CN103869070A - 检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体、酶标记物、邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、样本稀释液，所述包被原为邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测邻苯二甲酸二丁酯的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测白酒中邻苯二甲酸二丁酯的含量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫试剂盒，其特别适于白酒中邻苯二甲酸二丁酯含量的检测。

背景技术

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）属于邻苯二甲酸酯类，是目前国内外工业生产中使用最多的塑化剂（又称增塑剂），广泛存在于食品包装、化妆品、医疗器材以及环境水体中。这类塑化剂并非食品或食品添加物，但会通过环境迁移、食品包装迁移及非法添加等进入食品，对人体健康产生毒害作用，如造成内分泌失调，影响正常生育能力，在体内长期蓄积会导致畸形、癌变和突变，对心血管、消化和泌尿系统也有很大伤害。因此，我国卫生部卫办监督函〔2011〕551号文件中规定：严禁在食品、食品添加剂中人为添加邻苯二甲酸酯类物质，食品、食品添加剂中的邻苯二甲酸二（α-乙基已酯）（DEHP）、邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）和邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）最大残留量分别为1.5mg/kg、9.0mg/kg和0.3mg/kg。

目前文献报道有关邻苯二甲酸酯类物质的检测方法有气相色谱法、超高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法、气相色谱-离子阱质谱法等。但研究大多集中于环境样品和塑料包装材料，对于食品中的污染情况检测研究较少。我国食品中邻苯二甲酸酯检测使用“GB/T 21911-2008《食品中邻苯二甲酸酯的测定》”，包装中邻苯二甲酸酯检测使用“GB/T 21928-2008《食品塑料包装材料中邻苯二甲酸酯的测定》”，两种检测方法均运用气相色谱-质谱联用（GC-MS）的方法进行测定。该方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用。与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带的用于邻苯二甲酸二丁酯检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体、酶标记物、邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、样本稀释液，所述包被原为邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。

所述邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原是由邻苯二甲酸二丁酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述邻苯二甲酸二丁酯半抗原是由邻苯二甲酸酐与正丁醇、4-氨基丁酸反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体是以邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原作为免疫原制备获得，所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体可为邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体或邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体，其中优选邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体。

所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，其中优选羊抗鼠抗抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、样本稀释液。

所述邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液6瓶，浓度分别为0mg/L、0.02mg/L、0.06mg/L、0.18mg/L、0.54mg/L、1.62mg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1~2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述样本稀释液优选为pH值为7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1~7.5，含有1%~3%酪蛋白、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μl封闭液，37℃避光孵育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

在微孔条上预包被邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体溶液，样本中的邻苯二甲酸二丁酯与酶标板上包被的邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原竞争抗邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与；邻苯二甲酸二丁酯的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样本中邻苯二甲酸二丁酯的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中邻苯二甲酸二丁酯残留量的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测邻苯二甲酸二丁酯的方法，它包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用试剂盒进行检测；

（3）分析检测结果。

本发明检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫试剂盒主要采用竞争ELISA方法定性或定量检测样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。

附图说明

图1：邻苯二甲酸二丁酯半抗原合成路线图

图2：邻苯二甲酸二丁酯半抗原核磁共振氢谱图

图3：试剂盒标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1  试剂盒组分的制备

1、邻苯二甲酸二丁酯半抗原的制备

将1.48g邻苯二甲酸酐溶入50ml三氯甲烷中，搅拌下滴加入3ml 1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）和1.0ml正丁醇在10ml三氯甲烷中的混合液，室温搅拌6h，蒸除溶剂后，柱层析纯化得到邻苯二甲酸单丁酯；将1.11g邻苯二甲酸单丁酯溶入40ml三氯甲烷中，加入2.06g二环己基碳二亚胺（DCC），催化量的4-二甲氨基吡啶（DMAP），搅拌下缓慢滴加入0.8g 4-氨基丁酸在20ml三氯甲烷中的悬浮物，加毕继续室温反应8h，过滤，水洗，蒸干溶剂后柱层析纯化得到邻丁氧酰基羧丁基苯甲酰胺，即为邻苯二甲酸二丁酯半抗原。

取上述产物经核磁共振氢谱测定，如图2所示，12.0ppm左右的羧基信号峰，8.5ppm左右的亚氨基信号峰，8.0ppm左右的两组芳环信号峰以及0.8-4.3ppm的烷基信号峰说明半抗原合成成功。

2、抗原的制备

免疫原制备——邻苯二甲酸二丁酯半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原。

取10mg半抗原，溶解于1ml二甲基甲酰胺（DMF）中；取15mg碳化二亚胺（EDC）用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取BSA 30mg，使之充分溶解在3ml 0.1mol/LCB（pH 9.6）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。

包被原制备——邻苯二甲酸二丁酯半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联得到免疫原。

取10mg半抗原，溶解于1ml DMF中；取15mg EDC用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取OVA30mg，使之充分溶解在3ml 0.1mol/L CB（pH 9.6）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。

3、邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的制备

动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

4、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。

5、酶标记抗抗体的制备

将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4:1，由于辣根过氧化物酶在强氧化作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

（1）省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；

（2）降低辣根过氧化物酶与抗体的摩尔浓度比率至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失减少。

6、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2  检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

（1）包被邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原的酶标板；

（2）邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液6瓶，浓度分别为0mg/L、0.02mg/L、0.06mg/L、0.18mg/L、0.54mg/L、1.62mg/L；

（3）邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液；

（4）用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

（5）底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

（6）终止液为2mol/L硫酸；

（7）洗涤液为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

（8）样本稀释液为pH值为7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

实施例3  白酒样品中塑化剂的检测

1、样品前处理

移取100μl白酒样品于2ml聚苯乙烯离心管中，再加入400μl样本稀释液，充分振荡混匀；取50μl用于分析。

2、用试剂盒检测

向包被有邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原的酶标板微孔中加入邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液或经前处理的样品溶液50μl/孔，再加入邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应30min；倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应30min，取出重复洗板步骤；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μl，底物显色液B液四甲基联苯胺（TMB）50μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。

3、检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值（B）除以第一个标准品溶液（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，得到百分吸光度值。以邻苯二甲酸二丁酯标准品浓度（μg/L）的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，如图3所示。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的邻苯二甲酸二丁酯含量则可从标准曲线上读出。

实施例4  邻苯二甲酸二丁酯酶联免疫试剂盒技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，试剂盒标准曲线最低点为0.02mg/L，标准曲线的范围为0.02~1.62mg/L，IC₅₀（50%抑制浓度）浮动范围为0.065~0.110mg/L；对20份空白白酒样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对白酒样本的检测限为0.1mg/L。

2、样本精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差（RSD%）作为精密度评价指标。计算公式为：回收率（%）＝ 实际测定值/理论值×100%，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差RSD% ＝ SD/X×100%，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。

按150μg/L、300μg/L、600μg/L三个浓度邻苯二甲酸二丁酯（DBP）对白酒样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。

表1   精密度及准确度试验

以150、300、600μg/kg三个浓度的邻苯二甲酸二丁酯对白酒样品进行添加，平均回收率在79.3%~101.6%之间；批内、批间相对标准偏差均小于15%。

3、交叉反应率试验

选择与邻苯二甲酸二丁酯具有类似结构和类似功能的药物进行ELISA测定，通过各种药物的标准曲线分别得到其50%抑制浓度，用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。

表2  交叉反应率试验

药物名称	交叉反应率（%）
		邻苯二甲酸二丁酯（DBP）	100
邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）	35
		邻苯二甲酸二辛酯（DEHP）	＜1
邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）	＜1
		邻苯二甲酸二异辛酯（DIOP）	＜1
邻苯二甲酸二甲酯（DMP）	＜1

4、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2~8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值（零标准）、50%抑制浓度、邻苯二甲酸二丁酯添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2~8℃至少保存12个月以上。

Claims (9)

1.一种检测邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括：包被有包被原的酶标板、邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体、酶标记物、邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、样本稀释液，所述包被原为邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原是由邻苯二甲酸二丁酯半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述邻苯二甲酸二丁酯半抗原是由邻苯二甲酸酐与正丁醇、4-氨基丁酸反应得到，分子结构式为：

。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体是以邻苯二甲酸二丁酯偶联抗原作为免疫原制备获得，所述邻苯二甲酸二丁酯特异性抗体为邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体或邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1~2mol/L氢氧化钠。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤液为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；所述样本稀释液为pH值为7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述邻苯二甲酸二丁酯标准品溶液的浓度分别为0mg/L、0.02mg/L、0.06mg/L、0.18mg/L、0.54mg/L、1.62mg/L。

9.一种检测样品中邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，包括步骤：

（1）样品前处理；

（2）用权利要求1~8任一项所述的试剂盒进行检测；

（3）分析检测结果。

Images