溶液
YP+2％葡萄糖培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨、以及去离子水中的2％葡萄糖组成。
PDA板由马铃薯浸出液组成，该马铃薯浸出液是通过将300g切片的马铃薯(洗涤但未削皮)在水中煮沸30分钟，并且然后将该培养液倾析或滤过粗滤布而制成。然后添加蒸馏水，直到悬浮液的总体积为1升，随后添加20g的右旋糖和20g的琼脂粉。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(《细菌学分析手册》，第8版，修订A，1998)。
LB板由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂及补足到1升的去离子水组成。
LB培养基由10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、10g的氯化钠，以及补足到1升的去离子水组成。
COVE蔗糖板由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液及补足到1升的去离子水组成。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(《细菌学分析手册》，第8版，修订A，1998)。将培养基冷却至60℃并且然后添加无菌的乙酰胺和CsCl至浓度为10mM和15mM，随后以50μl/500ml的培养基添加X-100。
COVE盐溶液由26g的MgSO4·7H2O、26g的KCl、26g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液及补足到1升的去离子水组成。
COVE痕量金属溶液由0.04g的Na2B4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO4·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O及补足到1升的去离子水组成。
Dap-4C培养基由20g的右旋糖、10g的麦芽糖、11g的MgSO4·7H2O、1g的KH2PO4、2g的柠檬酸、5.2g的K3PO4·H2O、0.5g的酵母提取物(Difco)、1ml的DOWFAXTM63N10(陶氏化学公司(Dow Chemical Company)，米德兰市，密歇根州，美国)、0.5ml的KU6痕量金属溶液、2.5g的CaCO3及补足到1升的去离子水组成。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(《细菌学分析手册》，第8版，修订A，1998)。在使用之前，每150ml的培养基添加3.5ml的无菌的50％(NH4)2HPO4和5ml的无菌的20％乳酸。
KU6痕量金属溶液由0.13g的NiCl2、2.5g的CuSO4·5H2O、13.9g的FeSO4·7H2O、8.45g的MnSO4·H2O、6.8g的ZnCl2、3g的柠檬酸及补足到1升的去离子水组成。
实例1：胶囊青霉株系IBT4903的DNA序列信息的来源
在中国北京的北京基因组研究所(BGI)由分离自胶囊青霉株系IBT4903的基因组DNA通过亿明达(Illumina)DNA测序产生基因组序列信息。使用Pedant-ProTM序列分析套件(Pedant-ProTMSequence Analysis Suite)(百玛士资讯公司(Biomax Informatics AG)，马丁雷德，德国)分析基因组的初步装配。将由软件构建的基因模型用作检测基因组中的GH10同系物的起始点。使用多个作为向导的已知的GH10蛋白质序列构建更精确的基因模型。
实例2：胶囊青霉株系IBT4903基因组DNA提取
通过使胶囊青霉株系IBT4903在PDA板上，在26℃下生长7天使其进行繁殖。使用从PDA板收获的孢子接种在带挡板的摇瓶中的25ml的YP+2％葡萄糖培养基里并且在26℃下孵育72小时，同时以85rpm搅拌。
根据Plant Maxi试剂盒(凯杰丹麦公司(QIAGEN Danmark)，哥本哈根，丹麦)的修改的方案分离基因组DNA。通过在14,000x g下离心2分钟收获来自上面的培养物的真菌材料。除去上清液并且将球粒(0.5g)用石英砂在液氮中冷冻并且将其在预冷的研钵中研磨为细粉。将粉末转移至15ml离心管中，随后添加5ml预热至65℃的AP1缓冲液(凯杰丹麦公司，哥本哈根，丹麦)和10μl的RNase A母液(100mg/ml)，随后进行剧烈涡流。在用常规反相(regular inverting)的试管在65℃下孵育10分钟后，通过温和混合向裂解液中添加1.8ml的AP2缓冲液(凯杰丹麦公司，哥本哈根，丹麦)，随后在冰上孵育10分钟。然后将裂解液在室温下、在3000xg下离心5分钟，并且将上清液倾析进放置于50ml收集管中的QIASHREDDERTM大核酸纯化柱(maxi spin column)(凯杰丹麦公司，哥本哈根，丹麦)中，随后将其在室温下、在3000xg下离心5分钟。将贯流(flow-through)转移至一个新的50ml试管中并且添加1.5体积的AP3/E缓冲液(凯杰丹麦公司，哥本哈根，丹麦)，随后进行涡流。将十五毫升的样品转移至放置于50ml收集管中的大核酸纯化柱中并且在室温下、在3000xg下离心5分钟。将贯流丢弃并且向放置于50ml收集管中的大核酸纯化柱中添加12ml的AW缓冲液(凯杰丹麦公司，哥本哈根，丹麦)并且在室温下、在3000xg下离心10分钟。在丢弃贯流后，重复离心以处置剩余的醇。将大核酸纯化柱转移至一个新的50ml试管中并且添加0.5ml预热至70℃的AE缓冲液(凯杰丹麦公司，哥本哈根，丹麦)。在室温下孵育5分钟后，通过在室温下、在3000xg下离心5分钟对样品进行洗脱。通过另外0.5ml的AE缓冲液重复洗脱并且将洗脱物合并。通过在260nm下的UV测量收获的DNA的浓度。
实例3：包含编码具有木聚糖酶活性的家族GH10多肽的胶囊青霉株系IBT4903基因组序列的米曲霉表达载体的构建
设计下面所示的两种合成寡核苷酸引物来通过PCR扩增来自在实例2中制备的基因组DNA的胶囊青霉株系IBT4903基因(P244K1)。使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒(克罗泰克实验有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，山景，加州，美国)将该片段直接克隆进表达载体pDau109中(WO2005/042735)。
引物F-P244K1：
5’-ACACAACTGGGGATCCACC -3’(SEQ ID NO:3)
引物R-P244K1：
5’-CCCTCTAGATCTCGAG -3’(SEQ ID NO:4)
粗体字母代表基因序列。加下划线的序列与pDau109的插入位点是同源的。
使用高保真PCR试剂盒(High-Fidelity PCR Kit)(飞酶公司(FINNZYMES Oy)，艾斯堡，芬兰)用于扩增。PCR反应由5μl的5X HF缓冲液(飞酶公司，艾斯堡，芬兰)、0.5μl的dNTPs(10mM)、0.5μl的DNA聚合酶(0.2单位/μl)(飞酶公司，艾斯堡，芬兰)、1μl的引物F-P244K1(5μM)、1μl的引物R-P244K1(5μM)、0.5μl的胶囊青霉基因组DNA(100ng/μl)、以及16.5μl的去离子水组成，总体积为25μl。使用PTC-200DNA引擎(MJ研究公司(MJ Research Inc.)，南旧金山，加州，美国)进行扩增，程序为1个循环，在95℃下持续2分钟；35个循环，各自为在98℃下持续10秒钟，在60℃下持续30秒钟，并且在72℃下持续2.5分钟；以及1个循环，在72℃下持续10分钟。然后将样品保持在12℃，直至从PCR仪中移出。
使用40mM Tris碱、20mM乙酸钠、1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下1513bp产物带，并且根据厂商说明书，使用PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences)，布隆德比，丹麦)进行纯化。然后使用IN-FUSIONTM克隆试剂盒，将片段克隆到Bam HI和Xho I消化的pDau109中，生成质粒pP244K1。将P244K1基因克隆进BamHI-Xho I消化的pDau109中导致胶囊青霉P244K1基因在NA2-tpi双启动子的控制下进行转录。NA2-tpi启动子是来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的未翻译的前导子替换了未翻译的前导子。
根据产生P244K1GH10构建体的IN-FUSIONTM克隆试剂盒的说明书进行克隆方案。根据厂商的方案将处理的质粒和插入片段转化进ONETOP10F′化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加州，美国)中，并且将其涂板在补充有0.1mg的氨比西林/ml的LB板上。在37℃下孵育过夜后，观察到菌落在LB氨比西林板上选择下生长。将用P244K1GH10构建体转化的四个菌落在补充有0.1mg的氨比西林/ml的LB培养基中进行培养并且根据厂商的方案，使用质粒小提试剂盒(Spin Miniprep Kit)(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加州，美国)分离质粒。
用载体引物和P244K1基因特异性引物对分离的质粒进行测序以便确定不含PCR错误的代表性质粒表达克隆。
实例4：编码具有木聚糖酶活性的P244K1GH10多肽的胶囊青霉IBT4903基因组序列的表征
用应用生物系统公司3700型全自动DNA测序仪(Applied BiosystemsModel3700Automated DNA Sequencer)，使用版本3.1BIG-DYETM终止子化学(应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)，福斯特城，加州，美国)和引物步移策略进行胶囊青霉IBT4903P244K1GH10基因组克隆的DNA测序。仔细检查核苷酸序列数据的质量，并且借助PHRED/PHRAP软件(华盛顿大学，西雅图，华盛顿州，美国)将所有序列互相比较。
胶囊青霉P244K1GH10木聚糖酶编码序列的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中。编码序列是1438bp，包括被70bp(核苷酸57至126)、57bp(核苷酸284至340)、53bp(核苷酸474至526)、以及55bp(核苷酸641至695)四个内含子中断的终止密码子。编码的预测蛋白质是400个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen(尼尔森)等人，1997，Protein Engineering(《蛋白质工程》)10:1-6)预测出22个残基的信号肽。预测的成熟蛋白包含378个氨基酸，预测的分子量为40.3kDa并且等电点为4.54。
使用尼德曼和翁施算法(尼德曼和翁施，1970，《分子生物学杂志》.48:443-453)确定氨基酸序列的比较性成对地总体比对，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62矩阵。比对显示编码GH10木聚糖酶(成熟多肽)的胶囊青霉基因组DNA的推导的氨基酸序列与来自青霉属(GENESEQP AYB51189)的GH10木聚糖酶的推导的氨基酸序列具有79.6％的序列一致性(排除空位)。
实例5：胶囊青霉GH10木聚糖酶P244K1的表达
用质粒pP244K1转化根据欧洲专利EP0238023，第14-15页的方法制备的米曲霉MT3568原生质体。
在使转化体在PDA板上形成孢子之前，在COVE蔗糖选择板上通过单个的分生孢子纯化转化体。在30℃下，在YP+2％葡萄糖培养基中，分析来自1ml的96深孔固定培养的培养上清液的转化体产生的胶囊青霉GH10木聚糖酶。在E-Page8％SDS-PAGE48孔凝胶((英杰公司，卡尔斯巴德，加州，美国)上通过考马斯亮蓝染色确认表达。选择一个转化体用于进一步的工作并且将其指定为米曲霉34.1。
用于较大规模的生产，将米曲霉34.1孢子分散到PDA板上并且在37℃下孵育5天。用5ml的0.01％20将融合的孢子板洗涤两次，以使收集的孢子的数目最大化。然后使用孢子悬浮液接种包含100ml的Dap-4C培养基的二十五个500ml烧瓶。将培养株在30℃下进行孵育，同时以100rpm进行恒定振荡。在接种后第四天，通过经由MF75MachV0.2μm PES瓶顶过滤器(bottle top MF75MachV0.2μm PES filter)(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，罗斯基勒，丹麦)过滤收集每种培养液。米曲霉34.1的培养液产生大约52kDa的一个带，如使用E-Page8％SDS-PAGE48孔凝胶通过SDS-PAGE所确定的。通过肽测序证实这个带与胶囊青霉GH10多肽的一致性。
实例6：用于生产胶囊青霉GH10木聚糖酶(P244K1)的替代性方法
基于被鉴定为SEQ ID NO:1的核苷酸序列，可以从多个销售商，例如基因艺术公司(Gene Art)(基因艺术公司生物园(GENEART公司BioPark)，约瑟夫-恩格特街11号(Josef-Engert-Str.11)，93053，雷根斯堡，德国)或DNA2.0公司(DNA2.0，1430奥布赖恩大道(1430O'Brien Drive)，套房E，门洛帕克，加州94025，美国)获得合成基因。合成基因可以被设计成结合另外的DNA序列，例如限制酶切位点或同源重组区，以协助克隆到表达载体中。
使用上面描述的两种合成寡核苷酸引物F-P244K1和F-P244K1，可以使用一个简单的PCR反应来扩增来自SEQ ID NO:1的合成基因的全长开放读码框。然后可以将该基因克隆进表达载体(如在此描述的)中，并且在宿主细胞(如在此描述的)，例如米曲霉中进行表达。
实例7：胶囊青霉GH10木聚糖酶P244K1的纯化
将1000ml体积的过滤的米曲霉34.1液(实例5)调节至pH7.0并且使用0.22μm PES过滤器(赛默飞世尔科技，罗斯基勒，丹麦)进行过滤。以1.8M的浓度向滤液中添加硫酸铵。将滤液装载在60ml用1.8M硫酸铵(pH7.0)平衡的苯基SEPHAROSETM6快流柱(Phenyl SEPHAROSETM6Fast Flowcolumn)(高载量(high sub))(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上。在施加之后，用3柱体积的平衡缓冲液、随后是7柱体积的0.9M硫酸铵以15ml/分钟的流速洗涤该柱(蛋白质与该柱保持结合)。用5柱体积的50mM HEPES(pH7.0)以15ml/分钟的流速洗脱GH10木聚糖酶。收集10ml的部分并且通过SDS-PAGE进行分析(实例5)。将这些部分合并并且将其施加至在25mM HEPES(pH7.0)中平衡的SEPHADEXTMG-25(中(medium))柱(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上。收集、合并这些部分，并且将其施加至60ml在50mM HEPES(pH7.0)中平衡的SOURCETM15Q柱(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上。施加之后，用5柱体积的平衡缓冲液洗涤该柱并且用超过20柱体积从0-1000mM的线性梯度氯化钠洗脱结合的GH10木聚糖酶。收集10ml的部分并且通过SDS-PAGE进行分析(实例5)，并且将具有GH10木聚糖酶的部分合并，至终体积为90ml。通过A280/A260吸光度确定蛋白浓度。
实例8：预处理的玉米芯水解测定
在120℃下，以15％总干重固体(TS)用NaOH(0.08g/g干重芯)将玉米芯预处理60分钟。用水洗涤所得材料，直到它为pH8.2，从而形成经洗涤的碱性预处理的玉米芯(APCC)。通过添加6M HCl将APCC的pH调节至5.0并且用水进行广泛混合，在Cosmos ICMG40湿多效用研磨机(Cosmos ICMG40wet multi-utility grinder)(EssEmm公司，泰米尔纳德邦，印度)中碾磨APCC，并且在121℃下高压灭菌45分钟来制备研磨过筛的碱性预处理的玉米芯(GS-APCC)，最终的TS为3.33％。使用2.2ml深孔板(爱思进公司(Axygen)，联合市(Union City)，加州，美国)在1.0的总反应体积中水解GS-APCC。
用10mg的GS-APCC总固体/ml的50mM包含1mM硫酸锰以及不同酶组合物的乙酸钠(pH5.0)进行水解(表示为mg蛋白质/克的纤维素)。制备酶组合物并且然后将其以从50μl至200μl的范围的体积同时添加至所有的孔中，在每个反应中的终体积为1ml。然后使用ALPS-300TM板式热封机(ALPS-300TMplate heat sealer)(阿博基因公司(Abgene)，埃普索姆，英国)将板密封，充分混合，并且在特定温度下孵育72小时。一式三份地重复所有报道的实验。
水解后，使用0.45μm96孔过滤板(96-well filter plate)(密理博公司(Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州，美国)过滤样品并且如下所述的分析滤液的含糖量。当不立即使用时，将过滤的等分部分冷冻于-20℃下。使用在65℃下，用0.05％w/w苯甲酸-0.005M H2SO4以0.6ml/分钟的流速洗脱的4.6x250mmHPX-87H柱(伯乐实验室公司，赫拉克勒斯，加州，美国)测量稀释于0.005M H2SO4中的样品的糖浓度，并且通过整合来自由纯糖样品校准的屈光指数检测(1100HPLC，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies)，圣克拉拉，加州，美国)的葡萄糖、纤维二糖、以及木糖的信号进行定量。使用所得的葡萄糖等效物计算每个反应的纤维素转化的百分比。使用所得的木糖等效物计算每个反应的低聚木糖转化的百分比。
单独地测量葡萄糖、纤维二糖、以及木糖。对于适当的稀释因子，调节测量的糖浓度。使用软件MICROSOFT EXCELTM软件(微软公司，里奇兰，华盛顿州，美国)处理所有的HPLC数据。
使用以下等式计算纤维素向葡萄糖的转化程度：％葡萄糖转化＝(葡萄糖浓度/限制消化中的葡萄糖浓度)×100。为了计算％转化，基于纤维素酶对照(50-100mg的里氏木霉纤维素酶/克纤维素)设定100％转化点，并且将所有的值除以该数并且然后乘以100。取三份数据点的平均值并且计算标准差。
使用以下等式计算低聚木糖向木糖的转化程度：％木糖转化＝(木糖浓度/限制消化中的木糖浓度)×100。为了计算％转化，基于纤维素酶对照(补充有烟曲霉木聚糖酶(xyl3；WO2006/078256)和埃默森篮状菌β-木糖苷酶[参见实例9]的50-100mg的里氏木霉纤维素酶/克纤维素)设定100％转化点，并且将所有的值除以该数并且然后乘以100。取三份数据点的平均值并且计算标准差。
实例9：酶组合物的制备
烟曲霉纤维二糖水解酶I的制备。如在WO2011/057140中所描述，在米曲霉中重组地制备烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:5[DNA序列]以及SEQ ID NO:6[推导的氨基酸序列])。将烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I液过滤、浓缩并且使用配备有10kDa聚醚砜膜(颇尔滤清器公司(PallFiltron)，诺斯伯勒，马萨诸塞州，美国)的切向流浓缩器(颇尔滤清器公司，诺斯伯勒，马萨诸塞州，美国)、与20mM Tris-HCl(pH8.0)进行缓冲液交换。使用在20mM Tris-HCl(pH8)中平衡的Q柱(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)纯化烟曲霉GH7A纤维二糖水解酶I的脱盐液。使用0至1M的线性梯度NaCl洗脱该蛋白质。收集部分并且使用8-16％无染色(Stain-free)SDS-PAGE(伯乐实验室公司，赫拉克勒斯，加州，美国)、基于SDS-PAGE合并包含纤维二糖水解酶I的部分。
烟曲霉纤维二糖水解酶II的制备。如在WO2011/057140中所描述，在米曲霉中重组地制备烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:7[DNA序列]以及SEQ ID NO:8[推导的氨基酸序列])。根据厂商的说明书，将烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II的过滤液过滤并且使用400ml SEPHADEXTMG-25柱(通用电气医疗集团，英国)缓冲液交换进20mM Tris(pH8.0)中。将这些部分合并并且调节至1.2M硫酸铵-20mM Tris(pH8.0)。将纤维二糖水解酶II装载在用1.2M硫酸铵在20mM Tris(pH8.0)中平衡的苯基SEPHAROSETM6快流柱(高载量)(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上，并且用不具有硫酸铵的20mM Tris(pH8.0)洗脱。将这些部分合并。
具有增强纤维素分解活性的青霉属(埃默森(emersonii))GH61A多肽的制备。根据WO2011/041397重组地制备并纯化青霉属(埃默森)GH61A多肽(SEQ ID NO:9[DNA序列]以及SEQ ID NO:10[推导的氨基酸序列])。
里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II的制备。根据WO2011/057140重组地制备里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II(SEQ ID NO:11[DNA序列]以及SEQ ID NO:12[推导的氨基酸序列])。将里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II液过滤、脱盐并且使用配备有10kDa聚醚砜膜的切向流浓缩器缓冲液交换进20mM Tris(pH8.0)中。
烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶的制备。根据WO2005/047499，将米曲霉用作宿主，重组地制备(U569)(SEQ ID NO:13[DNA序列]以及SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])。将该液过滤并且用20％乙酸钠调节至pH8.0，这使得该溶液混浊。为了除去混浊，将该溶液在20000x g下离心20分钟，并且通过0.2μm过滤单位(耐洁公司(Nalgene)，罗切斯特，纽约，美国)过滤上清液。用去离子水稀释该滤液，以达到与50mM Tris/HCl(pH8.0)相同的传导性。将调节过的酶溶液施加至在50mM Tris-HCl(pH8.0)中平衡的Q快流柱(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上并且使用0至500mM的线性梯度氯化钠进行洗脱。将部分合并并且用1％(w/v)活性炭进行处理，以除去β-葡糖苷酶池(pool)的颜色。通过将悬浮液经由0.2μm过滤单位(耐洁公司，罗切斯特，纽约，美国)过滤除去炭。用20％乙酸将滤液调节至pH5.0并且用去离子水稀释10倍。将调节的滤液施加至在10mM琥珀酸(pH5.0)中平衡的SP快流柱(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上并且使用0至500mM的线性梯度氯化钠洗脱β-葡糖苷酶。
埃默森篮状菌GH3β-木糖苷酶的制备。如在WO2011/057140中所描述，在米曲霉中重组地制备埃默森篮状菌GH3β-木糖苷酶(SEQ ID NO:15[DNA序列]以及SEQ ID NO:16[推导的氨基酸序列])。将埃默森篮状菌GH3β-木糖苷酶脱盐并且使用配备有10kDa聚醚砜膜的切向流浓缩器缓冲液交换进50mM乙酸钠(pH5.0)中。
使用微板BCATM蛋白测定试剂盒(Microplate BCATMProtein Assay Kit)(赛默飞世尔科技(Thermo Fischer Scientific)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州，美国)确定上述每种单组分的蛋白浓度，在该试剂盒中将牛血清白蛋白用作蛋白标准品。将如上述制备的每种单组分合并，以产生由以下各项组成的酶组合物：37％烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I、25％烟曲霉Cel6A纤维二糖水解酶II、具有增强纤维素分解活性的15％埃默森青霉(Penicilliumemersonii)GH61A多肽、10％里氏木霉GH5内切葡聚糖酶II、5％木聚糖酶、5％烟曲霉β-葡糖苷酶、以及3％埃默森篮状菌β-木糖苷酶。在此将该酶组合物指定为“不具有木聚糖酶的酶组合物”。
实例10：胶囊青霉GH10木聚糖酶(P244K1)对在50-60℃下由酶组合物水解GS-APCC的作用
在50℃、55℃、以及60℃下评估胶囊青霉GH10木聚糖酶(P244K1)对使用不具有木聚糖酶的酶组合物(实例9)水解GS-APCC的作用。将不具有木聚糖酶的酶组合物用作对照。将具有胶囊青霉GH10木聚糖酶的酶组合物以1.425mg总蛋白/g纤维素添加至GS-APCC水解反应中，而将不具有木聚糖酶的酶组合物以1.5mg总蛋白/g纤维素添加至GS-APCC水解反应中。
如在实施例8中所描述进行该测定。将与GS-APCC(1％总固体)的1ml反应在包含1mM硫酸锰的50mM乙酸钠(pH5.0)中进行72小时。所有反应一式三份地进行并且在水解开始时涉及单个的混合。
如在图1中所示，在50℃、55℃、以及60℃下，与不具有木聚糖酶的酶组合物相比，包括胶囊青霉GH10木聚糖酶(P244K1)的酶组合物在1.425和1.5mg总蛋白/克纤维素下显著地增加纤维素水解为葡萄糖(因为胶囊青霉GH10木聚糖酶(P244K1)将纤维素转化为葡萄糖的程度高于不具有木聚糖酶的酶组合物)。
如在图2中所示，在50℃、55℃、以及60℃下，与不具有木聚糖酶的酶组合物相比，包括胶囊青霉GH10木聚糖酶(P244K1)的酶组合物在1.425和1.5mg总蛋白/克纤维素下显著地增加低聚木糖水解为木糖(因为胶囊青霉GH10木聚糖酶(P244K1)将低聚木糖转化为木糖的程度高于不具有木聚糖酶的酶组合物)。
本发明进一步通过以下编号的段落进行说明。
[1]一种具有木聚糖酶活性的分离的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的一种多肽；(b)由在至少高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；(d)在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及(e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的多肽的一个片段。
[2]如段落1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[3]如段落1所述的多肽,该多肽由在高或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码。
[4]如段落1所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
[5]如段落1-4中任一项所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:2的成熟多肽或由其组成。
[6]如段落5所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸23至400。
[7]如段落1所述的多肽，该多肽是在一个或多个位置处包含一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。
[8]如段落1所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的一个片段，其中该片段具有木聚糖酶活性。
[9]一种包括一个催化结构域的分离的多肽，该催化结构域选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸23至342具有至少80％序列一致性的一个催化结构域；(b)由在至少非常高严谨度条件下与SEQ IDNO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列；或其全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列具有至少80％序列一致性的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；(d)在一个或多个位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸23至342的变体；以及(e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的催化结构域的一个片段。
[10]如段落9所述的多肽，该多肽进一步包括一个碳水化合物结合结构域。
[11]一种包括可操作地连接至一个催化结构域的碳水化物结合结构域的分离的多肽，其中该结合结构域选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸366至400具有至少80％序列一致性的一个碳水化物结合结构域；(b)由在至少非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435或其全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个碳水化物结合结构域；(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435具有至少80％序列一致性的一种多核苷酸编码的一个碳水化物结合结构域；(d)在一个或多个位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸366至400的变体；以及(e)具有碳水化合物结合活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的碳水化物结合结构域的一个片段。
[12]如段落11所述的多肽,其中该催化结构域获得自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
[13]一种组合物，该组合物包括如段落1-12中任一项所述的多肽。
[14]一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-12中任一项所述的多肽。
[15]一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如段落14所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在一个表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
[16]一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如段落14所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽的产生的一个或多个控制序列。
[17]一种产生如段落1-12中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞处于其野生型形式时产生该多肽。
[18]如段落17所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
[19]一种产生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落16所述的宿主细胞。
[20]如段落19所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
[21]用编码如段落1-12中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。
[22]一种产生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养如段落21所述的转基因植物或植物细胞。
[23]如段落22所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
[24]一种产生亲本细胞的突变体的方法，该方法包括使编码如段落1-12中任一项所述的多肽的多核苷酸失活，这导致突变体比该亲本细胞产生的多肽少。
[25]一种通过如段落24所述的方法产生的突变体细胞。
[26]如段落25所述的突变体细胞，该突变体细胞进一步包括一个编码天然或异源蛋白质的基因。
[27]一种产生蛋白质的方法，该方法包括：在有益于产生该蛋白质的条件下培养如段落25或26所述的突变体细胞。
[28]如段落27所述的方法，该方法进一步包括回收该蛋白质。
[29]一种包括如段落14所述的多核苷酸的子序列的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中可任选地，该dsRNA是一个siRNA或miRNA分子。
[30]如段落29所述的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，该分子长约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个双核苷酸。
[31]一种抑制具有木聚糖酶活性的多肽在细胞中的表达的方法，该方法包括向该细胞给予或在该细胞中表达如段落29或30所述的双链抑制性RNA(dsRNA)分子。
[32]一种通过如段落31所述的方法产生的细胞。
[33]如段落32所述的细胞，该细胞进一步包括一个编码天然或异源蛋白质的基因。
[34]一种产生蛋白质的方法，该方法包括：在有益于产生该蛋白质的条件下培养如段落32或33所述的细胞。
[35]如段落34所述的方法，该方法进一步包括回收该蛋白质。
[36]一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至22或由其组成。
[37]一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括一个编码可操作地连接至如段落36所述的多核苷酸的蛋白质的基因，其中该基因对于编码该信号肽的多核苷酸来说是异源的。
[38]一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括一个编码可操作地连接至如段落36所述的多核苷酸的蛋白质的基因，其中该基因对于编码该信号肽的多核苷酸来说是异源的。
[39]一种产生蛋白质的方法，该方法包括：在有益于产生该蛋白质的条件下培养一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括一个编码可操作地连接至如段落36所述的多核苷酸的蛋白质的基因，其中该基因对于编码该信号肽的多核苷酸来说是异源的。
[40]如段落39所述的方法，该方法进一步包括回收该蛋白质。
[41]一种用于降解或转化纤维素材料或包含木聚糖的材料的工艺，该工艺包括：在如段落1-12中任一项所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料或包含木聚糖的材料。
[42]如段落41所述的工艺，其中对该纤维素材料或包含木聚糖的材料进行预处理。
[43]如段落41或42所述的工艺，其中该酶组合物包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有增强纤维素分解活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。
[44]如段落43所述的工艺，其中该纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二塘水解酶、以及β-葡糖苷酶。
[45]如段落43所述的工艺，其中该半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡萄糖醛酸酶。
[46]如段落41-45中任一项所述的工艺，该工艺进一步包括回收降解的纤维素材料或包含木聚糖酶的材料。
[47]如段落46所述的工艺，其中该降解的纤维素材料或包含木聚糖的材料是一种糖。
[48]如段落47所述的工艺，其中该糖选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。
[49]一种用于产生发酵产物的工艺，该工艺包括：(a)在如段落1-12中任一项所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物糖化纤维素材料或包含木聚糖的材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料或包含木聚糖的材料，以产生该发酵产物；并且(c)从发酵中回收该发酵产物。
[50]如段落49所述的工艺，其中对该纤维素材料或包含木聚糖的材料进行预处理。
[51]如段落49或50所述的工艺，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有增强纤维素分解活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。
[52]如段落51所述的工艺，其中该纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二塘水解酶、以及β-葡糖苷酶。
[53]如段落51所述的工艺，其中该半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡萄糖醛酸酶。
[54]如段落49-53中任一项所述的工艺，其中在同时的糖化和发酵中同时进行步骤(a)和(b)。
[55]如段落49-54中任一项所述的工艺，其中该发酵产物是一种醇、链烷烃、环烷烃、链烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[56]一种发酵纤维素材料或包含木聚糖的材料的方法，该方法包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料或包含木聚糖的材料，其中该纤维素材料或包含木聚糖的材料在如段落1-12中任一项所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下被一种酶组合物糖化。
[57]如段落56所述的工艺，其中发酵该纤维素材料或包含木聚糖的材料产生一种发酵产物。
[58]如段落57所述的工艺，该工艺进一步包括从发酵中回收该发酵产物。
[59]如段落57或58所述的工艺，其中该发酵产物是一种醇、链烷烃、环烷烃、链烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[60]如段落56-59中任一项所述的工艺，其中在糖化之前，对该纤维素材料或包含木聚糖的材料进行预处理。
[61]如段落56-60中任一项所述的工艺，其中该酶组合物包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有增强纤维素分解活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。
[62]如段落61所述的工艺，其中该纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二塘水解酶、以及β-葡糖苷酶。
[63]如段落61所述的工艺，其中该半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡萄糖醛酸酶。
[64]一种全发酵液配制品或细胞培养组合物，包括如段落1-12中任一项所述的多肽。
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (16)

1.一种具有木聚糖酶活性的分离的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的一种多肽；
(b)由在至少高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；
(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；
(d)在一个或多个(例如，几个)位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体；以及
(e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的多肽的一个片段。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
3.一种包括一个催化结构域的分离的多肽，该催化结构域选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸23至342具有至少80％序列一致性的一个催化结构域；
(b)由在至少非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列；或其全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列具有至少80％序列一致性的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
(d)在一个或多个位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸23至342的变体；以及
(e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的催化结构域的一个片段。
4.一种包括可操作地连接至一个催化结构域的碳水化物结合结构域的分离的多肽，其中该结合结构域选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸366至400具有至少80％序列一致性的一个碳水化物结合结构域；
(b)由在至少非常高严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435或其全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一个碳水化物结合结构域；
(c)由与SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435具有至少80％序列一致性的一种多核苷酸编码的一个碳水化物结合结构域；
(d)在一个或多个位置处包括一个取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸366至400的变体；以及
(e)具有碳水化合物结合活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的碳水化物结合结构域的一个片段。
5.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-4中任一项所述的多肽。
6.一种产生如权利要求1-4中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞处于其野生型形式时产生该多肽；并且可任选地，
(b)回收该多肽。
7.一种产生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括可操作地连接至一个或多个控制序列的如权利要求5所述的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多肽的产生；并且可任选地，
(b)回收该多肽。
8.用编码如权利要求1-4中任一项所述的多肽的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。
9.一种产生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求8所述的转基因植物或植物细胞；并且可任选地，
(b)回收该多肽。
10.一种产生亲本细胞的突变体的方法，该方法包括使编码如权利要求1-4中任一项所述的多肽的多核苷酸失活，这导致该突变体比该亲本细胞产生的多肽少。
11.一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至22或由其组成。
12.一种产生蛋白质的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该蛋白质的条件下培养一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括一个编码可操作地连接至如权利要求11所述的多核苷酸的蛋白质的基因，其中该基因对于编码该信号肽的多核苷酸来说是异源的；并且可任选地，
(b)回收该蛋白质。
13.一种用于降解或转化纤维素材料或包含木聚糖的材料的工艺，该工艺包括：在如权利要求1-4中任一项所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料或包含木聚糖的材料。
14.一种用于产生发酵产物的工艺，该工艺包括：
(a)在如权利要求1-4中任一项所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物糖化一种纤维素材料或包含木聚糖的材料；
(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料或包含木聚糖的材料，以产生该发酵产物；并且
(c)从发酵中回收该发酵产物。
15.一种发酵纤维素材料或包含木聚糖的材料的工艺，该工艺包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料或包含木聚糖的材料，其中该纤维素材料或包含木聚糖的材料在如权利要求1-4中任一项所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下被一种酶组合物糖化。
16.一种全发酵液配制品或细胞培养组合物，包括如权利要求1-4中任一项所述的多肽。
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