CN103946239A - 用于治疗b细胞慢性淋巴细胞性白血病和其他恶性血液病的cd44单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含CD44特异性抗体的组合物。这些抗体特异性结合到恶性血液病细胞。本发明还提供了使用所述CD44抗体以靶向表达CD44的细胞从而用于治疗性和诊断性目的的方法。

Description

用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病和其他恶性血液病的CD44单克隆抗体

相关申请案

本申请要求2011年10月26日提交的美国临时专利申请61/551,852的权益，该临时专利申请的内容以引用方式整体并入本文。

资助信息

本发明根据美国国立卫生研究院第P01CA081534和R37CA049780号资助在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

发明背景

技术领域

本发明整体涉及靶向恶性血液病的抗体。本发明还涉及特异性结合到CD44并靶向慢性淋巴细胞性白血病细胞的抗体。

背景信息

恶性血液病影响血液、骨髓和淋巴结。这些恶性疾病通常源于两大血液细胞谱系：骨髓和淋巴细胞系。骨髓细胞系通常产生粒细胞、红细胞、凝血细胞、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴细胞系产生B、T、NK和浆细胞。淋巴瘤、淋巴细胞性白血病和骨髓瘤来自淋巴细胞系，而急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病源自骨髓。

B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)具有高度变化的临床过程，并且特征在于血液、次级淋巴组织和骨髓中CD5+B细胞的克隆表达。CLL是具有可变预后的异源性疾病；一些患者具有无痛的过程和几乎正常的预期寿命，其他患者具有侵袭性疾病和较短的存活期。具有CLL的患者通常未在疾病的早期得到治疗并监控疾病进展。治疗通常始于患者的生活质量受到影响时。虽然尚不能治愈CLL，但是该病通常可以治疗并且已证实现行的标准化学疗法方案可以延长存活期。然而，存在一群为标准化学疗法方案难治性的或变成标准化学疗法方案难治性的CLL患者。

CLL细胞的存活受以下方面的支持：组织环境内的细胞，以及来自胞外基质的信号和与CD44的相互作用，而CD44在CLL细胞上高表达。CD44是一种在许多生理和病理功能中涉及到的多结构糖蛋白，这些功能包括细胞-细胞和细胞-基质粘附，支持细胞迁移，向相应的细胞表面受体或相关底物呈递生长因子、趋化因子或酶，以及将信号从细胞膜传递到细胞骨架或细胞核[Naor,D.等人Adv.Cancer Res.71,241-319,(1997)；Lesley,J.等人Adv.Immunol.54,271-335,(1993)]。该蛋白参与多种多样的细胞功能，这些功能包括淋巴细胞激活、再循环和归巢、造血作用以及肿瘤转移。已知该糖蛋白结合到多种配体(例如纤维蛋白原、纤连蛋白、丙氨酸、胶原)，主要的一种是透明质酸(HA)。

虽然如之前所述许多CLL患者对CLL的标准化学疗法方案有反应，但是存在一群为这些标准治疗难治性的或变成这些标准治疗难治性的CLL患者。对于这群患者，尚无现有化学疗法方案取得了成功，因而表明需要治疗CLL的新疗法。本发明提供这样的疗法，即CLL细胞特异性的新CD44抗体。

发明概要

本发明基于抗CD44抗体的生殖生成。此外，本发明基于使用抗CD44抗体治疗或预防恶性血液病的方法。另外，本发明提供制备CD44抗体的方法。

在一个方面，本发明提供特异性结合CD44的抗体或抗体片段。

在另一个方面，该抗体片段包括Fab片段、F(ab)2片段、FV片段、单链FV(scFV)片段、dsFV片段、CH片段或二聚scFV。

在各个实施方案中，抗体或抗体片段是人源化的。

在又一个方面，本发明提供特异性结合CLL细胞上的CD4的抗体或抗体片段。

在另一个方面，本发明提供编码本发明的抗体或抗体片段的分离的核酸。在又一个实施方案中，本发明提供包含编码所述抗体的核酸的表达载体。

在另一个方面，本发明提供药物组合物，该药物组合物包含本发明的抗体或抗体片段以及任选包含药学上可接受的载体。

在另一个方面，本发明提供产生抗体的方法。该方法包括：用包含编码抗体的核酸分子的表达构建体转化宿主细胞，以及在适合产生抗体的条件下培养宿主细胞，从而产生抗体。

在另一个方面，本发明提供用于检测样品中的CD44蛋白的方法。

在另一个方面，本发明提供使抗体靶向具有CD44受体的细胞的方法。该方法包括使细胞与本发明的抗体接触。

在另一个方面，本发明提供检测得自已知或疑似含有恶性血液病细胞的受试者的样品中CD44蛋白的存在性的试剂盒。该试剂盒包含抗体及其在测定环境下的使用说明。

在另一个方面，本发明提供使用本发明的抗体治疗人类受试者中的恶性血液病的方法。

在另一个方面，本发明提供通过施用本发明的CD44抗体而治疗或预防CLL的方法，其中结合到CLL细胞上的CD44的抗体在其上赋予生存优势。

在另一个方面，本发明提供监控使用本发明的抗体治疗患有恶性血液病或存在患恶性血液病风险的受试者的治疗方案的方法。

在一个其他方面，本发明提供用于治疗或预防受试者中的恶性血液病的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的CD44的抗体，其中恶性血液病为化学疗法和/或生物疗法难治性的。在一个实施方案中，化学疗法包括嘌呤核苷类似物和/或烷化剂。在另一个实施方案中，恶性血液病为化学疗法和生物疗法难治性的。在再一个实施方案中，生物疗法包括单克隆抗体。在一个实施方案中，单克隆抗体为抗CD20抗体。在一些实施方案中，恶性血液病为白血病。在另一个实施方案中，白血病为淋巴细胞性白血病。在一个其他实施方案中，淋巴细胞性白血病为B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

附图简述

图1A-C示出了慢性淋巴细胞性白血病B细胞上的CD44表达水平与疾病侵袭性的特征相关。

图2A-F示出了抗CD44mAb在体外直接诱导了CLL细胞的细胞凋亡，其中针对ZapAP-70+CLL细胞的效能增强。

图3A-C示出了在CLL细胞中抗CD44mAb介导的细胞凋亡为半胱天冬酶依赖性的。

图4示出了抗CD44mAb优先地诱导ZAP-70+CLL细胞的细胞凋亡，甚至在存在MSC的情况下也是如此。

图5A-D示出了抗CD44单克隆抗体阻断CLL细胞中HA诱导的AKT磷酸化和存活。

图6A-H示出了抗CD44mAb下调CLL细胞中的CD44和ZAP-70蛋白表达、破坏CD44-ZAP-70复合物并取消源于BCR的生存信号转导。

图7A-B示出了抗CD44mAb在体内损害CLL细胞存活。

图8示出了抗CD44mAb可介导CLL细胞吞噬，但不介导补体诱导的细胞死亡。

图9示出了抗CD44mAb对具有或不具有与CLL细胞中的CD44表达(MFIR)水平相似的ZAP-70表达的患者的影响。

图10A-B示出了用抗CD44mAb或利妥昔单抗处理的CLL细胞的活力。

具体实施方式

本发明基于抗CD44抗体的精液生成。此外，本发明基于使用抗CD44抗体治疗或预防恶性血液病的方法。另外，本发明提供制备CD44抗体的方法。

在描述本发明的方法前，应当理解，本发明不限于所述的特定组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定的实施方案，而不旨在进行限制，因为本发明的范围将只在所附权利要求书中进行限制。

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。因此，例如，提及“该方法”包括在阅读本公开后将变得对本领域的技术人员显而易见的一个或多个本文所述类型的方法和/或步骤等。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如之前所述，恶性血液病是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症。这些恶性疾病源于两大血液细胞谱系：骨髓和淋巴细胞系。骨髓细胞系通常产生粒细胞、红细胞、凝血细胞、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴细胞系产生B、T、NK和浆细胞。淋巴瘤、淋巴细胞性白血病和骨髓瘤来自淋巴细胞系，而急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病源自骨髓。

在过去，恶性血液病最常见地按照恶性疾病主要是位于血液(白血病)还是位于淋巴结(淋巴瘤)中而加以划分。白血病包括急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病和急性单核细胞性白血病。淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

急性淋巴细胞性白血病(ALL)是一种特征在于淋巴母细胞过量的白血病或白血球癌症。急性髓系白血病(AML)(也称为急性骨髓性白血病)是血细胞的骨髓细胞系的癌症，其特征在于在骨髓中蓄积并干扰正常血细胞生成的异常白血球的快速生长。慢性骨髓性(或髓系)白血病(CML)(也称为慢性粒细胞白血病(CGL))是白血球的癌症。它是一种特征在于主要为骨髓细胞在骨髓中增加且不受调控的生长并且这些细胞在血液中蓄积的白血病。B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)(也称为慢性淋巴系白血病(CLL))是最常见类型的白血病。CLL影响B细胞淋巴细胞。急性单核细胞性白血病(AMoL或AML-M5)被视为一种类型的急性髓系白血病。霍奇金淋巴瘤(之前称为霍奇金病)是一种类型的淋巴瘤，其为源自称为淋巴细胞的血细胞的癌症。非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一组不同的血癌，其包括除了霍奇金淋巴瘤之外的任何种类的淋巴瘤。

如之前所述，CLL一般无法治愈，但是通常可用延长存活期的标准化学疗法方案进行治疗。然而，存在一群为标准化学疗法方案难治性的或变成标准化学疗法方案难治性的CLL患者。CLL的护理标准包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、干细胞移植以及它们的组合。

术语“抗CD44抗体”、“抗CD44”、“CD44抗体”或“结合到CD44的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD44使得抗体可用作靶向CD44的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗CD44抗体特异性结合CD44。

在一个实施方案中，抗CD44抗体为单克隆人源化抗体。在另一个实施方案中，人源化抗体特异性结合CD44的恒定区。在一个优选的实施方案中，人源化抗体为Weigand等人Cancer Res.2012年9月1日；72(17):4329-39中所述的RG7356抗体，该参考文献以引用方式整体并入本文。在另一个实施方案中，人源化抗体的特征在于在结合到在细胞表面上表达的CD44时内化到细胞中。

本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用并涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合特性即可。

“抗体片段”是指不是完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、双链抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，其各自具有单个抗原结合位点；以及残余的"Fc"片段，其名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')₂片段。

作为参比抗体的“结合到相同表位的抗体”是指在竞争测定中将参比抗体与其抗原的结合阻断50％或以上的抗体，反之，参考抗体在竞争测定中将抗体与其抗原的结合阻断50％或以上。示例性竞争测定在本文提供。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指得自一群基本上均匀的抗体的抗体，也就是说，构成该群的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，但可能的变体抗体除外，例如包含天然存在的或在单克隆抗体制备物的产生过程中出现的突变，这样的变体通常以微量存在。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相比，单克隆抗体制备物的各个单克隆抗体抗位于抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示得自一群基本上均匀的抗体的抗体特性，而不应视为需要通过任何特定的方法产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用包含人免疫球蛋白基因座的全部或一部分的转基因动物的方法，这样的方法和制备单克隆抗体的其他示例性方法是本领域普通技术人员已知的。

“裸抗体”是指未偶联到异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记物的抗体。裸抗体可存在于药物制剂中。

“单链Fv”或"scFv"抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般来讲，scFv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。有关scFv的综述，参见例如Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal抗体,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York,1994),第269-315页。

抗体的“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。对应于免疫球蛋白的不同类的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段包含连接到同一多肽链(V_H-V_L)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而无法使同一链上的两个结构域配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双链抗体可以为二价的或双特异性的。双链抗体在例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)以及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中有更全面的描述。三链抗体和四链抗体也在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中有所描述。

出于本文的目的的“受体人构架”是这样的构架，其包含源自如下文所定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目是10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。

“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这样的改变的亲代抗体相比，这样的改变导致抗体对抗原的亲和力的提高。

术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)—般具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman andCo.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，使用结合抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补的VL或VH结构域文库，可以分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628(1991)。

“人共有构架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的构架。一般来讲，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。一般来讲，序列的亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIH Publication91-3242,Bethesda Md.(1991),第1-3卷中所述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如上文Kabat等人中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如上文Kabat等人中的亚组III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，在所述可变结构域中全部或基本上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些HVR，并且全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指经历了人源化的抗体。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分源自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种。

"Fab"片段含有重链和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域(包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)的羧基末端添加了几个残基。Fab'-SH在本文是恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基团的Fab'的名称。F(ab')₂抗体片段最初作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段而产生。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。

术语“Fc区”在本文用于限定含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C端区域。该术语包括天然序列的Fc区域和变体Fc区域。

“构架”或"FR"是指除高变区(HVR)残基外的可变结构域残基。可变结构域的FR—般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般出现在VH(或VL)的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文可互换的使用，以表示具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体，或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

"Fv"是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv物种由紧密、非共价关联的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以类似于双链Fv物种中的“二聚”结构关联。在此构型中，各可变结构域的三个HVR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体的抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅含三个抗原特异性HVR的一半Fv)也能够识别并结合抗原，但亲和力低于完整结合位点。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

"分离的"抗体是已经与其天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度，所述纯度通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)测定。有关评估抗体纯度的综述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

如本文所用，“治疗”(及其语法变型形式，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试进行临床干预以改变所治疗的个体的自然进程，并且可以针对预防而进行或在临床病理过程中进行。所需的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、降低疾病进展速率、改善或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。

术语“难治性肿瘤”或“难治性癌症”或“难治性恶性血液病”在本文用于表示某一治疗失败或抵抗某一治疗的肿瘤、癌症或恶性血液病，所述治疗诸如为“护理标准”治疗，例如用单独的或组合的化疗剂、单独的生物疗法、放射疗法、干细胞移植或其组合治疗。

术语“护理标准”用于表示专业审慎的医生用来治疗诸如癌症的某一疾病的治疗方法。护理标准根据癌症的类型和阶段、患者的病症和治疗史等而变化，并且对于本领域的技术人员将是显而易见的。

在一个方面，恶性血液病(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL))的“护理标准”包括通过化学疗法和/或生物疗法治疗。在一个实施方案中，化学疗法包括单种化疗剂或不止一种化疗剂。在另一个实施方案中，化学疗法包括嘌呤核苷类似物和/或烷化剂。在一个其他实施方案中，生物疗法包括单克隆抗体。在再一个实施方案中，单克隆抗体为抗CD20抗体。在一个实施方案中，抗CD20抗体为利妥昔单抗。

药剂(例如药物制剂)的“有效量”是指以必要的剂量和时间周期有效实现所需的治疗性或预防性结果的量。

如本文所述，恶性血液病(例如CLL)的护理标准包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、干细胞移植以及它们的组合。CLL的现行治疗包括多种不同类型的单独或组合给予的化疗剂。典型的化疗剂包括核苷类似物(例如嘌呤核苷类似物)、烷化剂和单克隆抗体。氟达拉滨是嘌呤类似物的实例并通常以组合方式用于CLL治疗。环磷酰胺和苯达莫司汀是烷化剂的实例。生物疗法包括施用基于多肽的药剂，包括抗体。在一个实施方案中，抗体为单克隆或多克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体为嵌合、人源化或人单克隆抗体。抗CD20抗体(诸如利妥昔单抗和奥法木单抗)以及抗CD52抗体(诸如阿仑单抗)用于CLL的化学免疫疗法。其他化疗剂包括苯达莫司汀、夫拉平度、雷利度胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松。典型的组合包括FCR(氟达拉滨、环磷酰胺和rituxan(利妥昔单抗))和CHOP(环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松)。CLL的替代治疗包括放射和干细胞移植。

在一个方面，受试者的恶性血液病为包括嘌呤核苷类似物和/或烷化剂的化学疗法难治性的。在一个实施方案中，化学疗法包括一种或多种选自以下的嘌呤核苷类似物：氟达拉滨、喷司他丁、硫唑嘌呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、脱氧助间型霉素、硫咪嘌呤、羟基脲和克拉屈滨。在另一个实施方案中，化学疗法包括一种或多种选自以下的烷化剂：氮芥类似物(例如环磷酰胺、双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、曲洛磷胺、苯达莫司汀和雌莫司汀)、烷基磺酸酯类(例如白消安、苏消安和甘露舒凡)、乙烯亚胺类(噻替哌、六甲蜜胺、三亚胺醌和卡波醌)、亚硝基脲类(例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、福莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀)以及三氮烯类(例如达卡巴嗪和替莫唑胺)。在一个优选的实施方案中，恶性血液病为包括嘌呤核苷类似物(例如氟达拉滨)和/或环磷酰胺的化学疗法难治性的。

在一个其他方面，受试者的恶性血液病为包括类固醇的化学疗法难治性的。在另一个实施方案中，化学疗法包括类固醇和烷化剂。在一个实施方案中，类固醇为泼尼松。在一个其他实施方案中，烷化剂为苯丁酸氮芥。在再一个实施方案中，化学疗法包括泼尼松和苯丁酸氮芥。

在一个其他方面，受试者的恶性血液病为包括有丝分裂抑制剂的化学疗法难治性的。在另一个实施方案中，化学疗法包括有丝分裂抑制剂、烷化剂和类固醇。在一个实施方案中，有丝分裂抑制剂为硫酸长春新碱。在另一个实施方案中，烷化剂为环磷酰胺。在再一个实施方案中，类固醇为泼尼松。在一个其他实施方案中，化学疗法为环磷酰胺、硫酸长春新碱和泼尼松(CVP)。

在另一个方面，受试者的恶性血液病为(i)包括嘌呤核苷类似物和/或烷化剂的化学疗法和(ii)生物疗法难治性的。在一个实施方案中，生物疗法包括单克隆抗体疗法。在另一个实施方案中，单克隆抗体疗法包括抗CD20抗体疗法或抗CD52抗体疗法。在一个优选的实施方案中，抗CD20抗体为利妥昔单抗或奥法木单抗。在一个优选的实施方案中，抗CD52抗体为阿仑单抗。在另一个优选的实施方案中，恶性血液病为(i)包括氟达拉滨的化学疗法和(ii)包括利妥昔单抗或奥法木单抗的单克隆抗体疗法难治性的。在一个其他优选的实施方案中，恶性血液病为(i)包括环磷酰胺的化学疗法和(ii)包括利妥昔单抗的单克隆抗体疗法难治性的。在又一个优选的实施方案中，恶性血液病为(i)包括苯达莫司汀的化学疗法和(ii)包括利妥昔单抗的单克隆抗体疗法难治性的。

在一个实施方案中，受试者的恶性血液病为包括FCR(氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗)和苯达莫司汀的疗法难治性的。在另一个实施方案中，受试者的恶性血液病为包括阿仑单抗的疗法难治性的。在另外的实施方案中，受试者的恶性血液病为包括阿仑单抗、苯丁酸氮芥、奥法木单抗、盐酸苯达莫司汀、环磷酰胺或磷酸氟达拉滨的疗法难治性的。在另一个实施方案中，受试者的恶性血液病为包括苯丁酸氮芥和泼尼松的疗法难治性的。在另一个实施方案中，受试者的恶性血液病为包括环磷酰胺、硫酸长春新碱和泼尼松(CVP)的疗法难治性的。在一个优选的实施方案中，恶性血液病为CLL。

如之前所述，CLL细胞在细胞表面上高表达CD44蛋白。CD44是一种在许多生理和病理功能中涉及到的多结构糖蛋白，这些功能包括细胞-细胞和细胞-基质粘附，支持细胞迁移，向相应的细胞表面受体或相关底物呈递生长因子、趋化因子或酶，以及将信号从细胞膜传递到细胞骨架或细胞核[Naor,D.等人Adv.Cancer Res.71,241-319,(1997)；Lesley,J.等人Adv.Immunol.54,271-335,(1993)]。该蛋白参与多种多样的细胞功能，这些功能包括淋巴细胞激活、再循环和归巢、造血作用以及肿瘤转移。已知该糖蛋白结合到多种配体(例如纤维蛋白原、纤连蛋白、丙氨酸、胶原)，主要的一种是透明质酸(HA)。CD44基因转录至少部分地通过β-连环蛋白和与肿瘤发展存在关联的Wnt信号转导而激活。

CD44具有由至少10个可变外显子(这些外显子编码一段胞外域)的差异拼接以及由细胞类型特异性糖基化决定的多个变体。

CD44在许多类型的恶性疾病中表达，因此，抗CD44的抗体在治疗恶性疾病方面可能非常有用。这样的抗体将会破坏CD44基质相互作用，并通过占据CD44诱导可导致细胞凋亡的CD44信号转导。然而，由于CD44在正常细胞上的低水平内源性表达，这样的抗体将必须为恶性疾病细胞上所表达的CD44特异性的，以避免不期望的副作用。

因此，在一个方面，本发明提供特异性结合到CD44的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，该抗体或抗体片段特异性结合到在CLL细胞上表达的CD44。

在各个实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可以为Fab片段、F(ab)2片段、FV片段、单链FV(scFV)片段、dsFV片段、CH片段或二聚scFV

如本文所用，“特异性结合”是指抗体结合到预定的抗原。通常，抗体以对应于约10^-8M或更低的K_D的亲和力结合，并且结合到预定抗原的亲和力(以K_D表示)是结合到除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力的至少1/10，并优选至少1/100。可选地，抗体可以对应于约10⁶M^-1、或约10⁷M^-1、或约10⁸M^-1、或10⁹M^-1或更高的K_A的亲和力结合，并且结合到预定抗原的亲和力(以K_A表示)是结合到除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力的至少10倍，并优选至少100倍。

如本文所用的术语"k_a"(M^-1s^-1)旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。如本文所用的术语"K_A"(M)旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数。

天然存在的抗体通常为含有两条轻链和两条重链的四聚体。用实验方法，可将抗体通过蛋白水解酶木瓜蛋白酶裂解，这导致每条重链断裂，从而产生三个单独的亚单元。由轻链和在质量上约等于轻链的重链片段构成的两个亚单元称为Fab片段(即，“抗原结合”片段)。由重链的两个相等片段构成的第三个单元称为Fc片段。Fc片段通常不涉及抗原-抗体结合，但是在摆脱抗原主体时所涉及的后续过程中具有重要意义。

由于Fab和F(ab')₂片段小于完整的抗体分子，因此比使用完整的抗体分子时可以获得更多的抗原结合结构域。通过木瓜蛋白酶对典型的IgG分子进行蛋白水解裂解已知产生两个单独的称为Fab片段的抗原结合片段，所述片段包含通过二硫键连接到连续重链的氨基末端部分的完整轻链。木瓜蛋白酶消化的免疫球蛋白的其余部分称为Fc片段并由保持原样且通过二硫键连接在一起的抗体的羧基末端部分组成。如果将抗体用胃蛋白酶消化，则产生称为F(ab')₂片段的片段，其不含Fc区但含有通过连续轻链与重链(作为Fab片段)之间的二硫键以及连续重链的其余部分之间的二硫键保持在一起的两个抗原结合结构域(Handbook of Experimental Immunology.第1卷:Immunochemistry,Weir,D.M.编辑,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1986))。

如本领域的技术人员将容易地认识到，也可通过本领域熟知的方法产生改变的抗体，例如嵌合、人源化、CDR移植、双功能、抗体肽二聚体(即，抗体的两个肽链组分的结合，例如，包含重链和轻链的抗体的一条臂，或包含VL、VH、CL和CH抗体结构域的Fab片段，或包含VL结构域和VH结构域的Fv片段)、单链抗体(例如包含通过接头连接到VH结构域的VL结构域的scFv(即单链Fv)片段等)。

为了产生scFv，使用标准逆转录酶方案首先通过mRNA(该mRNA从产生CD44抗原的mAb的杂交瘤分离出的)产生cDNA。然后可使用小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的一组引物通过标准聚合酶链反应(PCR)方法扩增编码mAb的重链和轻链的可变区的cDNA分子(Clackson(1991)Nature,352,624-628)。然后通过接头寡核苷酸将编码mAb重链和轻链可变区的扩增cDNA连接在一起以便生成重组的scFv DNA分子。将scFv DNA连接到丝状噬菌体质粒中，该质粒被设计成将扩增的cDNA序列融合到编码称为g3p的次要衣壳蛋白的噬菌体基因的5'区中。然后将大肠杆菌(Escherichia coli)细菌细胞用重组噬菌体质粒转化，并使丝状噬菌体生长然后收获。所需的重组噬菌体展示融合到次要衣壳蛋白的氨基末端区的抗原结合结构域。然后可例如使用称为“淘洗”的方法将这样的“展示噬菌体”在固定化抗原上通过，参见Parmley和Smith(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251,215-218；Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,6378-6382，以吸附含有能够结合抗原的scFv抗体蛋白的那些噬菌体粒子。然后可通过标准噬菌体感染方法扩增结合抗原的噬菌体粒子，然后再次针对抗原结合能力对扩增的重组噬菌种群进行筛选。这样连续多轮筛选抗原结合能力，然后进行扩增，将在重组噬菌体上展示的scFv中筛选出增强的抗原结合能力。筛选增强的抗原结合能力可通过以下方式进行：调整发生结合所处的条件以达到更紧密的结合活性。筛选增强的抗原结合活性的另一种方法是改变编码scFv的结合结构域的cDNA内的核苷酸序列，并使重组的噬菌体种群接受连续多轮抗原结合活性筛选和扩增(参见Lowman等人(1991)Biochemistry30,10832-10838以及Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,6378-6382)。

在筛选scFv时，可与大肠杆菌菌株HB2151相结合使用合适的载体产生游离形式的scFv。这些细菌实际上分泌可溶形式的scFv，不含噬菌体组分(Hoogenboom等人(1991)Nucl.Acids Res.19,4133-4137)。从HB2151细菌培养基中纯化可溶的scFv可通过使用固定在诸如AFFIGEL^TM(BioRad,Hercules,Calif.)的固相载体上的抗原分子通过亲和色谱完成。

对重组抗体技术的其他开发工作表明可能实现进一步的改进，诸如通过将scFv聚合成二聚体和四聚体而提高结合亲合力(参见Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,6444-6448)。

此外，重组抗体技术与杂交瘤相比提供更稳定的抗体遗传学来源。重组抗体还可以使用标准细菌噬菌体产生方法更快更经济地产生。

为了以重组方式产生本文所述的抗体或抗体片段，将编码抗体或抗体片段的核酸插入表达载体。轻链和重链可在相同或不同的表达载体中克隆。以引用方式整体并入本文的授予Kipps等人的美国专利No.6,287,569的教导以及其中提供的方法可由本领域的技术人员容易地进行修改以形成本发明的scFv。

表达载体通常可以作为附加体或作为宿主染色体的整体部分在宿主生物体中复制。大肠杆菌是一种尤其可用于表达本发明的载体的原核宿主。适用的其他微生物宿主包括芽孢杆菌属，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)和其他肠杆菌属，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)以及多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，还可以制备下述表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)和调控序列，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)优选的宿主，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列，诸如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖解酶)和复制起点、终止序列等。哺乳动物组织细胞培养也可用于表达和产生本发明的抗体(参见例如Winnacker,From Genes to Clones VCH Publishers,N.Y.,1987)。真核细胞是优选的，因为已经开发了许多能够分泌完整抗体的合适的宿主细胞系。用于表达编码本发明的免疫球蛋白的核酸的优选的合适宿主细胞包括：通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL1651)、人胚肾细胞系、幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠塞尔托利细胞、猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL1587)、人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)、布法罗大鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138,ATCCCCL75)、人肝细胞(Hep G2,HB8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCCCCL51)和TRI细胞。

可将包含所关注的多核苷酸序列的载体转移到宿主细胞中。氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,第2版,1989)。在引入重组DNA后，选择表达免疫球蛋白产物的细胞系。能够稳定表达的细胞系是优选的(即，在细胞系传代五十次后表达水平不降低)。

表达后，可根据本领域的标准程序对本发明的抗体或抗体片段进行纯化，这些程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(参见例如Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。至少约90％至95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，并且98％至99％或更高同质性是最优选的。

标记的抗体或可检测地标记的抗体通常为具有附接的可检测标记的抗体(或保持结合特异性的抗体片段)。可检测标记通常通过化学偶联而附接，但是如果标记为多肽，则也可通过基因工程技术附接。用于产生可检测地标记的蛋白的方法是本领域熟知的。本领域已知的可检测标记包括放射性同位素、荧光团、顺磁性标记、酶(例如辣根过氧化物酶)或发出可检测信号(例如放射性、荧光、颜色)或将标记暴露于其底物后发出可检测信号的其他部分或化合物。多种可检测标记/底物对(例如辣根过氧化物酶/二氨基联苯胺、抗生物素蛋白/链霉亲和素、荧光素酶/荧光素)、检测抗体的方法以及使用标记抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane编辑,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.)。也可产生较高灵敏度的另一种技术包括将抗体偶合到低分子量半抗原。然后可通过第二反应特异性检测这些半抗原。例如，常见的是使用诸如生物素的半抗原，生物素与可与特异性抗半抗原抗体反应的抗生物素蛋白、或二硝基苯基、吡哆醛和荧光素反应。

抗体可通过以下方式人源化：将不在抗原结合中直接涉及的Fv可变区的序列用来自人类Fv可变区的等价序列替换。人源化嵌合抗体的一般性综述由Morrison等人(Science229:1202-1207(1985))以及由Oi等人(BioTechniques4:214(1986))提供。这些方法包括分离、操纵和表达编码重链或轻链至少一条中的免疫球蛋白Fv可变区的全部或一部分的核酸序列。这样的核酸的来源是本领域技术人员熟知的，并例如可得自例如产抗体的杂交瘤。然后可将编码人源化或嵌合抗体或其片段的重组DNA克隆进合适的表达载体。

人源化抗体可选地可通过CDR取代(美国专利No.5,225,539；Jones,Nature321:552-525(1986)；Verhoeyan等人,Science239:1534(1988)以及Beidler,J.Immunol.141:4053-4060(1988))产生。因此，在某些实施方案中，用于偶联物的抗体是由ATCC登录号为PTA2439的杂交瘤产生的抗体的人源化或CDR移植形式。在其他实施方案中，抗体是抗体mAb3E10的人源化或CDR移植形式。例如，CDR区可包含氨基酸取代，诸如与图中所示的那些不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异。在一些情况下，存在1-5个之间的任何个氨基酸差异。

这样的变体包括其中将一个或多个取代引入抗体或抗体片段的重链核苷酸序列和/或轻链核苷酸序列的那些变体。

本发明的抗体可偶联到另一分子。多种接头可用于连接本文所述的偶联物的部分。如本文所用的术语“可降解的接头”是指能够在多种条件下裂解的接头部分。适合裂解的条件包括但不限于pH、紫外线辐照、酶活性、温度、水解、消除和取代反应以及键联的热力学性质。如本文所用的术语“光不稳定性接头”是指本领域已知的在特定的紫外波长下选择性裂解的接头部分。含有光不稳定性接头的本发明的化合物可用于将化合物递送到目标细胞或所关注的组织，随后可在存在紫外光源的情况下释放。

如本文所用的术语“接头”是允许将底物和活性分子靶向相同区域、组织或细胞(例如通过物理连接偶联物的各个部分)的任何键、小分子或其他媒介物。

在某些实施方案中，可以使用可裂解的或可降解的接头。在一个实施方案中，接头是一个或多个底物与一个或多个治疗性部分之间的化学键。因此，键可以是共价键或离子键。接头为化学键的治疗性复合物的实例是融合蛋白。在一个实施方案中，化学键为酸敏感的并且pH敏感性键在从血流(pH7.5)进入胞转小泡或细胞内部(pH约6.0)时裂解。可选地，键可以不是酸敏感的，但是可通过随后添加的或天然存在于目标部位微环境中的特异性酶或化学品而裂解。可选地，键可以是在还原性条件下裂解的键，例如二硫键。

可选地，键可以不能裂解。可以使用任何种类的酸可裂解的或酸敏感性的接头。酸可裂解的键的实例包括但不限于：一类称为顺式聚羧酸烯烃(cipolycarboxylic alkene)的有机酸。这类分子包含附接到含有至少一个双键的碳链的至少三个羧酸基团(COOH)。这些分子及其制备和使用方式在Shen等人的美国专利No.4,631,190中公开。

在另一个实施方案中，接头为诸如肽接头的小分子。在一个实施方案中，肽接头不能裂解。在又一个实施方案中，肽接头可通过碱在还原性条件下或通过特异性酶裂解。在一个实施方案中，酶是固有的。可选地，小肽可通过在治疗性复合物之后或除了治疗性复合物施用的非固有酶裂解。可选地，小肽可在还原性条件下裂解，例如，当肽含有二硫键时。可选地，小肽可以为pH敏感性的。

肽接头也可用作肽标签(例如myc或His₆(SEQ ID NO:1))或可以为已知接头序列GGGGS(SEQ ID NO:2)的一个或多个重复。技术人员将认识到接头序列可根据待连接以形成偶联物的多肽部分而变化。另外的肽接头和标签是本领域已知的，诸如表位标签、亲和标签、溶解性增强标签等。可与本发明一起使用的多种另外的标签和接头的实例包括血细胞凝集素(HA)表位、myc表位、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、钙调蛋白结合肽、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、FLAG八肽、nus、绿荧光蛋白(GFP)、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、V5、S蛋白、链霉亲和素、SBP、聚(Arg)、DsbA、c-myc标签、HAT、纤维素结合结构域、softag1、softag3、小类泛素修饰因子(SUMO)和泛素(Ub)。另外的实例包括：聚(L-Gly)，(聚L-甘氨酸接头)；聚(L-Glu)，(聚L-谷氨酰胺接头)；聚(L-Lys)，(聚L-赖氨酸接头)。在一个实施方案中，肽接头具有式(氨基酸)n，其中n为2与100之间的整数，优选地其中肽包括一个或多个氨氨基酸的聚合物。

化学和肽接头可通过本领域已知用于偶联物合成的技术键合在抗体与偶联物之间，即使用遗传工程或化学方法。偶联物合成可通过合适的抗体借助在合适的官能团处蛋白与其他部分的经典偶合反应而通过化学方法实现。

如本文所用，“核酸”是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)，适当时，核糖核酸(RNA)。还应当理解，该术语在适合上下文或适用于所述实施方案时包括单链多核苷酸(诸如反义)和双链多核苷酸(诸如siRNA)。

“蛋白编码序列”或“编码”特定多肽或肽的序列是当置于合适的调控序列控制下时在体外或体内转录(就DNA而言)和翻译(就mRNA而言)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列将通常位于编码序列的3'。

如本文所用，术语“载体”是指能够转运其所连接到的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体为基因组整合载体或“整合载体”，其可以变成整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体为附加型载体，例如能够在染色体外复制的核酸。能够指导可操作地连接到的基因的表达的载体在本文称为“表达载体”。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，除非上下文明确地相反指出。在表达载体中，控制转录的调控元件一般可衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。另外还可以包含通常由复制起点赋予的在宿主中的复制能力以及有利于识别转化体的选择基因。可以采用衍生自病毒(诸如逆转录病毒、腺病毒等)的载体。

在一个实施方案中，本发明提供产生蛋白的方法。该方法包括将宿主细胞用表达构建体转化，并在适合产生偶联物的条件下培养宿主细胞。

适用于制备蛋白和/或蛋白偶联物的载体包括选自杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、细菌人工染色体、病毒DNA、基于Pl的人工染色体、酵母质粒和酵母人工染色体的那些载体。例如，病毒DNA载体可选自牛痘、腺病毒、腐烂痘病毒(foul pox virus)、假狂犬病病毒和SV40衍生物。用于实践本发明方法的合适的细菌载体包括pQE70^TM、pQE60^TM、pQE-9^TM、pBLUESCRIPT^TM SK、pBLUESCRIPT^TM KS、pTRC99a^TM、pKK223-3^TM、pDR540^TM、PAC^TM和pRIT2T^TM。用于实践本发明方法的合适的真核载体包括pWLNEO^TM、pXTI^TM、pSG5^TM、pSVK3^TM、pBPV^TM、pMSG^TM和pSVLSV40^TM。用于实践本发明方法的合适的真核载体包括pWLNEO^TM、pXTI^TM、pSG5^TM、pSVK3^TM、pBPV^TM、pMSG^TM和pSVLSV40^TM。

本领域的技术人员可例如从lacI、lacZ、T3、T7、apt、λPR、PL、trp、CMV即刻早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒LTR和小鼠金属硫蛋白-I调控区中选择将要包含在这样的载体中的合适的调控区。

可在其中表达含有编码蛋白偶联物的多核苷酸的载体的宿主细胞包括(例如)细菌细胞、真核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、果蝇属(Drosophila)S2、夜蛾属(Spodoptera)SJ9、CHO、COS(例如COS-7)或Bowes黑素瘤细胞均是用于实践本发明方法的合适的宿主细胞。

递送的表达构建体通常是载体的一部分，在载体中诸如启动子的调控元件可操作地连接到所关注的核酸。启动子可以是组成型或诱导型的。组成型启动子的非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子和劳氏肉瘤病毒启动子。如本文所用，“诱导型”是指上调和下调两者。诱导型启动子是能够响应诱导物而直接或间接激活一个或多个DNA序列或基因转录的启动子。在不存在诱导物的情况下，DNA序列或基因将不会转录。诱导物可以是化学剂，诸如蛋白、代谢物、生长调节剂、酚类化合物或者通过例如热直接施加的或通过病原体或致病因子(诸如病毒)的作用间接施加的生理应激。诱导物也可以是照明物，诸如光和光的各个方面，其包括波长、强度、荧光、方向和持续时间。

诱导型启动子的实例是四环素(tet)-on启动子系统，其可用于调控核酸的转录。在该系统中，将突变的Tet阻遏蛋白(TetR)融合到单纯疱疹VP16(转录激活蛋白)以形成四环素控制的转录激活因子(tTA)，其由tet或强力霉素(dox)调控。在不存在抗生素的情况下，转录极低，而在存在tet或dox的情况下，转录被诱导。替代的诱导型系统包括蜕皮素或雷帕霉素系统。蜕皮素是一种昆虫蜕皮激素，其产生受蜕皮素受体和超气门蛋白基因(USP)产物的异源二聚体的控制。通过用蜕皮素或诸如米乐甾酮A的蜕皮素类似物处理而诱导表达。

可用于载体中的另外的调控元件包括但不限于多聚腺苷酸化序列、翻译控制序列(例如内部核糖体进入区段，IRES)、增强子或内含子。这样的元件可能不是必需的，但是它们可通过影响转录、mRNA稳定性、翻译效率等而增加表达。这样的元件可根据需要包含在核酸构建体中以获得核酸在细胞中的最佳表达。然而，有时无需这样的另外的元件就可以获得充分的表达。

载体还可以包含其他元件。例如，载体可以包含编码信号肽使得所编码的多肽被导向特定细胞位置的核酸(例如，信号分泌序列以使蛋白将由细胞分泌)或编码选择性标志的核酸。选择性标志的非限制性实例包括嘌呤霉素、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B转磷酸酶、胸苷激酶(TK)和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。这样的标志可用于筛选培养物中的稳定转化体。

病毒载体可用于形成偶联物，并包括腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、疱疹病毒和牛乳头瘤病毒载体(有关病毒和非病毒载体的综述，参见Kay等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:12744-12746(1997))。对病毒载体进行修饰，使得病毒的天然嗜性和致病性发生改变或被去除。也可对病毒的基因组进行修饰，以提高其传染性并适应编码所关注多肽的核酸的包装。

非病毒载体也可用于主题偶联物。为了进一步说明，在一个实施方案中，由载体编码的哺乳动物血清蛋白选自组织型纤溶酶原激活剂、组织型纤溶酶原激活剂的受体、链激酶、葡萄球菌激酶、尿激酶和凝血因子。本发明还提供治疗与在循环中形成凝块相关的病症的方法，包括向哺乳动物施用偶联物的步骤，该偶联物导致治疗有效量的这样的哺乳动物血清蛋白重组表达并分泌进血液，诸如从转导的肌肉细胞。

在另一个方面，本发明提供药物组合物，该药物组合物包含本发明的抗体或抗体片段以及任选包含药学上可接受的载体。

在另一个方面，本发明提供用于检测样品中的CD44蛋白的方法。该方法包括将样品与标记的CD44抗体或抗体片段接触，然后检测样品中可检测地标记的抗体与CD44之间的免疫反应性。

在另一个方面，本发明提供使用本发明的抗体治疗人类受试者中的恶性血液病的方法。该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或抗体片段。

在另一个方面，本发明提供通过向对其有需要的受试者施用本发明的CD44抗体而治疗或预防CLL的方法，其中结合到CLL细胞上的CD44的抗体在其上赋予生存优势。

在另一个方面，本发明提供治疗对其有需要的受试者中的恶性血液病的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的CD44的抗体，其中受试者的恶性血液病为化学疗法和/或生物疗法难治性的。在一个实施方案中，受试者的恶性血液病为疗法难治性的，其中该疗法包括(i)包括嘌呤核苷类似物和/或烷化剂的化学疗法，和/或(ii)包括单克隆抗体疗法的生物疗法。在另一个实施方案中，恶性血液病为白血病，优选淋巴细胞性白血病。在一个其他实施方案中，淋巴细胞性白血病为B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

在另一个方面，本发明提供治疗对其有需要的受试者中的B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的CD44的抗体，其中受试者的CLL为化学疗法和/或生物疗法难治性的。在一个实施方案中，受试者的CLL为疗法难治性的，其中该疗法包括(i)包括嘌呤核苷类似物和/或烷化剂的化学疗法，和/或(ii)包括单克隆抗体疗法的生物疗法。

在又一个方面，本发明提供抗CD44抗体在制造或制备药剂中的用途。在一个实施方案中，该药剂用于治疗受试者中的恶性血液病，其中该恶性血液病为化学疗法和/或生物疗法难治性的。在另一个实施方案中，该药剂用于治疗恶性血液病的方法，该方法包括向具有恶性血液病的受试者施用有效量的药剂，其中该恶性血液病为化学疗法和/或生物疗法难治性的。在某些实施方案中，恶性血液病为白血病。在其他实施方案中，白血病为淋巴细胞性白血病。在再一个实施方案中，淋巴细胞性白血病为B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

在一个其他实施方案中，本发明提供用于治疗恶性血液病的方法的结合到CD44的抗体，其中该抗体通过与恶性血液病相关的表达CD44的细胞内化并抑制该细胞的生长。在另一个实施方案中，本发明提供结合CD44的抗体在制造用于治疗恶性血液病的药剂中的用途，其中该抗体通过与恶性血液病相关的表达CD44的细胞内化并抑制该细胞的生长。在再一个实施方案中，将抗体偶联到另一分子，例如治疗性分子。在一些实施方案中，将抗体通过接头偶联到另一分子。在一些实施方案中，恶性血液病为CLL。在另一个实施方案中，表达CD44的细胞为B细胞。在一个优选的实施方案中，B细胞为CLL细胞。在另一个实施方案中，抗CD44抗体特异性结合到CD44。

在各个实施方案中，预防或治疗恶性血液病的方法还可以包括另外的治疗剂。这样的治疗剂可包括嘌呤类似物、烷化剂、单克隆抗体以及其他化疗剂。嘌呤类似物的实例包括氟达拉滨、喷司他丁、硫唑嘌呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤和克拉屈滨。烷化剂的实例包括环磷酰胺、双氯乙基甲胺或氮芥、乌拉莫司汀或尿嘧啶、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、亚硝基脲类、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素和白消安。

单克隆抗体的实例包括但不限于抗EGFr抗体(帕尼单抗、Erbitux(西妥昔单抗)、马妥珠单抗、IMC-IIF8、TheraCIM hR3)、地诺单抗、Avastin(贝伐单抗)、抗HGF抗体、Humira(阿达木单抗)、抗Ang-2抗体、Herceptin(曲妥珠单抗)、Remicade(英夫利西单抗)、抗CD20抗体、利妥昔单抗、Synagis(帕利珠单抗)、Mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星)、Raptiva(依法利珠单抗)、Tysabri(那他珠单抗)、Zenapax(达昔单抗)、NeutroSpec(法索单抗锝(99mTc))、托珠单抗、ProstaScint(铟Ill标记的卡罗单抗喷地肽)、Bexxar(托西莫单抗)、Zevalin(偶联到钇90的替伊莫单抗(IDEC-Y2B8))、Xolair(奥马珠单抗)、MabThera(利妥昔单抗)、ReoPro(阿昔单抗)、MabCampath(阿仑单抗)、Simulect(巴利昔单抗)、LeukoScan(硫索单抗)、CEA-Scan(阿西莫单抗)、Verluma(诺莫单抗)、Panorex(依决洛单抗)、阿仑单抗、CDP870、那他珠单抗、奥法木单抗和GA101。

其他化疗剂的实例包括但不限于：白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡；苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥多巴(meturedopa)、脲多巴(uredopa)；乙撑亚胺、六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺、三羟甲基蜜胺；布拉它辛、布拉它辛酮、δ-9-四氢大麻酚、β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙素；桦木酸；拓扑替康、CPT；苔藓虫素；海绵多聚乙酰(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；足叶草毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻素；尾海兔素；倍癌霉素(包括其合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；珊瑚类二萜(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1)；达内霉素，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、cactinomycin、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，诸如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂(folic acid replenisher)，诸如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；乙炔尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；nitraerine；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK.RTM.；雷佐生；根霉素；裂裥菌素；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(特别是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、漆斑菌素A和蛇形菌素)；urethan；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；胍血生；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；噻替哌；紫杉烷类、多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；奥沙利铂；leucovovin；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；依达曲沙；柔红霉素；氨喋呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A，诸如视黄酸；卡培他滨、oxalipltatin、苯达莫司汀、夫拉平度、雷利度胺、顺铂、阿糖胞苷、米托蒽醌、地塞米松。

在本发明的另一方面，可将上述两种或更多种的组合用于治疗或预防恶性血液病，诸如CHOP，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的联合疗法的缩写；FC，氟达拉滨和环磷酰胺的缩写；FRC，氟达拉滨、环磷酰胺和rituxan的缩写；以及FOLFOX，采用与5-FU和亚叶酸结合的奥沙利铂的治疗方案的缩写。

在另一个方面，本发明提供使抗体靶向具有CD44受体的细胞的方法。该方法包括使细胞与本发明的抗体接触。

在另一个方面，本发明提供监控使用本发明的抗体治疗患有恶性血液病或存在患恶性血液病风险的受试者的治疗方案或疾病进展的方法。又一个实施方案涉及确定与CD44的对照水平相比CD44蛋白的量是已增加还是降低，所述增加或降低因向受试者施用本发明的抗体还是因疾病进展所致。

在另一个方面，本发明提供检测得自已知或疑似含有恶性血液病细胞的受试者的样品中CD44蛋白的存在性的试剂盒。该试剂盒包含本发明的抗体及其在测定环境下的使用说明。

如本文所讨论，本发明的抗体或抗体片段可包括人源化抗体，并可与另外的活性或惰性成分(例如，在常规的药学上可接受的载体或稀释剂中，例如在免疫原性佐剂中)以及任选地与辅助或组合活性分子(诸如抗炎药和抗纤维蛋白溶解药)组合用于治疗性用途。

在其他实施方案中，将本文所述的抗体或抗体片段与组合治疗剂协调施用、与组合治疗剂共同配制或偶合到(例如共价键合)组合治疗剂，所述组合治疗剂例如为放射性核素、分化诱导剂、药物或毒素。可以采用本领域熟知的各种已知的放射性核素。可用于这样的组合治疗制剂和方法的药物包括甲氨蝶呤以及嘧啶和嘌呤类似物。合适的分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。合适的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素、志贺氏菌属(Shigella)毒素和商陆抗病毒蛋白。

在执行本发明的各种测定、诊断性和治疗性方法时，可取的是提前制备包含如本文所述的抗体或抗体片段与其他材料的组合的试剂盒。例如，就夹心酶免疫测定法而言，本发明的试剂盒可包含：特异性结合任选地连接到合适载体的CD44的抗体，可以按相同的方式与用酶标记的单克隆抗体或多克隆抗体一起结合到相同抗原的酶标记的单克隆抗体的冻干制剂或溶液，纯化的CD44的标准溶液，缓冲溶液，洗涤溶液，移液管，反应容器等。此外，试剂盒任选地包含标签和/或说明性材料，从而为在测定环境中实践本文所述的方法提供指示(即，方案)。虽然说明性材料通常包括书面或印刷材料，但是它们不限于此。设想了能够存储这样的说明并将它们传达给使用者的任何介质。这样的介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、磁盒、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。这样的介质可包括通往提供这样的说明性材料的互联网网站的地址。

重组方法

本文所述的抗CD44抗体可使用例如在美国专利No.4,816,567中所述的重组方法和组合物产生。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗CD44抗体的分离的核酸。这样的核酸可编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下载体(例如已用以下载体转化)：(1)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列和含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体以及包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如YO、NSO、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗CD44抗体的方法，其中该方法包括：在适合表达抗体的条件下培养如上提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。

对于抗CD44抗体的重组产生，将例如如上所述的编码抗体的核酸分离，然后插入一个或多个载体，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这样的核酸可使用常规程序容易地分离并测序(例如，通过使用能够特异性结合到编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。

用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。有关抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。(另见Charlton,Methods in MolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第245-254页，该文献描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可将抗体以可溶形式从细菌细胞浆液中分离，然后可进一步纯化。

除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，从而导致产生具有部分或完全的人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。

用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞还衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了可与昆虫细胞结合使用的许多杆状病毒株，尤其是用于转染秋粘虫(S_podo_pterafrugiperda)细胞。

植物细胞也可用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，可以使用能够在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系。可用的哺乳动物细胞系的其他实例为通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)、人胚肾细胞系(如例如在Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293个细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利细胞(如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)、TR1细胞(如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述)、MRC5细胞和FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，包括YO、NSO和Sp2/0。有关适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)。

测定法

可通过本领域已知的各种测定法对本文提供的抗CD44抗体进行鉴定、筛选或表征其物理/化学性质和/或生物活性。鉴定、筛选和表征可通过结合测定法和其他测定法进行。

在一个方面，例如通过诸如ELISA、Western印迹等已知的方法测试本发明的抗CD44抗体的CD44结合活性。可将许多类型的竞争结合测定法用于确定抗CD44抗体是否与另一种竞争，例如：固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等人,1983,Methods in Enzymology9:242-253)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)、使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人,1988,Molec.Immunol.25:7-15)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Cheung等人,1990,Virology176:546-552)以及直接标记RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，这样的测定法涉及使用：结合到具有这些中的任一者的固体表面或细胞的纯化抗原、未标记的供试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白。在存在供试抗原结合蛋白的情况下通过确定结合到固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常，供试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定法(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合到与参考抗原结合蛋白相同表位的抗原结合蛋白，以及对于存在空间位阻而言，结合到与参考抗原结合蛋白所结合的表位足够近的相邻表位的抗原结合蛋白。有关确定竞争性结合的方法的另外细节在本文的实施例中提供。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，它会将参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制(例如，降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多。在某些实施方案中，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。

在本发明的一个方面，可将竞争测定法用于鉴定与本文(例如，在实施例4中)所述的RG7356抗CD44抗体竞争与CD44的结合的抗体。在某些实施方案中，这样的竞争性抗体结合到RG7356抗CD44所结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法在Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols,"Methods in Molecular Biology,第66卷(Humana Press,Totowa,N.J.)中有所提供。

在示例性竞争测定中，将固定化的CD44在以下溶液中孵育，该溶液含有结合到CD44的第一标记抗体(例如RG7356抗CD44抗体)和正测试其与第一抗体竞争与CD44的结合能力的第二未标记抗体。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的CD44在含有第一标记抗体但不含第二未标记抗体的溶液中孵育。在容许第一抗体结合到CD44的条件下孵育后，将过量的未结合的抗体除去，并测量与固定化的CD44相关的标记的量。如果与固定化的CD44相关的标记的量在供试样品中相对于对照样品大大降低，则表明第二抗体与第一抗体竞争与CD44的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

在另一个方面，对合适的抗CD44抗体进行了鉴定、筛选并表征对恶性血液病相关细胞的存活的抑制能力。在一个实施方案中，恶性血液病为白血病，优选淋巴细胞性白血病。在一个优选的实施方案中，淋巴细胞性白血病为CLL。抗CD44抗体抑制恶性血液病相关细胞(例如CLL细胞)的存活的能力可使用本文所述的方法和测定法(例如，实施例4)加以验证。

制品

在本发明的另一方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述的恶性血液病的材料的制品。该制品包括容器以及在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射溶液袋等。容器可由诸如玻璃或塑料的多种材料形成。容器容纳自身或与另一种组合物组合可有效治疗、预防和/或诊断恶性血液病的组合物，并可具有无菌进入口(例如，容器可以为静脉注射溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的胶塞的小瓶)。该组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗CD44抗体。标签或包装说明书指明将组合物用于治疗选择的病症。此外，该制品可包括：(a)其中容纳有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗CD44抗体；和(b)其中容纳有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的治疗剂。在某些实施方案中，第二容器容纳第二治疗剂，诸如本文所述的另外的治疗剂中的一种。

在本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，其指示该组合物可用于治疗特定的病症。可选地或除此以外，制品还可以包含第二(或第三)容器，该容器容纳药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格尔氏溶液和葡萄糖溶液。其还可以包括从商业和用户的观点来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。

本文引用的所有参考文献(包括专利申请和公布)均以引用方式整体并入本文。

已经详细描述了本发明，将显而易见的是，在不脱离所附权利要求书中所限定的发明范围的情况下修改形式、变型形式和等同形式是可能的。此外，应当认识到，在本公开中的所有实例均作为非限制性实例提供。

实施例1

该实施例示出了抗CD44抗体的毒性作用是CLL细胞特异性的。

从32名CLL患者和4名健康自愿者中采集了淋巴细胞。将这些细胞在标准条件下培养。将亚微克量的CD44抗体施用给细胞。抗体对得自CLL患者的淋巴细胞具有直接的细胞毒性，但对得自健康自愿者的淋巴细胞无影响。

实施例2

该实施例示出了抗CD44抗体对CLL细胞的毒性作用不受与间充质细胞共同培养的影响。

从32名CLL患者和4名健康自愿者中采集了淋巴细胞。将这些细胞与间充质细胞一起在标准条件下培养。将亚微克量的CD44抗体施用给细胞。抗体对得自CLL患者的淋巴细胞具有直接的细胞毒性，但对得自健康自愿者的淋巴细胞无影响。正常情况下，间充质细胞可在体外支持CLL细胞的存活，这种情况在存在CD44抗体时不会出现。

实施例3

该实施例示出了移植到免疫缺陷小鼠中的CLL细胞的清除。

将CLL细胞移植到免疫缺陷RAG-2-/-/yc-/-小鼠中。然后向小鼠施用CD44抗体。结果表明低至1mg/kg的该mAb导致了移植的CLL的细胞的完全清除，这种影响未在对照品处理的动物中观察到。

实施例4

在该研究中，评估了表面CD44的表达水平，并测试了新开发的人源化抗CD44单克隆抗体(RG7356,Roche)在体外和体内抑制CLL细胞存活的能力效果。还探索了抗CD44抗体的作用机理。

材料和方法

人类样品。样品由CLL Research Consortium(CRC)在取得知情同意后采集，并得自满足CLL诊断标准的患者。流式细胞术表明这些样品具有超过95％的CD19+/CD5+细胞。如之前所述(Rassenti等人,N Engl J Med2004,351:893-901)评估了ZAP-70表达和IgVH基因突变状态。得自健康供体的血沉棕黄层样品从圣迭哥血库(San Diego Blood Bank)获得。将外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll-Hypaque(Pharmacia,Uppsala,Sweden)通过密度离心而分离，重悬在90％胎牛血清(FCS)和10％二甲基亚砜(DMSO)中以在液氮中进行活细胞保存。

试剂。人源化抗CD44Mab(RG7356)由Roche(Canada)馈赠。对照人IgG购自Cell Science。高分子量(>950kDa)透明质酸(HA)购自R&D system。Z-VAD-FMK购自BD。将RG7356用Alex647蛋白标记试剂盒(Invitrogen)根据制造商的说明与Alex647偶联，抗IgM-FITC购自BD，Alex488-偶联的Zap70购自Caltag Laboratories用于流式细胞术分析。

Western印迹分析和免疫沉淀。将得自健康供体的原代CLL细胞和PBMC如下所示进行处理。将细胞用PBS洗涤两次，然后在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(1％NP40,50mM Tris-HCl,pH7.5,100mM NaCl,5mMEDTA)中裂解(Roche)。使用二喹啉甲酸蛋白测定法(Pierce,Rockford,IL)测定了蛋白浓度。将得自各样品的等量蛋白通过SDS-PAGE分离，然后用CD44特异性抗体(Roche)、ZAP-70(BD Transduction Lab)、磷酸化-AKT(Ser473)、AKT(Cell Signaling Technology)、PARP(BD Biosicence)和β-肌动蛋白(SantaCruze Biotechnology)进行免疫印迹。将辣根过氧化物酶偶联的抗IgG(CellSignaling Technology)用作二抗。将膜通过化学发光系统(Thermo Fisherscientific)显色，并通过放射自显影进行记录。

对于免疫沉淀，将得自各样品的细胞裂解液首先用蛋白A琼脂糖珠(50％浆液)在4℃孵育3小时，然后将指定的抗体加入，再在4℃孵育1小时。将结合的珠在裂解缓冲液中洗涤四次，然后将SDS样品缓冲液加入，再接受如上所述的SDS-PAGE和免疫印迹。

磷酸化-AKT/总AKT ELISA。使用p-AKT(Ser473)和AKT夹心ELISA试剂盒(R&D system)根据制造商的说明测量了p-AKT和总AKT的水平。简而言之，将细胞固定，在96孔板的孔中透化，然后用衍生自不同物种的两种一抗孵育。将识别不同物种的两种二抗用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记，并将HRP或AP的两种谱图不同的荧光底物用于检测。p-AKT水平的倍数变化的计算基于p-AKT的荧光强度除以相对于无处理对照的总AKT的荧光强度。

细胞活力测定。细胞活力通过使用碘代3,3′-二己氧基羰花青(DiOC6；Invitrogen)分析线粒体跨膜电位(ΔΨm)以及通过对碘化丙啶(PI；Sigma)的细胞膜透性而测定。收获原代CLL细胞，并转移到容纳有含60nM DiOC6和10μg/mL PI的100μL FACS缓冲液的FACS管中。将细胞在37℃孵育20min，然后在30min内使用FACSCalibur(Becton Dickinson)通过流式细胞术进行分析。对于DiOC₆在525nm(FL-1)处以及对于PI在600nm(FL-3)处记录了荧光。使用FlowJo7.2.2软件(Tree Star)分析了数据。通过计算PI-/DiOC6^hi群的百分比确定了活细胞。

CLL与骨髓基质细胞(MSC)的共同培养。当指明时，将CLL细胞在MSC层上共同培养，MSC如文献(Fecteau等人:Mol Med2012,18:19-28)中所述在体外衍生自CLL患者的骨髓。将第2次传代和第6次传代之间的MSC以1000个细胞/cm²铺到96孔平底组织培养板中，2至3天后，添加1×10⁶个CLL细胞/mL(2×10⁵个细胞/孔)和指定浓度的RG7356或同型对照抗体(Sigma)。使用PI和DIOC6染色测定了CLL细胞活力。

CD44内化的检测。将CLL细胞用Alex647-偶联的人源化抗CD44抗体在冰上孵育20分钟。洗涤两次后，将细胞留在冰上或在37℃孵育指定的时间以促进内化。然后通过流式细胞术分析测定了平均荧光强度(MFI)。

钙流测量。将2×10⁶个CLL细胞在不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中经2uM Fluo-4AM(Molecular Probes)负载，然后在37℃孵育30分钟。将细胞用HBSS洗涤两次，然后悬浮在1mL缺陷RPMI中。提供流式细胞术(Becton Dickinson)记录了细胞悬液的荧光。将细胞保持在37℃用于IgM刺激。使用FlowJo软件分析了数据。

人CLL异种移植动物研究。将六至八周龄的RAG2^-/-γc^-/-小鼠(得自Dr.Catriona Jamieson,University of California San Diego)关在特定的无病原体条件下的层流柜中并自由进食。对小鼠的所有实验均根据国立卫生研究院(NIH；Bethesda,MD,USA)针对实验动物护理和使用的指南进行。研究方案得到了UCSD和Medical Experimental Animal Care Committee(USA)的批准。在AIM-V无血清培养基中制备了得自原代CLL患者的PBMC，将2×10⁷个活细胞注射进各小鼠的腹腔。第二天，经腹腔注射各种剂量的抗体。七天后，通过向腹腔注射总体积为12mL的DPBS引出腹腔灌洗液(PL)。使用Guava计数确定了PL细胞的总收获量。随后，将细胞用小鼠和人Fc阻断剂在4℃阻断30min，用各种人细胞表面标志(例如CD19、CD5、CD45)染色，并进行处理以进行FACS分析。为了计算PL中残余CLL细胞的最终数量，将通过FACS分析检测的CLL细胞百分比倒退测算到所获得的活细胞事件，然后乘以总PL细胞计数。将得自人IgG处理小鼠的残余CLL细胞作为基线设为100％。各处理组包括至少3只小鼠，并将数据表示为平均值±SEM。

抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定。在注射巯基乙酸盐4天后从Rag2^-/-γc^-/-小鼠的腹腔采集了巨噬细胞，并用于体外ADCP测定。简而言之，将活细胞冷冻的CLL PBMC重悬在含有2％(v/v)FBS低IgG、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640中，然后与指定浓度的抗CD44抗体利妥昔单抗或同种型对照一起以3×10⁴个细胞/孔的密度分配到96孔平底板(Corning)中。将板在冰上孵育30min，然后添加巨噬细胞(1.5×10⁵个细胞/孔)以实现5:1的效靶比。在37℃、5％CO₂下孵育3h后，收集细胞，并使用FACSCalibur仪器(BD)通过流式细胞术进行分析。将仅含有CLL细胞以及仅含有巨噬细胞的样品用于建立合适的活CLL细胞分类，以之为基础，使用FlowJo分析软件确定剩余的活CLL细胞的分率。

补体介导的细胞毒性测定(CDC)。将ZAP-70-CLL细胞分离、洗涤并重悬在含有10％(v/v)FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640中，然后以1×10⁵个细胞/孔的密度分配到96孔U型板(Corning)中。用10μg/mL的抗体在冰上孵育1h后，收获细胞，用PBS洗涤一次以除去未结合的抗体，然后用得自3-4周龄的兔子的20％的补体在37℃下在5％CO2中孵育2h。如上所述在用DiOC6和PI染色后通过流式细胞术测定了CLL细胞活力。

统计分析。使用成对或非成对学生t检验或单因素方差分析、然后使用Dunnett多重比较检验确定了统计显著性。使用皮尔逊相关系数分析了ZAP-70表达与用抗CD44抗体处理的细胞的活力之间的相关性。除非另外指明，否则数据均以平均值±SEM或中值±SEM表示。

结果

CD44在CLL细胞、尤其是在ZAP-70+细胞中高表达。对于流式细胞术使用偶联到Alexa647的人源化抗CD44mAb(RG7356)或对于免疫印迹分析使用未偶联的人源化抗CD44mAb(RG7356)，分析了得自59名CLL患者的白血病B细胞与得自8名健康供体的正常B细胞的CD44蛋白表达。图1A示出了用人源化CD44mAb(空白直方图)或对照mAb(阴影直方图)染色的人淋巴瘤B细胞系(EW36)、正常B细胞和CLL细胞的荧光直方图。通过流式细胞术在CD19+CD5+CLL B细胞和CD19+正常B细胞中均检测到了CD44的高表达水平，但在淋巴瘤B细胞系EW36(图1A)中无法检测。图1B示出了使用人CD44特异性的人源化CD44mAb或β-肌动蛋白的Ab对得自健康成人或CLL患者的EW36、外周血单核细胞(PBMC)的裂解液进行的免疫印迹分析。在Western印迹分析中，通过RG7356检测出在正常外周血单核细胞(PBMC)或CLL B细胞中的各个CD44同种型和标准CD44蛋白(图1B)。标准CD44看似主要位于CLL细胞和正常淋巴细胞两者中(图1B)。图1C示出了得自健康成人(n＝8)或CLL患者(n＝59)的PBMC，如在A组试剂盒中将其用人源化抗CD44mAb或对照mAb进行了染色。通过将CD44mAb的平均荧光强度(MFI)除以对照mAb的MFI获得了MFIR(平均荧光强度比)。各个点表示得自按CD19+CD5+B细胞分类的各个CLL患者样品或按CD19+B细胞(左)分类的健康成人样品的CD44表达水平。如文献所述(Chiorazzi等人,N Engl J Med2005,352:804-815)，将CD44表达水平根据IgV_H基因的体细胞突变程度(中)或根据ZAP-70表达水平(右)与CLL的临床特征相关联。线表示各组的中值CD44表达水平。P<0.05表明使用学生t检验进行计算时在两组之间存在总CD44表达的统计显著性差异。虽然在正常B细胞(平均荧光强度比(MFIR)的中值＝111.7)和CLL B细胞(MFIR＝131.9)中检测到了相似的CD44水平(图1C，右图)，但是在IGVH基因无突变的CLL B细胞中CD44表达水平明显高于IGVH基因发生突变的情况(图1C，中图；MFIR中值分别为161.2与118.5；p＝0.013)。此外，具有ZAP-70表达的CLL B细胞与具有低ZAP-70表达或无ZAP-70表达的那些细胞相比也显示出明显更高的CD44表达水平(图1C，左图；MFIR中值分别为161.2与118.7；p＝0.019)。

CLL细胞对RG7356诱导的直接细胞凋亡的敏感性。由于CD44表达水平与CLL细胞中的ZAP-70表达相关，因此具有高ZAP-70表达水平的患者可能对RG7356治疗反应性更高。为了检验这一假设，将得自总共28名患者(ZAP-70+,n＝16；ZAP-70-,n＝12)的原代CLL细胞和得自6名健康供体的PBMC用渐增浓度的RG7356孵育24小时。基于DiOC₆/PI染色通过流式细胞术分析了细胞凋亡的诱导情况。

如图2中所示，将CLL细胞或正常PBMC在存在抗CD44或hIgG对照mAb的情况下以指定的浓度和时间周期进行培养。收获细胞，并用DiOC₆/PI染色以通过流式细胞术测量活力。还对正常PBMC针对CD19表达进行了染色，以评价B细胞群中的细胞死亡。图2A展示了得自用50ug/ml mAb孵育24小时的2个代表性CLL样品的等值线图。相对DiOC6和PI荧光强度分别显示在X轴和Y轴上。为DiOC₆明亮和PI阴性的右下象限中的细胞是活细胞，并将那些数值用于生成所示的图线。图2B示出了将根据ZAP-70表达所分离的CLL细胞或正常PBMC在存在渐增浓度的mAb的情况下培养，24小时后收获以用于如上所述的细胞活力分析。所示的数据为一式三份的代表性样品的平均值+/-SEM。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001(学生t检验)。图2C显示了在存在或不存在(50ug/ml)mAb的情况下培养并在指定的时间收获以用于如上所述的细胞活力分析的细胞。所示的数据为一式三份的代表性样品的平均值+/-SEM。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001(学生t检验)。在图2D中，各个点代表用50ug/ml的抗CD44mAb培养24小时的得自一名患者的细胞的相对活力。活细胞百分比已针对用对照mAb处理的细胞的活力进行标准化。线表示按组划分的用抗CD44mAb处理的细胞的中值活力。正常细胞的N＝6，CLL细胞的n＝28。图2E示出了：根据ZAP-70的状态显示在D中所示的CD44mAb暴露后剩余的活细胞百分比，其中使用标准20％表达作为截止值。用抗CD44mAb处理的ZAP-70+CLL细胞(n＝12)的活力明显低于用抗CD44mAb处理的ZAP-70-CLL细胞(n＝16)的活力。P＝0.001(学生t检验)。图2F示出了：根据各样品的表达ZAP-70的细胞的百分比显示在D中所示的CD44mAb暴露后剩余的活细胞百分比。ZAP-70表达水平与用抗CD44mAb处理的细胞的活力相关。Pearson R＝-0.5345，P＝0.0034，n＝28。

低至2μg/ml的RG7356在CLL细胞中诱导了细胞凋亡，而在用浓度高达50μg/ml的RG7356或用人IgG对照抗体处理的正常B细胞中观察到很少的影响或未观察到影响(图2A-B)。此外，在ZAP-70+CLL细胞中的细胞凋亡诱导为剂量依赖性的。这些结果表明RG7356对CLL细胞、尤其是表达高水平ZAP-70的那些细胞具有选择性细胞毒性。

为了研究由RG7356诱导的细胞毒性的动力学，将细胞用50μg/ml的RG7356处理并在多个时间点进行分析。与无处理的或用对照hIgG处理的细胞相比，在CLL样品中在RG7356处理后3小时就发生了增加的细胞死亡并随着时间的推移而持续(图2C)。在不同的CLL样品之中，ZAP-70+细胞比ZAP-70-细胞对RG7356诱导的细胞凋亡明显更敏感，而不论CD44表达水平相当(图2E和图9)。此外，观察到了在24小时时用RG7356处理的CLL细胞的活力与各个样品所表达的ZAP-70水平之间的明显逆相关(图2F，皮尔逊相关系数R＝-0.5345，P＝0.0034)。相比之下，尽管处理长达48小时，也未在正常B细胞中观察到差异(图2C-D)，从而表明这种特异性CD44Mab表现出针对CLL细胞的选择性并对正常B细胞而言相对安全。

RG7356介导的细胞凋亡为半胱天冬酶依赖性的。与以下近期报道一致：抗CD44mAb介导的细胞死亡的标志是线粒体跨膜电位的降低(Gupta等人J Cell Mol Med2009,13:1004-1033)，我们的数据也证实RG7356在CLL细胞中诱导了细胞凋亡。为了进一步调查RG7356诱导CLL细胞死亡的机理，将细胞进行处理，并用膜联蛋白V和7AAD染色以进行FACS分析或裂解以进行SDS-PAGE，从而通过Western印迹了解PARP的裂解。

如图3所示，将CLL B细胞在存在50ug/ml抗CD44mAb或hIgG对照抗体的情况下培养48小时。图3A示出了用膜联蛋白V和7AAD染色并通过流式细胞仪分析的细胞。相对荧光强度分别显示在X轴和Y轴上。右下和右上象限中的细胞为凋亡细胞。在图3B中，收获细胞裂解液，并通过Western印迹分析了PARP的裂解片段。将β-肌动蛋白用作上样对照。(C)将细胞用抗CD44mAb在不存在或存在各种浓度的泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK的情况下培养48小时。在DIOC6和PI染色后将细胞通过流式细胞仪分析。将数据与无处理的样品(活力为100％)进行比较。所示的结果为得自三个不同CLL样品的平均值±SEM。使用Dunnett多重比较检验确定了统计显著性。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

在用RG7356处理的CLL细胞中发现了与用对照hIgG处理的细胞相比至少2倍的膜联蛋白V阳性凋亡细胞增加(图3A)。还在这些RG7356处理样品中检测到了PARP裂解的诱导(图3B)。最后，细胞死亡通过泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK以剂量依赖性方式得以拯救(图3C)，表明RG7356诱导的细胞凋亡在CLL细胞中为半胱天冬酶依赖性的。

CLL微环境的影响。据报道，细胞微环境避免CLL细胞发生自发性和药物诱导的细胞凋亡(Burger等人Blood2009,114:3367-3375；Meads等人Nat Rev Cancer2009,9:665-674)。为了研究CLL微环境对RG7356诱导的细胞凋亡的影响，对与源自患者骨髓的MSC共同培养的CLL细胞进行了细胞活力测定。

图4示出了将单独地或在存在间充质基质细胞(MSC)的情况下培养的CLL细胞用指定浓度的抗CD44mAb或hIgG对照抗体孵育24小时或48小时。通过染色和流式细胞术测量了活力。将数据针对活力为100％的0时间点时的PI^neg/DiOC₆ ^hi群进行标准化。所示的结果为得自每组的3名不同患者的平均值+/-SEM。*表示抗CD44mAb处理与hIgG处理之间的统计显著性差异(成对学生t检验)。

与之前的观察一致，RG7356处理的ZAP-70+CLL细胞不论MSC的存在均显示出快速而明显的活力降低，并且约50％的细胞在48小时时死亡(图4)。相比之下，ZAP-70-CLL细胞不论MSC的存在均不受影响。

抗CD44mAb(RG7356)在体外阻断透明质酸(HA)诱导的信号转导和ZAP-70+CLL细胞存活。由于已证实衍生自健康个体的MSC以及衍生自患有多发性骨髓瘤的患者的MSC表达HA合酶以及CD44的主要配体HA(Calabro等人Blood2002,100:2578-2585；Jung等人Biochem Biophys ResCommun2011,404:463-469)，我们调查了HA对CLL细胞存活和信号转导的影响。将CLL细胞在不存在或存在50μg/ml HA的情况下培养24小时，并使用DiOC₆/PI染色与流式细胞术分析评估了细胞活力。

图5A示出了得自在存在或不存在HA(50ug/ml)下孵育了24小时的ZAP-70^neg CLL样品(n＝5)或ZAP-70⁺CLL样品(n＝7)的纯化CLL细胞。收获CLL细胞，用DiOC6/PI染色并通过流式细胞术分析。所示的数据示出了所测试的各患者的DiOC₆+PI-活细胞的百分比。图5B示出了在不同的时间点从用HA(50ug/ml)刺激的CLL样品(n＝3，ZAP-70^neg或ZAP-70⁺)收获并通过磷酸化AKT(p-AKT)/总AKT(t-AKT)特异性ELISA测定法分析的细胞裂解液。所示的结果为针对相对于处理前的值(0min)的在不同时间点时的t-AKT进行标准化的p-AKT水平的平均值+/-SD。p<0.05表示使用成对学生t检验分析的差异的统计显著性。在图5C中，将ZAP-70⁺CLL样品在用或不用抗CD44mAb(50ug/ml)下预处理20分钟，然后用HA(50ug/ml)刺激5分钟。将细胞裂解，并通过Western印迹分析p-AKT和t-AKT的表达。在图5D中，将ZAP-70⁺CLL样品在用或不用抗CD44mAb下以及在用或不用HA下孵育24小时。收获细胞，在DiOC6/PI染色后通过流式细胞术分析。示出了DiOC6⁺/PI^neg活细胞的百分比。在Tukey多重比较检验后通过单因素方差分析确定了统计显著性。

在用HA处理的ZAP-70+患者样品中观察到了细胞活力的轻度到中度的增加(图5A，右图)。相比之下，HA处理对大多数ZAP-70-情况的活力具有较低的影响或无影响。当研究在CLL细胞中可通过HA诱导的可能的信号转导通路时，我们发现，使用pAKT/总AKT特异性ELISA测定法，AKT的磷酸化在HA处理后的5至10分钟之间快速增加(图5B)。与活力结果一致，AKT信号转导的磷酸化优先地在ZAP-70+情况下通过HA诱导，然而所有测试的样品均具有相似的CD44表达水平(数据未示出)。为了评价RG7356对HA诱导的信号转导和细胞存活的影响，将ZAP-70+CLL细胞用RG7356预处理，然后用HA刺激。在HA处理后p-AKT信号转导或存活的诱导均消除(图5C-D)，从而表明RG7356在阻断CD44与可在微环境中蓄积的HA之间的相互作用方面非常有效。

RG7356取消ZAP-70下游BCR信号级联。为了进一步调查RG7356抑制CLL细胞存活的机理，我们进行了内化测定。

图6A示出了抗CD44mAb被CLL细胞内化。将CLL细胞用Alexa-647偶联的抗CD44mAb染色，在4℃或37℃下孵育，并在指定的时间点通过流式细胞术分析。数据表示为针对0时间点时的细胞的CD44平均荧光强度(100％)标准化的CD44平均荧光强度(MFI)。图6B示出了在CD44mAb处理后CD44蛋白水平的降低。将CLL样品用hIgG对照Ab或抗CD44mAb(50ug/ml)处理48小时，并通过免疫印迹分析细胞裂解液。图6D示出了在CD44mAb处理后降低的ZAP-70蛋白水平。将CLL细胞用抗CD44mAb或hIgG对照Ab孵育指定的时间周期，用Alexa-488偶联的抗ZAP-70抗体染色，并通过流式细胞术分析。图中显示的是为ZAP-70⁺的2个代表性CLL样品。在图6D中，代表性直方图示出了在用抗CD44mAb(空白)或IgG对照(阴影)处理48小时的两个Zap-70+CLL样品(CLL1和CLL2)中ZAP-70的荧光强度。CD19+正常B细胞中的ZAP-70水平用作阴性对照(具有虚线的空白直方图)。图6E示出了CD44在CLL细胞中与Zap-70物理相关。将得自不同患者的CLL细胞的蛋白裂解液用抗CD44mAb或抗ZAP-70Ab进行免疫沉淀(IP)。将结合的产物或全细胞裂解液(WCL)使用在WB栏中指定的抗体通过免疫印迹进行探查。图6F示出了在抗CD44mAb处理后CD44和ZAP-70蛋白的下调。将ZAP-70⁺CLL细胞用抗CD44mAb(50ug/ml)或hIgG对照Ab处理，将蛋白裂解液用抗CD44mAb进行免疫沉淀(IP)，并接受通过指定的抗体进行的免疫印迹。图6G示出了抗CD44mAb处理降低了CLL细胞中IgM诱导的钙流。将Zap-70⁺CLL样品首先用荧光钙指示剂Fluo-4AM标记，用抗CD44mAb(50ug/ml)或hIgG对照Ab预孵育12小时，用抗IgM刺激，并通过FACS随时间的推移记录荧光强度。线表示对照CLL细胞(黑线)或用抗CD44mAb预孵育的细胞(灰线)随着时间(x轴)推移的荧光强度变化(y轴)。箭头表示添加抗IgM的时间。图6H显示了抗CD44mAb在CLL细胞中减轻IgM诱导的存活。将ZAP-70⁺CLL样品在用或不用50ug/ml抗CD44mAb或IgG对照Ab下在存在或不存在抗IgM(10ug/ml)的情况下孵育48小时。收获细胞，用DiOC₆/PI染色，并通过流式细胞术分析以测量活力。图中显示了得自所测试的三个患者样品之一的代表性数据。每个条示出了三个重复样的DiOC₆ ^hi/PI^neg活细胞的平均比例。误差条表示SEM。*表示在Tukey多重比较检验后使用单因素方差分析法分析的差异的统计显著性。

在结合到Alex647偶联的RG7356时，在37℃孵育10分钟后检测到了细胞表面CD44的快速内化，到2小时时，显示出超过40％的平均荧光强度(MFI)降低(图6A)。尽管处理长达24小时，也未观察到表面IgM的降低(数据未示出)，从而表明RG7356为CD44特异性的。在RG7356处理的CLL细胞中总CD44蛋白水平的Western印迹分析也揭示明显的降低(图6B)。令人感兴趣的是，ZAP-70表达水平在RG7356处理6小时后也明显降低，到12小时时，ZAP-70水平降低至少30-50％(图6C-D)。得自免疫沉淀分析的结果表明ZAP-70和CD44在所测试的所有ZAP-70+CLL细胞中但未在ZAP-70-情况下形成了复合物(图6E)，从而表明ZAP-70在CLL细胞中可能涉及CD44存活信号。实际上，用RG7356处理破坏了ZAP-70/CD44复合物，如图6F中所示。随后，BCR下游信号转导(例如细胞内钙流)也受到抑制(图6G)。此外，抗IgM刺激的促存活作用与用对照抗体处理相比被RG7356处理消除(图6H)。

RG7356在异种移植动物模型中损害CLL细胞存活。为了评价RG7356的体内效果，我们使用允许我们定量测定残余CLL细胞的高度免疫缺陷RAG2/γ链敲除小鼠(Rag2^-/-γc^-/-)建立了异种移植CLL停泊(parking)动物模型。

如图7所示，在注射mAb前一天，将CLL细胞注射到Rag2^-/-γc^-/-小鼠的腹腔。在注射细胞后7天采集腹腔灌洗液，在人特异性CD5、CD19和CD45染色后接受通过细胞计数和FACS分析进行的残余CLL测定。图7A显示了用低剂量或高剂量mAb处理的两个代表性CLL样品的等值线图。右下分类的细胞为人CLL细胞，并将那些数值用于生成图7B所示的条形图。图7B的图线中的每个条表示在用不同浓度的抗CD44mAb处理后从小鼠收获的残余CLL细胞的百分比，并且该百分比针对从通过对照hIgG处理的小鼠收获的残余CLL细胞的百分比(100％)进行标准化。所示的数据为得自3名不同患者的平均值+/-SEM(其中各组的n＝3)。P表示通过学生t检验计算的抗CD44mAb处理与hIgG处理之间的统计显著性差异。

剂量调整研究支持我们之前的观察结果：在低至0.01mg/Kg体重的单个低剂量下，ZAP-70+CLL细胞比ZAP-70-细胞对RG7356处理的反应性更强(图7A)。然而，不论ZAP-70表达水平如何，与对照hIgG的100％回收率相比，超过90％的CLL细胞从通过1mg/Kg RG7356处理的小鼠中清除(图7B)，从而表明RG7356以微环境(niche)依赖性方式高度有效地清除CLL细胞，而不论患者的疾病特性如何。

RG7356的作用模式为抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。虽然Rag2^-/-γc^-/-小鼠缺乏B、T和NK细胞，但是残余的巨噬细胞仍存在于腹腔中。为了进一步评价腹腔巨噬细胞对ZAP-70-CLL细胞中RG7356介导的细胞毒性的作用，将细胞在存在或不存在巯基乙酸盐富集的小鼠腹腔巨噬细胞的情况下处理，并接受细胞吞噬作用和细胞活力测定。

图8示出了用指定浓度的抗CD44mAb、对照hIgG Ab或利妥昔单抗在冰上预孵育30分钟的CLL样品。将细胞在37℃下单独地(空白条)或在存在比率为1:5的巨噬细胞(灰色条)或兔补体(右)的情况下进一步孵育3小时。收集细胞，染色，并通过流式细胞术分析活CLL细胞(PI^negDiOC₆ ^hi)。所示的数据为得自每组5名患者的平均值+/-SEM，并针对相应的对照样品(活力为100％)进行标准化。*表示p<0.05，**表示p<0.01(Tukey多重比较检验后进行单因素方差分析)。

在用RG7356或利妥昔单抗孵育3小时后，细胞活力仅在与腹腔巨噬细胞共同培养的细胞(图8，灰色条)但未在单独的细胞(空白条)中明显降低，达到约50％，从而表明在系统中发生了活性细胞吞噬作用。然而，与作为阳性对照用利妥昔单抗处理的细胞相比，未在RG7356处理的细胞中观察到补体介导的细胞毒性(图8，填充条)。

用抗CD44mAb或利妥昔单抗处理的CLL细胞的活力

在CLL细胞中表面CD44蛋白的高水平表达鼓舞了我们评价新开发的人源化抗CD44mAb(RG7356)对CLL细胞的细胞毒性活性。

在图9中，左图上的每个点代表得自各个CLL患者的B细胞(按CD19+CD5+B细胞分类)的CD44表达水平(MFIR)。线表示按各组划分的中值CD44表达水平。右图上的每个点代表用50ug/ml抗CD44mAb培养24小时的1名患者的细胞的相对活力。活细胞百分比已针对用对照mAb处理的细胞的活力进行标准化。线表示按组划分的用抗CD44mAb处理的细胞的中值或活力。使用学生t检验确定了统计显著性。

低至10ug/ml的RG7356显示出较高的直接细胞杀伤作用，其与相似剂量的利妥昔单抗相比明显更优，后者不诱导促凋亡活性(图10A)。然而，观察到对用高剂量的该RG7356处理的正常B细胞的存活影响很小或无影响，从而表明该抗CD44mAb对正常B细胞相对安全。此外，抗CD44mAb的凋亡细胞杀伤不需要IgG交联，并因此而言，抗CD44mAb诱导的直接细胞死亡诱导模式类似于所谓的II型CD20mAb。

II型CD20mAb的特征在于与I型mAb相比介导CDC活性的能力降低，但是已表明在其B细胞消耗活性方面胜过I型mAb(Mossner等人Blood2010,115:4393-4402；Beers等人Blood2008,112:4170-4177)。在此背景下，值得注意的是抗CD44mAb同样缺乏CDC活性。

图10A示出了用抗CD44mAb、利妥昔单抗或对照抗体(10ug/ml)孵育了24小时的CLL样品(n＝4)。收获CLL细胞，用DiOC6/PI染色并通过流式细胞术分析。所示的数据显示了DiOC6+PI-活细胞的百分比。p表示使用Dunnett多重比较检验分析的差异的统计显著性。图10B示出了对CLL细胞的mAb处理的表型分析。将原代CLL细胞用浓度为50ug/ml的抗CD44、利妥昔单抗或人IgG对照抗体在37℃下在细胞培养基中孵育，并在指定的时间点记录了显微照片(20倍相差物镜)。

抗CD44mAb孵育后的快速同型聚集(图10B)提供了以下证据：抗CD44mAb可被视为II型mAb，并与高度有效的直接细胞杀伤相关(Alduaij等人Blood2011,117:4519-4529)。

Claims (25)

1.一种特异性结合到CD44的分离的抗体或抗体片段。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、FV片段、单链FV(scFV)片段、dsFV片段、CH片段和二聚scFV。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段是人源化的。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段特异性结合到在CLL细胞上表达的CD44。

5.一种药物组合物，包含权利要求1所述的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体。

6.一种分离的核酸分子，编码权利要求1所述的抗体。

7.一种表达载体，包含权利要求6所述的核酸分子。

8.一种产生权利要求1所述的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括：

i)用表达构建体转化宿主细胞，所述表达构建体包含，

编码权利要求1所述的抗体或抗体片段的核酸分子；以及

ii)在适合产生偶联物的条件下培养所述宿主细胞，从而产生蛋白偶联物。

9.一种用于检测样品中的CD44蛋白的方法，所述方法包括：

(a)将所述样品与可检测地标记的权利要求1所述的抗体或抗体片段接触；以及

(b)检测所述样品中可检测地标记的肽与CD44之间的免疫反应性。

10.根据权利要求9所述的方法，还包括(c)确定与CD44的对照水平相比受试者中CD44蛋白的量是已经升高还是降低。

11.一种使抗体或抗体片段靶向具有CD44受体的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的抗体接触。

12.一种检测得自已知或疑似含有恶性血液病(hematological malignancy)细胞的受试者的样品中CD44蛋白的存在性的试剂盒，包含权利要求1所述的抗体或抗体片段及其在测定环境下的使用说明。

13.一种用于治疗或预防恶性血液病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的针对CD44的抗体。

14.一种监控用于治疗患有恶性血液病或存在患恶性血液病风险的受试者的治疗方案的方法，包括确定因施用CD44特异性抗体所致的CD44蛋白活性或表达的变化，从而监控所述受试者中的所述治疗方案。

15.一种用于治疗或预防CLL的方法，其中结合到CLL细胞上的CD44的抗CD44抗体对其赋予生存优势，所述方法包括施用权利要求1所述的抗体或抗体片段。

16.一种用于治疗或预防受试者中的恶性血液病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的特异性结合CD44的抗体，其中所述恶性血液病为化学疗法和/或生物疗法难治性的。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述化学疗法包括嘌呤核苷类似物。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述化学疗法包括烷化剂。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述化学疗法包括嘌呤核苷类似物和烷化剂。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述恶性血液病为化学疗法和生物疗法难治性的。

21.根据权利要求16或20所述的方法，其中所述生物疗法包括单克隆抗体。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述单克隆抗体为抗CD20抗体。

23.根据权利要求16所述的方法，其中所述恶性血液病为白血病。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述白血病为淋巴细胞性白血病。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述淋巴细胞性白血病为B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。