CN103864950B - 一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的制备方法及其应用。该方法以低分子坛紫菜多糖为原料，利用氧化还原反应将此多糖降解获得分子量低于10000Da的低分子量紫菜多糖，此多糖与氯化铁共热合成的多糖铁复合物在生理pH条件下溶解性良好且能够稳定存在，进行缺铁性贫血小鼠模型实验中效果良好。本发明具有操作简便，制备工艺稳定，制造成本低廉等优点。本发明对原材料有广泛地适用性，凡是分子量范围适合的多糖均可适用于本发明。
Description
技术领域
本发明属于海洋医用保健品领域，具体涉及到一种以低分子坛紫菜多糖为原料的多糖铁复合物的制备方法以及在治疗和预防缺铁性贫血中的应用。
背景技术
缺铁性贫血(DA)是当代世界上最严重的四大营养性疾病之一，严重影响人类的健康。根据世界卫生组织2002年发表的统计数据，全球有20亿人患有铁缺乏症，缺铁位于严重影响人类健康危险因素中的第九位。据统计，目前我国缺铁性贫血发生率高达15％-20％，全国约有2亿人患有缺铁性贫血和铁营养不良症，其中妇女、儿童为高发人群。
缺铁性贫血作为常见的贫血疾病，长期以来临床上主要应用硫酸亚铁的各种制剂进行治疗。硫酸亚铁虽然铁含量较高，吸收较好，在一定程度上可以缓解铁缺乏和贫血症状，但存在许多副作用。而且二价铁离子在体内可催化产生OH自由基，引起细胞毒性和生物体系的损伤。因此，硫酸亚铁（或其他亚铁盐）并不是理想的治疗缺铁性贫血的补铁剂。寻找结构适宜的大分子配合物是寻找新型补铁剂的一个重要方面。
许多多糖具有能与三价铁反应生成多糖铁复合物（Polysaccharide IronComplex, PIC）的特性。由于多糖铁复合物具有极高的水溶性，又具有理想的稳定性和吸收率，而且副作用少，生物利用度也不低于硫酸亚铁；并且配体多糖由于具有多方面的生物活性，如调节血糖、降血压、促进血循环等，亦可被机体吸收、利用，从而发挥相应的效应。而事实上，临床上已经有多种多糖铁复合物（例如右旋糖苷铁、多糖铁复合物力蜚能等）广泛应用于缺铁性贫血的治疗。多糖铁所利用的原料多糖有中药多糖、海藻多糖和真菌多糖等，种类繁多，在构型、分子量、单糖组成等方面的差异更为显著。在中国药典收录的口服铁剂品种均为低分子量铁剂，但是目前国内公布的申请专利中，如CN1995068报道的当归多糖铁，CN101390923报道的红景天多糖铁，CN102268098报道的墨旱莲多糖铁，CN102198151报道的黄芪多糖铁，CN1148600报道的海藻多糖，均采用高分子多糖为原料。而口服高分子量多糖的吸收率很低，因此高分子量多糖铁是否也能像低分子量的铁剂一样以分子形式直接吸收，可被吸收的最佳分子量范围是多大，尚需进一步探讨。因此在制备多糖铁复合物时，除考虑到溶解性、还原性和无铁离子存在等因素外，还要兼顾铁释放后多糖的多种生物活性的利用，才能最大限度地利用原料，节省能源。
本发明以海藻中具有补血和免疫双重作用的坛紫菜为原材料制备获得低分子量坛紫菜多糖，然后与氯化铁共热合成多糖铁复合物，并研究证实了其在治疗缺铁性贫血中的应用。
发明内容
本发明旨在提供一种以低分子坛紫菜多糖为原料的铁复合物的制备方法及其应用。本发明的目的是把铁负载在低分子坛紫菜多糖上，增加复合物的溶解性，利于活性成分的吸收，提高其生物利用度，并利用作为载体的坛紫菜多糖具有优良的补血和免疫的药效，达到提高铁元素的协同补血的目的。
本发明提供的具有治疗缺铁性贫血作用的坛紫菜多糖是采用高分子多糖氧化降解后的低分子量紫菜多糖为原料，通过氯化铁共热合成，在一定条件下反应复合得到。具体制备方法如下：
（1）将坛紫菜粉碎后加水搅拌提取，提取液用硅藻土助滤、透析后减压浓缩，之后加入乙醇沉淀，洗涤、烘干后得到坛紫菜多糖；
（2）将坛紫菜多糖溶于水配成溶液，加入降解试剂，常温下搅拌1小时后装入透析袋透析，所得透析液经浓缩后得到低分子坛紫菜多糖溶液；
（3）在所得的低分子坛紫菜多糖溶液中加入柠檬酸三钠，于65°C水浴中加热搅拌溶解后滴加碱液使溶液pH维持在8~9，然后滴加三氯化铁溶液，滴加过程中始终用碱液将保持溶液的pH为8~9，当反应液中出现红棕色不溶物质时，立即停止滴加碱液和三氯化铁溶液，趁热离心除去沉淀，收集深红棕色离心液，离心液中加入乙醇沉淀、抽滤、干燥得红棕色多糖铁复合物。
本发明所述的坛紫菜多糖提取条件为每1g坛紫菜多糖加入40mL水，提取温度100-110 °C，反应时间3小时；所述的多糖降解试剂为抗坏血酸和双氧水，并且两者在溶液中的最终浓度均为10 mM，降解时间为1小时。
所述的低分子坛紫菜多糖的分子量范围为6000-10000 Da。
所述的低分子坛紫菜多糖铁的制备条件为每1mL低分子坛紫菜多糖溶液加入0.125g柠檬酸三钠。
所述的多糖铁合成反应温度为65-80 °C。
所述的多糖铁复合物合成反应液的pH值8~9。
所述的沉淀复合物样品所达到的乙醇最终浓度为80%。
所述的铁复合物最终用于进行缺铁性贫血的治疗和预防。
将合成的低分子多糖铁复合物进行差示扫描热分析，发现其约在26 °C出现吸热曲线，此后一直很稳定不分解，直到235 °C开始发生熔融，在261 °C有明显吸热峰，在575 °C发生分解。而原料多糖则在345°C有明显吸热峰，并且在504°C发生分解，结果证实合成的多糖铁复合物为新生成化合物，与原料坛紫菜多糖有明显差别。
本发明所的复合物在生理pH条件下溶解性良好且能够稳定存在，进行缺铁性贫血小鼠模型实验中效果良好。本发明具有操作简便，制备工艺稳定，制造成本低廉等优点。本发明对原材料有广泛的适用性，凡是分子量范围适合的多糖均可适用于本发明。
附图说明
图1为低分子量坛紫菜多糖LP及多糖铁复合物LPPC的IR谱图。
图2 为低分子量坛紫菜多糖LP及多糖铁复合物LPPC的差示扫描热分析曲线。
具体实施方式
1、坛紫菜多糖的制备
称取100 g干燥坛紫菜粉碎后装入高压提取器，加入40倍蒸馏水于105 °C下提取3小时。提取液先用纱布过滤除去藻渣，然后用硅藻土助滤，得到澄清提取液。将提取液装于截留分子量3500 Da的透析袋中，流动自来水透析两天，蒸馏水透析一天之后减压浓缩，浓缩液加入无水乙醇使乙醇最终浓度达到75％，得到絮状白色沉淀。将沉淀用无水乙醇洗涤后烘干得到坛紫菜原料多糖42 g。
2、低分子量坛紫菜多糖的制备
将4 g上述坛紫菜原料多糖溶于水配成浓度为0.5%（质量分数）的溶液，然后加入抗坏血酸和双氧水，使两者最终浓度均达到10 mM，常温下搅拌1小时后装入透析袋透析。透析液浓缩得到低分子量多糖溶液。将上述浓缩液冷冻干燥得低分子量坛紫菜多糖2.6 g。
3、低分子多糖铁复合物的制备
取上述低分子多糖溶液200 mL，加入柠檬酸三钠0.5 g，置于70 °C水浴中加热，并不断搅拌。在搅拌过程中，先滴加氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液，使溶液pH维持在8~9，然后缓缓加入2 mol/L三氯化铁溶液；并始终保持溶液的pH为8~9。当反应液中出现红棕色不溶物质时，立即停止滴加氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液。继续在70 °C水浴加热1 h后，趁热离心。此时离心液呈深红棕色，加入4倍无水乙醇得到沉淀。将沉淀用无水乙醇洗涤、抽滤、干燥、得到浒苔多糖铁复合物约2.2 g。
4、多糖铁复合物治疗缺铁性贫血小鼠模型试验
将60 只健康小鼠随机分为6 组，即：模型组、阳性对照组( FeSO4，40 mg /kg)、阴性对照组、多糖铁高剂量组( 60 mg /kg)、中剂量组( 30 mg /kg)、低剂量组( 15 mg /kg)。除阴性对照组、模型组外，其余各组按上述剂量灌胃给药，每日1次, 连续灌胃给药20d(阴性对照组按0. 02 mL/g灌生理盐水)。阴性对照组喂常规饲料，饮自来水，其余各组喂低铁饲料，饮去离子水。除阴性对照组外，其余各组辅助放血，5天一次，每次采用眼眶静脉丛放血0. 5 mL，第20天称质量，摘眼球取血，测血红蛋白、红细胞，分离血清，按铬天青S法测血清铁含量，解剖小鼠称脾质量，计算脾脏指数。实验数据采用三次实验结果的平均值表示，组间t检验分析符合要求，实验结果见表1和2。
表1、低分子坛紫菜多糖铁对缺铁性贫血小鼠各血液成分的影响(±s )
* P<0.05, ** P<0.05.
表2、低分子坛紫菜多糖铁对缺铁性贫血小鼠脾脏和体重情况的影响(±s )
* P<0.05, ** P<0.05.
实验结果表明，低分子多糖铁能显著增加缺铁性贫血小鼠的血液成分、脾脏指数、脾质量和体重等指标，对小鼠免疫力的提高具有显著效果，是一种具有很大发展潜力的补铁剂。
Claims (7)
1.一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将坛紫菜粉碎后加水搅拌提取，提取液用硅藻土助滤、透析后减压浓缩，之后加入乙醇沉淀，洗涤、烘干后得到坛紫菜多糖；
(2)将坛紫菜多糖溶于水配成溶液，加入降解试剂，常温下搅拌1小时后装入透析袋透析，所得透析液经浓缩后得到低分子坛紫菜多糖溶液；
(3)在所得的低分子坛紫菜多糖溶液中加入柠檬酸三钠，于65℃水浴中加热搅拌溶解后滴加碱液使溶液pH维持在8～9，然后滴加三氯化铁溶液，滴加过程中始终用碱液将保持溶液的pH为8～9，当反应液中出现红棕色不溶物质时，立即停止滴加碱液和三氯化铁溶液，趁热离心除去沉淀，收集深红棕色离心液，离心液中加入乙醇沉淀、抽滤、干燥得红棕色多糖铁复合物。
2.根据权利要求1所述的一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的制备方法，其特征在于：所述的低分子坛紫菜多糖的分子量范围为6000-10000Da。
3.根据权利要求1所述的一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中坛紫菜加水搅拌提取时每1g坛紫菜多糖加入40mL水，提取温度为100-110℃，提取时间为3小时。
4.根据权利要求1所述的一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中坛紫菜多糖溶于水后坛紫菜多糖的浓度为0.5％，所述的降解试剂为抗坏血酸和双氧水，并且抗坏血酸和双氧水在溶液中的最终浓度均为10mM，降解时间为1小时。
5.根据权利要求1所述的一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中低分子坛紫菜多糖溶液中加入柠檬酸三钠时，每1mL低分子坛紫菜多糖溶液加入0.125g柠檬酸三钠。
6.根据权利要求1所述的一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的制备方法，其特征在于：所述的多糖铁复合物在热分析检测时，在26℃出现吸热曲线，在235℃开始发生熔融，在261℃有明显吸热峰，在575℃发生分解。
7.根据权利要求1所述制备方法得到的一种低分子坛紫菜多糖铁复合物的应用，其特征在于：所述的低分子坛紫菜多糖铁复合物的应用为用作治疗和预防缺铁性贫血的保健品。
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