CN1038330C

CN1038330C - 阿弗麦菌素的生产与分离

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Publication number: CN1038330C
Application number: CN94109161A
Authority: CN
Inventors: E·帕斯奎诺
Original assignee: SETEX SA
Current assignee: SETEX SA
Priority date: 1993-07-05
Filing date: 1994-07-05
Publication date: 1998-05-13
Anticipated expiration: 2014-07-05
Also published as: CN1106817A

Abstract

在与水混溶的溶剂存在下，通过将Streptomyces avermitilis菌株发酵液均质化，采用选自聚丙烯酸酯和酚-醛缩聚共聚物的树脂吸附阿弗麦菌素，接着用水/与水混溶溶剂混合物梯度洗脱，从所述发酵液中分离A_1a、B_1a、B_1b类阿弗麦菌素。其发酵液可由Streptomyces avermitilisVKMAC-1475D新菌株得到。

Description

阿弗麦菌素的生产与分离

本发明涉及阿弗麦菌素(avermectines)生产与分离的方法。更具体地说，本发明涉及A_1a、B_1a和B_1b类阿弗麦菌素，尤其是B_1a类阿弗麦菌素的分离。阿弗麦菌素是一组细菌代谢物，正如德国专利2717040中所描述的，它们是由产生这些化合物的菌株发酵得到的。还涉及具有杀寄生虫活性能力、符合结构(I)(如图1所示)的大环内酯，并且这些各自不同的成分是：

阿弗麦菌素A_1a R₁＝C₂H₅ R₂＝OCH₃

B_1b R₁＝CH₃ R₂＝OCH₃

B_1a R₁＝C₂H₅ R₂＝OH

B_1b R¹＝CH₃ R₂＝OH

人们知道，为了分离细菌代谢物，有可能使用合成的高交联树脂之类的吸附剂，如专利US4399274中所描述。根据该专利中使用的技术，用交联共聚物处理菌丝体提取物。

现在发现，不是从提取物中，而是从整个发酵液中用两种特定类型的树脂处理比较容易分离阿弗麦菌素：

a)聚丙烯酸酯，它与US4399274描述的树脂不同，不是共聚物；

b)酚-醛缩聚共聚物，它与US4399274描述的树脂不同，该树脂没有官能团，所述共聚物有弱碱性官能。

还发现，使用上述两类树脂中一类树脂时，有可能引向优先制取A_1a和B_1b类阿弗麦菌素的分离方法。

因此，本发明的内容是阿弗麦菌素的分离方法，其特征在于：在与水混溶的溶剂存在下，将产生阿弗麦菌素的Streptomyces avermitilis培养液得到的整个发酵液化，用选自于聚丙烯酸酯和酚-醛缩聚共聚物中的树脂处理这样得到的均化物，利用水/与水混溶的溶剂混合物梯度将吸附在树脂上的阿弗麦菌素游离。

在发酵结束后，将整个发酵液与适当体积的与水混溶的有机溶剂(例如丙酮、甲醇、异丙醇)混合。上述混合物再倒入均质器以便破坏细胞并有利于提取阿弗麦菌素。均质化的物质不经过滤或离心处理直接逆流装入柱中，柱中装有聚丙烯酸酯(如Amberlite^XAD-8或Diaion^HP)或酚-醛缩聚共聚物基体树脂。其树脂用水/溶剂混合物梯度洗涤。采用水/与水混溶的溶剂混合物梯度洗脱已吸附的阿弗麦菌素，该溶剂不必是吸附中使用的相同溶剂。

在使用合适梯度的同时，有可能分离许多阿弗麦菌素。

本发明的分离方法可用于由任何产生阿弗素菌素的菌株得到的发酵液。由新微生物streptomyces avermitilis得到的发酵液特别有利，该新微生物样品寄存在俄罗斯科学院-微生物生物化学和生理学研究所(Puschchino，莫斯科地区)培养物永久保存，其登记号为VKM AC-1475D。菌株VKM AC-1475D是本发明另一方面。经过发酵菌株在此产生有阿弗麦菌的细胞内混合物，其中主要组分是B_1a和A_1a阿弗麦菌素，前者的百分数为18-26％，后者为10-15％。

Streptomyces avermitilis VKM AC-1475D的形态学特征和培养物特征如下：孢子产生物形成具有突出的圆锥中心部分的灰-褐色菌落，通常在整个表面复盖培养介质。在菌落四周有一白边，其他菌落很少出现。

在有机琼脂、Pridham-Gottlieb琼脂、甘油-硝酸盐琼脂、无机琼脂、葡萄糖-天冬酰胺琼脂、燕麦粉琼脂、葡萄糖-硝酸盐琼脂、营养性琼脂上观察到了孢子生成。

有机琼脂

(*)SM：褐黑色 (*)SM＝植物性的培养物

AM：少量灰色 AM＝气生菌丝体

SP：褐黑色 SP＝可溶色素

Pridham-Sottlieb琼脂

(*)AM：带褐色的灰色

甘油-硝酸盐琼脂

(*)AM：少的，白色

SM：赭石桔黄

SP：微不足道，或浅黄

无机琼脂

(*)AM：少，白色

SM：无色或由浅黄到黄褐色

SP：微不足道。

葡萄糖-天冬酰胺琼脂

(*)AM：少，白色

SM：少，无色

SP：无(微不足道)

燕麦粉琼脂

(*)AM：灰色，有时有白色斑点

SM：灰黄色，褐灰色

SP：无

葡萄糖-硝酸盐琼脂

(*)AM：褐灰色

营养性琼脂

(*)AM：混有白色的褐灰色

SM：黑褐色

SP：褐色

在28℃两星期后观察，所有的介质pH都接近中性。

将前述的颜色变化与对已知菌株所作的描述进行仔细比较显示出明显的差别，这表明该微生物应作为Streptomyces avermitilis新菌种分类。

下面实施例说明了回收阿弗麦菌素A_1a、B_1a、B_2a的新方法。这些实施例只是说明性的，而不是对发明性作限制。

制备

Streptomyces avermitilis VKM AC-1475D发酵液。

使用Streptomyces avermitilis VKH AC-1475D得到阿弗麦菌素。将细菌保存在葡萄糖-土豆琼脂斜面上，在+4℃试管中以便试验维生素。至少每月一次应该用同样组合物在新鲜培养基(terrain)上再接种，待保存的培养物应在28℃培养7天。

1.将细菌置于具有下述组合物的琼脂培养斜面上培养与保存：

葡萄糖 10g/L(克/升)

琼脂 15g/L

土豆汁最高达 1L

为了制备土豆汁，将300g土豆放在700ml水中煮沸30分钟。将其溶液离心(6000rpm(转/分)，20分钟)以便制备沉淀汁。为了制备所述培养基，将葡萄糖和琼脂加到土豆汁中，在再加土豆汁直到体积达1升后，然后在灭菌器中于110℃、4.9×10^-2毫巴灭菌30分钟。在灭菌的适当场合下，将培养基转到试管中以试验维生素，试管为15ml，将其试管保持在倾斜位置，直到琼脂培养土完全凉下来。为了得到接种物，将菌株VKM AC-1475D再接种到新的葡萄糖-土豆琼脂斜面(喇叭嘴状琼脂)。其培养物应在试管中于28℃培养5天，以试验维生素(试管的体积：35ml)。

2.在长颈瓶中搅抖制备接种物

2.1利用下述组成的营养培养基在长颈瓶中培养接种物：

乳糖 20g/L

大豆粉 15g/L

酵母自溶产物 5g/L

蒸馏水最多1L用10％NaOH将pH调到7.0-7.2。

为了制备培养基将大豆粉和酵母自溶产物放到蒸馏水中。用力混合其混合物，用NaON溶液将pH调到7.0-7.2并用蒸馏水调到1升。之后将液体培养基分装在长颈瓶中达100ml的量，再于120℃灭菌器中于9.8×10^-2毫巴下灭菌1小时(长颈瓶体积750ml)。

将葡萄糖溶于蒸馏水，装入收集器中，将其体积调到7升，将该内容物于110℃灭菌器中于4.9×10^-2毫巴下灭菌达30分钟。将玉米提取物置于另一容器，在110℃灭菌器中于4.9×10^-2毫巴下灭菌达30分钟。将大豆粉溶于冷水中，倒入发酵罐，在搅拌器运行时，升温到80℃，在80℃保持达30分钟，然后让其冷却到温度为30℃。在装入其它组分后，除葡萄糖和玉米提取物之外，将总体积调到53升，提取试样，测定pH并放入pH测定仪，以10％NaOH溶液将液体培养基的pH调到7.0-7.2。在温度120℃压力9.8×10^-2毫巴下使该培养基灭菌达1小时，将发酵罐中的培养基冷却至温度29-30℃以后，在无菌下将葡萄糖与玉米提取液的灭菌液泵入培养基中，提取培养基试样作生化与微生物学研究。25％乳糖蒸馏水溶液另外在110℃灭菌器中于4.9×10^-2毫巴下灭菌30分钟。在实施接种之前，在无菌条件下将8ml乳糖溶液加到每个已装有液体培养基的长颈瓶中。为了接种长颈瓶中的培养基，取一小部分(小片)有培养液的琼脂培养基，它是用试管取出的以试验维生素，这是在无菌条件下操作的。

2.2接种物在搅拌的长颈瓶中生长

Streptomyces avermitilis VKM AC-1475D接种物于190-200rpm摇床中于28℃生长20-24小时。在摇瓶中培养的接种物应满足以下条件：

1)无污染的微生物；

2)接种物应是稳定的液体，并且是深栗子色；

3)pH应是6.9-7.2；

4)显微外观：很少与隆起的放线菌菌丝聚集。

3.在发酵器中Streptomyces avermitilis VKM AC-1475D的培养

3.1发酵器的准备

在装满料之前，发酵器应严格清洗，并用肥皂水仔细检查在压力14.7×10^-2毫巴下的气密性。准备好的待使用的发酵器装配有pH、O₂和温度的测量仪器。

3.2在发酵器中制备灭菌的营养培养基

对于Streptomyces avermitilis VKM AC-1475D的培养，使用具有下列组成的营养性培养基60升水装料^(*)名称基本物质含量总重量基本物质体积汁

％＜(g/L) g 的％，g(克) L

(克) (升)大豆粉 12 720 720玉米提取物 50 3 180 90葡萄糖 90 65 3900 3510干酵母 6 360CaCO₃ 98 6 360 352.8炔丙醇B-400 0.003蒸馏水最多达60(*)总体积60升，接种物体积50ml培养基应该灭菌并且具有以下生化特性：pH＝7.0-7.2葡萄糖含量＝5.0-7.9％发酵器中营养培养基用长颈瓶中培养的接种物接种。3.3Streptomyces avermitilis VKN AC-1475D的培养产生阿弗麦菌素的培养于发酵器中按以下条件进行：

温度：28°±1℃

开始搅拌：200rpm(转/分)

开始通气量：0L(升)/分当pO₂值降低到饱和时的60％时，应该使转数增加到400-450rpm并使空气供量增加到12-15L/分，即每单位体积培养基每分钟为0.2-0.25单位体积空气，以保证其pO₂值处在所述的水平。在培养的前24小时内pH值自然下降，之后其重新升高到最高达7.2，以后不再改变，直至发酵结束。培养时生成的泡沫可用炔丙醇B-400含水悬浮液予以除去。观察到18-24小时时生成的泡沫最多，此时生物量急剧增加，并从中放出CO₂。38℃乳化液的消泡沫剂平均消耗量是每次为3升。在培养期间，放线菌菌丝附着在基质颗粒表面，并且引起生成聚集体。

在对数相期间离开聚集体的菌丝长而宽。到培养物生长结束，菌丝聚集体变得更密实。在生长稳定期，菌丝短或完全不能见到。到发酵结束，通常看到放线菌自溶。在显微镜下观察用一片铁盖玻片压着的聚集体是无定形块。发酵时间为143-187小时，平均来说，一般为168小时。基于下述参数判断发酵中止：

-在营养培养基中无葡萄糖；

-阿弗麦菌素B₁的含量不低于100mcg/ml。

发酵结束时，将发酵罐的培养液过滤，并得到用于分离阿弗麦菌素的发酵液。

实施例1

在按照制备中提到的发酵结束时，具有下述组成的30(升)全部发酵液在混合器中与30L丙酮混合；混合器中安装有块速搅拌器：

总阿弗麦菌素 720mg/L(毫克/升)

阿弗麦菌素B_1a+B_1b 150mg/L

阿弗麦菌素A_1a 86mg/L

湿的沉淀物 300g/L

然后将其混合物转移到高压均质器中以便打破细胞。将其均质物直接逆流装入Amberlite^XAD-8柱中，其装料速度为110ml/分。在吸附阶段作为洗出液的1500ml洗份混合物含有与生物量有关的产物，而没有与阿弗麦菌素相关的任何产物。最后用5500ml的50％内酮溶液洗涤以便洗出滞留在树脂中的发酵液。首先用60％丙酮溶液以58ml/分速度洗脱吸附的阿弗麦菌素，回收到750ml的多份洗出液。前四份不含阿弗麦菌素，第5-14份含阿弗麦菌素B_1a，并有相当少量的B_2a。在第15-21份中洗出最大部分的阿弗麦菌素B_1a。阿弗麦菌素A_1a是在用纯丙酮洗脱得到的最后那份中。阿弗麦菌素B_1a和B_1b回收率约是86％。

实施例2

如实施例1那样用等体积甲醇处理全部发酵液得到均质物，将其离心分离。透明的上清液以100ml/分速度装入Duolite^A7柱上(缩聚酚-醛树脂)。用乙醇-水梯度混合物洗脱，并同时用碱性溶液控制洗出液的pH。将第13-20份洗脱液合并蒸发至干，残余物以乙酸乙酯处理。过滤除去不溶解的部分后。透明的滤液在真空下蒸发至干。在用甲醇结晶后得到4.82g阿弗麦菌素B_1a，纯度为86％。

Claims

1.分离阿弗麦菌素的方法，其特征在于：在与水混溶的溶剂存在下，把来自于Streptomyces avermitilis培养液的全部发酵液均质化，将均质物装在含有以选自于聚丙烯酸酯和酚-醛缩聚共聚物的树脂为基体的柱上，以便吸附阿弗麦菌素，利用水/与水混溶的有机溶剂的混合物梯度从树脂上洗脱吸附的阿弗麦菌素。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于：均质物是采用选自于球磨、高压均质机或超声仪的机械方法制备的。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于：将均质物直接逆流装到装有聚丙烯酸酯或酚-醛缩聚共聚物的柱上以便吸附阿弗麦菌素。

4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其特征在于树脂上阿弗麦菌素的洗脱是采用水和与水混溶的有机溶剂混合物梯度进行的，其有机溶剂选自于丙酮、甲醇和异丙醇。

5.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其特征在于整体发酵液来自于菌株VKM AC-1475D。