CN103948581B

CN103948581B - 左卡尼汀联合l-精氨酸在制备治疗糖尿病视网膜病变神经损伤药物中的应用

Info

Publication number: CN103948581B
Application number: CN201410080375.3A
Authority: CN
Inventors: 曹玉; 王云霄; 赵振寰; 王兰凤; 耿清波
Original assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Current assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Priority date: 2014-02-26
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2034-02-26
Also published as: CN103948581A

Abstract

本发明公开了含有左卡尼汀和L‑精氨酸的药物组合物，用于联合制备治疗糖尿病视网膜病变神经损伤药物中的应用，尤其是制备治疗糖尿病视网膜病变的视网膜神经损伤和Müller细胞损伤药物中的应用。本发明通过细胞和动物实验证明，与单独使用左卡尼汀相比，联合L‑精氨酸可以更加有效地保护糖尿病视网膜病变神经损伤，尤其是糖尿病视网膜病变的视网膜神经损伤和Müller细胞损伤，达到了协同增效的技术效果。

Description

左卡尼汀联合L-精氨酸在制备治疗糖尿病视网膜病变神经损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及左卡尼汀联合L-精氨酸在制备治疗糖尿病视网膜病变神经损伤药物中的应用。

背景技术

随着人类生活水平的普遍提高及人均寿命的延长，目前国内外糖尿病的发病率较以往显著升高。糖尿病有许多并发症，其中糖尿病视网膜病变(retinal retinopathy，DR)是其在眼部的最常见、最严重的微血管并发症之一，是主要致盲性眼病之一，主要是由于视网膜微血管发生病变从而引起视网膜一系列的病理改变，其发病率及严重程度随着糖尿病病程的延长而增耐。有研究报道糖尿病病程如果长达5年，则DR发病率可达44.4％，如糖尿病病程达7年，则DR的发病率可高达56％。

目前认为DR的基本病理学改变如下：①周细胞的选择性丢失；②基底膜的增厚；③微血管瘤的形成；④内皮细胞的增生；⑤新生血管的形成。其中周细胞的选择性丢失被视为其最早期的病理学改变。正常视网膜毛细血管中周细胞与内皮细胞的数量之比约为1∶1，而在糖尿病及其并发症患者中，两者比值约为1∶4，甚至更低。近年的研究表明，糖尿病视网膜病变的发生与氧化应激有关。氧化应激反应是指化学因素和环境因素引起体内自由基增加，导致抗氧化酶活力降低，DNA损伤，从而促进肿瘤生长、心血管疾病及细胞凋亡。在眼部，通过刺激细胞凋亡，破坏细胞膜的完整性，造成视网膜的不可逆损伤。高血糖使葡萄糖的有氧氧化增强，表现为在三羧酸循环过程产生的电子增多、线粒体的质子梯度增加，进而漏出的电子与O₂结合生成O₂ ^-，即活性氧(ROS)产生增加，导致氧化应激反应。Takeshi Nishikawa等研究表明：高血糖能增加线粒体ROS的产生，而这一过程又与糖尿病血管病变的发生有关。ROS宜攻击不饱利脂肪酸，而视网膜又是富含多不饱和脂肪酸的膜组织，并且相较于其他组织，对氧气的摄取能力利葡萄糖的氧化能力更强。所以糖尿病病变时，视网膜容易受到氧化应激的损伤。除此之外，高血糖能引起机体多条代谢通路反应改变，包括蛋白质非酶糖基化终产物(AGEs)形成、蛋白激酶C激活、多元醇代谢异常、氨基已糖途径激活，同时也促使各种炎症因子和细胞粘附因子的表达增多等。上述一系列病理生理改变导致视网膜血管壁周细胞死亡、基底膜增厚，使血管壁机能不全，破坏了血-视网膜屏障功能，进而导致渗透压增高，细胞水肿。

神经胶质细胞(neuroglial cell)又称神经胶细胞、胶质细胞，是神经系统的组成单位之一。近年来研究表明，视网膜Müller细胞是视网膜中最主要的胶质细胞，也是一种特殊化的神经胶质细胞，具有维持视网膜正常结构、参与构成血-视网膜屏障、支持和营养神经元、调节神经递质循环等生理功能。其在视网膜病变的多种病理过程中起着非常重要的作用。

由于糖尿病性视网膜病变的发病机制复杂，一直以来都缺乏有效的治疗手段。激光和手术治疗不能阻止DR的病情发展。随着对DR发病机制的深入研究，人们发现药物治疗可以阻断DR发病的多个途径。但目前常用的药物如抗血管内皮生长因子和糖皮质激素等等，在评价其治疗有效性及远期安全性等方面备有争议。因此，寻找安全有效的药物，用于DR的早期治疗，对降低致盲率尤为重要。

左卡尼汀(L-carnitine，LC)又名左旋肉碱，是哺乳类动物体内能量代谢所必须的天然物质，主要于肝脏、肾脏、心脏等组织内由三甲赖氨酸转化成γ-丁酰甜菜碱，再由肝脏、肾及脑组织将其转化成卡尼汀而合成，参与体内脂类代谢，对机体细胞能量代谢产生及转运起重要作用，是心、脑、肾等组织器官代谢所需能量的主要来源之一。同时LC还具有促进蛋白质降解、抗氧化、保护细胞膜等功能。左卡尼汀目前已广泛应用于心肌病、肝脏疾病、透析病人、糖尿病、男性不育、神经肌肉疾病、肾脏疾病等疾病的治疗。正常情况下，LC可将长链脂肪酸通过位于线粒体外膜的卡尼汀脂酰转移酶-I及内膜的卡尼汀脂酰转移酶-II将其转运到线粒体中，然后在线粒体酶的作用可将脂酰辅酶A(CoA)在线粒体中进行β-氧化。缺血、缺氧时脂类代谢发生障碍，可导致长链脂酰卡尼汀在线粒体中堆积及脂酰-CoA的堆积，致使游离的卡尼汀被大量消耗减少，而堆积的脂酰-CoA可导致膜结构的改变、膜相崩解致细胞死亡。如体内有足量的游离卡尼汀，则可使堆积的脂酰-CoA进入线粒体中在线粒体酶的作用下进行β-氧化，从而纠正脂类代谢障碍所致的能量失衡，防上脂质过氧化。另外有研究表明，LC除了可以促进脂肪酸通过β-氧化进行氧化利用外，它还可作为一种氧自由基清除剂有效的清除体内的氧自由基，其在增强机体氧化应激、防止脂质过氧化等方面具有明显保护作用。

陈杰(硕士论文《左卡尼汀对体外高糖培养鼠视网膜神经细胞的保护作用及机制探讨》)、尹晓琳(硕士论文《左卡尼汀对高糖条件下视网膜神经细胞的保护作用》)、于常红(左卡尼汀对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞保护作用的实验研究，《中国药理学通报》，2013年第29卷第11期)都就左卡尼汀对视网膜神经细胞的保护作用进行了研究。这些研究表明，左卡尼汀对高糖造成的视网膜神经细胞氧化损伤的保护作用与其发挥抗氧化特性有关。作为一种抗氧化剂，左卡尼汀可减少氧自由基的生成、增强细胞的抗氧化能力，并可稳定线粒体膜电位、改善线粒体功能，从而抑制高糖状态下氧化应激所造成的细胞凋亡。

另外，张莹(硕士论文《左卡尼汀对体外高糖培养鼠视网膜Müller细胞的保护作用及机制》)研究了左卡尼汀对视网膜Müller细胞的保护作用。研究表明，高糖对视网膜Müller细胞的损伤主要是由于ROS大量增加引起的氧化应激损伤，而LC对高糖损伤视网膜Müller细胞具有保护作用，可以抑制Müller细胞的凋亡，其机制可能与减少ROS生成，抑制线粒体膜通透性，维持线粒体膜电位有关。

但鉴于糖尿病性视网膜病变的复杂发病机制，以及发病的多个途径，如何进一步找寻更加安全有效的药物是人们关注的重点。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明人通过理论并结合大量细胞、动物实验发现，左卡尼汀联合L-精氨酸可以协同保护糖尿病视网膜病变神经损伤，尤其是糖尿病视网膜病变的视网膜神经损伤和Müller细胞损伤。

因此，本发明的目的是提供一种药物组合物，其特征在于，所述组合物中含有左卡尼汀和L-精氨酸，用于治疗糖尿病视网膜病变神经损伤。

进一步地，所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩尔比为1∶1～10。

进一步地，所述组合物的剂型为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂、乳剂或混悬剂。

本发明的另一目的是提供左卡尼汀联合L-精氨酸在制备治疗糖尿病视网膜病变神经损伤的药物中的应用，尤其是治疗糖尿病视网膜病变的视网膜神经损伤和Müller细胞损伤的药物中的应用。

进一步地，上述应用中左卡尼汀和L-精氨酸的摩尔比为1∶1～10，更进一步优选为1∶3～8，最优选为1∶6。

进一步地，上述应用中左卡尼汀和L-精氨酸可以以片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等常规剂型进行给药。

L-精氨酸(L-Arginine，L-Arg)是一种α氨基酸，其在多个过程中都扮演着重要的角色，例如细胞分裂、伤口复原、排出氨、免疫功能和分泌激素等。L-精氨酸和氨分子在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的催化下相互作用生成NO和L-胍氨酸。NO可激活鸟苷酸环化酶(cGMPase)生成环磷酸鸟苷(cGMP)，进而发挥其生物学效应，这一途径称为NO途径。NOS是一种含铁的单胺氧化酶，是NO合成过程中的限速酶，根据NOS的组织分布范围、钙依赖性和基因表达的不同，将NOS分为诱导型NOS(inducible NOS，iNOS)、神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)及内皮型NOS(endothe NOS，eNOS)。NO主要的生物学作用为：(1)生理剂量的NO可参与免疫反应及炎症过程中的信息传递，大剂最的NO则能引起神经元细胞损伤或杀死正常细胞，并导致细胞问信息传导障碍。(2)信息传递作用：NO是自主神经系统中神经元释放的一种不典型神经递质，广泛地存在于人体内的各个脏器，以局部扩散的方式作用于邻近细胞，通过NO途径生成的cGMP发挥生物学效应：(3)舒张血管：NO与GC结合并激活sGC，从而使cGMP水平升高而发挥其生物学效应：即通过松驰血管平滑肌，舒张血管来调节外周血管阻力，并参与调控脑循环、冠状动脉循环和肺循环；(4)炎症介质：白细胞介素I(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、脂多糖可诱导中性粒细胞和巨噬细胞L-Arg-NO途径的表达，生成大量NO，一方面可杀死胞内细菌、肿瘤细胞和寄生虫，另一方面又能损伤正常组织，造成细胞死亡，即参与机体的自身免疫反应。

本发明的有益效果在于：通过细胞和动物实验证明，与单独使用左卡尼汀相比，联合L-精氨酸可以更加有效地保护糖尿病视网膜病变神经损伤，尤其是糖尿病视网膜病变的视网膜神经损伤和Müller细胞损伤，达到了协同增效的技术效果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

实验例1

1.1实验动物

选择出生1-3d的标准普通级SD大鼠，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心提供，符合国家医用动物使用标准，标准号为清洁级。

1.2SD大鼠视网膜神经细胞的原代培养及高糖模型的建立，包括以下步骤(具体操作参见“左卡尼汀对体外高糖培养鼠视网膜神经细胞的保护作用及机制探讨”，陈杰，青岛大学硕士论文，2013)：

1.2.1配制以下主要试剂

含10％胎牛血清培养液、葡萄糖、5-溴-2’脱氧尿苷、4％多聚甲醛、PBS磷酸盐缓冲液。

1.2.2多聚赖氨酸处理细胞培养瓶或培养板

为促进所培养的视网膜神经细胞的贴壁，于接种前预先用多聚赖氨酸处理细胞培养瓶或培养板。方法：于实验前一天，25mm²培养瓶加入100μg／ml多聚赖氨酸2.0ml，均匀覆盖瓶底，于37℃培养箱内过夜，吸除培养瓶内多聚赖氨酸，PBS洗三遍，放于37℃培养箱内干燥备用。拟行免疫荧光鉴定的细胞接种于6孔板，培养板中预先放置27mm×29mm的盖玻片，并如上所述方法用多聚赖氨酸提前处理。

1.2.3原代视网膜神经细胞悬液的制备

将出生1-3d的SD大鼠浸泡至75％酒精中进行消毒5min，超净工作台内无菌取眼球，于冰浴PBS(含青霉素100U／ml青霉素及100μg／ml链霉素)洗3遍，显微镜下自角巩膜缘后约1mm处作环形切口，去除眼前节组织及玻璃体，钝性分离出视网膜神经上皮层，冰浴PBS漂洗2遍。显微眼科剪将取出的视网膜神经上皮层剪成约1mm²大小的组织块，收集于离心管内。加入约10倍体积的0.125％胰蛋白酶，37℃消化10-15min。含10％胎牛血清的DMEM／F12培养液终止消化，吸管轻轻反复吹打成单细胞悬液后400目不锈钢滤网过滤，1000r／min离心5min，收集细胞沉淀，含10％胎牛血清的DMEM／F12培养液重悬细胞。细胞计数板进行细胞计数，调整细胞密度为1×10⁶个／ml。

1.2.4原代视网膜神经细胞的接种培养

细胞悬液制备好后将其接种于事先置有包被了多聚赖氨酸盖玻片的6孔板或者多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，置于37℃、5％的CO₂培养箱培养。当培养24h时加入终浓度为20μg／ml的5-溴-2’脱氧尿苷以抑制非神经细胞的生长，48h时换液，此后每2-3d换液一次。

1.2.5高糖模型的建立

将细胞悬液接种于24孔板中，细胞培养3d时，选择30mmol／L葡萄糖继续培养48h，观察细胞形态。

1.3实验分组及方法

①正常细胞培养组(对照组)；②高糖损伤组(HG)；③左卡尼汀保护组(LC，100μmol／L)；④L-精氨酸保护组(L-Arg，600μmol／L)；⑤左卡尼汀(50μmol／L)和L-精氨酸(300μmol／L)的协同保护组(LC+L-Arg-1)；⑥左卡尼汀(50μmol／L)和L-精氨酸(50μmol／L)的协同保护组(LC+L-Arg-2)；⑦左卡尼汀(30μmol／L)和L-精氨酸(300μmol/L)的协司保护组(LC+L-Arg-3)。

第①组取原代视网膜神经细胞正常培养，第②组取高糖模型的视网膜神经细胞进行培养，第③-⑦组取高糖模型的视网膜神经细胞并加入相应的保护剂进行培养，培养时间在24h和48h时进行台盼蓝拒染实验计算细胞存活率。具体步骤为：首先消化离心收集细胞，根据细胞量用适当的细胞重悬液重悬细胞，吸取100μl重悬的细胞至离心管中，加入100μl台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色3min。吸取少量已染色的细胞，用细胞计数板计数，每个样品至少计数500个细胞。

细胞存活率=(细胞总数一蓝色细胞数)／细胞总数×100％。

1.4统计学处理

实验数据以Y±s表示，Y代表均值。采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。统计学方法采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。

1.5实验结果

该实验结果(见表1)显示：高糖作用下视网膜神经细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，左卡尼汀保护组细胞凋亡率低于高糖损伤组(P<0.05)，提示左卡尼汀能够抑制高糖损伤所致的细胞凋亡；但三种摩尔比的左卡尼汀和L-精氨酸的协同保护组细胞凋亡率明显低于高糖损伤组(P<0.01)，提示左卡尼汀利L-精氨酸发挥了协同增效的作用。

表1左卡尼汀联合L-精氨酸对糖尿病性视网膜病变的视网膜神经损伤的影响

注：*表示与正常组比较P<0.05，**表示与正常组比较P<0.01；#表示与高糖组比较<0.05，##表示与高糖组比较<0.01。

实验2

2.1SD大鼠视网膜Müller细胞的原代培养，包括以下步骤(具体操作参见“左卡尼汀对体外高糖培养鼠视网膜Müller细胞的保护作用及机制”，张莹，青岛大学硕士论文，2013)：

2.1.1多聚赖氨酸处理细胞培养板

2.1.2原代视网膜细胞悬液的制备

取出生后1～3d的SD大鼠，置于75％酒精中浸泡消毒和麻醉，5～8min后将其处死，无菌条件下取出眼球，置于PBS溶液中漂洗3次，去除球周筋膜组织，洗净眼球，自角巩膜缘后1mm作环形切口，取出角膜、晶状体和玻璃体，将视网膜神经上皮层从眼杯中钝性分离，用显微眼科剪将视网膜神经上皮层剪碎，收集到离心管中，离心，去除部分上清。

在离心管中加入等体积的0.125％胰蛋白酶，轻轻吹打，37℃水浴中消化8～15min，充分吹打细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM／F12培养液终止消化，400目不锈钢滤网过滤至离心管中，1000r／min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。

向细胞沉淀中加入DMEM／F12培养液(90％DMEM／F12培养基15mM HEPES、10％胎牛血清、2.5mM L-谷氨酰胺、青霉素100U／ml、链霉素100μ／ml)，反复吹打以重悬细胞。

2.1.3原代视网膜细胞的接种

2.2SD大鼠视网膜Müller细胞的纯化培养

吸出培养瓶中培养液，PBS洗涤1次，加入0.125％胰蛋白酶(覆盖瓶底即可)消化，相差显微镜下观察，见细胞收缩变圆、部分细胞悬浮后，吸除胰蛋白酶。加入含10％胎牛血清的DMEM／F12培养液终止消化，反复吹打重悬细胞。细胞计数，同原代细胞培养。分装细胞悬液至培养瓶中，置于37℃细胞培养箱培养。如此重复2～3遍后，即可得到细胞形态基本一致的视网膜Müller细胞。

2.3视网膜Müller细胞高糖模型的建立

2.4实验分组及方法

①正常细胞培养组(对照组)；②高糖损伤组(HG)；③左卡尼汀保护组(LC，100μmol／L)；④L-精氨酸保护组(L-Arg，600μmol／L)；⑤左卡尼汀(50μmol／L)和L-精氨酸(300μmol／L)的协同保护组(LC+L-Arg-1)；⑥左卡尼汀(50μmol／L)和L-精氨酸(50μmol／L)的协同保护组(LC+L-Arg-2)；⑦左卡尼汀(30μmol／L)和L-精氨酸(300μmol／L)的协同保护组(LC+L-Arg-3)。

第①组取原代视网膜Müller细胞正常培养，第②组取高糖模型的视网膜Müller细胞进行培养，第③-⑦组取高糖模型的视网膜Müller细胞并加入相应的保护剂进行培养，培养时间在24h和48h时进行台盼蓝拒染实验计算细胞存活率。具体步骤为：

0.125％胰蛋白酶消化Müller细胞，收集细胞，1000r／min离心3min，弃上清，取500μl细胞重悬液重悬细胞。取100μl重悬的细胞至离心管中，加入100μl台盼蓝染色液(2X)，混匀，染色3min。吸取100μl染色后的细胞，血球计数板计数，分别计数活细胞和死细胞数，计算细胞存活率。

细胞存活率=(细胞总数一蓝色细胞数)／细胞总数×100％。

2.5统计学处理

2.6实验结果

该实验结果(见表2)显示：高糖作用下视网膜Müller细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，左卡尼汀保护组Müller细胞凋亡率低于高糖损伤组(P<0.05)，提示左卡尼汀能够抑制高糖损伤所致的Müller细胞凋亡；但三种摩尔比的左卡尼汀和L-精氨酸的协同保护组Müller细胞凋亡率明显低于高糖损伤组(P<0.01)，提示左卡尼汀和L-精氨酸发挥了协同增效的作用。

表2左卡尼汀联合L-精氨酸对糖尿病性视网膜病变的视网膜Müller细胞损伤的影响

实验3

3.1糖尿病大鼠模型的建立，具体操作参见“左卡尼汀对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞保护作用的实验研究”，于常红等，《中国药理学通报》，2013年第29卷第11期：

实验室标准条件下，大鼠高糖饲料适应性喂养，空腹血糖达到16.7mmol／L以上为建模成功(测试前禁食12h)。

3.2实验分组及方法

①正常对照组；②糖尿病模型组；③左卡尼汀保护组(LC，200mg／Kg)；④L-精氨酸保护组(L-Arg，1200mg／Kg)；⑤左卡尼汀(100mg／Kg)和L-精氨酸(600mg／Kg)的协同保护组(LC+L-Arg-1)；⑥左卡尼汀(100mg／Kg)和L-精氨酸(100mg／Kg)的协同保护组(LC+L-Arg-2)；⑦左卡尼汀(60mg／Kg)和L-精氨酸(600mg／Kg)的协同保护组(LC+L-Arg-3)。

第①组取正常大鼠生理盐水灌胃，700mg／Kg，每天一次；第②组取糖尿病模型组大鼠生理盐水灌胃，700mg／Kg，每天一次；第③一⑦组取糖尿病模型组大鼠灌胃给予相应的保护剂，6周后处死大鼠，取视网膜染色。过程参见“左卡尼汀对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞保护作用的实验研究”，于常红等，《中国药理学通报》,2013年第29卷第11期，第1.3_3节。光学显微镜下观察视网膜各层，细胞核呈棕黄色颗粒染色的即为凋亡细胞。

凋亡指数AI=(凋亡细胞数量／细胞总数量)×100％。

3.3统计学处理

3.4实验结果

该实验结果(见表3)显示：糖尿病模型组的大鼠视网膜神经节细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，左卡尼汀保护组大鼠视网膜神经节细胞凋亡率低于高糖损伤组(P<0.05)，提示左卡尼汀能够抑制糖尿病所致的大鼠视网膜神经节细胞凋亡；但三种摩尔比的左卡尼汀和L一精氨酸的协同保护组大鼠视网膜神经节细胞凋亡率明显低于糖尿病模型组(P<0.01)，提示左卡尼汀和L.精氨酸发挥了协同增效的作用。

表3左卡尼汀联合L.精氨酸对糖尿病大鼠的视网膜神经节细胞凋亡的影响

组别(n=6)	AI指数(％)
		正常对照组	2.4±0.7
糖尿病模型组	15.5±2.8**
		LC	10.8±3.O*#
L-Arg	14.7±1.4
		LC+L-Arg-1	4.8±1.2*##
LC+L-Arg-2	5.1±1.5*##
		LC+L-Arg-3	5.2±1.0*##

注：*表示与正常对照组比较P<0.05，**表示与正常对照组比较P<0.01；#表示与糖尿病模型组比较<0.05，##表示与糖尿病模型组比较<0.01。

Claims

1.左卡尼汀联合L-精氨酸在制备治疗糖尿病视网膜病变神经损伤的药物中的应用；其中所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩尔比为1∶1～10。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩尔比为1∶3～8。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩尔比为1∶6。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述糖尿病视网膜病变神经损伤为视网膜神经损伤或Müller细胞损伤。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述左卡尼汀和所述L-精氨酸以片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂、乳剂或混悬剂进行给药。