CN103841972A - 用于癌症的治疗的克里唑蒂尼 - Google Patents

Abstract

本发明涉及ROS激酶抑制剂用于治疗哺乳动物中不正常的细胞生长的用途。具体而言，本发明提供治疗患有由至少一种遗传改变的ROS介导的癌症的哺乳动物的方法。具体而言，本发明提供藉由给药克里唑蒂尼治疗患有由至少一种遗传改变的ROS介导的癌症的哺乳动物的方法。

Description

用于癌症的治疗的克里唑蒂尼

本申请主张2011年8月2日提交的美国临时申请第61/514,386号的权利，其全文通过援引加入本文。

【技术领域】

本发明涉及ROS抑制剂用于治疗哺乳动物中不正常的细胞生长的用途。具体而言，本发明提供治疗患有癌症的哺乳动物的方法。

【背景技术】

人类癌症包括各种各样的疾病，其共同成为全世界发达国家中的主要死亡原因之一(American Cancer Society,Cancer Facts and Figures2005.Atlanta:American CancerSociety;2005)。癌症的进展是由一系列复杂多重遗传及分子事件(包括基因突变、染色体易位及核型异常)引起的(Hanahan等人Cell100:57-70(2000))。尽管癌症的潜在遗传病因多样且复杂的，但已观察到每一癌症类型呈现共同特征和获得的有利于其进展的能力。这些获得的能力包括失调的细胞生长、动员血管的持续能力(即，血管发生)、及肿瘤细胞局部扩散以及转移至继发性器官位点的能力(Hanahan等人Cell(2000))。因此，鉴别新颖治疗剂的能力呈现显著未满足的需要，所述治疗剂1)抑制在癌症进展期间被改变的分子靶标或2)靶向多种肿瘤中癌症进展共有的多个过程。

V-ros UR2肉瘤病毒致癌基因同系物1(ROS-1或ROS)是属于胰岛素受体亚族的原癌基因受体酪氨酸激酶，且涉及细胞增殖及分化过程。Nagarajan等人Proc Natl Acad Sci83:6568-6572(1986))。ROS在人类的多种不同组织的上皮细胞中表达。已在胶质母细胞瘤以及中枢神经系统肿瘤中发现ROS表现及/或激活的缺陷(Charest等人，Genes Chromos.Can.37(1):58-71(2003))。已阐述产生ROS激酶的异常融合蛋白的涉及ROS的遗传改变，包括胶质母细胞瘤(Charest等人(2003)；Birchmeier等人，Proc Natl Acad Sci84:9270-9274(1987))及NSCLC(Rimkunas等人，Clin Cancer Res epub，6月1日(2012))中的FIG-ROS缺失易位、NSCLC中的SLC34A2-ROS易位(Rikova等人，Cell131:1190-1203(2007)、NSCLC(Rikova等人，(2007))及胆管上皮癌(Gu等人，PLoSONE6(1):e15640(2011))中的CD74-ROS易位，以及已知驱动小鼠中的肿瘤生长的ROS的截短活性形式(Birchmeier等人Mol.Cell.Bio.6(9):3109-3115(1986))。在肺癌患者肿瘤试样中已报告其它融合物(fusion)(包括TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、EZR-ROS1及LRIG3-ROS1)(Takeuchi等人Nature Medicine(2012))。

钠依赖性磷酸盐转运蛋白同工型NaPi-3b蛋白(SLC34A2)是690个氨基酸的磷酸盐转运蛋白，其于人类肺及小肠中表达，且其具有钠依赖性活性。已在卵巢癌中发现SLC34A2表达和/或活性方面的缺陷(Rangel等人，Oncogene22(46):7225-7232(2003))。CD74是起到对MIF免疫细胞因子具有高亲和性的MHC II类伴侣蛋白的作用的整合膜蛋白(Leng等人，J.Exp.Med.197:1467-1476(2003))。FIG(融合于胶质母细胞瘤中)是编码454个氨基酸的蛋白质的基因，所述蛋白包括PSD-95、Disc Large、ZO-1(PDZ)结构域、两个卷曲螺旋区域及亮胺酸拉链。已表明FIG藉由经由其第二卷曲螺旋结构域与SNARE蛋白相互作用而于外周与Golgi装置结合，且因此被推断在Golgi-介导的小泡输送中起作用(Charest等人(2003))。

SLC34A2-ROS易位发生在染色体(4p15)与染色体(6q22)之间且产生两个融合蛋白变体，其组合钠依赖性磷酸盐转运蛋白同工型NaPi-3b蛋白(SLC34A2)的N末端与原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体(ROS)激酶的跨膜及激酶结构域(WO2007/084631)。迄今为止，已鉴别SLC34A2-ROS融合蛋白的两个变体，其分别是724个氨基酸(SLC34A2-ROS(L)；长变体)及621个氨基酸(SLC34A2-ROS(S)；短变体)(WO2007/084631)。SLC34A2-ROS易位还可被描述为ROS基因与SLC34A2基因的融合，其随后产生特征在于由SLC34A2-ROS融合基因编码的蛋白序列的异常SLC34A2-ROS融合蛋白。

CD74-ROS易位发生在染色体(5q32)与染色体(6q22)之间且产生组合CD74的N末端与原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS前体(ROS)激酶的跨膜及激酶结构域的融合蛋白。所得CD74-ROS融合蛋白是703个氨基酸的蛋白质(WO2009/051846)。CD74-ROS易位还可被描述为ROS基因与CD74基因的融合，其随后产生特征在于由CD74-ROS融合基因编码的蛋白序列的异常CD74-ROS融合蛋白。

FIG-ROS缺失易位以染色体(6q21)上的240千碱基的染色体内纯合缺失的方式发生，以产生组成型激活酪氨酸激酶(Charest等人(2003))。已报告FIG-ROS融合蛋白的变体，其分别是878个氨基酸(FIG-ROS(L)；长变体)及630个氨基酸(FIG-ROS(S)；短变体)(Gu等人(2011)；US2011/0287445)。由于涉及ROS基因的融合及缺失参与人类癌症的病因学，所以发现可用于减弱在此类融合及缺失中的ROS激酶活性的活性的ROS抑制剂代表癌症治疗中显著未满足的需要。

【发明内容】

在一个方面，本发明提供治疗需要此类治疗的人类的癌症的方法，所述方法包括向所述人类给药治疗有效量的式1的ROS激酶抑制剂：

或其药学上可接受的盐，其中所述癌症是由至少一种遗传改变的ROS介导的。所述式1的化合物可在本文中不同地以其通用名克里唑蒂尼(crizotinib)或其化学名3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺提及。

在本发明此方面的一个实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是ROS的融合基因。在此方面的另一实施方案中，所述ROS的融合基因是SLC34A2-ROS基因或CD74-ROS基因。在此方面的另一实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是涉及ROS激酶的遗传缺失。在此方面的另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS基因。在此方面的另一实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是遗传改变的ROS激酶。在此方面的之另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS融合物。在此方面的另一实施方案中，所述ROS融合物是SLC34A2-ROS激酶或CD74-ROS激酶。在此方面的另一实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是涉及ROS激酶的缺失蛋白质(deletion protein)。在此方面的另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS激酶。

在此方面的另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin'sDisease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。在此方面的另一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在此方面的另一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在此方面的另一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面，本发明提供包括向具有由ROS激酶介导的不正常的细胞生长的哺乳动物给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂的方法。在本发明此方面的一个实施方案中，所述不正常的细胞生长是由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由ROS激酶的融合基因介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的遗传缺失介导的。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由ROS激酶的融合蛋白介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的缺失蛋白质介导的。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。在此方面的一些此类实施方案中，所述方法包括向所述具有由ROS激酶介导的不正常的细胞生长的哺乳动物给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂，藉此治疗所述不正常的细胞生长。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。

在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在本发明此方面的另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是癌症。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在本发明的前述方面中的每一者的又一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面，本发明提供包括向患有由ROS激酶介导的癌症的哺乳动物给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂的方法。在本发明此方面的一个实施方案中，所述癌症是由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的。在另一实施方案中，所述癌症是由ROS激酶的融合基因介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的遗传缺失介导的。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由ROS激酶的融合蛋白介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的缺失蛋白质介导的。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。在此方面的一些此类实施方案中，所述方法包括向所述患有由ROS激酶介导的癌症的哺乳动物给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂，藉此治疗所述癌症。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在又一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面中，本发明提供包括藉由给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂治疗需要此类治疗的哺乳动物的由至少一种ROS激酶介导的癌症的方法。在本发明此方面的一个实施方案例中，所述癌症是由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的。在另一实施方案例中，所述癌症是由ROS激酶的融合基因介导的。在另一实施方案中，所述癌症是由涉及ROS激酶的遗传缺失介导的。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由ROS激酶的融合蛋白介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的缺失蛋白质介导的。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在又一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面，本发明提供治疗需要此类治疗的哺乳动物的不正常的细胞生长的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂。在本发明此方面的一个实施方案中，所述不正常的细胞生长是由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由ROS激酶的融合基因介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的遗传缺失介导的。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由ROS激酶的融合蛋白介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的缺失蛋白质介导的。在另一实施方案中，所述融合蛋白是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在本发明此方面的另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是癌症。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在本发明的前述方面中的每一者的又一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在本发明的前述方面中的每一者的一个实施方案中，所述哺乳动物是人类。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述哺乳动物是狗。

在另一方面，本发明提供治疗需要此类治疗的哺乳动物中显示对至少一种遗传改变的ROS激酶呈阳性的癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂。在本发明此方面的一个实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS的融合基因。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的遗传缺失。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS激酶的融合蛋白。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的缺失蛋白质。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在又一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面，本发明提供治疗ROS阳性癌症的方法，所述方法包括向需要此类治疗的哺乳动物给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂。在本发明此方面的一个实施方案中，所述ROS阳性癌症是由ROS的融合基因介导的。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述ROS阳性癌症是由涉及ROS激酶的遗传缺失介导的。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述ROS阳性癌症是由ROS激酶的融合蛋白介导的。在另一实施方案中，所述ROS阳性癌症是由涉及ROS激酶的缺失蛋白质介导的。在另一实施方案中，所述ROS激酶的融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述ROS激酶的融合蛋白是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述ROS激酶的融合蛋白是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述ROS激酶的缺失蛋白质是FIG-ROS。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在另一实施方案中，所述ROS阳性癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述ROS阳性癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是胶质母细胞瘤。

在此方面的一些实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面，本发明提供包括向具有由ROS激酶介导的不正常的细胞生长的哺乳动物给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂的方法。在本发明此方面的一个实施方案中，所述不正常的细胞生长是由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的。在另一实施方案中，所述不正常细胞生长是由ROS激酶的融合基因介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的遗传缺失介导的。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由ROS激酶的融合蛋白介导的。在另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是由涉及ROS激酶的缺失蛋白质介导的。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在本发明此方面的另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是癌症。在另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在又一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面，本发明提供包括向已知呈ROS阳性的患者给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂的方法。在一个实施方案中，所述患者患有由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的癌症。在另一实施方案中，所述癌症是由ROS激酶的融合基因介导的。在另一实施方案中，所述癌症是由涉及ROS激酶的遗传缺失介导的。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述癌症是由ROS激酶的融合蛋白介导的。在另一实施方案中，所述癌症是由涉及ROS激酶的缺失蛋白质介导的。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在本发明的前述方面中的每一者的又一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面，本发明提供包括以下的方法：

i.鉴别患有显示对至少一种遗传改变的ROS激酶呈阳性的癌症的患者；及

ii.向所述患者给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂。

在本发明此方面的一个实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS的融合基因。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的遗传缺失。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS激酶的融合蛋白。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的缺失蛋白质。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。在此方面的一些此类实施方案中，所述方法包括(i)鉴别患有显示对至少一种遗传改变的ROS激酶呈阳性的癌症的患者；及(ii)向所述患者给药治疗有效量的ROS激酶抑制剂，藉此治疗所述癌症。在此方面的一些实施方案中，所述治疗导致逆转或抑制癌症的进展。

在此方面的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。

在本发明此方面的另一实施方案中，所述不正常的细胞生长是癌症。在本发明的前述方面中的每一者的另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在本发明的前述方面中的每一者的又一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在本发明此方面的又一实施方案中，所述化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物或其药学上可接受的盐以包含所述式1的化合物或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在一个方面中，本发明提供ROS激酶抑制剂用于制备用于治疗需要此类治疗的人类的癌症的药物的用途，所述治疗包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的式1的ROS激酶抑制剂

或其药学上可接受的盐，其中所述癌症是由至少一种遗传改变的ROS介导的。在本发明此方面的一个实施方案中，所述癌症是由ROS的融合基因介导的。在此方面的另一实施方案中，所述ROS的融合基因是SLC34A2-ROS基因或CD74-ROS基因。在此方面的另一实施方案中，所述癌症是由涉及ROS激酶之遗传缺失介导的。在此方面的另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS基因。在此方面的另一实施方案中，所述癌症是由遗传改变的ROS激酶介导的。在此方面的另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS融合物。在此方面的另一实施方案中，所述ROS融合物是SLC34A2-ROS激酶或CD74-ROS激酶。在此方面的另一实施方案中，所述癌症是由涉及ROS激酶的缺失蛋白质介导的。在此方面的另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS激酶。

在此方面的另一实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。在此方面的另一实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在此方面的另一实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在此方面的另一实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。在此方面的另一实施方案中，所述式1的化合物以包含所述式1的化合物及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在另一方面，本发明提供ROS激酶抑制剂用于制备用于治疗由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的癌症的药物的用途。在一个实施方案中，ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。在本发明此方面的一个实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS的融合基因。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的遗传缺失。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS激酶的融合蛋白。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的缺失蛋白质。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。在本发明此方面的又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是胶质母细胞瘤。

在另一方面，本发明提供ROS激酶抑制剂用于制备用于治疗ROS阳性癌症的药物的用途。在一个实施方案中，ROS激酶抑制剂是ROS激酶的小分子抑制剂。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是氨基吡啶化合物或氨基吡嗪化合物。在另一实施方案中，所述ROS激酶抑制剂是式1的化合物：

或其药学上可接受的盐。在本发明此方面的一个实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS的融合基因。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的遗传缺失。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS激酶的融合蛋白。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的缺失蛋白质。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。在本发明此方面的又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是胶质母细胞瘤。

在另一方面，本发明提供药盒，其包含ROS激酶抑制剂的药物组合物及一组用于向患有ROS阳性癌症的患者给药所述药物组合物的说明书。在本发明此方面的一个实施方案中，所述ROS阳性癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在本发明此方面的又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是胶质母细胞瘤。

在另一方面，本发明提供药盒，其包含ROS激酶抑制剂的药物组合物及一组用于向患有ROS阳性癌症的患者给药所述药物组合物的说明书。在一个实施方案中，所述ROS阳性癌症是由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS的融合基因。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的遗传缺失。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS激酶的融合蛋白。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的缺失蛋白质。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述缺失蛋白质是FIG-ROS。在本发明此方面的一个实施方案中，所述ROS阳性癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在本发明此方面的又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是胶质母细胞瘤。

在另一方面，本发明提供药盒，其包含克里唑蒂尼的药物组合物及一组用于向患有ROS阳性癌症的患者给药所述药物组合物的说明书。在一个实施方案中，所述ROS阳性癌症是由至少一种遗传改变的ROS激酶介导的。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS的融合基因。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合基因是CD74-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的遗传缺失。在另一实施方案中，所述遗传缺失是FIG-ROS。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是ROS激酶的融合蛋白。在另一实施方案中，所述遗传改变的ROS激酶是涉及ROS激酶的缺失蛋白质。在另一实施方案中，所述融合蛋白是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。在另一实施方案中，融合蛋白是SLC34A2-ROS。在另一实施方案中，所述融合蛋白是CD74-ROS。在本发明此方面的一个实施方案中，所述ROS阳性癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在本发明此方面的又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在又一实施方案中，所述ROS阳性癌症是胶质母细胞瘤。

在另一方面，本发明提供藉由给药式1的化合物或其药学上可接受的盐抑制细胞中的ROS激酶活性的方法：

在另一方面，本发明提供治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐，其中所述癌症是由至少一种遗传改变的ROS介导的。在一些此类实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是遗传改变的ROS基因或遗传改变的ROS蛋白质。

在此方面的一些实施方案中，所述治疗导致逆转或抑制癌症的进展。在此方面的常见实施方案中，所述哺乳动物是人类。

在此方面的常见实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是遗传改变的ROS基因，例如ROS融合基因。在一些此类实施方案中，所述ROS融合基因是SLC34A2-ROS基因或CD74-ROS基因。在其它此类实施方案中，所述ROS融合基因是FIG-ROS基因。

在此方面的常见实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是遗传改变的ROS蛋白质，例如ROS融合蛋白。在一些此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是SLC34A2-ROS激酶或CD74-ROS激酶。在其它此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是FIG-ROS激酶。

在此方面的一些实施方案中，本发明提供逆转或抑制哺乳动物中癌症的进展的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐，其中所述癌症是由ROS融合基因介导的。在一些此类实施方案中，所述ROS融合基因是SLC34A2-ROS基因。在其它此类实施方案中，所述ROS融合基因是CD74-ROS基因。在又一些此类实施方案中，所述ROS融合基因是FIG-ROS基因。在一些实施方案中，所述ROS融合基因选自SLC34A2-ROS基因、CD74-ROS基因及FIG-ROS基因。

在此方面的其它实施方案中，本发明提供逆转或抑制哺乳动物中癌症的进展的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐，其中所述癌症是由ROS融合蛋白介导的。在一些此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是SLC34A2-ROS激酶。在其它此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是CD74-ROS激酶。在又一些此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是FIG-ROS激酶。在一些实施方案中，所述ROS融合蛋白选自SLC34A2-ROS激酶、CD74-ROS激酶及FIG-ROS激酶。

在此方面的一些实施方案中，癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在此方面的其它实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在此方面的一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在此方面的其它实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在此方面的常见实施方案中，3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐以包含3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

在此方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述给药步骤之前鉴别患有癌症的哺乳动物的步骤，所述癌症的特征在于至少一种遗传改变的ROS，例如遗传改变的ROS基因或遗传改变的ROS蛋白。在一些此类实施方案中，所述癌症的特征在于具有遗传改变的ROS多核苷酸和/或遗传改变的ROS多肽。

在又一方面，本发明提供治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括：(i)鉴别患有特征在于至少一种遗传改变的ROS的癌症的哺乳动物；及(ii)向所述哺乳动物给药治疗有效量的3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐。在一些此类实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是遗传改变的ROS基因或遗传改变的ROS蛋白质。

在此方面的一些实施方案中，所述治疗导致逆转或抑制癌症的进展。在此方面的常见实施方案中，所述哺乳动物是人类。

在此方面的一些实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是遗传改变的ROS基因，例如ROS融合基因。在一些此类实施方案中，所述ROS融合基因是SLC34A2-ROS基因或CD74-ROS基因。在其它此类实施方案中，所述ROS融合基因是FIG-ROS基因。

在此方面的一些实施方案中，所述至少一种遗传改变的ROS是遗传改变的ROS蛋白质，例如ROS融合蛋白。在一些此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是SLC34A2-ROS激酶或CD74-ROS激酶。在其它此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是FIG-ROS激酶。

在此方面的一些实施方案中，本发明提供逆转或抑制哺乳动物中癌症的进展的方法，所述方法包括：(i)鉴别患有特征在于至少一种ROS融合基因的癌症的哺乳动物；及(ii)向所述哺乳动物给药治疗有效量的3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐。在一些此类实施方案中，所述ROS融合基因是SLC34A2-ROS基因。在其它此类实施方案中，所述ROS融合基因是CD74-ROS基因。在又一些此类实施方案中，所述ROS融合基因是FIG-ROS基因。在一些实施方案中，所述ROS融合基因选自SLC34A2-ROS基因、CD74-ROS基因及FIG-ROS基因。

在此方面的一些实施方案中，本发明提供逆转或抑制哺乳动物中癌症的进展的方法，所述方法包括：(i)鉴别患有特征在于至少一种ROS融合蛋白的癌症的哺乳动物；及(ii)向所述哺乳动物给药治疗有效量的3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐。在一些此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是SLC34A2-ROS激酶。在其它此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是CD74-ROS激酶。在又一些此类实施方案中，所述ROS融合蛋白是FIG-ROS激酶。在一些实施方案中，所述ROS融合蛋白选自SLC34A2-ROS激酶、CD74-ROS激酶及FIG-ROS激酶。

在此方面的一些实施方案中，所述癌症的特征在于具有遗传改变的ROS多核苷酸和/或遗传改变的ROS多肽。

在此方面的一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

在此方面的其它实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。在此方面的一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在此方面的其它实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤。

在此方面的常见实施方案中，3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐以包含3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

【附图简要说明】

图1：在U138MG细胞及HCC78细胞中，克里唑蒂尼对SLC34A2-ROS磷酸化的浓度依赖性抑制。

图2：克里唑蒂尼对HCC78细胞生存力的浓度依赖性抑制。

图3：在HCC78人类NSCLC细胞中，克里唑蒂尼对SLC34A2-ROS磷酸化及ROS介导的信号转导的浓度依赖性抑制。

图4：在具有SLC34A2-ROS融合物的HCC78人类NSCLC细胞中，克里唑蒂尼对裂解的半胱天冬酶3水平的剂量依赖性增加。

图5：克里唑蒂尼在一组ROS融合物改造的3T3-ROS肿瘤模型中的细胞减少效力，所述模型在裸鼠中具有人类CD74-ROS、SLC34A2-ROS(L)、SLC34A2-ROS(S)、FIG-ROS(L)及FIG-ROS(S)。

图6：在裸鼠中的3T3-CD74-ROS异种移植物模型中，克里唑蒂尼对ROS磷酸化(A)及肿瘤生长(B)的剂量依赖性抑制。

图7：在裸鼠中的3T3-SLC34A2-ROS(L)异种移植物模型中，克里唑蒂尼对肿瘤生长的剂量依赖性抑制。

【具体实施方式】

除非另外指明，否则本文中所有提及的本发明化合物均包括提及其盐、溶剂合物、水合物及复合物、以及其盐的溶剂合物、水合物及复合物，包括其多晶型、立体异构体及同位素标记的形式。

定义

除非另有说明，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的意义相同的意义。尽管在本发明的实施或测试中可使用与本文所描述的方法及材料相类似或等价的任何方法及材料，但本文描述了优选的方法及材料。在描述实施方案并主张本发明时，应根据下文所述的定义使用某些术语。

除非上下文另外明确指出，否则单数形式英文词“a”、“an”及“the”还包括复数个指示物。因此，例如提及“Themethod”包括一或多种本文所述类型和/或在阅读本公开内容后本领域普通技术人员显而易见的方法及/或步骤。

除非另外指明，否则本文所用术语“不正常的细胞生长”是指独立于正常调节机制的细胞生长(例如，失去接触抑制)。

除非另外指明，否则本文所用术语“给药（adminisering）”是指其中患者藉由其自身努力摄取如本文所述的治疗剂的自身给药动作、其中患者经由其他的努力(例如，医生、护士、家庭成员或IV)摄取如本文所述的治疗剂的给药动作。给药还包括处方如本文所述的治疗剂的动作。除非另外指明，否则本文所用术语“给药（administration）”是指如上文刚刚定义的“给药（adminisering）”的处理动作。

本文所用“抗体”是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE，包括Fab或其抗原识别片段，包括嵌合抗体、多克隆抗体及单克隆抗体。本文所用术语“人源化抗体”是指这样的抗体分子，其中在非抗原结合区域中的氨基酸被替代以更接近地类似于人类抗体，同时仍保持初始的结合能力。

术语“生物试样”在本文中以其最宽泛的含义使用，且意指怀疑含有SLC34A2-ROS融合物、CD74-ROS融合物、FIG-ROS融合物或截短的ROS多核苷酸或多肽或其片段的任何生物试样，且可包括细胞、分离自细胞的染色体(例如，多个中期染色体)、基因组DNA(于溶液中或结合至固体载体以供(例如)DNA印迹分析(Southern analysis))、RNA(于溶液中或结合至固体载体以供(例如)RNA印迹分析(northernanalysis))、cDNA(于溶液中或结合至固体载体)、来自细胞、血液、尿、髓或组织的提取物等。

本文所用术语“缺失基因”是指自遗传事件产生的基因，藉此来自基因组中的同一染色体上的不同位置的两个基因经由两个基因之间的核苷酸的缺失(还称为“遗传缺失”)融合。缺失基因包括但不限于上述FIG-ROS基因。

本文所用术语“融合基因”是指自遗传事件产生的基因，藉此来自基因组中的不同位置的两个基因融合、易位或反转以产生新基因。融合基因的特定实例包括但不限于SLC34A2基因和ROS基因的融合以形成SLC34A2-ROS基因、及CD74基因和ROS基因的融合以形成CD74-ROS基因。

本文所用术语“遗传改变的ROS”是指本文所述ROS融合物或缺失中的任一者，不管基因组DNA、核苷酸、或蛋白质或多肽。术语“遗传改变的ROS多核苷酸”是指编码本文所述的遗传改变的ROS蛋白质中的任一者的多核苷酸。术语“遗传改变的ROS蛋白质”是指本文所述的融合、缺失、截短或突变中的任一者。本文所用术语“遗传改变的ROS蛋白质”可与“遗传改变的ROS多肽”互换使用。优选的遗传改变的ROS蛋白质包括“ROS融合物”。优选的ROS融合物包括但不限于SLC34A2-ROS融合蛋白及CD74-ROS融合蛋白。优选的遗传改变的ROS多肽包括SLC34A2-ROS融合多肽及CD74-ROS融合多肽。

本文所用的“ROS激酶”是指本文所述的含有ROS蛋白质的激酶部分的任何蛋白质。ROS激酶包括但不限于本文所述的遗传改变的ROS蛋白质及野生型ROS蛋白质。术语“遗传改变的ROS激酶”是指由遗传改变的ROS多核苷酸编码的蛋白质或多肽。

本文所用术语“ROS多肽特异性试剂”是指对本文所述的ROS激酶中的任一者具有特异性的任一试剂，例如抗体、AQUA肽、核酸探针、核酸引物等。举例而言，优选的“ROS多肽特异性试剂”是对本文所述的遗传改变的ROS激酶中的任一者具有特异性的抗体。更优选地，本文所用的“ROS多肽特异性试剂”是对SLC34A2-ROS融合多肽和/或CD74-ROS融合多肽和/或FIG-ROS融合多肽具有特异性的抗体。在所述“ROS多肽特异性试剂”是抗体时，所述试剂在本文中可称作“ROS多肽特异性抗体”。所述ROS多肽特异性抗体是例如“SLC34A2-ROS融合多肽抗体”、“SLC34A2-ROS融合蛋白抗体”或“FIG-ROS融合蛋白抗体”。

除非另外指明，否则本文所用术语“治疗(treating)”意指逆转、减轻、抑制此术语所应用的病症或病况的进展、或者所述病症或病况的一或多种症状。除非另外指明，否则本文所用术语“治疗(treatment)”是指如上文刚刚定义的“治疗(treating)”的处理动作。术语“治疗(treatment)”包括上述“给药(‘administering’或‘administration’)。

本文所用术语“药学上可接受的盐“包括酸加成盐及碱盐(base salt)(包括双盐(disalt))。

适宜的酸加成盐是由形成无毒盐的酸形成的。实例包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、羟苯酰苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、糖二酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐及三氟乙酸盐。

适宜的碱盐是由形成无毒盐的碱形成的。实例包括铝盐、精氨酸盐、苄星青霉素盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘油盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐及锌盐。

关于适宜的药学上可接受的盐，参见“Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”，Stahl及Wermuth(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)，其公开内容的全文通过援引加入本文。

本发明化合物的药学上可接受的盐可藉由将所述化合物和期望的酸或碱(若适当)的溶液混合在一起容易地制得。可将盐自溶液中沉淀出来并藉由过滤收集，或可藉由蒸发掉溶剂回收盐。盐的电离度可在完全电离至几乎无电离之间变化。

本发明的化合物既可以非溶剂化形式存在还可以溶剂化形式存在。术语“溶剂合物”在本文中用于描述包含本发明的化合物及一或多个药学上可接受的溶剂分子(例如，乙醇)的分子复合物。当溶剂为水时，使用术语“水合物”。本发明的药学上可接受的溶剂合物包括其中结晶溶剂可经同位素取代的水合物及溶剂合物，例如，D₂O、d₆-丙酮、d₆-DMSO。

本发明还包括同位素标记的化合物，除一或多个原子由原子质量或质量数不同于自然界中通常所发现的原子质量或质量数的原子代替外，其与所述式1的化合物相同。可纳入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟及氯的同位素，例如分别为²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F及³⁶Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明化合物及所述化合物的药学上可接受的盐在本发明的范围内。某些同位素标记的本发明化合物，例如纳入诸如³H及¹⁴C等放射性同位素的那些化合物，可用于药物和/或基质组织分布测定中。含氚(即³H)及碳-14(即¹⁴C)同位素因其易于制备及可检测性而是特别优选的。此外，用诸如氘(即²H)的较重同位素进行取代能够提供由更高的代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如，体内半衰期增加或剂量需要量减少，且因而在一些情况下可能是优选的。同位素标记的本发明式1的化合物通常可藉由实施针对未标记的化合物所述的方法、用易于获得的同位素标记的试剂替代非同位素标记的试剂来制得。

本发明的范围还包括复合物，例如包合物、药物-宿主包合复合物，其中与上述溶剂合物相反，药物及宿主是以化学计量或非化学计量量存在。本发明还包括含有两种或更多种有机及/或无机组份的药物复合物，所述组份可以是化学计量量或非化学计量的量。所得复合物可以是离子化的、部分离子化的或未离子化的。关于此类复合物的综述，参见J PharmSci,64(8),1269-1288，Haleblian(1975年8月)，其公开内容的全文通过援引加入本文。

诊断测试

本领域技术人员已知的多种测定模式可结合本发明用作诊断测试，以确定生物试样中的遗传改变的ROS的存在或不存在。在诊断测试所得的测试结果显示生物试样含有遗传改变的ROS时，将自其采集所述生物试样的患者视为ROS阳性。类似地，在诊断测试所得的测试结果显示生物试样(其中所述生物试样是癌症肿瘤活组织检查)含有遗传改变的ROS时，将所述癌症视为ROS阳性癌症。具体而言，在所述生物试样包含癌细胞的情况下，可以藉由使用本领域技术人员已知或如本文所述的技术检测遗传改变的ROS多核苷酸和/或多肽的存在，将所述癌症表征为含有遗传改变的ROS基因或遗传改变的ROS蛋白质，例如ROS融合基因或ROS融合蛋白。

免疫测定

用于本发明方法的实施中的免疫测定可为均相免疫测定或异相免疫测定。在均相测定中，免疫反应通常涉及突变体ROS多肽特异性试剂(例如，SLC34A2-ROS融合多肽特异性抗体、CD74-ROS融合多肽特异性抗体或FIG-ROS融合多肽特异性抗体)、经标记的分析物及感兴趣的生物试样。在抗体结合至经标记的分析物时，由标记产生的信号被直接或间接改变。免疫反应及其程度的检测均是在均相溶液中实施。可采用的免疫化学标记包括自由基、放射性同位素、荧光染料、酶、噬菌体、辅酶等。还可有利地采用半导体纳米晶体标记或“量子点”，其制备及使用已被充分阐述(通常参见K.Barovsky,Nanotech.Law&Bus.1(2):论文14(2004)及其中引用的专利)。

在异相测定途径中，试剂通常是生物试样、突变体ROS激酶多肽特异性试剂(例如，抗体)及适于产生可检测信号的手段(means)。可使用如下文进一步阐述的生物试样。通常将抗体固定于载体(例如珠粒、板或载玻片)上，且使其与怀疑含有抗原的液相形式的试样接触。随后将载体与液相分开且采用产生可检测信号的手段检测载体相或液相的可检测信号。信号与生物试样中分析物的存在相关。产生可检测信号的手段包括放射性标记、荧光标记、酶标记、量子点等的使用。举例而言，若欲检测的抗原含有第二结合位点，则在分离步骤之前，可将结合至该位点的抗体连接至可检测基团并添加至液相反应溶液中。可检测基团在固体载体上的存在指示测试试样中的抗原的存在。适宜的免疫测定的实例是放射性免疫测定、免疫荧光测定、酶联免疫测定等。

可用于实施本文公开的方法的免疫测定模式及其变化形式已为本领域所熟知(通常参见E.Maggio,Enzyme-Immunoassay,(1980)(CRC Press公司，Boca Raton,Fla.)；还参见例如美国专利第4,727,022号(Skold等人“Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions andtheir Application”)；美国专利第4,659,678号(Forrest等人，“Immunoassay of Antigens”)；美国专利第4,376,110号(David等人，“Immunometric Assays Using MonoclonalAntibodies”))。适于形成试剂-抗体复合物的条件已为本领域技术人员所熟知。可检测试剂的浓度应足够，以使SLC34A2-ROS融合多肽的结合与背景相比可检测。

用于本文所公开的方法的实施(例如，IHC、蛋白质印迹、免疫荧光及流式细胞术)中的抗体包括但不限于特异性结合至全长SLC34A2或CD74(例如，结合至所述蛋白质的N末端)或全长ROS(例如，结合ROS的激酶结构域中的表位)的抗体。此类抗体可自市场购得(例如，参见由Abcam,Inc.,Cambridge MA以产品ab5512销售的ROS特异性多克隆抗体)。若所用抗体特异性结合至全长ROS或全长SLC34A2(例如在蛋白质印迹分析中或藉由流式细胞术)，则可对相同试样采用另一方法以检测本发明突变体ROS多肽或多核苷酸(例如，SLC34A2-ROS多肽或多核苷酸)的存在。举例而言，可利用Abcam's ab5512抗体实施关于渗透化细胞的流式细胞术，之后使细胞裂解并使用对编码SLC34A2或CD74的cDNA的5'端具有特异性(即，与其杂交)的PCR引物(例如，正向引物)及对编码ROS的cDNA的3'端的补体具有特异性(即，与其杂交)的PCR引物(例如，反向引物)进行遗传物质(例如，mRNA或基因组DNA)的PCR分析。

用于本发明方法中的所有抗体皆可根据已知技术(例如沉淀)连接至适于诊断测定的固体载体(例如，由诸如乳胶或聚苯乙烯的材料形成的珠粒、板、载玻片或孔)。抗体或其它ROS多肽特异性试剂同样可根据已知技术连接至可检测基团，例如放射标记(例如，35S、1251、1311)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)及荧光标记(例如，荧光素)。

基于细胞的测定(例如流式细胞术(FC)、免疫组织化学(IHC)或免疫荧光(IF))在实施本发明的方法中尤其合意，这是因为此类测定模式是临床上适宜的，允许体内检测遗传改变的ROS蛋白质表达，并避免因操作得自例如肿瘤试样的细胞以获得提取物而导致的人为改变活性的风险。因此，在一些优选的实施方案中，本发明的方法是以流式细胞术(FC)、免疫组织化学(IHC)或免疫荧光(IF)测定模式实施的。

可在用靶向抑制ROS激酶活性的药物治疗之前、期间及之后，采用流式细胞术(FC)测定哺乳动物肿瘤中的遗传改变的ROS蛋白质的表达。举例而言，若需要时，可针对SLC34A2-ROS融合多肽表达或CD74-ROS融合多肽表达和/或激活、以及针对鉴别癌细胞类型的标记等，藉由流式细胞术分析来自穿刺针抽出物的肿瘤细胞。可根据标准方法实施流式细胞术。例如，参见Chow等人，Cytometry(Communications in Clinical Cytometry)46:72-78(2001)。简言之且举例而言，可采用以下细胞分析方案：于37℃下，用2%多聚甲醛固定细胞10分钟，之后在冰上，于90%甲醇中透化处理30分钟。随后可将细胞用一级ROS多肽特异性抗体染色，洗涤并用荧光标记的二级抗体标记。随后可根据所用仪器的特定方案，利用流式细胞仪(例如，Beckman CoulterFC500)分析细胞。此类分析可鉴定肿瘤中表达的SLC34A2-ROS融合多肽或CD74-ROS融合多肽的水平。用ROS抑制治疗剂治疗肿瘤后的类似分析显示表达SLC34A2-ROS融合多肽的肿瘤或表达CD74-ROS融合多肽的肿瘤对ROS激酶的靶向抑制剂的反应性。

还可在用靶向抑制ROS激酶活性的药物治疗之前、期间及之后，采用免疫组织化学(IHC)染色法测定哺乳动物癌症(例如NSCLC)中遗传改变的ROS蛋白质的表达和/或激活状态。可根据公知技术实施IHC。(例如，参见ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL，第10章，Harlow及Lane编辑，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。简言之且举例而言，藉由以下方式制备石蜡包埋组织(例如，来自活组织检查的肿瘤组织)用于免疫组织化学染色：用二甲苯然后用乙醇脱除组织切片的石蜡；在水中然后在PBS中水合；通过在柠檬酸钠缓冲液中加热载玻片，使抗原解除掩蔽；在过氧化氢中孵育切片；在封闭溶液中封闭；在一级抗SLC34A2-ROS融合多肽抗体或抗CD74-ROS融合多肽抗体及二级抗体中孵育载玻片；且最后使用ABC抗生物素蛋白/生物素方法根据制造商的说明书检测。还可采用免疫荧光(IF)测定以测定在用靶向抑制ROS激酶活性的药物治疗之前、期间及之后哺乳动物癌症中SLC34A2-ROS融合多肽或CD74-ROS融合多肽的表达和/或激活状态。可根据公知技术实施IF。例如，参见J.M.Polak及S.Van Noorden(1997)INTRODUCTION TOIMMUNOCYTOCHEMISTRY，第2版；ROYAL MICROSCOPYSOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK37,BioScientific/Springer-Verlag。简言之且举例而言，可将患者试样在多聚甲醛中然后在甲醇中固定，用封闭溶液(例如马血清)封闭，与抗SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或FIG-ROS融合多肽的一级抗体一起孵育，之后与经荧光染料(例如Alexa488)标记的二级抗体一起孵育，并用落射荧光显微镜分析。

用于上述测定中的抗体可有利地连接至荧光染料(例如，Alexa488、PE)或用于多参数分析的其它标记(例如量子点)、以及其它信号转导(EGFR、磷酸化-AKT、磷酸化-Erk1/2)和/或细胞标记(细胞角蛋白)抗体。用于测量遗传改变的ROS多肽的多种其它方案(包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)及荧光活化细胞分选(FACS))已为本领域所知且提供用于诊断SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或FIG-ROS融合多肽表达水平的改变或异常的基础。藉由在适于复合物形成的条件下组合取自正常哺乳动物个体(优选人类)的体液或细胞提取物与SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或FIG-ROS融合多肽的抗体，来确立SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或FIG-ROS融合多肽表达的正常或标准值。可藉由各种方法，但优选藉由光度测定方式对标准复合物形成的量进行定量。将来自活组织检查的组织的个体、对照及疾病试样中表达的SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或FIG-ROS融合多肽的量与标准值进行比较。标准与个体值之间的偏差确立用于诊断疾病的参数。

肽及核苷酸测定

类似地，可制备用于检测/定量包含来自肿瘤的细胞的生物试样中表达的遗传改变的ROS多肽的AQUA肽并用于标准AQUA测定中，如上文部分E中所详细描述的。因此，在本发明方法的一些优选实施方案中，ROS多肽特异性试剂包含对应于包含SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或FIG-ROS融合多肽的融合结点(fusion junction)的肽序列的重同位素标记的磷酸肽(AQUA肽)。用于实施本发明方法的ROS多肽特异性试剂还可为可直接杂交和检测生物试样中的融合多肽或截短多肽表达转录物的mRNA、寡核苷酸或DNA探针。

简言之且举例而言，可用荧光素标记的RNA探针探测福尔马林固定、石蜡包埋的患者试样，之后用甲酰胺、SSC及PBS洗涤并用荧光显微镜分析。编码遗传改变的ROS多肽的多核苷酸还可用于诊断目的。可使用的多核苷酸包括寡核苷酸序列、反义RNA及DNA分子及PNA。所述多核苷酸可用于检测和定量活组织检查的组织中的基因表达，其中SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或缺失ROS多肽的表达可能与疾病相关。该诊断测定可用于区分SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或缺失ROS多肽的不存在、存在及过度表达，并监测在治疗性干预期间SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或缺失ROS多肽量的调节。在一个优选实施方案中，与能够检测多核苷酸序列(包括编码SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或FIG-ROS融合多肽的基因组序列或紧密相关的分子)的PCR探针的杂交可用于鉴别编码遗传改变的ROS多肽的核酸序列。此类探针的构建及使用已为本领域技术人员所知且描述于美国专利公开US2010/0221737中。

探针的特异性(不管其是来自高特异性区域(例如，融合结点中的独特核苷酸)或较低特异性区域(例如，3'编码区域))及杂交或扩增的严格度(最大、高、中间或低)会决定所述探针是否仅鉴别编码遗传改变的ROS多肽的天然存在序列、等位基因或相关序列。探针还可用于检测相关序列，且优选应含有至少50%来自编码遗传改变的ROS多肽的序列中的任一者的核苷酸。

SLC34A2-ROS融合多核苷酸、CD74-ROS融合多核苷酸或缺失ROS多核苷酸可用于DNA印迹或RNA印迹分析、斑点印迹或其它基于膜的技术中；用于PCR技术中；或用于利用来自患者活组织检查的流体或组织的检验试条(dip stick)、针、ELISA或芯片测定中，以检测遗传改变的ROS多肽表达。此类定性或定量方法已为本领域所公知。在特定方面，编码遗传改变的ROS多肽的核苷酸序列可用于检测各种癌症(包括肺癌，包括NSCLC)的活化或诱发的测定中。可藉由标准方法标记遗传改变的ROS多核苷酸并在适于形成杂交复合物的条件下将其添加至患者的液体或组织试样中。在适宜的孵育阶段后，洗涤试样并将信号定量并与标准值进行比较。若活组织检查或提取的试样中的信号的量自相当的对照试样的信号量显著改变，则核苷酸序列已与试样中的核苷酸序列杂交，且试样中编码SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或缺失ROS多肽的核苷酸序列的水平改变的存在指示存在相关疾病。此类测定还可用于评价特定治疗性治疗方案在动物研究、临床试验、或监测个别患者的治疗中的功效。

为提供诊断特征在于表达遗传改变的ROS多肽的疾病的基础，确立表达的正常或标准曲线。这可藉由以下方式完成：在适于杂交或扩增的条件下组合取自正常个体(动物或人类)的体液或细胞提取物和编码SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或缺失ROS多肽(例如，FIG-ROS融合多肽)的序列或其片段。可藉由比较由正常个体获得的值与来自实验的值对标准杂交进行定量，其中使用已知量的实质上纯化的多核苷酸。可比较由正常试样获得的标准值与由来自具有疾病症状的患者的试样获得的值。使用标准值与个体值之间的偏差确立疾病的存在。

一旦确立疾病且开始治疗方案，则可定期重复杂交测定以评价患者中的表达水平是否开始接近正常患者中所观察到的水平。由连续测定获得的结果可用于显示经几天至数月范围内的时段的治疗的功效。

遗传改变的ROS多核苷酸的其它诊断用途可涉及聚合酶链反应(PCR)(为本领域技术人员的标准的另一优选分析模式)的使用。(例如，参见MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL，第2版，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。PCR寡聚物可以化学方式合成、以酶方式生成或由重组来源产生。寡聚物优选由两种核苷酸序列组成，一者具有正义定向(5'至3')且另一者具有反义定向(3'至5')，其在最佳化的条件下用于鉴别特定基因或病况。可在较不严格的条件下采用相同的两个寡聚物、寡聚物的嵌套组(nested sets)或甚至寡聚物的简并库(degeneratepool)以检测和/或定量紧密相关的DNA或RNA序列。

还可用于定量SLC34A2-ROS融合多肽、CD74-ROS融合多肽或缺失ROS多肽的表达的方法包括放射标记或生物素化核苷酸、对照核酸的共扩增及其上插入实验结果的标准曲线(Melby等人，J.Immunol.Methods,159:235-244(1993)；Duplaa等人，Anal.Biochem.229-236(1993))。可藉由以ELISA模式进行测定加速多个试样的定量速度，其中感兴趣的寡聚物提供于各种稀释物中且分光光度或比色反应产生快速定量。

遗传改变的ROS多核苷酸可用于产生杂交探针，其用于定位(mapping)天然存在的基因组序列。可使用公知技术将序列定位至特定染色体或染色体的特定区域。此类技术包括荧光原位杂交(FISH)、FACS、或人工染色体构建，例如酵母人工染色体、细菌人工染色体、细菌P1构建体或单一染色体cDNA文库，如参见Price,C.M.,Blood Rev.7:127-134(1993)及Trask,B.J.,Trends Genet.7:149-154(1991)。在一个非限制性实施方案中，采用FISH(如Verma等人HUMANCHROMOSOMS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES,Pergamon Press,New York,N.Y.(1988)中所述)且可与其它物理染色体定位技术及遗传图谱数据关联。遗传图谱数据的实例可参见1994Genome Issue of Science(265:1981f)。编码SLC34A2-ROS融合多核苷酸、CD74-ROS融合多核苷酸或缺失ROS多核苷酸的基因在物理染色体图谱上的位置与特定疾病或特定疾病的易感性之间的相关性可有助于限定与该遗传性疾病相关的DNA的区域。核苷酸序列可用于检测正常、携带或受累个体之间的基因序列的差异。

染色体制品的原位杂交及物理定位技术(例如使用确定的染色体标记的连接分析)可用于延伸遗传图谱。即使特定人类染色体的数量或臂是未知的，另一哺乳动物物种(例如小鼠)的染色体上的基因的放置经常还可揭示相关标记。可藉由物理定位将新序列分配至染色体臂或其部分。这为使用定位克隆或其它基因发现技术寻找疾病基因的研究者提供有价值的信息。

应理解，可组合检测遗传改变的ROS多核苷酸的所有方法(例如，PCR及FISH)和检测遗传改变的ROS多核苷酸或遗传改变的ROS多肽的其它方法。举例而言，可检测生物试样的遗传物质中的SLC34A2-ROS多核苷酸(例如，在循环肿瘤细胞中)，之后对试样的蛋白质进行蛋白印迹分析或免疫组织化学(IHC)分析以确定SLC34A2-ROS多核苷酸是否实际上表达为生物试样中的SLC34A2-ROS多肽。可使用特异性结合至由所检测的SLC34A2-ROS多核苷酸编码的多肽的抗体实施此类蛋白印迹或IHC分析，或可使用特异性结合至全长SLC34A2(例如，结合至该蛋白质的N末端)或全长ROS(例如，结合ROS的激酶结构域中的表位)的抗体实施所述分析。本领域已知此类测定(例如，参见美国专利7,468,252)。

ROS激酶治疗剂

已表明，遗传改变的ROS多肽出现在人类NSCLC的至少一个亚群中(参见Rikova等人，Cell131:1190-1203(2007))。因此，可藉由抑制ROS激酶在此类癌症中的活性或藉由抑制ROS激酶在此类癌症中的表达，体内抑制哺乳动物癌症(例如NSCLC)的进展，在所述癌症中表达至少一种ROS融合蛋白(例如，SLC34A2-ROS融合蛋白)。特征在于突变体ROS激酶的表达的癌症中的ROS活性可藉由使所述癌症(例如肿瘤)与ROS激酶治疗剂接触来抑制。

ROS激酶治疗剂可为包含至少一种生物或化学化合物的任何组合物，所述化合物体内直接或间接抑制ROS激酶的表达和/或活性，包括下述的ROS激酶抑制剂化合物。此类化合物包括这样的治疗剂，其直接作用于ROS激酶自身或作用于改变ROS的活性的蛋白质或分子，或藉由抑制ROS的表达间接起作用。此类组合物还包括仅包含单一ROS激酶抑制化合物的组合物，以及包含多种治疗剂(包括抗其它RTK的治疗剂)的组合物，其还可包括非特异性治疗剂，如化学治疗剂或一般转录抑制剂。

小分子ROS激酶抑制剂

用于实施本发明方法的ROS激酶治疗剂是小分子ROS激酶抑制剂。小分子激酶抑制剂是一类通常藉由以下方式抑制其靶标酶的活性的分子：特异性且经常不可逆地结合至所述酶的催化位点，和/或结合至所述酶中的防止所述酶采用其活性必需的构象的ATP结合裂隙或另一结合位点。小分子ROS激酶抑制剂可使用ROS激酶三维结构的X射线结晶学或计算机建模来合理设计，或可藉由用于抑制ROS的化合物文库的高通量筛选来发现。此类方法已为本领域所公知且已加以描述。可例如藉由检验此类化合物抑制一组激酶中的ROS活性而非其它激酶活性的能力和/或藉由检验包含肿瘤细胞的生物试样中的ROS活性的抑制，确认ROS抑制的特异性，所述肿瘤细胞已知表达ROS融合蛋白或被改变以表达ROS融合蛋白。

本文中证明可用作ROS激酶治疗剂的小分子ROS抑制剂的实例包括美国专利第7230098号、美国专利第7,858,643号及WO2006/021881（各自的所有公开内容全部通过援引加入本文）中所揭示类型的氨基吡啶及氨基吡嗪化合物。具体而言，对于本发明用作ROS激酶治疗剂的氨基吡啶及氨基吡嗪化合物包括具有以下通式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中Y、R¹、R²及A¹具有如美国专利第7,230,098号中描述的一般含义。更具体而言，对于本发明用作ROS激酶治疗剂的氨基吡啶及氨基吡嗪化合物包括具有以下通式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中Y、R¹及R²具有如美国专利第7,858,643号中描述的一般含义。已表明上述类型的氨基吡啶及氨基吡嗪化合物为ROS激酶抑制剂且因此对于本发明用作ROS激酶治疗剂。具体而言，若显示癌症对遗传改变的ROS激酶(例如，SLC34A2-ROS、CD74-ROS或FIG-ROS)呈阳性，则可向需要癌症治疗的患者给药此类化合物。

一种特别优选的化合物是化合物3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺(克里唑蒂尼)，其由式1表示：

其制备描述于美国专利第7,858,643号中。(还参见McDermott,U.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.104,19936-19941(2007))。式1的化合物公开于国际专利公开WO2006/021884及美国专利申请第2006/0046991号（各自的内容全部通过援引加入本文）。另外，式1的化合物的外消旋物公开于国际专利公开WO2006/021881及美国专利申请第2006/0128724号（各自的内容全部通过援引加入本文）。

最初设计为c-Met/HGFR抑制剂的克里唑蒂尼在本文中已证明具有抗ROS激酶的活性，且因此具有抗本文所述的ROS融合蛋白及ROS缺失蛋白质的活性。在基于酶及细胞的测定中评价了克里唑蒂尼对ROS催化活性的效力。本文提供的数据证明克里唑蒂尼是重组人类ROS-1激酶(催化结构域)的有效ATP竞争性抑制剂。

下文所述的ROS-1酶测定提供0.097nM的平均Ki值(n=4)。克里唑蒂尼剂量依赖性地抑制HCC78细胞中的ROS磷酸化，所述细胞呈现导致组成型激活SLC34A2-ROS融合蛋白的表达的4p15、6q22染色体易位事件(Rikova等人(2007))，平均IC₅₀值为41nM(n=11)(表1，图1)。克里唑蒂尼还剂量依赖性地抑制具有FIG-ROS融合物的U138MG人类胶质母细胞瘤细胞中的ROS磷酸化(Charest等人(2003))，平均IC₅₀值为49nM(n=2)(表1，图1)。

在经改造以表达各种ROS-融合蛋白(包括CD74-ROS、FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)、SLC34A2-ROS(S)及SLC34A2-ROS(L))的一组3T3细胞系中，克里唑蒂尼抑制ROS磷酸化，IC₅₀值为3.4nM至36nM(表1)。

还评价了克里唑蒂尼对HCC78的细胞生存力的效力，所述HCC78呈现导致组成型激活SLC34A2-ROS融合蛋白的表达的4p15、6q22染色体易位事件(Rikova等人(2007))。克里唑蒂尼显示对HCC78细胞生存力的浓度依赖性抑制(图2)。针对HCC78细胞生存力的抑制计算的IC₅₀值是约59nM。这些结果表明HCC78细胞的细胞生长及存活依赖于ROS融合且克里唑蒂尼是ROS依赖性细胞生长及存活的有效抑制剂。

在分子水平上，组成型激活的ROS融合激酶在调节RTK催化活性及停靠调节性底物的细胞内区域中诱导多个酪氨酸残基的磷酸化。评价了克里唑蒂尼抑制HCC78人类NSCLC细胞中的SLC34A2-ROS依赖性信号传导途径的能力，以进一步理解抗肿瘤作用机制并确认ROS激酶活性的抑制与下游信号转导相关。克里唑蒂尼剂量依赖性地体外抑制HCC78细胞中的ROS磷酸化(激活环)、以及下游衔接头或信号传导分子(包括SHP2、STAT3、AKT及ERK1/2)(图3)。这些结果表明关键信号传导途径与克里唑蒂尼的有效剂量之间具有相关性。

进一步评价了克里唑蒂尼诱导HCC78人类NSCLC细胞中的细胞凋亡的能力。克里唑蒂尼显示剂量依赖性地诱导HCC78NSCLC细胞中的激活的半胱天冬酶-3的水平(图4)，表明增加的细胞凋亡也与有效剂量的水平相关。

在一组ROS融合物改造的肿瘤异种移植物模型中评价了克里唑蒂尼的抗肿瘤功效。在NIH3T3细胞中改造了代表人类癌症适应症的肿瘤异种移植物，所述适应症与ROS染色体易位(包括CD74-ROS、在人类NSCLC中鉴别的SLC34A2-ROS的长变体及短变体、及在人类NSCLC、胶质母细胞瘤及胆管上皮癌中鉴别的Fig-ROS的长变体及短变体)相关(Rimkunas等人(2012)；Gu等人(2011))。克里唑蒂尼以75/mg PO BID的给药方案，在所有3T3-ROS改造肿瘤模型中显示显著的细胞减少效力(图5)。

在裸鼠中的3T3-CD74-ROS及3T3-SLC34A2-ROS(L)异种移植物模型中评价了克里唑蒂尼体内抑制ROS磷酸化及肿瘤生长的能力。克里唑蒂尼在160mg/kg/天(80mg/kgBID)、80mg/kg/天(40mg/kg BID)、40mg/kg/天(20mg/kg BID)及20mg/kg/天(10mg/kg BID)的剂量下，在3T3-CD74-Ros肿瘤异种移植物中显示肿瘤生长的剂量依赖性抑制(图6B)。克里唑蒂尼在所有治疗群组中还显示3T3-CD74-Ros肿瘤中的ROS磷酸化的显著抑制(图6A)。在3T3-SLC34A2-ROS(L)异种移植物模型中观察到克里唑蒂尼的类似抗肿瘤功效(图7)。

给药途径及剂型

口服给药

本发明化合物可口服给药。口服给药可涉及吞咽以便化合物进入胃肠道，或可采用含服(buccal)或舌下给药，藉此化合物直接自口腔进入血流。

适于口服给药的制剂包括固体制剂，例如片剂；含有颗粒、液体、或粉末的胶囊剂；锭剂(包括液体填充的)；咀嚼剂；多颗粒剂及纳米颗粒剂；凝胶；固体溶液；脂质体；膜剂(包括粘膜粘着剂)；阴道锭(ovule)；喷雾剂及液体制剂。

液体制剂包括混悬剂、溶液、糖浆剂及酏剂。此类制剂可用作软胶囊或硬胶囊内的填充物且通常包含药学上可接受的载体(例如，水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、或适宜的油)及一或多种乳化剂和/或助悬剂。液体制剂还可藉由固体的复溶(reconstitution)来制得，例如由小药囊(sachet)复溶来制得。

本发明化合物还可用于快速溶解、快速崩解的剂型中，例如阐述于Liang及Chen的Expert Opinion in TherapeuticPatents，11(6)，981-986(2001)中的那些，其公开内容的全文通过援引加入本文。

对于片剂剂型，取决于剂量，药物可占所述剂型的1wt%至80wt%，更通常占所述剂型的5wt%至60wt%。除药物外，片剂通常含有崩解剂。崩解剂的实例包括羟基乙酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮(crospovidone)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉及藻酸钠。一般而言，崩解剂会占所述剂型的1wt%至25wt%、优选5wt%至20wt%。

粘合剂通常用以赋予片剂制剂粘着特性。适宜的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然及合成树胶、聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、羟丙基纤维素及羟丙基甲基纤维素。片剂还可含有稀释剂，例如乳糖(一水合物、经喷雾干燥的一水合物、无水物等)、甘露醇、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、微晶纤维素、淀粉及二水合磷酸氢钙。

片剂还可任选地包含表面活性剂(例如月桂基硫酸钠及聚山梨酯80)及助流剂(例如二氧化硅及滑石粉)。若存在，则表面活性剂的量通常占片剂的0.2wt%至5wt%，助流剂通常占片剂的0.2wt%至1wt%。

片剂通常还含有润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰富马酸钠，以及硬脂酸镁与月桂基硫酸钠的混合物。润滑剂通常是以占片剂0.25wt%至10wt%、优选0.5wt%至3wt%的量存在。

其它常规成份包括抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂及遮味剂。

例示性的片剂含有多达约80wt%的药物、约10wt%至约90wt%的粘合剂、约0wt%至约85wt%的稀释剂、约2wt%至约10wt%的崩解剂及约0.25wt%至约10wt%的润滑剂。

片剂掺合物可直接或藉由辊压制来形成片剂。或者，片剂掺合物或掺合物的部分可在压片前经湿法、干法或熔融粒化、熔融凝结或挤出。最终制剂可包含一或多个层且可以是包衣或未包衣的；或被包囊。

片剂制剂详细论述于H.Lieberman及L.Lachman的“Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets，第1卷”，MarcelDekker,N.Y.,N.Y.,1980(ISBN0-8247-6918-X)中，其公开内容的全文通过援引加入本文。

用于口服给药的固体制剂可配制成速释和/或调节释放（modified release）。调节释放制剂包括延时释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放及程序性释放。

适宜的调节释放制剂描述于美国专利第6,106,864号中。其它适宜的释放技术(例如高能分散体及渗透性及包衣粒子)的详细内容可参见Verma等人，Pharmaceutical TechnologyOn-line,25(2),1-14(2001)。使用口香糖以实现控制释放描述于WO00/35298中。这些参考文献的公开内容的全文通过援引加入本文。

肠胃外给药

本发明化合物还可直接给药至血流、肌肉、或内部器官中。适于肠胃外给药的方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内及皮下给药。适于肠胃外给药的装置包括针式(包括微型针)注射器、无针式注射器及输注技术。

肠胃外制剂通常是水溶液，其可含有赋形剂(例如盐、碳水化合物)及缓冲剂(优选3-9的pH)，但对于某些应用，可能更适合将其配制为无菌非水性溶液或与适宜的媒剂(例如无菌、无致热源的水)组合使用的干燥形式。

肠胃外制剂在无菌条件下的制备(例如藉由冻干)可容易地使用本领域技术人员所公知的标准医药技术实现。

用于制备肠胃外溶液的本发明化合物的溶解性可藉助使用适当的制剂技术(例如加入增溶剂)来增强。

肠胃外给药的制剂可被配制成速释和/或调节释放。调节释放制剂包括延时释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放及程序性释放。因此，可将本发明的化合物配制成固体、半固体、或触变液体，用于以植入的贮库形式给药，提供活性化合物的调节释放。此类制剂的实例包括药物涂布的支架及PGLA微球。

局部给药

本发明化合物还可局部给药至皮肤或粘膜，即皮肤给药或透皮给药。用于此目的的典型制剂包括凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏、软膏、扑粉剂、敷料、泡沫剂、膜剂、皮肤贴片、薄片、植入物、海绵、纤维、绷带及微乳剂。还可使用脂质体。典型载体包括醇、水、矿物油、液体凡士林、白凡士林、甘油、聚乙二醇及丙二醇。可加入渗透增强剂；参见例如J Pharm Sci，88(10)，955-958，Finnin及Morgan，(1999年10月)。其它局部给药方式包括藉由电穿孔、电离子透入法、超声透入法、超声促渗法及微型针或无针(例如，Powderject^TM、Bioject^TM等)注射的递送。这些参考文献的公开内容的全文通过援引加入本文。

局部给药的制剂可被配制成速释和/或调节释放。调节释放制剂包括延时释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放及程序性释放。

吸入/鼻内给药

本发明化合物还可经鼻内给药或藉由吸入给药，通常以下列形式：来自干粉吸入器的干粉(单独地、作为混合物(例如，与乳糖的干燥掺合物)、或作为混合组份粒子(例如，与诸如磷脂酰胆碱的磷脂混合))或作为来自加压容器、泵、喷射器、雾化器(优选使用电流体动力学以生成细雾的雾化器)或喷雾器的气溶胶喷雾(使用或不使用适宜的抛射剂，例如1,1,1,2-四氟乙烷或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)。对于鼻内使用，所述粉末可包含生物粘着剂，例如脱乙酰壳多糖或环糊精。

所述加压容器、泵、喷射器、雾化器或喷雾器含有本发明化合物的溶液或悬浮液，其包含例如乙醇、乙醇水溶液、或适于活性物质的分散、增溶或延长释放的替代剂、作为溶剂的抛射剂及任选存在的表面活性剂(例如失水山梨醇三油酸酯、油酸、或寡聚乳酸)。

在以干粉或悬浮液制剂形式使用之前，将药品微粉化至适于藉由吸入递送的大小(通常小于5微米)。这可藉由任何适当粉碎方法(例如螺旋喷射研磨、流化床喷射研磨、用以形成纳米粒子的超临界流体处理、高压均化或喷雾干燥）实现。

用于吸入器或吹药器中的胶囊(例如，由明胶或HPMC制得)、泡罩及药筒可被配制为含有本发明的化合物、适宜的粉末基质(例如乳糖或淀粉)及性能改良剂(例如l-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁)的粉末混合物。乳糖可为无水的或一水合物的形式，优选后者。其它适宜的赋形剂包括葡聚糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖及海藻糖。

适用于使用电流体动力学以产生细雾的雾化器中的溶液制剂每次喷射可含有1μg至20mg本发明化合物，且喷射体积可从1μL至100μL不等。典型制剂包含本发明的化合物、丙二醇、无菌水、乙醇及氯化钠。可用于代替丙二醇的替代性溶剂包括甘油及聚乙二醇。

可将适宜的调味剂(例如薄荷醇及左薄荷醇)或甜味剂(例如糖精或糖精钠)添加至欲以吸入/鼻内给药的本发明制剂中。

可使用例如聚(DL-乳酸-共聚羟基乙酸)(PGLA)将吸入/鼻内给药的制剂配制成速释和/或调节释放。调节释放制剂包括延时释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放及程序性释放。

在使用干粉吸入剂及气溶胶的情形下，藉助可递送计量量的阀来确定剂量单位。本发明的单位通常被设计为给药含有期望量的本发明化合物的计量剂量或“喷(puff)”。总日剂量可以单个剂量给药或更通常以分开的剂量全天给药。

直肠/阴道内给药

本发明化合物可经直肠或阴道(例如以栓剂、阴道栓、或灌肠剂的形式)给药。可可脂是传统的栓剂基质，但视需要可使用多种替代物。

用于直肠/阴道给药的制剂可被配制成速释和/或调节释放。调节释放制剂包括延时释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放及程序性释放。

眼部给药

本发明化合物还可直接给药至眼或耳，通常以在等渗且经pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液或溶液的液滴的形式给药。适于眼部及耳部给药的其它制剂包括软膏、可生物降解(例如可吸收的凝胶海绵、胶原)及不可生物降解(例如聚硅氧)的植入物、糯米纸囊剂(wafer)、镜片及微粒或囊状系统(例如类脂质体(niosome)或脂质体)。可将诸如交联聚丙烯酸、聚乙烯醇、透明质酸、纤维素聚合物(例如，羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素)或杂多糖聚合物(例如，琼脂糖胶)的聚合物与防腐剂(例如，苯扎氯铵)一起掺入。此类制剂还可藉由电离子透入法递送。

用于眼部/耳部给药的制剂可被配制成速释和/或调节释放。调节释放制剂包括延时释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放或程序性释放。

其它技术

本发明化合物可与可溶性大分子实体(例如，环糊精及其适宜衍生物或含有聚乙二醇的聚合物)组合使用，以改良其在以任一上述给药方式使用时的溶解性、溶出速率、遮味、生物利用度和/或稳定性。

已发现药物-环糊精复合物(举例而言)可广泛用于大多数剂型及给药路径。包合复合物及非包合复合物皆可使用。作为与药物直接复合的替代形式，环糊精可用作辅助添加剂，即作为载体、稀释剂或增溶剂。最经常用于此类目的的是α-、β-、及γ-环糊精，其实例可参见PCT公开第WO91/11172号、第WO94/02518号及第WO98/55148号，其公开内容的全文通过援引加入本文中。

剂量

所给药的活性化合物的量可依赖于所治疗个体、病症或病况的严重程度、给药速率、化合物的沉积及处方医师的决定。然而，有效剂量通常为约0.001至约100mg/kg体重/天、优选约0.01至35mg/kg/天，其以单个剂量或分开剂量给药。对于70kg的人类而言，这可总计为约0.07至约7000mg/天、优选约0.7至约2500mg/天。在一些情况中，低于上述范围下限的剂量水平可能更合适，而在其它情形下可使用更高剂量而不会造成任何有害副作用，其中此类更高剂量通常分成几个较小剂量用以全天给药。

药盒

由于例如出于治疗特定疾病或病况的目的可能期望给药活性化合物的组合，所以本发明的范围涵盖：两种或更多种药物组合物(其中至少一者含有本发明的化合物)可方便地组合成适于共同给药所述组合物的药盒形式。因此，本发明的药盒包含两种或更多种分开的药物组合物(其中至少一者含有本发明化合物)及用于单独保存所述组合物的装置(例如容器、分开的瓶、或分开的箔包装)。此类药盒的实例是用于包装片剂、胶囊等的常见泡罩包装。

本发明的药盒尤其适于给药不同剂型(例如，口服及肠胃外剂型)、以不同剂量间隔给药单独的组合物、或相互滴定单独的组合物。为有助于顺应性，所述药盒通常包含用于给药的指示或说明，并可能提供有记忆辅助。此类指示或说明可呈“标记”或文本形式。其它此类指示或说明可含有关于诊断测试以确定癌症是否为ROS阳性或患者是否为ROS阳性的信息。

实施例

体外测定

材料及方法

体外方法

ROS-1酶测定

使用微流迁移位移测定测量ROS-1酶的抑制。在96孔板中的50μL体积中实施反应，且该反应含有0.25nM重组人类ROS-1催化结构域(aa1883-2347)、GST标记(Invitrogen公司)、1.5μM磷光体-受体肽、5'FAM-KKSRGDYMTMQIG-CONH₂(Caliper LifeSciences)、测试化合物(11个剂量的3倍连续稀释物，最终2%DMSO)或仅DMSO、1mM DTT、0.002%Tween-20及在25mM Hepes,pH7.1中的5mM MgCl₂，且在20min预孵育后藉由添加ATP(56μM最终浓度，约Km水平)开始反应。将反应物于室温下孵育1小时，随后藉由添加0.1M EDTA(pH8)终止。在电泳分离荧光标记的肽底物及磷酸化产物后在LabChip EZReader II(Caliper LifeSciences)上测定反应完成的程度(在DMSO情况下约5%转化)。藉由使用非线性回归方法(GraphPad Prism,GraphPad软件，San Diego,CA)将转化%拟合成竞争抑制的方程，来计算每一试验的Ki值，且实验测量的ATP K_m=56μM。一组四个试验产生0.097nM的平均Ki值。

细胞系

HCC78细胞是由患有定型为非小细胞肺癌的肺腺癌的65岁男性的胸腔积液建立的人类非小细胞肺癌细胞系。HCC78细胞购自DSMZ细胞库(Braunschweig,Germany)。U138细胞及NIH3T3细胞购自American Tissue CultureCorporation TCC。

NIH3T3-ROS融合细胞系生成

NIH3T3ROS融合物改造的细胞系是内部生成的。将ROS融合变体SLC34A2-ROS(L)、SLC34A2-ROS(S)、CD74-ROS(L)、FIG-ROS(L)及FIG-ROS(S)克隆至逆转录病毒载体pMSCV puro(Clontech)中。在293T细胞中藉由与pMSCV载体共转染并包装质粒pC10A1产生携带EML4-ALK基因的逆转录病毒。使用逆转录病毒上清液转导NIH3T3细胞且利用2μg/ml嘌呤霉素选择汇集群体达5天并在用于后续实验之前藉由DNA测序验证。

细胞激酶磷酸化测定

使用多种血清饥饿细胞实施用于直接测定克里唑蒂尼抑制配体依赖性或组成型激酶磷酸化的能力的细胞测定(即，ELISA或免疫印迹法)。

基于细胞的磷酸化-ROS ELISA测定

使用一组具有各种ROS融合物的细胞系测定克里唑蒂尼对ROS磷酸化的效力。将细胞以20,000细胞/孔的密度接种于96孔板中的100μl生长培养基中。使用ROS融合物阴性细胞孔作为背景。使接种细胞粘附过夜。次日，移除生长培养基并使细胞在无血清的培养基(具有0.04%BSA)中培养。实施克里唑蒂尼的连续稀释，向每一孔中添加适当对照或指定浓度的克里唑蒂尼，并于37℃下将细胞培养1小时。生成细胞溶胞产物并如制造商的方案中所述藉由使用

Phospho-Ros(panTyr)Sandwich ELISA Kit(Cell Signaling，目录号：7093)测定HCC78细胞中的SLC34A2-ROS的总磷酸化-酪氨酸水平。利用四参数分析方法藉由浓度反应曲线拟合计算EC₅₀值。

针对SLC34A2-ROS的基于细胞的磷酸化-ROS ELISA测定

使用具有SLC34A2-ROS融合物的HCC78细胞测定克里唑蒂尼对ROS磷酸化的效力。将HCC78细胞以20,000细胞/孔的密度接种于96孔板中的100μl具有10%FBS及青霉素/链霉素的RPMI培养基中。使用无细胞孔作为背景。使接种的细胞粘附过夜。次日，移除生长培养基并使细胞在无血清的培养基(具有0.04%BSA)中培养。实施克里唑蒂尼的连续稀释，向每一孔中添加适当对照或指定浓度的克里唑蒂尼，并于37℃下将细胞培养1小时。生成细胞溶胞产物并如制造商的方案中所述藉由使用

Phospho-Ros(panTyr)Sandwich ELISA Kit(Cell Signaling，目录号：7093)测定HCC78细胞中的SLC34A2-ROS的总磷酸化-酪氨酸水平。利用四参数分析方法藉由浓度反应曲线拟合计算IC₅₀值。基于细胞的磷酸化-ROS ELISA测定提供45nM的平均IC₅₀值(n=8)。

免疫印迹

还使用免疫印迹法测定HCC78细胞中的相对激酶磷酸化状态及总蛋白质水平，且测定3T3-CD74-ROS肿瘤裂解物中的所关注蛋白质。对于体外研究而言，用各个剂量水平的克里唑蒂尼将HCC78细胞处理3小时。使细胞在冷的1×细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technologies,Boston MT)中裂解。

对于体内研究而言，用克里唑蒂尼75mg/kg PO BID治疗具有肿瘤的小鼠达10天。在研究结束时，在最后一次剂量7小时后切除肿瘤。将所切除肿瘤在干冰上快速冷冻，使用液氮冷却的冷冻研钵及研杵粉碎，并在冷的1×细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technologies,Boston MT)中裂解。由细胞及肿瘤裂解物提取蛋白质并使用BSA测定(Pierce,Rockford,IL)来测定蛋白质浓度。藉由SDS-PAGE分离由细胞及肿瘤裂解物提取的蛋白质试样，将其转移至尼龙膜，并利用以下抗体实施感兴趣的蛋白质的免疫印迹杂交。

用于免疫印迹研究中的抗体均为来自Cell SignalingTechnology(Danvers,Massachusetts,United States)且列举如下：抗总ROS(目录号：3266)、抗磷酸化ROS(目录号：3078)、抗磷酸化SHP2(目录号：5431)、抗磷酸化STAT3(目录号：9131)、抗总AKT(目录号：9272)、抗磷酸化-AKT S473(目录号：4161)、抗总-MAPK44/42(目录号：9102)、抗磷酸化-MAPK44/42(目录号：4370)、裂解的半胱天冬酶-3(目录号：9661)。

细胞生存力、增殖及存活测定

细胞生存力分析

所培养的HCC78细胞适于具有10%FBS及青霉素/链霉素(Invitrogen)的RPMI生长培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)，只要可能标准化筛选即可。使一些需要特殊培养基的细胞在供货商推荐的培养基中生长。使细胞胰蛋白酶化并以3000-5000细胞/孔的密度接种于96孔板(Corning Costar第3904号板，Kennebunk,ME)中并使其粘附过夜。次日，一式两份地用以9个连续浓度给药的单一试剂药物处理细胞(以4倍的比率自10μM逐渐降低至152pM，从而产生完整S形曲线)。在37℃下再培养3-5天后(直至细胞铺满达到约70-80%为止)，添加制造商推荐体积的1/5的Cell Titer Glo(Promega,Madison,WI)以使用Envision多重读数器(Perkin-Elmer,Waltham,MA)间接测量细胞生存力/增殖。还在细胞接种一天后且在药物治疗之前自细胞板读取基线细胞计数读数。自最终细胞计数减去基线计数并用PRISM(Graphpad,La Jolla,CA)或XLFIT(IDBS,Surrey,UK)绘图。针对HCC78细胞生存力的抑制计算的IC₅₀值为约59nM。

细胞增殖/存活测定

将细胞以低密度在96孔板中接种于生长培养基(补充有2%、5%或10%胎牛血清-FBS的培养基)中并于37℃下培养过夜。次日，向指定孔中添加克里唑蒂尼或适当对照的连续稀释物，且于37℃下将细胞培养72小时。随后实施Cell TiterGlo测定(Promega,Madison,WI)以测定相对细胞数量。利用四参数分析方法藉由浓度反应曲线拟合计算EC₅₀值。

体内方法

无胸腺小鼠中的皮下异种移植物模型

自Charles River(Wilmington,MA)获得雌性nu/nu小鼠(5-8周龄)。在无尘室条件下将动物维持于无菌滤盖笼中，此类笼具有安装于HEPA过滤通气槽上的Alpha-Dri/bed-o-cob梳形衬垫。动物可自由接受无菌啮齿动物混合饲料及水。收获植入无胸腺小鼠中的指定细胞并藉由以450Xg离心5-10分钟使其沉淀。将细胞沉淀洗涤一次并重新悬浮于无血清的培养基中。对细胞补充50%Matrigel(BD Biosciences,SanJose CA)以有利于获取肿瘤。将细胞(5×10⁶，在100μL中)经皮下植入小鼠的后肋区域中并使其生长至指定大小，之后针对每一实验给药化合物。藉由利用电子卡尺的测量测定肿瘤大小且肿瘤体积计算为其长度×宽度²×0.4的积。

数据及结果

实施例1

在生物化学酶测定中克里唑蒂尼对ROS1激酶活性的抑制

在基于酶及细胞的测定中评价了克里唑蒂尼对ROS催化活性的效力。证实克里唑蒂尼为重组人类ROS1激酶(催化性结构域)的有效ATP竞争抑制剂，平均Ki值为0.097nM(n=4)。

实施例2

在基于细胞的测定中克里唑蒂尼的激酶活性

克里唑蒂尼以41nM的平均IC₅₀值(n=11)剂量依赖性地抑制HCC78细胞中的ROS磷酸化，此类细胞呈现导致此类细胞中的组成型激活SLC34A2-ROS融合蛋白表达的4p15、6q22染色体易位事件(Rikova等人，(2007))(表1，图1)。

克里唑蒂尼还以49nM的平均IC₅₀值(n=2)抑制具有FIG-ROS融合物的U138MG人类胶质母细胞瘤细胞中的ROS磷酸化(Charest等人，(2003))(表1，图1)。

在一组被改造成表达各种ROS-融合蛋白的3T3细胞系中，克里唑蒂尼以3.4nM至36nM的IC₅₀值抑制这些细胞中的ROS磷酸化(表1)。

表1

实施例3

在体外HCC78人类NSCLC细胞中抑制ROS介导的信 号转导及诱导细胞凋亡

评价了克里唑蒂尼抑制HCC78细胞中的SLC34A2-ROS依赖性信号传导途径的能力。

如图3中的免疫印迹中所阐释，在药物治疗3小时后在体外HCC78细胞中，克里唑蒂尼剂量依赖性地抑制ROS磷酸化(激活环)、以及下游衔接头或信号传导分子(包括SHP2、STAT3、AKT及ERK1/2)(图3)。这些数据表明关键信号传导途径与克里唑蒂尼的有效剂量之间具有相关性。

利用蛋白印迹分析评价了克里唑蒂尼的细胞凋亡的半胱天冬酶-3标记的剂量依赖性调节。在药物治疗3小时后，在HCC78NSCL细胞中观察到激活的半胱天冬酶-3水平的显著剂量依赖性诱导(图4)，指示增加的细胞凋亡还与有效剂量水平相关。

实施例4

口服给药后克里唑蒂尼在裸鼠中的一组致癌ROS融合 变体改造的异种移植物肿瘤模型中的细胞减少效力

在一组ROS融合物改造的肿瘤异种移植物模型中在代表人类癌症适应症的NIH3T3细胞中评价了克里唑蒂尼的抗肿瘤功效，所述适应症与ROS染色体易位(包括CD74-ROS、在人类NSCLC中鉴别的两种形式的SLC34A2-ROS、及在人类NSCLC、胶质母细胞瘤及胆管上皮癌中鉴别的两种形式的FIG-ROS)相关(Rimkunas等人，(2012)Clin Cancer Res.6月1日。[在印刷之前电子出版])；Gu等人，(2011)PLoS One.6(1):e15640)。

克里唑蒂尼以75/mg PO BID的给药方案，在具有人类致癌ROS融合变体的所有5个3T3-ROS改造的肿瘤模型中显示显著的细胞减少效力，如图5中所示。在肿瘤体积达到约200mm³时，小鼠开始接受克里唑蒂尼治疗，且在药物治疗的约4至5天内肿瘤快速消退至5mm³至10mm³的大小。在开始给药后的约7天内对照肿瘤达到1500mm³的大小，且此研究的平均克里唑蒂尼治疗时间为约10天。

实施例5

克里唑蒂尼在裸鼠中的3T3-CD74-ROS及 3T3-SLC34A2-ROS(L)异种移植物模型中剂量依赖性地抑制 ROS磷酸化及肿瘤生长

为评价克里唑蒂尼对ROS激酶活性及肿瘤生长的药效学抑制，实施以多个剂量水平的经口BID给药的裸鼠3T3-CD74-ROS肿瘤异种移植物研究。在整个研究中利用电子光标卡尺测量肿瘤体积并在口服给药克里唑蒂尼达10天后(稳定状态)第7小时收获肿瘤试样。藉由ELISA定量肿瘤中的ROS磷酸化状态。

克里唑蒂尼显示在肿瘤生长方面的剂量依赖性抑制，如图6B中所示。在160mg/kg/天组(80mg/kg BID)及80mg/kg/天群组(40mg/kg BID)中分别观察到94%及61%的肿瘤消退，且在40mg/kg/天组(20mg/kg BID)及20mg/kg/天组(10mg/kg BID)中分别观察到78%及54%的肿瘤生长抑制。

在最后一次克里唑蒂尼口服给药7小时后，在所有治疗组中观察到3T3-CD74-ROS肿瘤中的ROS磷酸化显著抑制(图6A)。

还在3T3-SLC34A2-ROS(L)模型中观察到克里唑蒂尼的类似抗肿瘤功效程度(图7)。

实施例6

式1的化合物(克里唑蒂尼)的合成

PLE是由Roche生产的酶且经由Biocatalytics公司以来自猪肝的粗酯酶制剂的形式销售，通常称作PLE-AS（自Biocatalytics以ICR-123形式购得，以硫酸铵混悬剂形式销售)。在CAS登记薄中将该酶分类为“羧酸酯水解酶，CAS编号9016-18-6”。相应的酶分类编号是EC3.1.1.1。已知该酶对大量酯的水解具有宽的底物特异性。在pH滴定器中使用基于丁酸乙酯的水解的方法测定脂肪酶活性。1LU(脂肪酶单位)为于22℃、pH8.2下每分钟释放1μmol可滴定丁酸的酶的量。本文报告的制剂(PLE-AS，混悬剂形式)通常是以已宣告活性>45LU/mg(蛋白质含量为约40mg/mL)的不透明棕绿色液体形式运输。

(1S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

(1S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇(在以下路线中示为化合物(S-1))是藉由外消旋乙酸1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙酯的酶促水解、酯化及化学水解与根据路线B的反转的组合制得。外消旋乙酸1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙酯(化合物A2)是根据路线A制得。

路线A

1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇(A1)：向2',6'-二氯-3'-氟苯乙酮(Aldrich，目录号52,294-5)(207mg,1mmol)在2mL无水CH₃OH中的溶液中添加硼氢化钠(90mg,2.4mmol)。将反应混合物于室温下搅拌1h，随后蒸发，从而产生无色油状残余物。藉由快速色谱(用在己烷中的0→10%EtOAc洗脱)纯化残余物，从而产生无色油状化合物A1(180mg；0.88mmol；86.5%收率)；MS(APCI)(M-H)-208；1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.64(d,J=6.82Hz,3H)3.02(d,J=9.85Hz,1H)6.97-7.07(m,1H)7.19-7.33(m,1H)。

乙酸1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙酯(A2)：向化合物A1(2.2g,10.5mmol)在20mL CH₂Cl₂中的溶液中依序添加乙酸酐(1.42mL,15mmol)及吡啶(1.7mL,21mmol)。将反应混合物于室温下搅拌12h且随后蒸发，从而产生浅黄色油状残余物。藉由快速色谱(用在己烷中的7→9%EtOAc洗脱)纯化残余物，从而产生无色油状化合物A2(2.26g；9.0mmol；85.6%收率)；1H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.88(d,J=6.82Hz,3H)2.31(s,3H)6.62(q,J=6.82Hz,1H)7.25(t,J=8.46Hz,1H)7.49(dd,J=8.84,5.05Hz,1H)。

路线B

向配备有pH电极、顶置式搅拌器及碱添加管线(1MNaOH)的50mL夹套烧瓶中添加1.2mL100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)及0.13mL PLE AS混悬剂。随后逐滴添加化合物A2(0.13g，0.5mmol，1.00当量)并将所得混合物于室温下搅拌20h，使用1M NaOH将反应内容物的pH维持于7.0。藉由RP-HPLC监测反应物的转化及对映异构体过量(ee's)，并在消耗50%起始材料后停止(在这些条件下约17小时)。随后将混合物用10mL乙酸乙酯萃取三次以回收作为R-1及S-2的混合物的酯及醇。

在氮气氛下向R-1及S-2的混合物(0.48mmol)在4mL吡啶中的溶液中添加甲磺酰氯(0.06mL,0.6mmol)。将反应混合物于室温下搅拌3h，随后蒸发以获得油状物。向混合物中添加水(20mL)且随后添加EtOAc(20mL×2)以萃取水溶液。将有机层合并、干燥、过滤并蒸发，从而产生R-3及S-2的混合物。此混合物未经进一步纯化即用于下一步骤反应中。¹H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.66(d,J=7.1Hz,3H)1.84(d,J=7.1Hz,3H)2.09(s,3H)2.92(s,3H)6.39(q,J=7.0Hz,1H)6.46(q,J=6.8Hz,1H)6.98-7.07(m,1H)7.07-7.17(m,1H)7.23-7.30(m,1H)7.34(dd,J=8.8,4.80Hz,1H)。

在氮气氛向在4mL DMF中的R-3及S-2的混合物(0.48mmol)中添加乙酸钾(0.027g,0.26mmol)。将反应混合物加热至100℃并保持12h。向反应混合物中添加水(20mL)并添加EtOAc(20mL×2)以萃取水溶液。干燥合并的有机层，过滤并蒸发，从而产生S-2的油状物(72mg，在两个步骤中61%收率)。手性ee：97.6%。¹H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.66(d,J=7.1Hz,3H)2.09(s,3H)6.39(q,J=6.8Hz,1H)7.02(t,J=8.5Hz,1H)7.22-7.30(m,1H)。

在氮气氛下于0℃下向化合物S-2(4.64g,18.8mmol)中缓慢添加甲醇钠(19mmol；0.5M，在甲醇中)。在室温下将所得混合物搅拌4小时。蒸发溶剂并添加H₂O(100mL)。将冷却的反应混合物用乙酸钠-乙酸缓冲液溶液中和至pH7。添加乙酸乙酯(100mL×2)以萃取水溶液。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，从而获得白色固体状S-1(4.36g，94.9%收率)；SFC-MS：97%ee，¹H NMR(400MHz，氯仿-D)δppm1.65(d,J=6.8Hz,3H)5.58(q,J=6.9Hz,1H)6.96-7.10(m,1H)7.22-7.36(m,1H)。

5-溴-3-[1-(2,6-二氯-3-氟-苯基)-乙氧基]-吡啶-2-基胺(外 消旋物)：

1.于0℃下使用冰浴将2,6-二氯-3-氟苯乙酮(15g,0.072mol)在THF(150mL,0.5M)中搅拌10min。缓慢添加氢化锂铝(2.75g,0.072mol)。将该反应物在环境温度下搅拌3hr。在冰浴中冷却反应物，并逐滴添加水(3mL)，之后缓慢添加15%NaOH(3mL)。将混合物于环境温度下搅拌30min。添加15%NaOH(9mL)、MgSO₄并过滤混合物以移除固体。将固体用THF(50mL)洗涤并浓缩滤液，从而产生黄色油状1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇(14.8gm，95%收率)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.45(d,3H),5.42(m,2H),7.32(m,1H),7.42(m,1H)。

2.于0℃下向三苯基膦(8.2g,0.03mol)及DEAD(13.65mL40%在甲苯中的溶液)在THF(200mL)中的搅拌溶液中添加1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇(4.55g,0.021mol)及3-羟基硝基吡啶(3.35g,0.023mol)在THF(200mL)中的溶液。在氮气氛下于环境温度下搅拌所得鲜橙色溶液4小时，此时消耗所有起始材料。移除溶剂，并将粗物质干式装载至硅胶上，并用乙酸乙酯-己烷(20:80)洗脱，从而得到粉色固体状3-(2,6-二氯-3-氟苄氧基)-2-硝基吡啶(6.21g,0.021mol,98%)。¹HNMR(CDCl₃,300MHz)δ1.8-1.85(d,3H),6.0-6.15(q,1H),7.0-7.1(t,1H),7.2-7.21(d,1H),7.25-7.5(m,2H),8.0-8.05(d,1H)。

3.将3-(2,6-二氯-3-氟苄氧基)-2-硝基吡啶(9.43g,0.028mol)及铁屑(15.7g,0.28mol)悬浮于AcOH(650mL)及EtOH(500mL)的搅拌混合物中。将反应物缓慢加热回流并搅拌1hr。将反应物冷却至室温，随后添加二乙醚(500mL)及水(500mL)。藉由添加碳酸钠小心地中和溶液。将合并的有机萃取物用饱和NaHCO₃(2×100mL)、H₂O(2×100mL)及盐水(1×100mL)洗涤，随后干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空下浓缩至干燥，从而得到浅粉色固体状3-(2,6-二氯-3-氟苄氧基)吡啶-2-基胺(9.04g,0.027mol,99%)。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ1.8-1.85(d,3H),4.9-5.2(brs,2H),6.7-6.84(q,1H),7.0-7.1(m,1H),7.2-7.3(m,1H),7.6-7.7(m,1H)。

4.使用冰浴将3-(2,6-二氯-3-氟苄氧基)吡啶-2-基胺(9.07g,0.03mol)在乙腈中的搅拌溶液冷却至0℃。向此溶液中逐滴添加N-溴琥珀酰亚胺(NBS)(5.33g,0.03mol)。将反应物于0℃下搅拌15min。在真空下将反应物浓缩至干燥。将所得深色油状物溶解于EtOAc(500mL)中，并经由硅胶色谱纯化。随后在真空中移除溶剂，从而得到白色结晶固体状5-溴-3-(2,6-二氯-3-氟苄氧基)吡啶-2-基胺(5.8g,0.015mol,51%)。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ1.85-1.95(d,3H),4.7-5.0(brs,2H),5.9-6.01(q,1H),6.8-6.95(d,1H),7.01-7.2(t,1H),7.4-7.45(m,1H),7.8-7.85(d,1H)。

5-溴-3-[1(R)-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]吡啶-2-基胺：

如上文针对外消旋物所述制备对映异构体纯的R异构体，但使用上述对映异构体纯的起始材料。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.74(d,3H),6.40(m,1H),6.52(br s,2H),7.30(m,1H),7.48(m,1H),7.56(s,1H);MS m/z382(M+1)。

4-甲磺酰氧基哌啶-1-羧酸叔丁酯(2)

向冷却至0℃的4-羟基哌啶-1-羧酸叔丁酯(7.94g,39.45mmol)在CH₂Cl₂(100mL)中的搅拌溶液中缓慢添加NEt₃(5.54mL,39.45mmol)，之后添加甲磺酰氯(3.06mL,39.45mmol)及DMAP(48mg,0.39mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。向混合物中添加水(30mL)。用CH₂Cl₂(3×30mL)萃取，之后干燥(Na₂SO₄)并在真空中移除溶剂，从而获得白色固体状4-甲磺酰氧基哌啶-1-羧酸叔丁酯(11.00g，>99%收率)。¹HNMR(CDCl₃,400MHz)δ4.89(m,1H),3.69(m,2H),3.31(m,2H),3.04(s,3H),1.95(m,2H),1.83(m,2H),1.46(s,9H)。

4-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡 唑-1-基]哌啶-1-羧酸叔丁酯

4-(4-碘-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3)

于4℃下向4-碘吡唑(0.57mmol)在DMF(2L)中的搅拌溶液中逐滴添加NaH(1.2当量，0.68mmol)。于4℃下将所得混合物搅拌1小时且随后添加4-甲磺酰氧基哌啶-1-羧酸叔丁酯化合物2(1.1当量，0.63mmol)。将所得混合物加热至100℃并保持12h。将反应物用H₂O骤冷并用EtOAc萃取若干次。将合并的有机层干燥，过滤并浓缩，从而获得橙色油状物。藉由硅胶色谱(用在戊烷中的5%EtOAc洗脱)纯化残余物，从而产生白色固体状化合物3(140g,66%)。

4-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吡 唑-1-基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(4)

向化合物3(140g,0.37mol)在1.5L DMSO中的溶液中依序添加双(戊酰)二硼(1.4当量，134g，0.52mol)及乙酸钾(4当量，145g，1.48mol)。将混合物用氮吹扫若干次且随后添加二氯双(三苯基膦)钯(II)(0.05当量，12.9g，0.018mol)。将所得混合物于80℃下加热2h。将反应混合物冷却至室温并经由硅藻土床过滤并用EtOAc洗涤。将滤液用饱和NaCl(500mL×2)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。藉由硅胶色谱(用在己烷中的5%EtOAc洗脱)纯化残余物，从而产生白色固体状化合物4(55g,40%)。

3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基 -1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺(1)

向3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(4,4,5,5-四甲基[1,3,2]二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶-2-基胺(15.22g,35.64mmol)及4-(4-溴吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(14.12g,42.77mmol)在DME(143mL)中的搅拌溶液中添加Na₂CO₃(11.33g,10692mmol)在水(36mL)中的溶液。使溶液脱气并充氮三次。向该溶液中添加Pd(PPh₃)₂Cl₂(1.25mg,1.782mmol)。使反应溶液脱气并再次充氮三次。将反应溶液于87℃油浴下搅拌约16小时(或直至消耗硼烷频哪醇酯为止)，冷却至环境温度并用EtOAc(600mL)稀释。将反应混合物经由

垫过滤并用EtOAc洗涤。将EtOAc溶液用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩。在用EtOAc/己烷系统洗脱的硅胶柱(Biotage90+柱：用600mL100%己烷平衡，区段1：2250mL50%EtOAc/己烷线性，区段2：4500mL75%EtOAc/己烷线性，区段3：4500mL100%EtOAc)上纯化粗产物，从而获得4-(4-{6-氨基-5-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]吡啶-3-基}吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11.8g，60%收率，约95%纯度)，Rf为0.15(50%EtOAc/己烷)。MS m/e550(M+1)⁺。

向4-(4-{6-氨基-5-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]吡啶-3-基}吡唑-1-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(11.8g,21.45mmol)在CH₂Cl₂(59mL,0.2M)中的溶液中添加4N HCl/二噁烷(21mL)。将溶液搅拌过夜，从而形成固体。用玻璃棒彻底碾压固体并经超声波处理，从而释放固体中捕获的起始材料。另外添加4N HCl/二噁烷(21mL)并于室温下再搅拌2小时，其中LCMS显示无起始材料。在内衬有滤纸的布氏漏斗(Buchner funnel)中过滤悬浮液。保存母液，因为其含有<5%产物。将固体转移至500mL烧杯并添加HPLC水直至固体完全溶解为止。藉助添加固体Na₂CO₃将pH调节至10。将水溶液用CH₂Cl₂(5×200mL)萃取或直至LCMS显示水层中无产物为止。将CH₂Cl₂溶液经Na₂SO₄干燥并浓缩。在用CH₂Cl₂/MeoH/NEt₃系统洗脱的硅胶柱(Biotage40+柱：用600mL100%CH₂Cl₂平衡产生副产物，区段1：1200mL10%MeOH/CH₂Cl₂线性，区段2：2400mL10%MeOH/CH₂Cl₂梯度，区段3：2400mL9%MeOH/1%NEt₃/CH₂Cl₂)上纯化重新溶解于CH₂Cl₂(10mL)及MeOH(1mL)中的粗产物。收集期望的部分，从而提供3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺(7.19g，75%合并收率，白色固体)。MS m/e450(M+1)⁺。¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ7.92(s,1H),7.76(s,1H),7.58(m,1H),7.53(s,1H),7.45(m,1H),6.90(s,1H),6.10(m,1H),5.55(bs,2H),4.14(m,1H),3.05(m,2H),2.58(m,2H),1.94(m,2H),1.80(d,3H),1.76(m,2H)。

将固体产物3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺溶解于二氯甲烷中，且缓慢蒸发溶剂以生成微细结晶固体。在高真空干燥后，确认试样是熔点为194℃的单晶多晶型形式A。

Claims (15)

1.治疗哺乳动物的癌症方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药治疗有效量的3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐，其中所述癌症是由至少一种遗传改变的ROS介导的。

2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人类。

3.权利要求1的方法，其中所述至少一种遗传改变的ROS是遗传改变的ROS基因。

4.权利要求3的方法，其中所述遗传改变的ROS基因是ROS融合基因。

5.权利要求4的方法，其中所述ROS融合基因是SLC34A2-ROS基因或CD74-ROS基因。

6.权利要求4的方法，其中所述ROS融合基因是FIG-ROS基因。

7.权利要求1的方法，其中所述至少一种遗传改变的ROS是ROS融合蛋白。

8.权利要求7的方法，其中所述ROS融合蛋白是SLC34A2-ROS激酶。

9.权利要求7的方法，其中所述ROS融合蛋白是CD74-ROS激酶。

10.权利要求7的方法，其中所述ROS融合蛋白是FIG-ROS激酶。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述癌症选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤及其组合。

12.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、激素难治性前列腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠直肠腺癌、神经母细胞瘤、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)及胃癌。

13.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。

14.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐以包含3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基胺或其药学上可接受的盐及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。

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