CN103861094A - 一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用；先设计特异性引物，对A型产气荚膜梭菌DNA进行PCR扩增获得α毒素基因片段克隆到pMD18-T Vector载体后，选取阳性重组子，连接到PET-28a（+）质粒上，将重组质粒导入受体菌株，成功构建重组菌株BL21(DE3)-α。将制取好的α毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，加入0.01%的硫柳汞，即得产气荚膜梭菌α毒素基因工程苗，易于工业化生产，操作简单，安全性好，产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗能有效预防因A型产气荚膜梭菌引起的动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽等疾病。
Description
（一）技术领域
本发明一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用，属于动物基因工程技术领域。
（二）发明背景
产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽及人类食物中毒的主要病原菌之一，该菌的致病因子是其所产生的外毒素。迄今，已发现的产气荚膜梭菌外毒素有12种（α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ和ν）之多，但起主要致病作用的只有4种（α、β、ε和ι），据此将该菌分为A、B、C、D、E等5个毒素型。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素，它是产气荚膜梭菌主要的毒力因子，具有磷脂酶C和鞘磷脂酶等2种酶的活性，能同时水解细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂，导致细胞裂解，因而具有细胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性，引起动物气性坏疽，兔梭菌性下痢等，严重威胁畜禽的健康，阻碍畜牧业的发展。
为了控制产气荚膜梭菌病的流行，许多科研学者曾研制过产气荚膜梭菌的灭活疫苗用于预防。王璞（2013）对产气荚膜梭菌与化脓隐秘杆菌二联灭活疫苗的制备及体液免疫效果评价研究；郭凤华等（2010）对A型产气荚膜梭菌类毒素灭活疫苗的研制研究；曲海波等（2010）对A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与全菌灭活疫苗的安全性和免疫效力的比较研究；徐为中等（2005）兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病A型三联灭活疫苗的研制。这些疫苗对该病的流行有一定的控制作用，但其存在以下缺点：诱导产生的免疫反应持续时间较短，需要多次接种；灭活剂对毒素抗原有影响，且对不同的抗原成分影响不同；由于诱导的免疫反应水平较低，以及各个抗原成分之间的疫苗应答不平衡，可能诱发疾病；一般要求对疫苗进行浓缩纯化；不能通过自然途径接种，不易产生局部免疫反应等，质量需要进一步改进。
α毒素的类毒素疫苗在动物上具有保护作用,但是出于安全性考虑此疫苗不太可能适用于人类，因此疫苗研究必须基于对毒素结构和分子功能的完全理解，重视毒素与呼吸道和胃肠道表面的相互作用关系。α毒素的启动子是最强的启动子之一，可被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别，因而α毒素在自身启动子作用下不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达，也可在大肠杆菌中得到高效表达。本发明根据产气荚膜梭菌的发病机理，获得α毒素的保护性抗原基因片段，利用分子生物学技术，研制出α毒素基因工程疫苗，此疫苗产量高、安全性高、纯度高、稳定性好，能有效避免疫苗浓缩、诱导免疫持续时间短等问题。
（三）发明内容
本发明的目的在于提供一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用，该疫苗具备免疫力强、针对性好、无毒副作用、安全性好等优点，能有效预防A型产气荚膜梭菌所引起的动物创伤性气性坏疽、恶性水肿、坏死性肠炎、肠毒血症等疾病。
一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，是将产气荚膜梭菌α毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。
所述的产气荚膜梭菌α毒素蛋白的制备步骤如下：
1）设计引物
根据Genebank上已经提交的α毒素基因序列（登陆号:AY823400，其序列如Seq ID No:1所示）扩增α毒素的部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Nco I和BamH I酶切位点；
primer1：5'-AGGGATGGAAAGATTGATGG-3' Nco I
primer2：5'-TTATTTTATATTATAAGTTGAATTTCCTGA-3' BamH I
2）制备模板和PCR扩增目的基因
用接种环挑取A型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；
3）将α毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体
将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18-T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18-T-α；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18-T-α；
4）构建原核表达载体pET28a-α
将阳性重组质粒pMD18-T-α与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a-α；将pET28a-α与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-α；
5）α毒素蛋白的诱导表达、纯化
用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到α毒素蛋白。
本发明还涉及一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1）设计引物
根据Genebank上已经提交的α毒素基因序列（登陆号:AY823400，其序列如Seq ID No:1所示）扩增α毒素的部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Nco I和BamH I酶切位点；
primer1：5'-AGGGATGGAAAGATTGATGG-3' Nco I
primer2：5'-TTATTTTATATTATAAGTTGAATTTCCTGA-3' BamH I
2）制备模板和PCR扩增目的基因
用接种环挑取A型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；
3）将α毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体
将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18-T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18-T-α；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18-T-α；
4）构建原核表达载体pET28a-α
将阳性重组质粒pMD18-T-α与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a-α；将pET28a-α与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-α；
5）α毒素蛋白的诱导表达、纯化
用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到α毒素蛋白。
6）将所述的α毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗。
本发明还涉及产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗在预防因A型产气荚膜梭菌所引起的动物的动物创伤性气性坏疽、恶性水肿、坏死性肠炎、肠毒血症中的应用。
产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的上述免疫效果最突出表现在鸡和家兔的应用上；在针对家兔免疫时，免疫剂量为2ml/只，肌肉注射；在针对鸡免疫时，免疫剂量为0.5ml/只，颈部皮下注射。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗,具备免疫力强、针对性好、无毒副作用、安全性好、纯度高、稳定性好等优点并且能避免疫苗浓缩、诱导免疫持续时间短等问题，有效预防A型产气荚膜梭菌所引起的动物创伤性气性坏疽、恶性水肿、坏死性肠炎、肠毒血症等疾病。
（四）附图说明
图1是本发明目的基因的PCR扩增结果图，说明PCR成功扩增出1113bp的α毒素基因。
图2是本发明Ni-NTA柱提纯后蛋白SDS-PAGE电泳结果图，说明最优条件下诱导的菌液超声裂解，上清及沉淀样品分别纯化，纯化后蛋白样品经SDS-PAGE电泳，目标蛋白主要以包涵体的形式存在，大小约45KD。
图3是本发明α毒素表达蛋白的Western blot检测结果图，结果显示目的蛋白能与阳性抗体发生反应，说明表达的α毒素蛋白具有良好的特异性。
（五）具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法如无描述均为本领域已知方法。
实施例1：产气荚膜梭菌α毒素蛋白的表达、纯化
1、设计引物
根据Genebank上已经提交的α毒素基因序列（登陆号:AY823400，其序列如Seq ID No:1所示）扩增α毒素的部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Nco I和BamH I酶切位点；
primer1：5'-AGGGATGGAAAGATTGATGG-3' Nco I Seq ID No:3
primer2：5'-TTATTTTATATTATAAGTTGAATTTCCTGA-3' BamH I Seq ID No:4
2、制备模板
用接种环挑取A型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基（组分：100毫升蒸馏水、1克葡萄糖和3.8克豆琼脂粉灭菌后，加入5毫升绵羊血分装到六个血平板上）上，37℃厌氧（88％N2、7％H2、5％CO2）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT，培养基成分通用）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液用DNA提取试剂盒（大连宝生物公司）提取DNA模板。
3、PCR扩增与回收目的基因
(1)扩增目的基因
PCR反应体系（25ul）：1.0ul的模版DNA，10×PCR buffer(Mg2+free)2.5ul，MgCl2（2.5mmol/L）2ul，dNTP（2.5mmol/L）1.3ul，上下游引物(25μmol/L)各1ul，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2ul；最后用灭菌双蒸水补足到25ul。
PCR反应程序：94℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃70s，共30个循环，最后在72℃中延伸10min。
(2)回收目的基因条带
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因条带，具体步骤如下：
①在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的片段部分的凝胶，尽量减小凝胶的体积，提高DNA的回收率。
②切碎凝胶块，以提高凝胶的回收率，称量凝胶块的重量，计算凝胶块的体积，以1mg=1ul计算。
③向凝胶块中加入等体积胶块融化液DR-I buffer。
④均匀混合后，75℃加热融化胶块，此时间断震荡混合，使胶块充分融化6-10min。
⑤向上述胶块融化液中再加入步骤③所述DR-I buffer1/2体积量的DR-II buffer，均匀混合。
⑥将上述得到的溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去滤液。
⑦再将500ul的RinseA加入步骤⑥处理后的吸附柱中，12000rpm离心30s，弃去滤液。
⑧再将700ulRinseB加入⑦处理后的吸附柱中，12000rpm离心30s，弃去滤液。
⑨再将700ulRinseB加入⑧处理后的吸附柱中，12000rpm离心30s，弃去滤液。
⑩将吸附柱安置于一个1.5ml的离心管上，在吸附柱膜的中央处加入25ul的灭菌蒸馏水，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱目的DNA。
（3）将α毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体
将步骤（2）中洗脱的目的DNA与pMD18-T Vector（购自北京天根生化科技有限公司）混合，体系为：pMD18-T Vector1ul，回收产物（即洗脱的目的DNA）3ul，ddH2O1ul，solutionI5ul，混合后于16℃连接5-7h。将连接产物与Top10感受态细胞（购自北京康为世纪生物科技有限公司）混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒。
所述的将连接产物与Top10感受态细胞混合进行转化的具体步骤如下：
①取一离心管,加入50ul冰浴上融化的Top10感受态细胞，再加入连接产物10ul，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
②42℃水浴中热激30s，然后快速将离心管转移到冰浴中2min，该过程勿摇动离心管。
③再加入500ul无菌的LB液体培养基（100mlLB液体培养基组分：Tryptone1ml，Yeastextract0.5ml，Nacl1ml），混匀后置于37℃，200r/min培养1h。
所述的筛选重组转化菌提取质粒，具体步骤如下：
吸取200ul上步骤中已经转化的感受态细胞加到含有100ug/ml氨苄抗生素的LB琼脂培养基（普通琼脂培养基）（100mlLB琼脂培养基组分：Tryptone1ml，Yeast extract0.5ml，Nacl1ml，1.5g琼脂粉）上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。37℃过夜培养的平板上无菌操作挑取单菌落接种于含100ug/ml氨苄抗生素的LB液体培养基（100mlLB液体培养基组分：Tryptone1ml，Yeast extract0.5ml，NaCl1ml）增菌，37℃振荡培养12-14h，按照质粒提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）说明，提取质粒，具体步骤如下：
①柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12000rpm，离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
②取5ml过夜培养的菌液加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm，离心1分钟，尽量吸除上清。
③再向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器彻底悬浮沉淀。
④再向离心管中加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使其充分裂解。
⑤再向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000rpm，离心10分钟，此时离心管底部出现沉淀。
⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12000rpm，离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
⑦再向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm，离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
⑧重复操作步骤⑦。
⑨将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm，离心2分钟。
⑩再将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm，离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。
所述的平衡液BL、溶液P1、溶液P2、溶液P3、漂洗液PW、吸附柱CP3、洗脱缓冲液EB均为质粒提取试剂盒中的组成内容。
将得到的质粒DNA用限制性内切酶（Nco I和BamH I）37℃酶切3h，酶切体系10ul：限制性内切酶（Nco I和BamH I）各0.5ul，质粒6ul，10×buffer1ul，ddH2O2ul。酶切产物于1%琼脂糖凝胶观察酶切片断，确定阳性重组质粒，送金斯特工程有限公司进行核苷酸序列测定。
4、构建原核表达载体pET28a-α
将测序结果为阳性的α克隆重组质粒与表达载体pet28a（购自北京天根生化科技有限公司）均用Nco I和BamH I双酶切，37℃孵育3h。酶切体系50ul：限制性内切酶各2.5ul，质粒30ul，10×buffer5ul，ddH2O10ul。
酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体，具体回收步骤同DNA凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）说明。
将回收产物与pet28a线性载体连接，体系为：pet28a线性载体1ul，目的基因片段（即回收产物）3ul，ddH2O1ul，solution I5ul，混合后于16℃连接5-7h。将连接产物与BL21(DE3)pLysS感受态细胞（购自北京艾比根生物技术有限公司）（原核表达宿主）混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒，具体步骤如下：
①取冰浴上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞50ul，加入连接产物10ul，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
②42℃水浴中热激45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
③向离心管中加入500ul无菌的LB液体培养基，混匀后置于37℃，200转/min培养1h。
④吸取200ul已转化了的感受态细胞加到含有100ug/ml Kana抗生素的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。37℃过夜培养的平板上无菌操作挑取单菌落接种于含100ug/ml Kana抗生素的LB液体培养基增菌，37℃振荡培养12-14h，得到重组菌株。
将重组菌株按照质粒提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）说明提取质粒。提取得到的质粒DNA用Nco I和BamH I限制性内切酶37℃酶切3h，酶切体系10ul：限制性内切酶各0.5ul，质粒6ul，10×buffer1ul，ddH2O2ul。酶切产物于1%琼脂糖凝胶观察酶切片断，确定阳性重组质粒pET28a-α，送金斯特工程有限公司进行核苷酸序列测定。Blast在线比对所测α毒素全基因序列与GenBank已发表相应序列的同源性在98%以上。
将上述经酶切测序确定已转入阳性重组质粒pET28a-α的重组菌株命为BL21(DE3)-α。
5、α毒素蛋白的诱导表达、纯化及特异性检测
将上述得到的BL21(DE3)-α接种于含100ug/ml Kana抗生素（泰安飞扬生物科技有限公司）的LB液体培养基中，37℃震荡培养，当菌液OD值达到0.6时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，诱导表达12h。
将诱导表达的菌液离心收集沉淀，加入0.01M PBS溶液重悬，超声裂解细胞（超声裂解程序：1s，1s，20min，25℃），裂解完全后菌液离心（8000rpm/min，15min，4℃），分离上清1备用。沉淀用0.01M PBS溶液漂洗2次，离心弃上清2，用尿素溶液（北京中生瑞泰科技有限公司）重悬沉淀，重悬后的沉淀与首次分离得到的上清1分别通过Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱（南京金斯瑞生物科技有限公司）纯化，得到α毒素蛋白。
纯化后的样品进行SDS-PAGE电泳，并通过Western blot检测表达蛋白的特异性。
实施例2：α毒素蛋白毒性测定
将BL21(DE3)-α的培养上清（即上清1）、菌体及菌体裂解物（步骤5）中裂解完全后的菌液）以及产气荚膜梭菌强毒A528培养上清分别接种在卵黄琼脂平板（称取琼脂培养基成品50g，加入去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃灭菌15min，冷至50℃左右，每100mL培养基加入50%的无菌卵黄盐水悬10-15mL，摇匀立即倾注六个平皿，凝固）上，36℃厌氧培养24h，BL21(DE3)-α的培养上清、菌体及菌体裂解物均不出现特征性混浊环，而产气荚膜梭菌强毒A528培养上清出现乳白色混浊环，说明BL21(DE3)-α已不具备α毒素的磷脂酶C活性；经腹腔注射BL21(DE3)-α的balb/c小白鼠（18-20g，10只），3周后全部存活，每只小白鼠均无临床症状。
所述的产气荚膜梭菌强毒A528培养上清制备方法：用接种环挑取A型产气荚膜梭菌菌种NCTC528接种于一个血平板培养基（100毫升蒸馏水、1克葡萄糖和3.8克豆琼脂粉灭菌后，加入5毫升绵羊血分装到六个血平板上）上，37℃厌氧（88％N2、7％H2、5％CO2）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）（培养基成分通用）的试管内，37℃厌氧培养12h，得到产气荚膜梭菌A528菌体培养液，12000rpm离心30s，取上清即得。
实施例3：α毒素基因工程疫苗安全检验
用体重1.5-2千克的家兔4只，各肌肉注射疫苗5毫升，观察10日，均健活，注射部位没有发生坏死。
实施例4：α毒素基因工程疫苗无菌检验及硫柳汞含量测定
参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001年版）附录301页进行，无菌生长。
参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001年版）附录313页进行，符合《制品检验的有关规定》（硫柳汞含量不超过0.01%）。
实施例5：α毒素基因工程疫苗免疫剂量研究
（1）取1.5-2kg健康家兔24只，分为对照组和实验组，每组各12只,实验组每只肌肉注射1ml、2ml、3ml的α毒素基因工程苗，每组4个重复，对照组分别肌肉注射1ml、2ml、3ml无菌生理盐水，每组4个重复，21日后，24只兔分别静脉注射1ml A型产气荚膜梭菌，观察3-5日，对照组12只兔全部死亡。免疫组中肌肉注射1mlα毒素基因工程疫苗的家兔出现精神不振，2日后出现死亡，肌肉注射2ml、3ml实验组均未出现不良症状。确定2ml疫苗作为家兔常规接种剂量。
（2）取1.5kg左右鸡40只，分为对照组和实验组，每组各20只,实验组每只肌肉注射0.1ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml的α毒素基因工程苗，每组5个重复，对照组分别皮下注射0.1ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml无菌生理盐水，每组5个重复。21日后，40只鸡分别肌肉注射1ml A型产气荚膜梭菌，观察3-5日，对照组20只鸡全部死亡，解剖出现严重的肠胀气和坏死性出血等坏死性肠炎的症状，免疫组中皮下注射0.1ml、0.25mlα毒素基因工程疫苗的鸡出现精神不振，于2日死亡，解剖发现其肠胀气、出血等病死症状，皮下注射0.5ml、0.75ml实验组均健康，解剖后无不良现象。确定0.5ml疫苗作为鸡常规接种剂量。
Claims (3)
1.一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于产气荚膜梭菌α毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到；
所述的产气荚膜梭菌α毒素蛋白的制备步骤如下：
1）设计引物
根据Genebank上已经提交的α毒素基因序列扩增α毒素特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Nco I和BamH I酶切位点；
primer1：5'-ATGAAAAGAAAGATTTGTAAGGCG-3' Nco I
primer2：5'-TTATTTTATATTATAAGTTGAATTTCCTGAAATCC-3' BamH I
2）制备模板和PCR扩增目的基因
用接种环挑取A型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；
3）将α毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体
将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18-T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18-T-α；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18-T-α；
4）构建原核表达载体pET28a-α
将阳性重组质粒pMD18-T-α与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a-α；将pET28a-α与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-α；
5）α毒素蛋白的诱导表达、纯化
用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到α毒素蛋白。
2.一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1）设计引物
根据Genebank上已经提交的α毒素基因序列扩增α毒素的部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Nco I和BamH I酶切位点；
primer1：5'-AGGGATGGAAAGATTGATGG-3' Nco I
primer2：5'-TTATTTTATATTATAAGTTGAATTTCCTG A-3' BamH I
2）制备模板和PCR扩增目的基因
用接种环挑取A型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；
3）将α毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体
将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18-T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18-T-α；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18-T-α；
4）构建原核表达载体pET28a-α
将阳性重组质粒pMD18-T-α与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a-α；将pET28a-α与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-α；
5）α毒素蛋白的诱导表达、纯化
用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到α毒素蛋白。
6）将所述的α毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗。
3.如权利要求1所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗在预防因A型产气荚膜梭菌所引起的动物坏死性肠炎、肠毒血症和创伤性气性坏疽中的应用。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109602898A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-12 | 江苏省农业科学院 | 一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法 |
| CN114107304A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-01 | 佛山市正典生物技术有限公司 | 一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法 |
| CN115011534A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-09-06 | 山东农业大学 | 一种茎瘤固氮根瘤菌ors571的突变株、构建方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101198352A (zh) * | 2005-04-18 | 2008-06-11 | 谢尔英·普劳有限公司 | 产气荚膜梭菌α类毒素疫苗 |
-
2014
- 2014-03-27 CN CN201410117383.0A patent/CN103861094A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101198352A (zh) * | 2005-04-18 | 2008-06-11 | 谢尔英·普劳有限公司 | 产气荚膜梭菌α类毒素疫苗 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 卢田粉: "《产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究》", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》, no. 2, 15 February 2013 (2013-02-15) * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109602898A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-12 | 江苏省农业科学院 | 一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法 |
| CN109602898B (zh) * | 2018-12-28 | 2022-02-22 | 江苏省农业科学院 | 一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法 |
| CN114107304A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-01 | 佛山市正典生物技术有限公司 | 一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法 |
| CN114107304B (zh) * | 2021-12-09 | 2024-02-02 | 佛山市正典生物技术有限公司 | 一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法 |
| CN115011534A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-09-06 | 山东农业大学 | 一种茎瘤固氮根瘤菌ors571的突变株、构建方法及应用 |
| CN115011534B (zh) * | 2022-03-23 | 2023-11-03 | 山东农业大学 | 一种茎瘤固氮根瘤菌ors571的突变株、构建方法及应用 |
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