CN103834739A - 一种脂质代谢型肥胖基因体质评估的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的ABCA1基因、LPL基因、PPARG基因、ADRB3基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供脂质代谢型肥胖体质评估，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法，可用于评估脂质代谢型肥胖基因体质情况，针对性的提示受检者根据遗传体质选择不同的减肥策略，属于分子生物学技术领域。
背景技术
肥胖症是一种热量代谢障碍，摄入热量超过消耗的热量，引起体内脂肪积聚过多所致。一般认为超过按身高所测标准体重20%即可成为肥胖。肥胖症是一种与遗传因素及生活方式密切相关的慢性疾病，它会引发血脂升高，容易造成脂肪肝、动脉血管病变、心脏病、糖尿病，肥胖的儿童还会引发性功能发育不良并导致成人期各种疾病发病率和死亡率上升。因此，若通过有效的方法来预防，就能避免过早地出现高血压、冠心病、糖尿病、脑血管病等疾患，从而提高人们的生存质量。
由于至少有40%躯体脂肪量的差异是由遗传因素引起的，所以很容易明确遗传对肥胖有很大影响。遗传体质不同的人在患肥胖症时应采取不同的减肥策略，利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的体重管理分子检测产品会对减肥者的减肥计划提供基因减肥概念的个性化体重管理建议，具有较强的社会意义和市场前景。目前肥胖症的临床治疗方法主要是饮食和运动疗法，但存在着碳水化合物、脂肪以及蛋白质摄入量控制“一刀切” 和盲目采用减肥药物的非个体化治疗方式。原因主要在于无法明确地将患者区分成为不同的减重体质，从而对不同患者是否需要严格控制碳水化合物的摄入，是否需要控制脂肪的摄入，是否需要使用减肥药物，以及应该使用哪类减肥药物的治疗措施选择上没有明确指导。
脂类物质具有重要的生物功能，脂肪是体内的一种主要能量来源，但脂肪摄入过量而运动量又过少将产生肥胖，并导致一些慢性病的发生；膳食脂肪总量增加，还会增大某些癌症的发生几率。因此有意识地控制脂肪摄入和积极从事体力或体育活动，以消耗摄入多余的热量，避免过多的脂肪在体内积存。
研究发现，脂质代谢型肥胖相关基因变异会导致脂肪细胞增大增多、内脏脂肪组织的脂肪分解减少，皮下脂肪含量变多，造成脏器脂肪含量增高，体重易上升，基础代谢率低，易形成高血压，葡萄糖的耐受性高，内脏脂肪组织的脂肪分解减少，导致脏器肥胖。因此应有意识地控制脂肪摄入和积极从事体力或体育活动，以消耗摄入多余的热量，避免过多的脂肪在体内积存。
研究发现ABCA1，LPL，PPARG，ADRB3基因与脂质代谢型肥胖体质有关。
ABCA1为ATP-binding cassette transporterA1， abca1(三磷酸腺苷结合盒转运体A1)蛋白编码基因，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆转运(RCT)和HDL生成的起始步骤中起重要作用，被称作RCT守门人。核受体PPARs、LXRs和FXR对abca1蛋白的表达具有调控作用。ABCA1功能障碍将导致巨噬细胞内大量的胆固醇沉积而成为泡沫细胞，继而浸润血管壁，促进冠心病的发生发展。
ABCA1在机体中最重要的作用是对高密度脂蛋白的转运。高密度脂蛋白是机体重要的抵抗心脑血管疾病的大分子，它可以将机体多余的胆固醇从外周细胞转运入肝脏内，同时也可以保护低密度脂蛋白不受氧化损伤的影响，抑制血管内皮细胞上粘性大分子的表达，组织单核分子进入血管壁。而ABCA1对于肝脏内和外周细胞内的胆固醇水平可以进行调节，主要通过将多余的胆固醇从外周细胞泵出，与乏脂蛋白apoA-I结合形成初始状态的高密度脂蛋白，而初始状态的高密度脂蛋白通过胆固醇磷酸酰化成为胆淄醇酸脂的脂化反应转化为成熟的α高密度脂蛋白。决定血清内α高密度脂蛋白含量的几个因素包括肝脏内ABCA1转运酶和apoA-I的含量以及乏脂蛋白apoA-I的含量。
LPL基因编码脂蛋白脂酶，该酶在心脏、肌肉和脂肪组织中进行表达。LPL以同型二聚体蛋白的形式行使功能，其分子生物学的作用包括两部分，一部分为甘油三脂的水解酶作用，另一部分则是受体介导的脂蛋白内吞作用的桥梁。LPL蛋白上的位点突变在严重的情况下可以导致I型高脂蛋白血症，而较轻程度上则引起体内脂蛋白代谢的紊乱，导致高脂蛋白血症、糖尿病、肥胖等疾病发病风险增高。
PPARG为peroxisome proliferative activated receptor, gamma（过氧化物酶体增生激活受体γ）编码基因，属于核受体过氧化物酶体增生激活受体亚家族，可以与类维生素A受体（RXR）接合形成异型二聚物，该异性二聚物可以通过与特异DNA序列的结合调控多种基因的转录，该特异DNA序列通常称为过氧化物酶体增殖反应元件，PREE。PPARG编码的蛋白主要负责脂类的分化代谢以及糖、脂代谢等。此外，PPARG还被发现与多种疾病相关，包括：肥胖、糖尿病、动脉硬化和癌症等。PPARG突变或异常表达等都会引起过氧化物酶体增生激活受体γ活性偏高，脂肪酸吸收增加，容易造成脂肪堆积。
肾上腺素受体（ADRB3）在瘦素调节的神经通路中扮演着重要角色，通过传递交感神经信号，参与骨的重吸收和能量的代谢，对骨骼发育及体重的调节有着重要影响。ADRB3突变或异常表达等会造成内脏脂肪组织的脂肪分解减少，皮下脂肪含量变多，造成脏器肥胖。携带Arg64的同型或异性合子脏器脂肪含量特高，体重易上升，基础代谢率低，易形成高血压，葡萄糖的耐受性高，内脏脂肪组织的脂肪分解减少，造成内脏肥胖。
目前的基础研究已能从理论上证明基因分型检测可以用于判断肥胖体质的类型，而且检测方法简便、检测成本在可接受程度中、检测结果可信。因此，基因分型检测用于评估肥胖体质的可行性是明确的。根据基因检测结果结合体重管理测评系统建立个性化体重健康评估报告，有针对的解决体重控制问题，提高人们生活质量。因此利用现有科学、技术研究成果来开发这样一个产品，时机是成熟的。
本发明的目的是提供一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
为实现以上目的，本发明提供一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法。其具体步骤为：
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806；脂蛋白脂酶（LPL）rs320；过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282；肾上腺素受体（ADRB3）rs4994，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan®-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10µl，即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl 25mM MgCl2溶液、0.02µl（5units/µl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、4个位点分别采用不同的正向引物（20µM，0.225µl）、反向引物（20µM，0.225µl）、VIC荧光探针（10µM，0.25µl）和FAM荧光探针（10µM，0.25µl）工具进行检测（探针、引物、序列如下）；
三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806
带VIC荧光A型探针
CAAaGGAGAAACT
带FAM荧光G型探针 CAAgGGAGAAACT
正向引物
AAGTCTGTGCAATGGATCAAAA
反向引物
CTCACCAGGATTGGCTTCAG
cataaattgc aaaatagtga ggatgttgtt
catctaataa aagtggttcc aggaattcag
actctggatt cctgtttgcc aaatcatgtg
tcccactctt aagaaaacga gttggactct
ggatttttct ttgcaagagg gacaagagtg
tgggagatac tgagttaatg caacttgcag
gttttaagtg tcctgtcatt gtgccttgtg
ctttgataca ttctgagttt cagtaaagag
acctgatgca ttggactgtt gcaatggaac
ctgttttaag atcttcaaag ctgtattgat
atgaagttct ccaaaagact tcaaggaccc
agcttccaat cttcataatc ctcttgtgct
tgtctctctt tgcatgaaat gcttccaggt
atttttgcaa ggctaccagt tacatttgac
aagtctgtgc aatggatcaa aatcagaaga gatgattcaa
cttggtgacc aagaagtttc
tgagctttgt ggcctaccaa rggagaaact
ggctgcagca gagcgagtac ttcgttccaa
catggacatc ctgaagccaa cctggtgagt
agacttgctc actggagaaa cttcaagcac
taatgctttc ggaatgtgag gcttttcctt
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acggctggct gggagtttgt gatataattt
agttcagtgg tattctaagt gttcttagtg
ttctttcaga cttttgggcc atctcccaaa
gggtgaatgg gaagaataag ctgggtgtgg
ctgagtttaa gccaaaagtt ttttgtgctt
gtttcaatca gagaagacct gctttttcat
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tcatttgaaa acagagttct tcatatttaa
aaaaaaaaag tcttgaaacc attgatggga
agatggatat ctatttatgt ttaaaaaccc
atcataaaga tgacattgtg ggctgtcaca
gttggaaggc
脂蛋白脂酶（LPL）rs320
带VIC荧光G型探针
AGCgTTTATACTA
带FAM荧光T型探针 AGCtTTTATACTA
正向引物
CCACCCATGTGTACCCATAAA
反向引物
TTTGGTGATACAAGCAAATGAC
aggagagact cagaaaaagt aattaaatgt
atttttcttc cttcacttta gacccccacc
tgatgtcagg acctaggggc tgtatttcag
gggccttcac aattcaggga gagctttagg
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aacctcttca agaagggtga gattccaaga
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acactagcaa tgtctagctg aaggcagatg
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tggcagagtt gatcttttat catctcttgg
tgaaagccca gtaacataag actgctctag
gctgtctgca tgcctgtcta tctaaattaa
ctagcttggt tgctgaacac caggttaggc
tctcaaatta ccctctgatt ctgatgtggc
ctgagtgtga cagttaatta ttgggaatat
caaaacaatt acccagcatg atcatgtatt
atttaaacag tcctgacaga
过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282
带VIC荧光C型探针
GACcCAGAAAGCG
带FAM荧光G型探针 GACgCAGAAAGCG
正向引物
GCAAACCCCTATTCCATGCT
反向引物
TACATAAATGCCCCCACGTC
agctttctgg tatttcataa gcaagagatt
taagttttcc atttaagaag caattgtgaa
ttttacaaca ataaaaaatg caagtggata
ttgaacagtc tctgctctga taattctaaa
tacagtacag ttcacgcccc tcacaagaca
ctgaacatgt gggtcaccgg cgagacagtg
tggcaatatt ttccctgtaa tgtaccaagt
cttgccaaag cagtgaacat tatgacacaa
ctttttgtca cagctggctc ctaataggac
agtgccagcc aattcaagcc cagtcctttc
tgtgtttatt cccatctctc ccaaatattt
ggaaactgat gtcttgactc atgggtgtat
tcacaaattc tgttacttca agtctttttc
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tgggagattc tcctattgac scagaaagcg
attccttcac tgatacactg tctgcaaaca
tatcacaagg taaagttcct tccagatacg
gctattgggg acgtgggggc atttatgtaa
gggtaaaatt gctcttgtag ttgtcttcca
ggttgtgttt gttttaatac tatcatgtgt
acactccagt attttaatgc ttagctcgtt
gctatcgcgt tcatttaaaa acatgttcag
aaccttaaaa aaggaaacct aacctaatct
attttatctc tgtgcatggc tcccatttcc
tgaattttaa gcattaaagg tatagttata
tccaaaaaca atcctgttca tttttatttc
ctgagtttgc atagatttcc caagaataca
taagggcttt ttagacttga agggtcactt
tttcctcttt tcatctcata tgttagagat
ctctcataac tgtttttatc cctcttgcag
cacttttatt cctcttgaag tactctcagc
tcttttctgt
肾上腺素受体（ADRB3）rs4994
带VIC荧光C型探针
GCCcGGACTCCGA
带FAM荧光T型探针 GCCtGGACTCCGA
正向引物
ATCCAGTACCCCTTGGTTCC
反向引物
GTTTCCCTGAGGCTGTCTTG
ttcctccaga tttagctaaa ggaaacgtgg
agcatcccat tggccatcct ccccactctc
caattcggct ccagaggccc ctccagacta taggcagctg
cccctttaag cgtcgctact
cctcccccaa gagcggtggc accgagggag
ttggggtggg gggaggctga gcgctctggc
tgggacagct agagaagatg gcccaggctg
gggaagtcgc tctcatgcct tgctgtcccc
tcccctgagc caggtgattt gggagacccc
ctccttcctt ctttccctac cgccccacgc
gcgacccggg gatggctccg tggcctcacg
agaacagctc tcttgcccca tggccggacc
tccccaccct ggcgcccaat accgccaaca
ccagtgggct gccaggggtt ccgtgggagg
cggccctagc cggggccctg ctggcgctgg
cggtgctggc caccgtggga ggcaacctgc
tggtcatcgt ggccatcgcc yggactccga
gactccagac catgaccaac gtgttcgtga
cttcgctggc cgcagccgac ctggtgatgg
gactcctggt ggtgccgccg gcggccacct
tggcgctgac tggccactgg cgttgggcgc
cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga
cgtgctgtgt gtgaccgcca gcatcgaaac
cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct
ggctgtgacc aacccgctgc gttacggcgc
actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc
tgtggtcctg gtgtgggtcg tgtcggccgc
ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg
gtggcgcgta ggggccgacg ccgaggcgca
gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc
cttcgcctcc aacatgccct acgtgctgct
gtcctcctcc gtctccttct accttcctct
tctcgtgatg ctcttcgtct acgcgcgggt
tttcgtggtg
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806；脂蛋白脂酶（LPL）rs320；过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282；肾上腺素受体（ADRB3）rs4994四张图。
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（2）、脂蛋白脂酶（LPL）rs320
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型，
（3）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴中间区域为CG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（4）、肾上腺素受体（ADRB3）rs4994
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型，
本发4个位点的基因分型可以采用TaqMan®-MGB技术对这些位点进行基因分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。除此之外，基因测序等技术也可以作为备选的基因分型手段。
本发明的优点是：检测准确率高，可重复性强。
附图说明
图1为三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806示意图；
图2为脂蛋白脂酶（LPL）rs320示意图；
图3为过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282示意图；
图4为肾上腺素受体（ADRB3）rs4994示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法，可以让受检者在考虑以饮食和运动方式进行瘦身之前，先了解自身基因体质情况，了解个人的肥胖潜能成因，选择最适合的个体化营养及运动瘦身方式，将各种肥胖基因表现的型态一一击破，达到最有效健康的减重效果。
为实现以上目的，本发明提供一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法。其具体步骤为：
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806；脂蛋白脂酶（LPL）rs320；过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282；肾上腺素受体（ADRB3）rs4994，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan®-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10µl，即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl 25mM MgCl2溶液、0.02µl（5units/µl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、4个位点分别采用不同的正向引物（20µM，0.225µl）、反向引物（20µM，0.225µl）、VIC荧光探针（10µM，0.25µl）和FAM荧光探针（10µM，0.25µl）工具进行检测（探针、引物、序列如下）；
三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806
带VIC荧光A型探针
CAAaGGAGAAACT
带FAM荧光G型探针 CAAgGGAGAAACT
正向引物
AAGTCTGTGCAATGGATCAAAA
反向引物
CTCACCAGGATTGGCTTCAG
cataaattgc aaaatagtga ggatgttgtt
catctaataa aagtggttcc aggaattcag
actctggatt cctgtttgcc aaatcatgtg
tcccactctt aagaaaacga gttggactct
ggatttttct ttgcaagagg gacaagagtg
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aaaaaaaaag tcttgaaacc attgatggga
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atcataaaga tgacattgtg ggctgtcaca gttggaaggc
脂蛋白脂酶（LPL）rs320
带VIC荧光G型探针
AGCgTTTATACTA
带FAM荧光T型探针 AGCtTTTATACTA
正向引物
CCACCCATGTGTACCCATAAA
反向引物
TTTGGTGATACAAGCAAATGAC
aggagagact cagaaaaagt aattaaatgt
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过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282
带VIC荧光C型探针 GACcCAGAAAGCG
带FAM荧光G型探针 GACgCAGAAAGCG
正向引物
GCAAACCCCTATTCCATGCT
反向引物
TACATAAATGCCCCCACGTC
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tgtgtttatt cccatctctc ccaaatattt
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cacttttatt cctcttgaag tactctcagc
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肾上腺素受体（ADRB3）rs4994
带VIC荧光C型探针
GCCcGGACTCCGA
带FAM荧光T型探针 GCCtGGACTCCGA
正向引物
ATCCAGTACCCCTTGGTTCC
反向引物
GTTTCCCTGAGGCTGTCTTG
ttcctccaga tttagctaaa ggaaacgtgg
agcatcccat tggccatcct ccccactctc
caattcggct ccagaggccc ctccagacta
taggcagctg cccctttaag cgtcgctact
cctcccccaa gagcggtggc accgagggag
ttggggtggg gggaggctga gcgctctggc
tgggacagct agagaagatg gcccaggctg
gggaagtcgc tctcatgcct tgctgtcccc
tcccctgagc caggtgattt gggagacccc
ctccttcctt ctttccctac cgccccacgc
gcgacccggg gatggctccg tggcctcacg
agaacagctc tcttgcccca tggccggacc
tccccaccct ggcgcccaat accgccaaca
ccagtgggct gccaggggtt ccgtgggagg
cggccctagc cggggccctg ctggcgctgg
cggtgctggc caccgtggga ggcaacctgc
tggtcatcgt ggccatcgcc yggactccga
gactccagac catgaccaac gtgttcgtga
cttcgctggc cgcagccgac ctggtgatgg
gactcctggt ggtgccgccg gcggccacct
tggcgctgac tggccactgg cgttgggcgc
cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga
cgtgctgtgt gtgaccgcca gcatcgaaac
cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct
ggctgtgacc aacccgctgc gttacggcgc
actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc
tgtggtcctg gtgtgggtcg tgtcggccgc
ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg
gtggcgcgta ggggccgacg ccgaggcgca
gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc
cttcgcctcc aacatgccct acgtgctgct
gtcctcctcc gtctccttct accttcctct
tctcgtgatg ctcttcgtct acgcgcgggt
tttcgtggtg
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806；脂蛋白脂酶（LPL）rs320；过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282；肾上腺素受体（ADRB3）rs4994四张图。
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（2）、脂蛋白脂酶（LPL）rs320
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型，
（3）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴中间区域为CG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（4）、肾上腺素受体（ADRB3）rs4994
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型，
步骤5：检测报告表
<110> 上海中优医药高科技有限公司
<120>一种脂质代谢型肥胖基因体质评估的方法
<160>20
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (501)
<223> n =a或g
<400> 1
cataaattgc aaaatagtga ggatgttgtt catctaataa aagtggttcc aggaattcag 60
actctggatt cctgtttgcc aaatcatgtg tcccactctt aagaaaacga gttggactct 120
ggatttttct ttgcaagagg gacaagagtg tgggagatac tgagttaatg caacttgcag 180
gttttaagtg tcctgtcatt gtgccttgtg ctttgataca ttctgagttt cagtaaagag 240
acctgatgca ttggactgtt gcaatggaac ctgttttaag atcttcaaag ctgtattgat 300
atgaagttct ccaaaagact tcaaggaccc agcttccaat cttcataatc ctcttgtgct 360
tgtctctctt tgcatgaaat gcttccaggt atttttgcaa ggctaccagt tacatttgac 420
aagtctgtgc aatggatcaa aatcagaaga gatgattcaa cttggtgacc aagaagtttc 480
tgagctttgt ggcctaccaa nggagaaact ggctgcagca gagcgagtac ttcgttccaa 540
catggacatc ctgaagccaa cctggtgagt agacttgctc actggagaaa cttcaagcac 600
taatgctttc ggaatgtgag gcttttcctt ggacagcatg actttgtttt gtagaaaagt 660
acggctggct gggagtttgt gatataattt agttcagtgg tattctaagt gttcttagtg 720
ttctttcaga cttttgggcc atctcccaaa gggtgaatgg gaagaataag ctgggtgtgg 780
ctgagtttaa gccaaaagtt ttttgtgctt gtttcaatca gagaagacct gctttttcat 840
gtttttacta ttataatact aagcaagagc tcatttgaaa acagagttct tcatatttaa 900
aaaaaaaaag tcttgaaacc attgatggga agatggatat ctatttatgt ttaaaaaccc 960
atcataaaga tgacattgtg ggctgtcaca gttggaaggc 1000
<210> 2
<211> 980
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (501)
<223> n =g或t
<400> 2
aggagagact cagaaaaagt aattaaatgt atttttcttc cttcacttta gacccccacc 60
tgatgtcagg acctaggggc tgtatttcag gggccttcac aattcaggga gagctttagg 120
aaaccttgta tttattactg tatgatgtag attttcttta ggagtcttct tttattttct 180
tatttttggg gggcaggggg ggggaagtga cagtattttt gtatttcatg taaggaaaac 240
ataagccctg aatcgctcac agttattcag tgagagctgg gattagaagt caggaatctc 300
agcttctcat ttggcactgt ttcttgtaag tacaaaatag ttagggaaca aacctccgag 360
atgctacctg gataatcaaa gattcaaacc aacctcttca agaagggtga gattccaaga 420
taatctcaac ctgtctccgc agccccaccc atgtgtaccc ataaaatgaa ttacacagag 480
atcgctatag gatttaaagc ntttatacta aatgtgctgg gattttgcaa actatagtgt 540
gctgttattg ttaatttaaa aaactctaag ttaggattga caaattattt ctctttagtc 600
atttgcttgt atcaccaaag aagcaaacaa acaaacaaaa aaaaaaagaa aaagatcttg 660
gggatggaaa tgttataaag aatctttttt acactagcaa tgtctagctg aaggcagatg 720
ccctaattcc ttaatgcaga tgctaagaga tggcagagtt gatcttttat catctcttgg 780
tgaaagccca gtaacataag actgctctag gctgtctgca tgcctgtcta tctaaattaa 840
ctagcttggt tgctgaacac caggttaggc tctcaaatta ccctctgatt ctgatgtggc 900
ctgagtgtga cagttaatta ttgggaatat caaaacaatt acccagcatg atcatgtatt 960
atttaaacag tcctgacaga 980
<210>3
<211> 1000
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (501)
<223> n =c或g
<400> 3
agctttctgg tatttcataa gcaagagatt taagttttcc atttaagaag caattgtgaa 60
ttttacaaca ataaaaaatg caagtggata ttgaacagtc tctgctctga taattctaaa 120
tacagtacag ttcacgcccc tcacaagaca ctgaacatgt gggtcaccgg cgagacagtg 180
tggcaatatt ttccctgtaa tgtaccaagt cttgccaaag cagtgaacat tatgacacaa 240
ctttttgtca cagctggctc ctaataggac agtgccagcc aattcaagcc cagtcctttc 300
tgtgtttatt cccatctctc ccaaatattt ggaaactgat gtcttgactc atgggtgtat 360
tcacaaattc tgttacttca agtctttttc ttttaacgga ttgatctttt gctagataga 420
gacaaaatat cagtgtgaat tacagcaaac ccctattcca tgctgttatg ggtgaaactc 480
tgggagattc tcctattgac ncagaaagcg attccttcac tgatacactg tctgcaaaca 540
tatcacaagg taaagttcct tccagatacg gctattgggg acgtgggggc atttatgtaa 600
gggtaaaatt gctcttgtag ttgtcttcca ggttgtgttt gttttaatac tatcatgtgt 660
acactccagt attttaatgc ttagctcgtt gctatcgcgt tcatttaaaa acatgttcag 720
aaccttaaaa aaggaaacct aacctaatct attttatctc tgtgcatggc tcccatttcc 780
tgaattttaa gcattaaagg tatagttata tccaaaaaca atcctgttca tttttatttc 840
ctgagtttgc atagatttcc caagaataca taagggcttt ttagacttga agggtcactt 900
tttcctcttt tcatctcata tgttagagat ctctcataac tgtttttatc cctcttgcag 960
cacttttatt cctcttgaag tactctcagc tcttttctgt 1000
<210> 4
<211>1000
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (501)
<223> n =c或t
<400> 4
ttcctccaga tttagctaaa ggaaacgtgg agcatcccat tggccatcct ccccactctc 60
caattcggct ccagaggccc ctccagacta taggcagctg cccctttaag cgtcgctact 120
cctcccccaa gagcggtggc accgagggag ttggggtggg gggaggctga gcgctctggc 180
tgggacagct agagaagatg gcccaggctg gggaagtcgc tctcatgcct tgctgtcccc 240
tcccctgagc caggtgattt gggagacccc ctccttcctt ctttccctac cgccccacgc 300
gcgacccggg gatggctccg tggcctcacg agaacagctc tcttgcccca tggccggacc 360
tccccaccct ggcgcccaat accgccaaca ccagtgggct gccaggggtt ccgtgggagg 420
cggccctagc cggggccctg ctggcgctgg cggtgctggc caccgtggga ggcaacctgc 480
tggtcatcgt ggccatcgcc nggactccga gactccagac catgaccaac gtgttcgtga 540
cttcgctggc cgcagccgac ctggtgatgg gactcctggt ggtgccgccg gcggccacct 600
tggcgctgac tggccactgg cgttgggcgc cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga 660
cgtgctgtgt gtgaccgcca gcatcgaaac cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct 720
ggctgtgacc aacccgctgc gttacggcgc actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc 780
tgtggtcctg gtgtgggtcg tgtcggccgc ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg 840
gtggcgcgta ggggccgacg ccgaggcgca gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc 900
cttcgcctcc aacatgccct acgtgctgct gtcctcctcc gtctccttct accttcctct 960
tctcgtgatg ctcttcgtct acgcgcgggt tttcgtggtg 1000
<210> 5
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光A型探针，与ABCA1 rs2230806
SNP位点结合。
<400>5
caaaggagaa act 13
<210>6
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光G型探针，与ABCA1 rs2230806
SNP位点结合。
<400>6
caagggagaa act 13
<210>7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于ABCA1 rs2230806
SNP序列扩增的正向引物。
<400> 7
aagtctgtgc aatggatcaa aa 22
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于ABCA1 rs2230806
SNP序列扩增的反向引物。
<400>8
ctcaccagga ttggcttcag 20
<210> 9
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光G型探针，与 LPL rs320 SNP位点结合。
<400>9
agcgtttata cta 13
<210>10
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光T型探针，与LPL rs320 SNP位点结合。
<400>10
agcttttata cta 13
<210>11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于LPL rs320 SNP序列扩增的正向引物。
<400> 11
ccacccatgt gtacccataa a 21
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于LPL rs320 SNP序列扩增的反向引物。
<400>12
tttggtgata caagcaaatg ac 22
<210> 13
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光C型探针，与PPARG rs1801282
SNP位点结合。
<400>13
gacccagaaa gcg 13
<210>14
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光G型探针，与PPARG rs1801282
SNP位点结合。
<400>14
gacgcagaaa gcg 13
<210>15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于PPARG rs1801282
SNP序列扩增的正向引物。
<400> 15
gcaaacccct attccatgct 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于PPARG rs1801282
SNP序列扩增的反向引物。
<400>16
tacataaatg cccccacgtc 20
<210> 17
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光C型探针，与ADRB3 rs4994 SNP位点结合。
<400>17
gcccggactc cga 13
<210>18
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光T型探针，与ADRB3 rs4994 SNP位点结合。
<400>18
gcctggactc cga 13
<210>19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于ADRB3 rs4994 SNP序列扩增的正向引物。
<400> 19
atccagtacc ccttggttcc 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于ADRB3 rs4994 SNP序列扩增的反向引物。
<400>20
gtttccctga ggctgtcttg 20
Claims (2)
1.一种脂质代谢型肥胖基因体质评估方法，其特征在于，具体步骤为
步骤1：检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；
步骤2：基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时－2.5小时，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；
步骤3：荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806；脂蛋白脂酶（LPL）rs320；过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282；肾上腺素受体（ADRB3）rs4994，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan®-MGB技术，进行检测试剂合成；
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10µl，即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl 25mM MgCl2溶液、0.02µl（5units/µl）Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、4个位点分别采用不同的正向引物（20µM，0.225µl）、反向引物（20µM，0.225µl）、VIC荧光探针（10µM，0.25µl）和FAM荧光探针（10µM，0.25µl）工具进行检测（探针、引物、序列如下）；
三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806
带VIC荧光A型探针 CAAaGGAGAAACT
带FAM荧光G型探针 CAAgGGAGAAACT
正向引物 AAGTCTGTGCAATGGATCAAAA
反向引物 CTCACCAGGATTGGCTTCAG
cataaattgc aaaatagtga
ggatgttgtt catctaataa aagtggttcc aggaattcag
actctggatt cctgtttgcc
aaatcatgtg tcccactctt aagaaaacga gttggactct
ggatttttct ttgcaagagg
gacaagagtg tgggagatac tgagttaatg caacttgcag
gttttaagtg tcctgtcatt
gtgccttgtg ctttgataca ttctgagttt cagtaaagag
acctgatgca ttggactgtt
gcaatggaac ctgttttaag atcttcaaag ctgtattgat
atgaagttct ccaaaagact
tcaaggaccc agcttccaat cttcataatc ctcttgtgct
tgtctctctt tgcatgaaat
gcttccaggt atttttgcaa ggctaccagt tacatttgac
aagtctgtgc aatggatcaa
aatcagaaga gatgattcaa cttggtgacc aagaagtttc
tgagctttgt ggcctaccaa
rggagaaact ggctgcagca gagcgagtac ttcgttccaa
catggacatc ctgaagccaa
cctggtgagt agacttgctc actggagaaa cttcaagcac
taatgctttc ggaatgtgag
gcttttcctt ggacagcatg actttgtttt gtagaaaagt
acggctggct gggagtttgt
gatataattt agttcagtgg tattctaagt gttcttagtg
ttctttcaga cttttgggcc
atctcccaaa gggtgaatgg gaagaataag ctgggtgtgg
ctgagtttaa gccaaaagtt
ttttgtgctt gtttcaatca gagaagacct gctttttcat
gtttttacta ttataatact
aagcaagagc tcatttgaaa acagagttct tcatatttaa
aaaaaaaaag tcttgaaacc
attgatggga agatggatat ctatttatgt ttaaaaaccc
atcataaaga tgacattgtg
ggctgtcaca gttggaaggc
脂蛋白脂酶（LPL）rs320
带VIC荧光G型探针 AGCgTTTATACTA
带FAM荧光T型探针 AGCtTTTATACTA
正向引物 CCACCCATGTGTACCCATAAA
反向引物 TTTGGTGATACAAGCAAATGAC
aggagagact cagaaaaagt
aattaaatgt atttttcttc cttcacttta gacccccacc
tgatgtcagg acctaggggc
tgtatttcag gggccttcac aattcaggga gagctttagg
aaaccttgta tttattactg
tatgatgtag attttcttta ggagtcttct tttattttct
tatttttggg gggcaggggg
ggggaagtga cagtattttt gtatttcatg taaggaaaac
ataagccctg aatcgctcac
agttattcag tgagagctgg gattagaagt caggaatctc
agcttctcat ttggcactgt
ttcttgtaag tacaaaatag ttagggaaca aacctccgag
atgctacctg gataatcaaa
gattcaaacc aacctcttca agaagggtga gattccaaga
taatctcaac ctgtctccgc
agccccaccc atgtgtaccc ataaaatgaa ttacacagag
atcgctatag gatttaaagc
ktttatacta aatgtgctgg gattttgcaa actatagtgt
gctgttattg ttaatttaaa
aaactctaag ttaggattga caaattattt ctctttagtc
atttgcttgt atcaccaaag
aagcaaacaa acaaacaaaa aaaaaaagaa aaagatcttg
gggatggaaa tgttataaag
aatctttttt acactagcaa tgtctagctg aaggcagatg
ccctaattcc ttaatgcaga
tgctaagaga tggcagagtt gatcttttat catctcttgg
tgaaagccca gtaacataag
actgctctag gctgtctgca tgcctgtcta tctaaattaa
ctagcttggt tgctgaacac
caggttaggc tctcaaatta ccctctgatt ctgatgtggc
ctgagtgtga cagttaatta
ttgggaatat caaaacaatt acccagcatg atcatgtatt
atttaaacag tcctgacaga
过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282
带VIC荧光C型探针 GACcCAGAAAGCG
带FAM荧光G型探针 GACgCAGAAAGCG
正向引物 GCAAACCCCTATTCCATGCT
反向引物 TACATAAATGCCCCCACGTC
agctttctgg tatttcataa
gcaagagatt taagttttcc atttaagaag caattgtgaa
ttttacaaca ataaaaaatg
caagtggata ttgaacagtc tctgctctga taattctaaa
tacagtacag ttcacgcccc
tcacaagaca ctgaacatgt gggtcaccgg cgagacagtg
tggcaatatt ttccctgtaa
tgtaccaagt cttgccaaag cagtgaacat tatgacacaa
ctttttgtca cagctggctc
ctaataggac agtgccagcc aattcaagcc cagtcctttc
tgtgtttatt cccatctctc
ccaaatattt ggaaactgat gtcttgactc atgggtgtat
tcacaaattc tgttacttca
agtctttttc ttttaacgga ttgatctttt gctagataga
gacaaaatat cagtgtgaat
tacagcaaac ccctattcca tgctgttatg ggtgaaactc
tgggagattc tcctattgac
scagaaagcg attccttcac tgatacactg tctgcaaaca
tatcacaagg taaagttcct
tccagatacg gctattgggg acgtgggggc atttatgtaa
gggtaaaatt gctcttgtag
ttgtcttcca ggttgtgttt gttttaatac tatcatgtgt
acactccagt attttaatgc
ttagctcgtt gctatcgcgt tcatttaaaa acatgttcag
aaccttaaaa aaggaaacct
aacctaatct attttatctc tgtgcatggc tcccatttcc
tgaattttaa gcattaaagg
tatagttata tccaaaaaca atcctgttca tttttatttc
ctgagtttgc atagatttcc
caagaataca taagggcttt ttagacttga agggtcactt
tttcctcttt tcatctcata
tgttagagat ctctcataac tgtttttatc cctcttgcag
cacttttatt cctcttgaag
tactctcagc tcttttctgt
肾上腺素受体（ADRB3）rs4994
带VIC荧光C型探针 GCCcGGACTCCGA
带FAM荧光T型探针 GCCtGGACTCCGA
正向引物 ATCCAGTACCCCTTGGTTCC
反向引物 GTTTCCCTGAGGCTGTCTTG
ttcctccaga tttagctaaa
ggaaacgtgg agcatcccat tggccatcct ccccactctc
caattcggct ccagaggccc
ctccagacta taggcagctg cccctttaag cgtcgctact
cctcccccaa gagcggtggc
accgagggag ttggggtggg gggaggctga gcgctctggc
tgggacagct agagaagatg
gcccaggctg gggaagtcgc tctcatgcct tgctgtcccc
tcccctgagc caggtgattt
gggagacccc ctccttcctt ctttccctac cgccccacgc
gcgacccggg gatggctccg
tggcctcacg agaacagctc tcttgcccca tggccggacc
tccccaccct ggcgcccaat
accgccaaca ccagtgggct gccaggggtt ccgtgggagg
cggccctagc cggggccctg
ctggcgctgg cggtgctggc caccgtggga ggcaacctgc
tggtcatcgt ggccatcgcc
yggactccga gactccagac catgaccaac gtgttcgtga
cttcgctggc cgcagccgac
ctggtgatgg gactcctggt ggtgccgccg gcggccacct
tggcgctgac tggccactgg
cgttgggcgc cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga
cgtgctgtgt gtgaccgcca
gcatcgaaac cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct
ggctgtgacc aacccgctgc
gttacggcgc actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc
tgtggtcctg gtgtgggtcg
tgtcggccgc ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg
gtggcgcgta ggggccgacg
ccgaggcgca gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc
cttcgcctcc aacatgccct
acgtgctgct gtcctcctcc gtctccttct accttcctct
tctcgtgatg ctcttcgtct
acgcgcgggt tttcgtggtg
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806；脂蛋白脂酶（LPL）rs320；过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282；肾上腺素受体（ADRB3）rs4994四张图;
步骤4：SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；
（1）、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）rs2230806
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为AA基因型、坐标轴右上区域为AG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（2）、脂蛋白脂酶（LPL）rs320
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型，
（3）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）rs1801282
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴中间区域为CG基因型、坐标轴右下区域为GG基因型，
（4）、肾上腺素受体（ADRB3）rs4994
在检测结果图中，坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型。
2.权利要求书1中的所述的四个基因的组合模式。
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