CN103911371A - 一种酿酒酵母整合型表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酿酒酵母整合型表达载体。本发明提供了一种双链DNA片段，自上游至下游依次包括如下元件：酿酒酵母染色体上游同源臂、真核启动子、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因、真核转录终止序列和酿酒酵母染色体下游同源臂。本发明还保护含有所述双链DNA片段的质粒，即为酿酒酵母整合型表达载体，能够使外源或内源基因在酿酒酵母中表达，并且无需诱导，利用酿酒酵母生产目的蛋白，或用于基因工程菌株的代谢途径构建。本发明的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母的蛋白表达和代谢途径构建提供了很好的工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种酿酒酵母整合型表达载体。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最密切的一种酵母。酿酒酵母是制作面包和馒头等食品及酿酒的传统微生物，是迄今为止最具生物安全性的微生物。同时，在现代分子和细胞生物学中，酿酒酵母被用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。
酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。
酿酒酵母是现代工业生物技术、保健品行业和医用生物技术中常用的微生物。由于酿酒酵母具有优良的发酵性能，如良好的鲁棒性、快速的细胞繁殖性、生产过程中耐受杂菌污染等特性，在工业生物技术中常被用作代谢工程途径改造的出发生物，经各种代谢通路途径改造后的酿酒酵母工程菌被用于大宗化学品和精细化工的生产，如燃料乙醇、麦角固醇等。另外，由于酿酒酵母属于真核生物且具有高生物安全性，在医用生物技术领域和保健品行业也有广泛应用，如乙肝疫苗的生产，功能保健酵母的开发等。酿酒酵母表达载体是上述应用和研究不可缺少的工具，各种类型表达载体的构建工作越来越受到人们的重视。
酿酒酵母的表达载体通常为质粒型表达载体。常用的质粒型表达载体属于大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体，操作时会将大肠杆菌的复制起始点和原核筛选标记（如氨苄青霉素抗性基因）带入酿酒酵母细胞中，存在隐性的生物安全问题。如果使用体内组装技术将质粒型表达载体转入酿酒酵母，虽然能去除原核生物的DNA原件，但增加了操作的复杂程度。除此之外，用质粒型表达载体构建工程菌存在质粒易丢失的问题，导致工程菌生产性能的不稳定。
发明内容
本发明的目的是提供一种酿酒酵母整合型表达载体。
本发明提供了一种双链DNA片段（真核元件组），自上游至下游依次包括如下元件：酿酒酵母染色体上游同源臂、真核启动子、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因、真核转录终止序列和酿酒酵母染色体下游同源臂。
所述酿酒酵母的IRES序列为酿酒酵母中具有内部核糖体进入位点并具有启动翻译功能的DNA序列。所述酿酒酵母的IRES序列具体可如序列表的序列1自5’末端第2312至2659位核苷酸所示。
所述真核启动子可为酵母的启动子，具体可为酿酒酵母的启动子。所述酿酒酵母的启动子具体可为酿酒酵母的ILV5基因启动子、酿酒酵母的TDH3基因启动子或酿酒酵母的ADH2基因启动子。所述酿酒酵母的ILV5基因启动子具体可如序列表的序列1自5’末端第1014至1567位核苷酸所示。所述酿酒酵母的TDH3基因启动子具体可如序列表的序列2所示。所述酿酒酵母的ADH2基因启动子具体可如序列表的序列3所示。
所述真核转录终止序列可为酵母的转录终止序列，具体可为酿酒酵母的转录终止序列。所述酿酒酵母的转录终止序列可为酿酒酵母的URA3基因转录终止序列。所述酿酒酵母的URA3基因转录终止序列具体可如序列表的序列1自5’末端第3477至3551位核苷酸所示。
所述酿酒酵母染色体上游同源臂，可为酿酒酵母染色体上的18SrDNA的上游同源臂，具体可如序列表的序列1自5’末端第675至1007位核苷酸所示。所述酿酒酵母染色体下游同源臂，可为酿酒酵母染色体上的18SrDNA的下游同源臂，具体可如序列表的序列1自5’末端第3558至3921位核苷酸所示。
所述真核筛选基因可为营养缺陷型选择标记基因或抗生素选择标记基因，具体可为酿酒酵母的URA3基因。所述酿酒酵母的URA3基因具体可如序列表的序列1自5’末端第2673至3476位核苷酸所示。所述酿酒酵母的URA3基因具体可如序列表的序列1自5’末端第2673至3473位核苷酸所示。
本发明还保护一种具有所述真核元件组的质粒（酿酒酵母整合型表达载体）。
所述酿酒酵母整合型表达载体还包括原核元件组；所述原核元件组自上游至下游依次包括如下组件：原核复制起点和原核筛选基因。
所述的原核复制起点具体可为pMB1的复制起始点。
所述的原核筛选基因具体可为氨苄青霉素抗性基因。
所述酿酒酵母整合型表达载体具体可为将序列表的序列1所示的质粒去除序列1自5’末端第1580至2296位核苷酸所示DNA片段后得到的质粒。
所述真核元件组或所述酿酒酵母整合型表达载体可用于制备蛋白。
应用所述真核元件组制备蛋白时，将目的蛋白的编码基因插入真核元件组的真核启动子和酿酒酵母的IRES序列之间，得到融合DNA分子，然后将融合DNA分子导入酵母菌株，通过所述融合DNA分子和酵母菌株的基因组DNA发生同源重组，将真核启动子、目的蛋白的编码基因、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因和真核转录终止序列整合入酵母菌株的基因组DNA中，通过培养菌株可以得到目的蛋白。所述真核启动子用于启动所述目的蛋白的编码基因的表达。所述真核筛选基因可以提供筛选重组菌的选择压力，以避免现有方法中的如下局限性：选择压力低，无法提高目的片段在宿主染色体上的拷贝数，使目的基因无法得到满意的表达量。
所述酵母菌株可为酿酒酵母，具体可为酿酒酵母w303菌株。
所述目的蛋白可为mCherry蛋白。所述mCherry蛋白的编码基因具体可如序列表的序列1自5’末端第1580至2296位核苷酸所示。
本发明还保护一种制备蛋白的方法，是将目的蛋白的编码基因插入所述真核元件组的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间，得到融合DNA分子，将所述融合DNA分子导入酵母菌株并培养所述酵母菌株，得到所述目的蛋白。
所述酵母菌株可为酿酒酵母，具体可为酿酒酵母w303菌株。
所述目的蛋白可为mCherry蛋白。所述mCherry蛋白的编码基因具体可如序列表的序列1自5’末端第1580至2296位核苷酸所示。
本发明还保护一种制备蛋白的方法，是将目的蛋白的编码基因插入所述酿酒酵母整合型表达载体的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间，得到重组质粒，获得所述重组质粒中的融合DNA分子（可通过酶切所述重组质粒的方式从重组质粒中获得融合DNA分子，也可将所述重组质粒作为模板，通过PCR扩增的方式获得融合DNA分子），将所述融合DNA分子导入酵母菌株并培养所述酵母菌株，得到所述目的蛋白；所述融合DNA分子为将所述目的蛋白的编码基因插入所述真核元件组的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间得到的DNA分子。
所述酵母菌株可为酿酒酵母，具体可为酿酒酵母w303菌株。
所述目的蛋白可为mCherry蛋白。所述mCherry蛋白的编码基因具体可如序列表的序列1自5’末端第1580至2296位核苷酸所示。
应用本发明的方法制备蛋白时，转入酿酒酵母的DNA片段除目的基因外均为酿酒酵母自身染色体的DNA片段，其他DNA片段在载体线性化时已被切除，不含任何原核生物的DNA元件。本发明的酿酒酵母表达载体能够使外源或内源基因在酿酒酵母中表达，并且无需诱导，利用酿酒酵母生产目的蛋白，或用于基因工程菌株的代谢途径构建。本发明的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母的蛋白表达和代谢途径构建提供了很好的工具。
附图说明
图1为重组质粒pEXILV5-mCherry的结构示意图。
图2为实施例2中通过荧光强度表征mCherry表达水平的结果。
图3为实施例2中的SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
质粒pSK-mCherry的制备方法如下：将人工合成的序列表的序列1自5’末端第1568至2296位核苷酸所示的DNA分子（其中第1568至1573位核苷酸为ClaI酶切识别序列“ATCGAT”、第1574至1579位核苷酸为NdeI酶切识别序列“CATATG”、第1580至2296位核苷酸为mCherry蛋白的编码基因，第2297-2302位核苷酸为EcoRI酶切识别序列“GAATTC”）插入pBlueScriptIISK(-)载体的ClaI和EcoRI酶切位点之间，得到质粒pSK-mCherry。
pBlueScriptIISK(-)载体：购自Agilent Technologies Genomics，CatalogNo.212206。
酿酒酵母w303菌株（菌株属性：MATa;ura3-52;trp1Δ2;leu2-3,112;hi s3-11;ade2-1;can1-100）：购自EUROSCARF，编号20000A。
实施例1、酿酒酵母表达载体的制备
一、重组质粒pEXILV5-mCherry的构建
1、提取酿酒酵母（拉丁名为Saccharomyces cerevisiae；中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌株编号为2.1882）的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用ILV5P-S（下划线标注SalI识别序列）和ILV5P-AS（下划线标注ClaI识别序列）组成的引物对（靶序列为554bp）进行PCR扩增，得到具有酿酒酵母的ILV5基因启动子的PCR扩增产物。
ILV5P-S：5’-ACGCGTCGACCCCTATCTGTTCTTCCGCTCTACC-3’；
ILV5P-AS：5’-CCATCGATGTTTTATTTTTTACTTATATTGCTGGTAGG-3’。
3、用限制性内切酶SalI和ClaI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶SalI和ClaI双酶切质粒pSK-mCherry，回收约3997bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pILV5mCherry。
6、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用18sUP-S（下划线标注XhoI识别序列）和18sUP-AS（下划线标注SalI识别序列）组成的引物对（靶序列为333bp）进行PCR扩增，得到具有酿酒酵母的18SrDNA的上游同源臂的PCR扩增产物。
18sUP-S：5’-CCGCTCGAGAAGGACTCAAGGTTAGCCAGAAG-3’；
18sUP-AS：5’-ACGCGTCGACAGGGAGCCTGAGAAACGGCTAC-3’。
7、用限制性内切酶XhoI和SalI双酶切步骤6的PCR扩增产物，回收酶切产物。
8、用限制性内切酶XhoI和SalI双酶切步骤5得到的重组质粒，回收约4551bp的载体骨架。
9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到重组质粒pRI5mCherry。
10、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用TIF4631-ires-S（下划线标注EcoRI、SmaI识别序列）和TIF4631-ires-AS（下划线标注BamHI识别序列）组成的引物对（靶序列为348bp）进行PCR扩增，得到具有酿酒酵母的IRES序列(TIF4631)的PCR扩增产物。
TIF4631-ires-S：5’-GGAATTCTCCCCCGGGGACTCGATAACGACGTGAGAAAC-3’；
TIF4631-ires-AS：5’-CGGGATCCTATTGTAATAGGTAATTACAGTTGTCCTCTTAC-3’。
11、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切步骤10的PCR扩增产物，回收酶切产物。
12、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切步骤9得到的重组质粒，回收约4884bp的载体骨架。
13、将步骤11的酶切产物和步骤12的载体骨架连接，得到重组质粒pRI5mIRES。
14、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用Ura3-s（下划线标注BamHI、SpeI识别序列）和Ura3-AS（下划线标注XbaI识别序列）组成的引物对（靶序列为879bp）进行PCR扩增，得到具有酿酒酵母的URA3基因（真核筛选标记基因）和URA3基因转录终止序列的PCR扩增产物。
Ura3-s：5’-CGGGATCCGACTAGTATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCT-3’；
Ura3-AS：5’-GCTCTAGATAATAACTGATATAATTAAATTGAAGCTCTAAT-3’。
15、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤14的PCR扩增产物，回收酶切产物。
16、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切步骤13得到的重组质粒，回收约5232bp的载体骨架。
17、将步骤15的酶切产物和步骤16的载体骨架连接，得到重组质粒pRI5mIRURA3。
18、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用18sDOWN-S（下划线标注XbaI识别序列）和18sDOWN-AS（下划线标注BstXI识别序列）组成的引物对（靶序列为364bp）进行PCR扩增，得到具有酿酒酵母的18SrDNA的下游同源臂的PCR扩增产物。
18sDOWN-S：5-GCTCTAGACGTAAGGTGCCGAGTGGGTC-3
18sDOWN-AS：5-CTGCAGAACCACCGCGGTGGGTGGCTCTTGGCGAACCAGGAC-3
19、用限制性内切酶XbaI和BstXI双酶切步骤18的PCR扩增产物，回收酶切产物。
20、用限制性内切酶XbaI和BstXI双酶切步骤17得到的重组质粒，回收约6111bp的载体骨架。
21、将步骤19的酶切产物和步骤20的载体骨架连接，得到重组质粒pEXILV5-mCherry。重组质粒pEXILV5-mCherry的结构示意图见图1。
重组质粒pEXILV5-mCherry的测序结果如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，自5’末端第675至1007位核苷酸为酿酒酵母的18SrDNA的上游同源臂，第1014至1567位核苷酸为酿酒酵母的ILV5基因启动子，第1580至2296位核苷酸为mCherry蛋白的编码基因，第2312至2659位核苷酸为酿酒酵母的IRES序列，第2673至3476位核苷酸为酿酒酵母的URA3基因,第3477至3551位核苷酸为酿酒酵母的URA3基因转录终止序列，第3558至3921位核苷酸为酿酒酵母的18SrDNA的下游同源臂,第4336-5003位核苷酸为pMB1复制起点，第5154-6011位核苷酸为原核筛选标记基因（氨苄青霉素抗性基因）。
二、重组质粒pEXTDH3-mCherry的构建
1、同步骤一的1。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用GPDp-S（下划线标注SalI识别序列）和GPDp-AS（下划线标注NdeI识别序列）组成的引物对（靶序列为698bp）进行PCR扩增，得到具有酿酒酵母的TDH3基因启动子的PCR扩增产物。
GPDp-S：5’-ACGCGTCGACATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCG-3’；
GPDp-AS：5’-GAATTCCCATATGTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG-3’。
3、用限制性内切酶SalI和NdeI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
后续步骤均同步骤一。
得到重组质粒pEXTDH3-mCherry。
重组质粒pEXTDH3-mCherry的测序结果与重组质粒pEXILV5-mCherry的差异仅在于将序列表的序列1自5’末端第1014至1573位核苷酸序列替换为了序列表的序列2所示的核苷酸序列。
三、重组质粒pEXADH2-mCherry的构建
1、同步骤一的1。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用ADH2P-S（下划线标注SalI识别序列）和ADH2P-AS（下划线标注ClaI识别序列）组成的引物对（靶序列为521bp）进行PCR扩增，得到具有酿酒酵母的ADH2基因启动子的PCR扩增产物。
ADH2P-S：5’-ACGCGTCGACGCCAAGAACTCTAACCAGTCTTATC-3’；
ADH2P-AS：5’-CCATCGATTGTGTATTACGATATAGTTAATAGTTGATAG-3’。
后续步骤均同步骤一。
得到重组质粒pEXADH2-mCherry。
重组质粒pEXADH2-mCherry的测序结果与重组质粒pEXILV5-mCherry的差异仅在于将序列表的序列1自5’末端第1014至1567位核苷酸序列替换为了序列表的序列3所示的核苷酸序列。
实施例2、本发明的酿酒酵母表达载体的表达水平检测
一、表达mCherry的酿酒酵母重组菌的构建
1、用限制性内切酶XhoI和BstXI双酶切重组质粒pEXILV5-mCherry，回收酶切产物（具有18SrDNA的上游同源臂、ILV5基因启动子、mCherry蛋白的编码基因，IRES序列，URA3基因、URA3基因转录终止序列和18SrDNA的下游同源臂）。将酶切产物通过乙酸锂法（Ito,H.,Fukuda,Y.,Murata,K.,and Kimura,A.1983.Transformationof intact yeast cells treated with alkali cations.J.Bacteriol.53:163–168.）转化酿酒酵母w303，得到重组菌，将其命名为重组菌I-rfp。
2、用限制性内切酶XhoI和BstXI双酶切重组质粒pEXTDH3-mCherry，回收酶切产物（具有18SrDNA的上游同源臂、TDH3基因启动子、mCherry蛋白的编码基因，IRES序列，URA3基因、URA3基因转录终止序列和18SrDNA的下游同源臂）。将酶切产物通过乙酸锂法转化酿酒酵母w303，得到重组菌，将其命名为重组菌T-rfp。
3、用限制性内切酶XhoI和BstXI双酶切重组质粒pEXADH2-mCherry，回收酶切产物（具有18SrDNA的上游同源臂、ADH2基因启动子、mCherry蛋白的编码基因，IRES序列，URA3基因、URA3基因转录终止序列和18SrDNA的下游同源臂）。将酶切产物通过乙酸锂法转化酿酒酵母w303，得到重组菌，将其命名为重组菌A-rfp。
二、重组菌表达mCherry的能力检测
YGM培养基：将8gYGM（购自泛基诺公司，货号为YGM003A-19）和20g葡萄糖溶于水并用水定容至1L。
YPD培养基：将10g酵母粉、20g葡萄糖和20g蛋白胨溶于水并用水定容至1L。
将步骤一制备的各个重组菌和酿酒酵母w303分别进行如下培养和mCherry表达水平检测：
1、挑取单菌落于3ml YGM培养基中，30℃、220rpm培养16hr。
2、取1ml种子液于30ml液体发酵培养基（YGM培养基或YPD培养基）中，30℃、220rpm培养16hr。
3、取5ml步骤2得到的发酵液，4℃、10000rpm离心2min，收获细胞。
4、用5ml无菌水重悬细胞，4℃、10000rpm离心2min，收获细胞，尽量吸干残余液体。
5、用水悬浮步骤4得到的细胞，使其OD600nm=1。
6、检测步骤5得到的细胞悬浮液的荧光强度，用无菌水作空白对照，激发光波长为587nM，发射光波长为610nM。
用发射光强度表征mCherry表达水平，采用YGM培养基作为液体发酵培养基时的结果见图2（图2的纵坐标为发射光强度以10为底的对数）。各个重组菌进行以上步骤检测出来的发射光强度均高于酿酒酵母w303进行以上步骤检测出来的发射光强度。各重组菌进行以上步骤检测出来的发射光强度差异说明各个重组质粒表达mCherry的水平不同，实现了该系列载体差异表达目的蛋白的目的。
7、取10ml步骤5得到的细胞悬浮液，4℃、10000rpm离心2min，收获细胞；用1ml无菌水重悬细胞，将菌悬液转至1.5ml离心管中，4℃、10000rpm离心2min，弃上清液并尽量吸干残余液体；用200ul50mmol/L pH7.5的磷酸钾缓冲液悬浮细胞，加0.2g酸洗玻璃珠（Sigma，G8772-10G），涡旋振荡破碎细胞（条件为振荡10sec、冰浴20sec，总振荡时间为10min）；细胞破碎后以4℃、13000rpm离心40min，收集上清液（总蛋白抽提液）；用Bradford法测定蛋白浓度，用50mmol/L pH7.5的磷酸钾缓冲液将总蛋白抽提液稀释至相同浓度进行SDS-PAGE检测，上样量为每孔含总蛋白10ug。
结果见图3，1、2、4、6为采用YGM培养基作为液体发酵培养基时的结果，9、10、11、12为采用YPD培养基作为液体发酵培养基时的结果，1和9为酿酒酵母w303，2和10为重组菌T-rfp，4和12为重组菌I-rfp,6和11为重组菌A-rfp，8为标准分子量标记（自上自下依次为：170、130、95、72、55、43、34、26、17、10kDa），箭头标注目的条带。
重组菌T-rfp、重组菌I-rfp和重组菌A-rfp的总蛋白中有明显的mCherry条带，而在酿酒酵母w303总蛋白中没有明显的mCherry对应条带。
Claims (10)
1.一种双链DNA片段，自上游至下游依次包括如下元件：酿酒酵母染色体上游同源臂、真核启动子、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因、真核转录终止序列和酿酒酵母染色体下游同源臂。
2.如权利要求1所述的双链DNA片段，其特征在于：所述酿酒酵母染色体上游同源臂为酿酒酵母染色体上的18SrDNA的上游同源臂，所述酿酒酵母染色体下游同源臂为酿酒酵母染色体上的18SrDNA的下游同源臂。
3.如权利要求2所述的双链DNA片段，其特征在于：所述“酿酒酵母染色体上的18SrDNA的上游同源臂”如序列表的序列1自5’末端第675至1007位核苷酸所示，所述“酿酒酵母染色体上的18SrDNA的下游同源臂”如序列表的序列1自5’末端第3558至3921位核苷酸所示。
4.如权利要求1至3中任一所述的双链DNA片段，其特征在于：所述真核启动子为酿酒酵母的启动子、所述真核转录终止序列为酿酒酵母的转录终止序列。
5.如权利要求4所述的双链DNA片段，其特征在于：所述酿酒酵母的启动子为酿酒酵母的ILV5基因启动子、酿酒酵母的TDH3基因启动子或酿酒酵母的ADH2基因启动子；所述酿酒酵母的转录终止序列为酿酒酵母的URA3基因转录终止序列。
6.一种质粒，包括真核元件组；所述真核元件组为权利要求1至5中任一所述的双链DNA片段。
7.如权利要求6所述的质粒，其特征在于：所述质粒还包括原核元件组；所述原核元件组自上游至下游依次包括如下组件：原核复制起点和原核筛选基因。
8.权利要求1至5中任一所述的双链DNA分子或权利要求6或7所述的质粒在制备蛋白中的应用。
9.一种制备蛋白的方法，是将目的蛋白的编码基因插入权利要求1至5中任一所述双链DNA分子的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间，得到融合DNA分子，将所述得到融合DNA分子导入酵母菌株并培养所述酵母菌株，得到所述目的蛋白。
10.一种制备蛋白的方法，是将目的蛋白的编码基因插入权利要求6或7所述重组质粒的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间，得到重组质粒，获得所述重组质粒中的融合DNA分子，将所述融合DNA分子导入酵母菌株并培养所述酵母菌株，得到所述目的蛋白；所述融合DNA分子为将所述目的蛋白的编码基因插入所述真核元件组的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间得到的DNA分子。
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