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CN103917638A - 多级分析物检定 - Google Patents

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CN103917638A
CN103917638A CN201280054618.5A CN201280054618A CN103917638A CN 103917638 A CN103917638 A CN 103917638A CN 201280054618 A CN201280054618 A CN 201280054618A CN 103917638 A CN103917638 A CN 103917638A
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E.布伦南
C.李
A.贝伦基
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Nexus Dx Inc
Original Assignee
Nexus Dx Inc
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Publication date
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Abstract

本发明提供方法和设备，用于检测在样品中分析物(包括心肌损伤的标志如心肌肌钙蛋白)的两个或者更多个阈水平的存在。在多个实施方案中，本发明提供用于测定患者病症的便利的即时检验试验，以指导具有成本效益的健康护理。

Description

多级分析物检定
背景技术
已经开发了试验以检测在体内样品中分析物的存在，包括以即时检验(point-of-care)的形式，其允许健康护理从业人员迅速确定患者的病症。这些试验通常涉及抗原-抗体反应或者一些其它配体-配体受体结合事件，并可涉及放射性标记物、酶促标记物、荧光标记物，或者其它可检测标记物。许多这种试验设计成通过以下方法进行定性测定：检测分析物在样品中以指定水平或者浓度或者以高于指定水平或者浓度存在或者不存在。
然而，表明分析物在样品中以可检测浓度或者以高于可检测浓度存在或者不存在的二元试验结果不一定向临床医师、患者，或者进行试验的人员提供最有用的信息。例如，在患者血清中心肌肌钙蛋白(例如，cTnI)(其为心肌损伤的标志)的存在可指示许多病症，或者与许多病症相关，所述病症包括心肌梗塞以及继发性缺血性和非缺血性损伤如冠状动脉介入(coronaryintervention)、心肌心包炎、败血病、心脏创伤、化学疗法，和肾衰竭。参见Sharma等人，Cardiac Troponins，J.Clin.Pathol.57:1025-1026(2004)。因此，在血清中心肌肌钙蛋白的存在不一定指示患者正在经历急性心脏事件(例如，心肌梗塞或者MI)。此外，这种水平的不存在不一定排除急性心脏事件(例如MI)，这是因为在这种事件之后历时约4至12小时在血清中肌钙蛋白水平增加。而重要的是测定是否肌钙蛋白水平正在随时间推移以与急性心脏事件一致的方式增加。
能够提供准确的，半定量的，便利的，和具有成本效益的关于样品中的分析物水平的信息(包括心肌损伤的标志)的即时检验试验将极大地满足需要。
发明内容
本发明提供用于检测样品中的分析物的两种或者更多种阈水平的存在的方法和设备。在多个实施方案中，本发明提供用于测定患者病症的便利的即时检验试验，以指导具有成本效益的健康护理。
在一个方面，本发明提供设备，其用于检测患者样品中的心肌损伤或者损害的标志的至少两个阈水平。心肌损伤或者损害的这种标志(其包括心肌肌钙蛋白(例如，cTnT或者cTnI)、肌红蛋白和CK-MB)的增加的水平可指示本申请所述的心肌梗塞和其它急性心脏事件。所述设备可适于即时检验测定，并可由健康护理专业人员或者由未经训练的人员使用，以测定住院治疗或者紧急护理的需要。
根据该方面，所述设备涉及横向流动膜(lateral flow membrane)和结合试剂以在心肌损伤或者损害的标志(“生物标志”)的存在下形成可检测的复合物。所述设备包含样品施用区，和一个或者多个与样品施用区流体连通的流体流动路径。所述流体流动路径包含第一生物标志捕获区和第二生物标志捕获区，其可串联地位于单个流动路径上或者可位于分开的流动路径中。所述第一捕获区设置成可检测地捕获在样品中以第一阈水平或者以高于第一阈水平存在的生物标志，和所述第二捕获区设置成可检测地捕获在样品中以第二阈水平或者以高于第二阈水平存在的生物标志。因此，所述设备提供用于测定或者追踪患者中的生物标志水平的半定量信息，并提供用于以即时检验的形式测定患者病症的多方面信息。
例如，所述设备可含有结合试剂，其用于检测心肌肌钙蛋白如cTnI的至少两个阈水平。在这种实施方案中，所述第一阈水平可指示在血液循环中cTnI的存在，并可对应于约0.04ng/mL并提供更具体的临床评价。例如，高于此阈的cTnI水平表示，应该监测患者的增加的cTnI水平，其指示潜在的心脏事件。所述第二阈水平可指示急性心脏事件，并可对应于在循环中的约0.1ng/mL cTnI。高于所述第二阈水平的cTnI水平指示急性心脏事件，例如MI。在某些实施方案中，所述设备也可提供cTnI的三种或者更多种阈水平的测定，以增强试验的敏感性和/或特异性和/或范围，和/或提供甚至更加具体的临床评价。
一个或多个流体流动路径通常由一个或者多个吸水的(bibulous)，吸收性的，和/或多孔的膜形成，并且每个流动路径可包含对照区，所述对照区产生作为成功样品流动的指示的可检测信号。在一些实施方案中，所述流体流动路径还可包含具有各种孔隙度的膜或者垫以过滤细胞和/或碎片，所述膜或者垫通常接近样品施用区。在这些或者其它实施方案中，所述流体流动路径可包含一个或者多个容纳结合试剂的试剂垫，和/或可在末端包含吸收垫以帮助驱动样品流动。
所述生物标志(例如，cTnI)是可检测的，例如，在样品中通过形成可捕获的和可检测的复合物，用第一结合成员和第二结合成员形成，所述第一结合成员和第二结合成员包含在所述设备中(例如，在试剂垫中)或者添加至样品(例如，在预孵育步骤中)。所述第一结合成员和所述第二结合成员可为本申请详细描述的免疫试剂。所述第一结合成员具有附着的或者结合的可检测的标记物，所述标记物可在捕获区固定复合物之后被观察到或者检测到。本申请描述了多种适合的标记物。所述设备可包含一个或者多个第二结合成员，以允许在特定的捕获区捕获或者固定复合物。具体地，每个第二结合成员在捕获区被固定或者能够在样品流动期间在特定捕获区被固定。例如，可将至少一个第二结合成员通过抗生蛋白链菌素-生物素相互作用，通过抗体-抗原相互作用，或者通过互补或者基本互补的寡聚核苷酸的杂交在捕获区捕获。所述第一和/或第二结合成员可散布性地结合在一个或多个cTnI捕获区上游的一个或多个流动路径中，使得样品中的生物标志在样品流动期间与第一和第二结合成员形成可捕获和可检测的复合物。
在一些实施方案中，所述第一捕获区和所述第二捕获区位于不同的，平行的或者双向的，与样品施用区流体连通的流动路径中。例如，所述设备可包含两个、三个，或者更多的流动路径，每个流动路径设置成测定样品中的生物标志的不同的阈水平。在一些实施方案中，为了在一段时间内重复试验以检测升高的分析物水平，所述设备可包含至少第二样品施用区，和相应的一个或多个流动路径。
为了在多个阈水平检测生物标志，通常对所述设备进行设置。在一些实施方案中，所述第一捕获区具有第一量的固定的捕获剂，和所述第二捕获区具有第二量的所述固定的捕获剂，另外的捕获区以此类推，以在每个捕获区可检测地捕获标志的不同阈水平。固定的捕获剂可为，例如，抗生蛋白链菌素、生物素、抗体，或者天然或者人工的多核苷酸，相对的结合成员与分析物特异性的结合试剂(“所述第二结合成员”)缀合。在其它实施方案中，所述第一捕获区包含对所述生物标志具有第一亲和性的抗体，以及所述第二捕获区包含对所述生物标志具有第二亲和性的抗体，以在不同的阈水平可检测地捕获生物标志。低亲和性抗体和高亲和性抗体可非散布性地与各自的捕获区结合，或者可通过使用特异性捕获剂如一种或多种抗生蛋白链菌素或者多核苷酸捕获剂等而引导至特定捕获区。例如，具有不同序列的多核苷酸捕获剂可用于将低亲和性抗体和/或高亲和性抗体引导至特定捕获区。
在其它实施方案中，捕获区是连续的，阈或者相对水平通过沿着流动路径捕获的可检测免疫复合物的相对长度来识别。
在另一方面，本发明提供半定量方法，用于评价患者样品中的心肌损伤或者损害的标志如心肌肌钙蛋白(例如，cTnI)的水平。所述方法包括将试验样品施用至本发明设备，并在捕获区中检测特异性可检测信号是否存在。患者可具有急性心脏事件的一个或者多个症状，和/或可具有慢性心脏疾病，从而使得快速肌钙蛋白(例如，cTnI)测定对于确定紧急介入的需要而言是潜在关键的。而且，患者可具有与cTnI的特定循环水平相关的慢性症状，例如肾脏病、在前心脏创伤或者外科介入，或者败血病，使得在潜在背景水平上快速并准确地检测cTnI的升高水平的方法是理想的，以避免不必要的紧急护理的费用。在患者样品显示的标志水平在第一阈水平，但是低于第二阈水平的情况下，在约1至约10小时内重复试验以检测标志的升高水平。
例如，指示cTnI的第一阈水平的可检测信号暗示应针对心肌梗塞的体征和症状监测患者，和在一些实施方案中，在一段时间后重复试验以检测cTnI的升高水平。指示cTnI的第二阈水平的可检测信号暗示针对潜在急性心脏事件如MI治疗患者。在患者不具有用试验设备可检测的cTnI水平的情况下，确定患者不经历急性心脏事件，或者具有低的不利结果的危险。
在另一方面，本发明提供设备和方法，其用于检测试验样品中的分析物的至少两个阈水平。在该方面，所述分析物不需要是心肌损伤的标志，而可为任何标志，其在样品中的水平可暗示超过一种医疗决策点(medicaltreatment decision point)。这种标志可指示中风或者脑外伤，对治疗剂的变态反应(例如，抗治疗剂的IgE抗体)，或者具体疾病活动性的量度，包括自身免疫性疾病(通过检测自身抗体或者测定细胞因子分布)。
在此方面，所述设备通常包含样品施用区，和一个或者多个与样品施用区流体连通的流体流动路径。一个或多个流体流动路径包含第一分析物捕获区和第二分析物捕获区。第一和第二捕获区串联地位于单个流动路径上或者位于分开的流动路径中。所述第一分析物捕获区包含第一量的固定的捕获剂，以在以第一阈水平或者以高于第一阈水平存在于样品中时直接或者间接地可检测地捕获分析物(例如，以可检测的复合物形式存在)。所述第二分析物捕获区包含第二量的固定的捕获剂，其设置成在以第二阈水平或者以高于第二阈水平存在于样品中时直接或者间接地可检测地捕获分析物(例如，以可检测的复合物形式存在)。用于与分析物形成可检测复合物(例如，免疫复合物)的结合试剂可在所述设备中在流体流动路径中存在，或者在预孵育步骤中与样品组合。
在多个实施方案中，固定的捕获剂是选自抗生蛋白链菌素-生物素、抗体-抗原，或者互补或者基本互补的天然或者人工的寡聚核苷酸的结合对的一员，其中相对结合成员与用于形成复合物的结合试剂之一(例如，所述第二结合成员)缀合。
附图说明
图1示出本发明的试验设备。所述试验设备包含与横向流动膜流体连通的样品施用区。图1还示出使用连续捕获区的实施方案。
图2示出本发明的试验设备。所述试验设备包含与一个横向流动膜流体连通的样品施用区，所述一个横向流动膜被不可渗透屏障分成两个亚部分。
图3示出本发明的试验设备。所述试验设备包含样品施用区和试剂垫，其中的试剂垫与被屏障分开的两个平行的，独立的横向流动膜流体连通。每个横向流动膜包含捕获区和对照区，并且每个横向流动膜的下游是吸收垫。
图4示出本发明的试验设备。所述试验设备包含与单一样品施用区流体连通的两个独立的横向流动膜。所述试验设备使用双向流。
图5示出本发明的试验设备。所述试验设备包含一个样品施用区和用于检测多个分析物的围绕样品施用区放射状排列的多个横向流动膜，每一分析物在多个阈水平。
图6示出包含横向流动膜的试验设备，所述横向流动膜包含由支撑基质支撑的两个串联取向的捕获区。所述两个捕获区使用高和低亲和性抗体以分别检测低和高分析物阈。所述试验设备设计成可检测地捕获相同分析物的两个不同的浓度。
图7示出包含两个捕获区的横向流动膜，其设计成可检测地捕获相同分析物的两个不同的浓度。一个捕获区使用高亲和性抗体，每个抗体与生物素缀合。生物素与横向流动膜上的抗生蛋白链菌素结合，以固定高亲和性抗体。所述第二捕获区使用与横向流动膜直接结合的低亲和性抗体。
图8示出包含两个捕获区的横向流动膜，其设计成可检测地捕获相同分析物的两个不同的浓度，或者两个不同的分析物。捕获剂为寡聚核苷酸，其中所述互补寡聚核苷酸固定在特定捕获区。
图9显示在本发明的试验设备上运行的多水平心肌肌钙蛋白检定的结果。示例性实施方案使用平行的流动路径和固定在捕获区的不同量的生物素，以产生分析物的两个可检测的阈。
具体实施方式
本发明提供用于检测样品中的分析物的两个或者更多个阈水平的存在的方法和设备。在多个实施方案中，本发明提供用于确定患者病症的便利的即时检验试验，以指导具有成本效益的健康护理。
在体液样品中的分析物浓度是用于疾病和其它临床病症的诊断或者预后的有用指示物。如本申请所述，在单一试验设备上的多个阈(即，截断)水平增强试验所传递的信息，并提供快速评价医疗选择的机会。而且，在多个阈水平测量一个或多个分析物可用于监测疾病状态或者病症的进展，或者用于确定病症是否存在，这通过以下方法进行：通过在一段时间内的连续测量，测量分析物水平的演变。
使用半定量试验如横向流动试验(lateral flow test)针对多个阈水平测量分析物浓度可特别有用，这是因为超过一个临床决策点(并因此，所得的行动过程)可在即时检验时在单一评价中解决，并可由未经训练的人员实施。
在多个实施方案中，本发明设备和方法避免了定量分析经常需要的麻烦的或者不便的仪器使用的需要，从而使得本发明对于例如家庭、农村地区、救护车、飞机，和欠发达地区是理想的。本发明提供足以向无经验的使用者发出需要紧急健康护理的信号的容易解释的试验。
所涉及的分析物和标志
所述设备在某些实施方案中检测与心肌损伤或者损害有关的分析物，其在血清中的存在指示急性心肌事件，例如心肌梗塞。这种分析物包括心肌肌钙蛋白(例如，cTnT、cTnI，和cTnC)、肌红蛋白，和CK-MB。心肌损伤的其它标志描述在美国专利6,461,828中，将其全部内容并入本文作为参考。所述设备可设置成检测心肌损伤的至少一个、两个，或者三个标志的多个阈水平。
所述分析物可为至少一种心肌肌钙蛋白(例如，cTnI、cTnC、cTnT)。循环心肌肌钙蛋白的水平对于心肌损伤而言是特异性的。而且，在血清中的心肌肌钙蛋白的水平在MI的逐步发展中随时间推移而改变。例如，如果患者呈现MI样症状如不稳定胸痛和ECG的非特异性变化，但是当症状最初出现时cTnI的血液浓度低于正常值的99％，那么受试者应在6-9小时内再次测试。随时间推移cTnI的增加为心肌坏死提供更准确的风险评估和特异性，并排除提高的肌钙蛋白的非特异性原因，例如肾损伤。基于连续试验cTnI的20％-30％的增加被认为是显著的。
在某些实施方案中，所述设备测定在患者样品中高于多个阈水平的cTnI的存在。在心肌梗塞(MI)后的最初4–12小时，心肌肌钙蛋白I(cTnI)增加。例如，如果受试者的循环肌钙蛋白I水平大于约0.04ng/mL，但是小于约0.1ng/mL，则有心肌梗塞或者急性心脏事件的嫌疑，但是肌钙蛋白I的这种水平可能是由于不同于心肌梗塞的原因所导致，例如肾脏病。因此，大于0.04ng/mL，但是小于0.1ng/mL的报告血液cTnI量的单一测量值可能不是确定性的。然而，如果在最初测量数小时后(例如，2-8小时后)，第二测量显示受试者的cTnI水平大于约0.1ng/mL，则这表明受试者的肌钙蛋白I水平随时间推移增加，并表明MI明显可能性更大。
因此，在涉及cTnI的具体实施方案中，将所述设备设置成检测在患者血液或者血清中cTnI的低阈水平，所述低阈水平指示cTnI的存在。该阈可为约0.01ng/mL至约0.06ng/mL，或者在某些实施方案中，为约0.04ng/mL。在这些实施方案中，所述设备也设置成同时检测cTnI的较高阈，其指示急性心脏事件，例如MI。cTnI的较高阈在患者血液或者血清中可为约0.08ng/mL至约0.2ng/mL，或者在具体实施方案中，约0.1ng/mL。如果使用所述试验设备的最初测量值显示cTnI水平大于约0.1ng/mL，那么与cTnI小于0.1ng/mL相比，不良事件如MI或者死亡的危险为约2.2-至3.0-倍高。如果最初测量值显示在血液或者血清中的cTnI水平小于约0.04ng/mL，那么MI可能性不高，除非试验在MI发展的极早期进行。
在一些实施方案中，所述设备设置成测定循环cTnI的第三阈水平的存在。第三阈水平可为约0.2ng/mL至约0.7ng/mL(例如，约0.5ng/mL)。约0.5ng/mL或者更高的cTnI水平对MI具有高特异性。血液或者血清cTnI水平为约0.5ng/mL或者更高的受试者可能正在经历心肌损伤。对于在MI的急性胸痛或者其它症状的发作后在家庭进行试验的个体，包括对于具有急性和/或慢性心脏病史的患者，和/或经历cTnI可存在于循环中的其它疾病如肾脏病或者先前心脏创伤或者介入或者心炎(心包炎或者心内膜炎)的患者，这种三个阈水平的系统可为特别有意义的。在没有其它症状或者指征的情况下，所述试验结果可提供关于需要寻求立即医疗护理的信息。
在一些实施方案中，至少两个分析物通过单一试验设备检测。所述两个分析物可为MI的特异性标志。例如，在一个实施方案中，所述试验设备包含至少一个对肌钙蛋白I特异性的捕获区，和对肌钙蛋白T特异性的至少第二捕获区。每一肌钙蛋白的可检测阈是使得选择所述可检测阈以“包括(rulein)”MI(指示循环肌钙蛋白的存在的低阈)，同时选择其它可检测阈以“排除(rule out)”MI(指示MI或者急性心脏事件的高阈)。由于肌钙蛋白I和肌钙蛋白T二者对MI均是特异性的，但是由不同的基因遗传编码，所以在横向流动设备上通过它的特异性捕获区除去一个分子不会影响在所述设备上通过它的特异性捕获区脱除的其它分子的水平。
所述设备可设置成测定心肌损伤或者状态的第二标志如肌红蛋白或者CK-MB的至少一个，或者多个阈水平。这种标志描述在美国专利5,290,678中，将其全部内容并入本文作为参考。
在这些和其它实施方案中，所述设备可提供心功能状态的其它标志如NT-proBNP、BNP、proBNP、ANP或者pro-ANP的半定量测定，这些标志也描述在美国专利6,461,828中，将其并入本文作为参考。
在其它实施方案中，作为中风或者其它脑外伤的测定，所述设备测定脑损伤或者创伤的一个或者多个标志的多个阈水平。例如，在一些实施方案中，所述标志包括以下标志中的一个或者多个：髓磷脂碱蛋白(MBP)、S100蛋白的β同工型(S100)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血栓调节蛋白、呈二聚体或者四聚体形式的葡萄糖转运体I、Neurothelin，γ-谷氨酰转肽酶，和P-糖蛋白。这些和其它标志描述在美国专利6,780,606中，将其全部内容并入本文作为参考。因此，本发明提供用于随时间推移追踪循环水平的设备和方法，如本申请中对于心脏标志所描述和例示。
在其它实施方案中，所述设备测定炎性或者免疫应答标志的存在，其可在暴露于药物或者潜在抗原或者其它刺激物后监测。这种标志可为针对治疗剂的抗体以监测治疗介入的效力或者对治疗介入的反应，或者所述标志可为自身抗体，其指示自身免疫疾病以监测随时间推移的疾病活动性(包括响应于治疗)。
通常，所述分析物可为毒素、有机化合物、蛋白质(包括免疫球蛋白)、肽(例如，肽类激素)、微生物或者其组分、维生素、代谢物、药物(包括为治疗目的而给予的药物以及为违法目的而服用的药物)、污染物质、杀虫剂或者上述任意物质的抗体。
通常，所述样品可为测试分析物的存在和/或浓度的任何物质，包括生物或者环境样品。在多个实施方案中，所述样品为体液样品如全血液、血清、血浆、尿、汗、唾液、脑脊髓液、鼻分泌物等。在所述设备设置成检测心肌损伤的一个或者多个标志的情况下，在一些实施方案中样品可为血液、血清，或者血浆。
横向流动试验
本发明的设备和方法使用横向流动试验。横向流动试验是公知的，并例如描述在美国专利6,461,828、6,177,281、7,390,674，和U.S.7,491,551中，将其全部内容并入本文作为参考。横向流动试验通常包含样品施用区(例如，用于施用流体样品进行测试)，和一个或者多个与样品施用区流体连通的流体流动路径。流体流动路径包含第一生物标志捕获区和第二生物标志捕获区，其可串联地位于单个流动路径上或者可位于分开的流动路径中。术语“流体连通”意味着样品可从流动路径的第一组件流动至流动路径的第二组件，反之亦然。第一组件与第二组件流体连通，即使存在插入组件。例如，样品施用区、试剂区(例如，其容纳检定免疫试剂)，和包含一个或者多个捕获区的横向流动膜可串联地位于试验设备上，并将流体连通。所述设备还可包含一个或者多个用于分离血液细胞或者大碎片的组件，包括具有适当孔隙度的滤器。
横向流动试验涉及横向流动膜和结合试剂，以在所涉及的标志或者分析物的存在下形成可检测复合物。复合物(例如，免疫复合物)包含对分析物具有特异性的并具有附着的或者结合的标记物的第一试剂，以及所述第二试剂是固定的或者可捕获的，并且也对所涉及的分析物具有特异性。结合试剂可为免疫试剂，所述免疫试剂通常为抗体或者其部分。在多个实施方案中，免疫试剂为与所涉及的分析物结合的单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性或者二特异性抗体、嵌合抗体，或者抗体部分或者片段。抗体可具有任何同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG，和IgM，及其亚型。
免疫试剂还可为抗原结合抗体部分或者片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、单链抗体分子、由包含一个或者多个抗原结合域的免疫球蛋白分子的任何片段形成的多特异性抗体。
在结合试剂为免疫试剂的实施方案中，至少一种免疫试剂(例如，“所述第一免疫试剂”或者“所述第一结合成员”)含有可通过视觉或者仪器手段检测的附着的或者结合的标记物。一种或者多种标记物可用于本发明的设备和方法中，例如，为了在视觉上区别在不同流动路径中的捕获区，或者用于区别对照区。在其它实施方案中，两种不同的标记物用于在视觉上区别不同的分析物。适用于本发明中的各种标记物包括通过化学或者物理手段产生信号的标记物。这种标记物包括酶促标记物(例如，在底物的存在下产生可检测信号)、色原、染料、催化剂、荧光或者荧光样化合物和/或粒子、磁性化合物和/或粒子、化学发光化合物和/或粒子，和放射性标记物。标记物可与所述第一免疫试剂直接或者间接地共价或者非共价结合，所述第一免疫试剂对目标分析物具有特异性。在某些实施方案中，标记物在进行试验后的至少2，至少4，至少6，或者至少8小时内仍然可检测，使得数小时后的重复试验可与所述第一结果直接对比。
通过特异性结合对相互作用，至少一种免疫试剂(例如，“所述第二免疫试剂”或者“第二结合成员”)在捕获区被固定，或者在所述捕获区可捕获。示例性结合对成员包括互补或者基本互补寡聚核苷酸、配体-受体、抗体-抗原，或者抗生蛋白链菌素-生物素。这种第二结合成员可提供用于检测分析物的多个阈水平的基础。例如，如下文更详细的讨论，捕获区可使用相同结合对成员的不同的量或者浓度，以在不同的水平固定或者捕获所述第二免疫试剂。可选择地，捕获区可使用不同的免疫试剂捕获方案，以区别对所涉及的分析物具有不同亲和性的第二免疫试剂。具体地，低亲和性和高亲和性抗体可通过鉴别缀合的捕获试剂来识别。
每个流动路径还可包含在一个或者多个捕获/检测区下游的一个或者多个对照区，作为成功样品流动的指示。在一个实施方案中，对照区可具有用于捕获或者检测在流动路径的终端未结合的标记的结合试剂的存在的工具。例如，对照区可包含固定的抗-鼠IgG，其中所述第一结合试剂(例如，标记的免疫试剂)为鼠单克隆抗体。其它样品流动对照是本领域已知的，并可根据本发明使用。
所述试验设备还可包含吸收垫，其位于横向流动膜下游并与横向流动膜流体连通，以帮助驱动样品流动。这种用于横向流动检定的组件也是公知的。
此外，另外的组件可用于在施用至设备之前预混合样品和结合剂。用于这种目的的示例性组件描述在WO2007/098184、WO2009/014787，和WO2010/132453中，将其中的每个的全部内容并入本文作为参考。
膜基底
横向流动基底通常为多孔的，吸收性的，和/或吸水的基底或者膜，其允许运输流体样品，例如，通过毛细作用。许多材料可用作横向流动基底，并且这种材料包括有机或者无机聚合物，以及天然和合成聚合物，包括但不限于，琼脂糖类、纤维素、硝化纤维素、乙酸纤维素、其它纤维素衍生物、葡聚糖、葡聚糖衍生物和葡聚糖共聚物、其它多糖、玻璃、硅胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、人造丝、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、乙烯基聚合物、聚乙烯醇、聚苯乙烯和聚苯乙烯共聚物、与二乙烯基苯等交联的聚苯乙烯、丙烯酸类树脂、丙烯酸酯和丙烯酸、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共混物、乙烯基化合物和丙烯酰胺的共聚物、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯衍生物及其共聚物。
在一个实施方案中，横向流动基底包含硝化纤维素，例如，纤维素的任何硝酸酯。在某些实施方案中，横向流动基底包含与纤维素的羧酸酯组合的硝化纤维素。
基底(例如，硝化纤维素基底)的孔径可改变。例如，孔径可为约1μm至约20μm，或者约8μm至约15μm，或者约10μm至约12μm。
流动路径的各组件可使用不同的基底材料和/或不同的孔径，以控制流体流动，控制试剂与基底材料散布性地结合的能力，和/或控制碎片的过滤。
在一些实施方案中可将流动路径的组件用封闭剂如牛血清白蛋白、全动物血清、酪蛋白，或者脱脂奶粉(non-fat dry milk)处理。
限定至少一个流体流动路径的横向流动基底可由通常水不渗透层(例如，)背衬，或者层积在通常水不渗透层(例如，)上。然而，在一些实施方案中，横向流动基底可为自支撑的。当使用时，通常将背衬通过粘合剂固定至基质。水不渗透背衬通常用于低厚度基底。
流体流动路径
通常，流体流动路径由至少一个样品施用区和至少一个横向流动基底限定。在使用多个横向流动基底的情况下，多个横向流动基底可与相同或者不同的样品施用区流体连通。试剂区或者垫是任选的。
在一个实施方案中，所述试验设备包含一个与单一样品施用区流体连通的横向流动膜(图1)。然而，本发明不限于这种构造。例如，在其它实施方案中，所述试验设备包含一个如图2中所示的横向流动膜。在这种实施方案中，横向流动膜允许两个流体流动路径，因为不可渗透屏障将所述膜分成两个平行的亚部分。
在其它实施方案中，所述试验设备包含两个如图3中所示的横向流动膜，每个限定单独的流体流动路径。在这种实施方案中，在相同试验设备上的两个独立的流动条是平行的。每个横向流动膜与试剂垫(例如，容纳免疫试剂)流体连通，所述试剂垫(例如，容纳免疫试剂)在单一样品施用区下游，并与单一样品施用区流体连通。在一个实施方案中，所述试验设备构造类似于图3的构造，不同的是不存在试剂区，并且每个横向流动膜与样品施用区直接流体连通。
也可使用至少两个单独的样品施用区，每个样品施用区与分开的，独立的横向流动基底流体连通，其中每个横向流动基底限定单独的流体流动路径。单独的流体流动路径还可包含单独的试剂区或者垫。所述试验设备可具有另外的样品施用区(例如，三个、四个或者五个样品施用区)，每个样品施用区对应于在单独的横向流动基底上的单独的流体流动路径，或者对应于在相同横向流动基底上的单独的流体流动路径(例如，通过一个或者多个不可渗透屏障将横向流动膜分成多个亚部分)。在使用中，将测量的流体样品体积施用至每个样品施用区。
通过如图4中所示定位样品施用区，也可在单一试验设备中使用平行的，独立的横向流动基底。在这种实施方案中，所述试验设备使用双向的流体流动。类似地，多个横向流动膜可围绕单一样品施用区(图5)放射状地排列。在这种实施方案中，每个横向流动膜限定一个流体流动路径，或者通过使用一个或者多个不可渗透屏障限定多个流体流动路径。
在其它实施方案中，所述试验设备包含用于多个横向流动基底的一个样品施用区。在这种实施方案中，将样品一次施用至所述试验设备，并且样品施用区与每个横向流动基底或者流体流动路径流体连通(图3，4，5)。
在某些实施方案中，所述设备具有能够进行两个或者三个试验的设计，使得试验可历时2至10小时进行，以监测增加的分析物浓度。
捕获区
本申请所述的设备和方法使用至少两个捕获区，用于区别分析物的两个阈水平。至少两个捕获区可串联地排列在单一流动路径上，或者可在单独的流动路径中，每个捕获区设计成捕获分析物的不同的可检测阈浓度。
一种多个捕获区实施方案在图6中示出。图6示出在具有支撑基质的横向流动膜上的流体流动路径的侧视图。横向流动膜包含两个串联取向的捕获区，其中一个捕获区使用高亲和性捕获配体(例如，抗体)，而所述第二捕获区使用不同的低亲和性捕获配体(例如，抗体)。亲和性的差异允许在相同试验设备上捕获不同的量的相同分析物，由此在不同的阈水平检测分析物。如图6中所示，具有不同亲和性的抗体(其对应于所述第二免疫试剂)可固定在各自的捕获区。在图6中提供的实施方案也可在具有多个流体流动路径的试验设备上实施，所述多个流体流动路径存在于一个或者多个横向流动膜上。例如，在一个实施方案中，一个“高亲和性”捕获区存在于一个流体流动路径中，以及“低亲和性”捕获区存在于第二流体流动路径中。这种设计避免了在所述第一捕获区损耗分析物的可能性，这种损耗可歪曲在下游第二捕获区的结果。任选地，流体流动路径在单一基底上由不可渗透屏障形成；和/或可存在于单独的横向流动基底上。
具有高亲和性抗体的捕获区捕获并保留较大量的分析物，并因此与具有低亲和性捕获抗体的捕获区相比，在较低分析物浓度显示可视信号。在这种设计中，通过使用超过两种抗体亲和性，捕获区的数目可容易地扩展至超过两个。抗体可直接沉积或者通过结合剂如BSA或者IgG或者氨基葡聚糖或者抗体所缀合的其它蛋白质分子沉积。这种结合剂可帮助增强信号，这是由于在结合剂上抗体的增加的密度，或者因为结合剂可对基质材料具有较强相互作用，或者因为键合形成“系链(tether)”，其通过减少位阻允许抗体的较大亲和力或者结合能力。
在其它实施方案中，所述第二免疫试剂中的至少一种不固定在它的捕获区，而是与将它引导至特定捕获区的结合部分缀合。这种结合相互作用用于在样品流动期间“分类”高亲和性和低亲和性免疫试剂，并且这种结合部分包含生物素/抗生蛋白链菌素或者互补寡聚核苷酸(或其衍生物)。
例如，如图7中所示，固定在低阈捕获区中的捕获试剂为抗生蛋白链菌素，其捕获生物素缀合的免疫试剂(例如，所述第二结合成员)。低亲和性抗体可直接固定在高阈捕获区。图7中所示的抗生蛋白链菌素/生物素相互作用可任选取代有本申请所述的其它结合对，例如互补寡聚核苷酸，包括衍生物如pRNA和本申请所述的其它结合对。这些捕获区还可在一个流体流动路径上串联取向，或者位于单独的流体流动路径上。
捕获区可使用多种特异性结合相互作用以捕获或者固定含有分析物的可检测免疫复合物，以及这些相互作用包括抗原/抗体、生物素/抗生物素蛋白、碳水化合物/凝集素、互补寡聚核苷酸(包括吡喃糖基RNA或者DNA，或者其它寡聚核苷酸衍生物)、受体/配体分子(包括激素/激素受体)、酶/辅因子，或者特异性蛋白质相互作用，和金属/螯合剂。
在某些实施方案中，寡聚核苷酸在一个或多个捕获区与横向流动基底的表面直接或者间接地(例如，通过化学连接体)结合，互补寡聚核苷酸与用于捕获免疫复合物的免疫试剂缀合(参见图8)。然后，不同的捕获顺序提供区别具有不同分析物亲和性的不同的抗体试剂的基础。
在一些实施方案中，寡聚核苷酸选自DNA、RNA、DNA-RNA杂交物、包含锁定核酸的寡聚核苷酸、吡喃糖基-RNA(pRNA)、吡喃糖基-DNA(pDNA)、2’-O-甲基寡聚核苷酸，和5’-5’倒置寡聚核苷酸。使用寡聚核苷酸试剂捕获寡聚核苷酸缀合物描述在美国专利申请公开2005/0208576中，将其并入本文作为参考。
互补寡聚核苷酸可具有相同或者相似的杂交效率，并与高和低亲和性抗体缀合或者连接，由此提供区别分析物的不同阈水平的基础。参见图8。因为较高亲和性抗体在较大程度上与分析物复合，所以较高亲和性抗体已经结合的区将捕获并保留较大量的分析物，并因此与捕获较低亲和性抗体的区相比，在较低样品分析物浓度显示可视信号。
可选择地，在每个捕获区中相同特异性结合对成员的浓度可改变(例如，固定)，以允许捕获不同的目标分析物水平。因此，具有相对较高固定试剂浓度的区捕获更多分析物并在较低分析物浓度产生阳性信号。例如，抗生蛋白链菌素可以以0.1mg/mL至约10mg/mL，或者0.1至5mg/mL的浓度施用至捕获区，由此形成不同的捕获区，其具有在分析物的存在下形成的生物素缀合和标记的免疫复合物的不同的可检测阈。
在一个实施方案中，试验设备包含具有单一流体流动路径的单一横向流动膜，所述单一流体流动路径包含串联捕获区(参见，例如，图7和8)。在这种实施方案中，在所述第一捕获区中发生高亲和性捕获结合的情况下，尤其是当分析物在试验样品中以低浓度存在时，可能发生以下情况：样品中的分析物的显著部分将捕获在所述第一捕获区上。例如，在横向流动免疫检定的典型捕获区中，1mm x5mm的捕获区可保留约1μg，或者约6皮摩尔的捕获IgG(Brown(2009).Antibodies:Key to a Robust Lateral Flow Immunoassay.In Lateral Flow Immunoassay,edited by Wong and Tse,Humana Press,NewYork,p.60)。因此，包含0.04ng/mL浓度的cTnI的100μL样品(1.5x10-16摩尔分析物)可被一个捕获区完全耗尽，这是因为捕获分子以超过104倍过量存在。
类似地，对于NT-proBNP，在单一试验设备上的多个截断值将为有用的，因为临床决策点为约125pg/mL和约450pg/mL(其分别为对在75岁以下和75岁和高于75岁的个体推荐的CHF决策阈值)。这些浓度在100μL样品中分别对应于1.5x10-15和5.4x10-15摩尔分析物。样品中的分析物将受捕获区影响，其保留约10-12摩尔分析物分子。因此，对于这种分析物，不考虑在横向流动设备上的分析物损耗的串联捕获区将为不实际的。
在某些实施方案中，所述设备构造利用了分析物损耗现象。在一个实施方案中，横向流动试验设备通过将多个捕获区层积为连续的行或者区域形成，或者通过将捕获区层积为由在试验膜上沉积的捕获部分形成的连续区域形成。随着分析物和试剂反应并沿着设备迁移并与捕获分子结合，将分析物从迁移溶液除去。然后，可检测捕获区域的数目或者捕获区域的长度与最初存在于样品中的分析物分子的数量直接相关，并由此，这些实施方案能够扩展设备的定量范围。根据这种实施方案的设备像仪表(gauge)一样用于检测分析物水平，并对于扩展检定范围特别有用。
在连续捕获区域的情况中，具有可视标记物的捕获区的部分将与最初存在于样品中的分析物的数量直接相关。以此方式，分析物的量可以以半定量的，像温度计一样的方式测量(参见图1)。
标记物
至少一种免疫试剂或者结合成员具有可检测部分(例如，标记物)。示例性标记物包括微粒标记物，例如胶体金属粒子如金、胶体非金属粒子如硒或者碲、染色的或者着色的粒子如染色的塑料、染色的浸渍胶乳粒子、有机聚合物胶乳粒子和脂质体、纳米球、着色的珠粒、聚合物微囊，或者含有直接可见物质的其它囊泡等。
至于不直接检测标记物(例如，用裸眼)的检定，可使用荧光标记物如荧光素、铕、花青，或者alexa染料、化学发光标记物、荧光能量转移标记物、荧光量子点、顺磁标记物、使用电流(用直流电压或者振荡外加电压)或者碳纳米管检测方法的电化学标记物。
例如，可检测分子包括但不限于荧光团以及本领域已知的其它可检测分子，例如描述在Principles of Fluorescence Spectroscopy,Joseph R.Lakowicz(Editor),Plenum Pub Corp,第二版(July1999)和Richard P.Hoagland的Molecular Probes Handbook的第六版中，将其全部内容并入本文作为参考。
直接可视标记包括染料浸渍的胶乳或者其它粒子的掺入，其与用于与抗体缀合的金粒子相比具有更多官能团，或者比金更可见。在某些实施方案中，使用银包覆的金粒子，其可将信号增强一个或者二个数量级。使用量子点或者纳米球作为比色标记物也可增强信号。使用较大金粒子(例如，大于标准40nm直径的粒子)也可提供增强的敏感性。
带有标记物的特异性结合对成员可在捕获/检测区上游与横向流动膜散布性地结合。在这些实施方案中，当样品在横向流动膜上沿着流体流动路径迁移时，它遇到一个或多个经标记的特异性结合对成员，并且分析物(如果在样品中存在的话)结合带有标记物的特异性结合对成员。分析物-特异性结合对成员-标记物复合物进一步迁移至捕获区，并结合捕获结合对成员。然后可将过量标记物洗掉。
本发明提供如上所述的设备，用于检测一种分析物的多个水平、多个分析物，或者多个分析物的多个水平。为了检测试验分析物的存在，必须将分析物标记，使得它可视化。可视化可在使用外部读数仪器的情况下或者不使用外部读数仪器的情况下发生。
在某些实施方案中，所述设备使用外部读数器以提供客观结果。在各种实施方案中，读数器可提供显示的，可打印的，或者可下载的结果。使用外部读数器可为有利的，使得可使用具有较大敏感性的标记物，例如荧光标记物。
读数器还提供通信能力(例如，经因特网、电缆、无线电，或者GSM等)的选项，以在出现需要紧急行动的特定结果时自动通知健康护理或者紧急健康护理专业人员，或者可连接至机构的健康记录以储存试验记录。读数器还提供各种内存选项，以获得(例如，通过字母数字输入或者通过自动条码读取)操作者ID和患者ID，以及用于详细病史的试验结果的日期和时间。
实施例
通过参考以下的说明性实施例，进一步说明本发明。
实施例1–评价用于检测心肌肌钙蛋白I的存在的二水平试验设备
在具有四个串联捕获区的横向流动试验设备中，施用包含10ng/mLcTnI的样品。超过一半分析物被所述第一线(参见图9和下表1)消耗。
实施例2–评价用于检测心肌肌钙蛋白I的存在的二水平试验设备
以下研究的目的是证实示例性设备以定性/半定量方式区别心肌肌钙蛋白I(cTnI)的两个浓度的能力。
试剂
附着于着色微球的鼠单克隆抗-cTnI抗体，约0.02％.
缀合于生物素的兔多克隆抗-cTnI抗体，约10μg/mL.
具有固定的抗生蛋白链菌素-载体复合物(SA)的横向流动膜。低敏感性条通过将SA以约0.5mg/mL施用至膜制备，高敏感性条使用约2mg/mL的SA制备。
测试的样品
通过检定测试的样品为(1)肝素锂人血浆，混合的，正常(NHP)，和(2)NHP，含有以固定浓度(通过商业cTnI免疫检定证实的浓度)在其中稀释的重组cTnI。
试验设备和检定
所述试验设备包含一个高敏感性横向流动膜(“条”)和一个低敏感性横向流动膜。所述膜彼此平行排列，类似于图3中所示的设备。两个横向流动膜(一个低敏感性和一个高敏感性)在单一设备中彼此平行地配对；所述设备的样品施用部分允许样品自由流向两个膜。所述试验设备不包含不可渗透屏障，因为在横向流动膜之间具有空间。
测试三组样品，每组样品一式三份–(1)空白NHP(即，无重组cTnI)，(2)含有约50pg/mL重组cTnI的NHP和(3)含有约500pg/mL重组cTnI的NHP。
将样品以每个试验设备约240μL施用，在环境条件孵育约15分钟。然后将每个试验设备在视觉上和在便携式反射计上在约550nm(例如，520-550nm)读数。
结果
具有收集的数据的实施例在表2和图10中给出。这些结果证实，二水平试验设备设计允许仅在高敏感性条上检测低浓度(例如，约50pg cTnI/mL)的分析物，和在两个条上检测高浓度(例如，约500pg/mL)的分析物。
在低敏感性条上的信号平均值的三个标准偏差(SD)范围内的信号分布的分析表明在低浓度不存在分析物检测。
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将在本申请中引用的专利、专利申请、公开、产品描述，和规程的全部内容并入本文作为参考。

Claims (43)

1.用于检测在患者样品中的心肌损伤标志的至少两个阈水平的设备，其包含：
样品施用区；
一个或者多个流体流动路径，其由一个或者多个横向流动基底形成，并与所述样品施用区流体连通；
第一标志捕获区和第二标志捕获区，其中所述第一和第二捕获区串联地位于单个流动路径上或者位于分开的流动路径中；
其中所述第一捕获区设置成当标志以第一阈水平或者高于第一阈水平存在于所述样品中时，可检测地捕获所述标志，并且所述第二捕获区设置成当标志以第二阈水平或者高于第二阈水平存在于所述样品中时，可检测地捕获所述标志。
2.权利要求1的设备，其中所述标志为心肌肌钙蛋白。
3.权利要求2的设备，其中所述心肌肌钙蛋白为cTnI。
4.权利要求3的设备，其中所述第一阈水平对应于所述患者样品中的约0.04ng/ml cTnI。
5.权利要求3或者4的设备，其中所述第二阈水平对应于所述患者样品中的约0.1ng/ml cTnI。
6.权利要求1-5中的任一项的设备，其中所述流体流动路径由一个或者多个吸水性膜或者吸收性膜形成。
7.权利要求1-6中的任一项的设备，其还在每个流动路径中包含对照区以指示样品流动。
8.权利要求1-7中的任一项的设备，其还包含第一标志-结合成员，所述第一标志结合成员具有附着的可检测标记物。
9.权利要求8的设备，其还包含至少一个第二标志结合成员，每个第二标志结合成员固定在捕获区，或者具有可被所述捕获区捕获的部分。
10.权利要求9的设备，其中至少一个第二结合成员可通过抗生蛋白链菌素-生物素相互作用，通过抗体-抗原相互作用，或者通过互补或者基本互补寡聚核苷酸的杂交捕获。
11.权利要求8-10中的任一项的设备，其中所述第一和第二结合成员为抗体或者其抗原结合部分。
12.权利要求7-11中的任一项的设备，其中所述结合成员散布性地结合在一个或多个捕获区上游的一个或多个流动路径中。
13.权利要求1-12中的任一项的设备，其中所述第一捕获区和所述第二捕获区在平行的或者双向的流动路径中。
14.权利要求13的设备，其包含三个或者更多流动路径，每个流动路径设置成用于检测不同的标志阈水平。
15.权利要求14的设备，其中所述第一捕获区具有第一量的固定的捕获剂，和所述第二捕获区具有第二量的所述固定的捕获剂。
16.权利要求15的设备，其中所述捕获剂为抗生蛋白链菌素、生物素、抗体，或者多核苷酸。
17.权利要求14的设备，其中所述第一捕获区包含对cTnI具有第一亲和性的抗体，和所述第二cTnI捕获区包含对cTnI具有第二亲和性的抗体。
18.权利要求14的设备，其中所述第一捕获区包含具有第一序列的单链寡聚核苷酸或者寡聚核苷酸衍生物，和所述第二捕获区包含具有第二序列的单链寡聚核苷酸或者寡聚核苷酸，
其中所述第二结合成员具有附着的互补寡聚核苷酸或者寡聚核苷酸衍生物，以分别将高亲和性和低亲和性结合成员直接固定至所述第一和第二捕获区。
19.权利要求14的设备，其中所述第一捕获区包含对所述标志具有第一亲和性的固定的免疫试剂，和所述第二捕获区包含固定的抗生蛋白链菌素，其中对所述标志具有第二亲和性的第二免疫试剂具有附着的生物素。
20.权利要求14的设备，其中所述第一和第二捕获区是连续的，和标志阈由沿着所述连续捕获区结合的可检测标志的长度限定，由此扩展所述检测的范围。
21.用于评价样品中的心肌损伤的标志水平的半定量方法，所述方法包括：
将试验样品施用至权利要求1-20中的任一项的试验设备，
在一个或多个捕获区中检测可检测信号的存在或者不存在。
22.权利要求21的方法，其中指示所述标志的第一阈水平的可检测信号暗示第一决策，和指示所述第二阈水平的可检测信号暗示第二决策。
23.权利要求21或者22的方法，其中所述患者具有心肌梗塞的一个或者多个症状。
24.权利要求22或者23的方法，其中cTnI的第一阈水平暗示应历经1-10小时的时段针对心肌梗塞的体征和症状监测所述患者病症。
25.权利要求24的方法，其中cTnI的第二阈水平暗示应针对潜在的心肌梗塞治疗患者。
26.权利要求24的方法，其中在1-10小时内重复所述方法以检测升高的cTnI水平。
27.权利要求21-26中的任一项的方法，其中所述患者具有慢性心脏疾病，或者与循环cTnI的可检测水平相关的其它病症。
28.权利要求21-27中的任一项的方法，其中所述试验在家庭或者在即时检验处实施。
29.用于检测试验样品中的分析物的至少两个阈水平的设备，所述设备包含：
样品施用区；
一个或者多个流体流动路径，其由一个或者多个横向流动基底形成，并与所述样品施用区流体连通；
第一分析物捕获区和第二分析物捕获区，其中所述第一和第二捕获区串联地位于单个流动路径上或者位于分开的流动路径中；
其中所述第一分析物捕获区包含一定量的第一固定的结合成员，以当分析物以第一阈水平或者高于第一阈水平存在于所述样品中时，直接或者间接地可检测地捕获所述分析物，和
其中所述第二分析物捕获区包含一定量的第二固定的结合成员，其设置成当分析物以第二阈水平或者高于第二阈水平存在于所述样品中时，直接或者间接地，可检测地捕获所述分析物，其中所述第一和第二固定的结合成员为相同或者不同的。
30.权利要求29的设备，其中所述流体流动路径由一个或者多个吸水性或者吸收性膜形成。
31.权利要求29或者30的设备，其还在每个流动路径中包含对照区以指示样品流动。
32.权利要求29-31中的任一项的设备，其还包含第一和第二分析物-结合成员，所述第一分析物结合成员具有附着的可检测标记物，和所述第二分析物结合成员具有可由所述固定的结合成员捕获的部分。
33.权利要求32的设备，其中所述第二分析物结合成员可通过抗生蛋白链菌素-生物素相互作用，通过抗体-抗原相互作用，或者通过互补或者基本互补寡聚核苷酸的杂交捕获。
34.权利要求32的设备，其中所述分析物结合成员为抗体或者其抗原-结合部分。
35.权利要求32的设备，其中所述分析物结合成员散布性地结合在一个或多个分析物捕获区上游的一个或者多个流动路径中。
36.权利要求29-35中的任一项的设备，其中所述第一分析物捕获区和所述第二分析物捕获区在平行的或者双向的流动路径中。
37.权利要求29-36中的任一项的设备，其中所述固定的结合剂为抗生蛋白链菌素、生物素、抗体，或者多核苷酸。
38.权利要求29-37中的任一项的设备，其包含三个或者更多流动路径，每个流动路径设置成用于检测不同的分析物阈水平。
39.权利要求38的设备，其中所述分析物为cTnI和/或NT-proBNP。
40.用于评价样品中的分析物水平的半定量方法，所述方法包括：
将试验样品施用至权利要求29-39中的任一项的试验设备，
在一个或多个捕获区中检测信号的存在或者不存在。
41.权利要求40的方法，其中指示分析物的第一阈水平的可检测信号暗示第一决策，和指示所述第二阈水平的可检测信号暗示第二决策。
42.权利要求40的方法，其中作为事件或者病症的指示，所述分析物在样品中历经1小时至一周的时段升高。
43.权利要求42的方法，其中将所述方法重复至少一次。
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