CN103827670B - 免疫印迹校准条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测患者样品中抗体的一种方法和一种装置。该装置具有至少一个孵育通道，该孵育通道中可以插入一个免疫印迹条，并且在该孵育通道中所述免疫印迹条可以与患者样品、结合物以及底物一起孵育。该装置还具有一个对照，该对照被设计成一个用于目测孵育质量的单独的校准条。

Description

免疫印迹校准条

本发明涉及用于检测患者样品中抗体的一种方法和一种器具，该器具具有至少一个孵育通道，在该孵育通道中可能插入免疫印迹条，并且可能将所述条与患者样品、结合物以及底物一起孵育。此外，该器具具有用于目测孵育质量的对照工具。

在医学实验室诊断学领域中，已知不同的测定系统，使用这些系统可以检验患者样品中特异性抗体的存在。由于在病毒或细菌感染性疾病后在患者体内形成抗体，使用此类测定使得诊断急性病或患者已经经受的另外的疾病成为可能。类似地，当选择相对应地适合抗原时，还可能诊断自身免疫性疾病或过敏。

典型地，通过所谓的分段式诊断学检测抗体，其中首先进行敏感性筛选，并且然后进行特异性确认。在此方面，在常规的血清学中，ELISA（酶联免疫吸附测定）通常用于该筛选，而免疫印迹条，更具体地说是蛋白印迹条、斑点印迹条或线点条（line blot strip），主要用作确认测定。

通过检测特异性患者抗体以及它们所属的具体免疫球蛋白类别，可能得出关于以下两点的结论：已经发生的细菌或病毒感染、或急性存在的细菌或病毒感染，以及感染随时间的进展。例如，免疫球蛋白类别IgM的抗体是所谓的早期抗体，而免疫球蛋白类别IgG的抗体典型地是晚期抗体。

为了确保已经正确进行了具体测定并且因此显示正确结果，具有所谓的功能或反应对照带的免疫印迹是已知的，通过该功能或反应对照带可以检查血清或结合物的加入。在此，该结合物包含一种抗体，该抗体偶联至患者血清中的特异性抗体上并且通常源于另外的动物物种。当已添加任何Ig类别的结合物时，常显现相对应的对照带。

然而，相比之下，不可能使用这些测定系统来针对是否使用该测定必需的特异性Ig类别的结合物得到断言。例如，在以此方式设计的一种测定的情况中，当已经将检验条与结合物孵育时，将总是显现一个带；确切地，这种情况将发生而无论是否使用IgM结合物、IgG结合物或IgA结合物。以此方式，如果IgM检验条错误地与IgG结合物孵育，可能忽略例如早期包柔氏螺旋体（Borrelia）病，因为尽管将显现对照带，真实测定将传递出一个阴性结果。因此，在此情况下，治疗将停止于该疾病的早期并且感染可以不引人注意的转换到晚期。

因此，如果希望的话，在检验条的基础上，能够识别是否已经添加血清以及所添加结合物的功能是否正确。

在此方面，DE10000322A1披露了一种具有至少两个不同对照区的免疫印迹条。所描述的检验条首先具有一个血清对照区，该血清对照区通过相对应的对照带指示该检验条已经与患者血清孵育，并且其次还具有至少一个结合物对照区，该结合物对照区指示该检验条已经与来自另外的动物物种的、标记的抗-患者免疫球蛋白抗体孵育。通过提供多个不同的结合物对照区，可能用相对应的检验条确定提供用于该检验的结合物实际上是否已经使用。此外，在该检验条上可任选地提供传感物断开区，使得检查已满足的正确孵育时间成为可能。

作为检验条上一个替代的传感物断开区，还已知提供了一个单独的、预先显色的（predeveloped）校准条，以便比较患者条上的断开对照与校准条的对应传感物区的颜色强度（参见，来自OrgentecDiagnostika GmbH（欧根泰克诊断股份有限公司）的ORG710ANA-9-Line[710-0803-02-d]（2008年3月）的说明书）。将患者条上的断开对照“施加”到校准条的对应带上并比较颜色强度。以此方式，意图在于检查是否已经在可靠条件下进行了该检验。

现有技术中已知的这些方案的一个问题在于当评估这些测定时，考虑到在实验室中实际上占优势的实验条件通常是不令人满意的。例如，已经预孵育的检验条不允许得出关于单独带在不同实验室条件下将显现的强度的任何结论。类似地，有问题的是以下事实：尽管常用的阳性和/或阴性对照允许对与患者血清和/或用正确的结合物进行的孵育作出陈述，相比之下不可能作出关于该测定结果的定量陈述，尤其是当考虑到在具体检验条上显现的带的具体特性时。此外，在考虑到真实实验室和测定条件时，已知的测定系统不检查随着正确孵育时间的顺应性，或相对应的评估也与相当大量的工作相关联，因为每个检验条需要单独检查。在此方面，例如，测定试剂盒是已知的，其中在每个检验条上提供一个断开区并且一旦在该检验条上显现断开带即停止孵育。以此方式进行检验显现出是不利的，特别是对于实验室技术领域朝向日益增大的自动化程度需求的发展而言，因为必须在整个孵育期间观察检验条。

从已知的测定系统以及还有相关问题继续发展前进，本发明一个目标是限定一种用于评估免疫印迹条的测定系统，通过比较简单的手段，该系统允许首先检查实验参数，更具体地说，检查患者血清和/或正确的结合物的添加，并且其次，校准检验结果，同时考虑实际上占优势的实验条件。此外，有待限定的该测定系统应当使其成为可能或至少适当地易于适配从而实现正确孵育时间的监测。在此，传感物断开区应当特别有效地安排在该测定系统之内。此外，例如处于阳性或阴性对照形式的另外的对照区应当是可易于整合到所限定的测定系统中的。

通过一种用于确定如权利要求1中所要求的患者样品中的抗体的器具，并且还通过如权利要求8中要求的方法，本发明的潜在目标得以实现。本发明的有利实施例是从属权利要求的主题，并且部分参照附图而被更具体地阐明于以下描述中。

根据本发明，进一步开发了一种用于检测患者样品中抗体的器具，该器具具有至少一个孵育通道，该孵育通道中可能插入免疫印迹条并且可能将所述条与患者样品、结合物以及底物一起孵育，并且该器具具有用于目测孵育质量的对照工具，从而使得具有至少两个对照区的单独校准条被提供为对照工具，该对照工具可插入另一个孵育通道中并且可与已知的参比样品、结合物以及底物一起孵育，并且因此，在已经进行孵育之后，基于显现在校准条的至少两个对照区中的对照带的颜色强度与至少一个已孵育的孵育条的至少一个带的颜色强度的比较，可能确定抗体-病原蛋白反应的质量值。质量值是相对于根据本发明的器具理解的，意思是可能相对于至少一个标准确定所进行的测定的质量。

根据本发明的技术方案提供了一种测定系统，该测定系统使得可能在考虑孵育期间实际上占优势的实验室条件的同时易于检查孵育的质量。在此，可想到的是：将显现在校准条上的对照带与显现在患者条上的至少一个带的强度进行比较和/或考虑到该校准条上的至少两个对照带产生一个校准曲线，当评估患者条时，最后查询该曲线。

在本发明一个具体实施例中，校准条上的至少两个对照带在患者样品中相同抗体浓度下以不同强度显现。捕获对照带的强度并且从这些值产生校准曲线。在所述校准曲线的基础上，可能，首先，对进行的孵育质量作出陈述，并且其次，至少半定量地评估显现在患者条上的带。为了进一步改善校准，优选在该校准条上提供超过两个，特别是五个对照带以产生校准曲线。一旦在测定完成后已经产生校准曲线，检查该校准曲线是否在对属于具体测定的批认证限定的值的范围内。

本发明具体另外的开发进一步设想了将用于阴性对照的对照区提供在该校准条上。在阴性对照的对照区中，典型地不显现带，因为该区仅非常薄地涂覆或者与正常地不预期存在于该患者样品中的抗体反应。如果阴性对照的对照区中显现带，在任何情况下都应当检查该测定是否正确进行，因为以下情况至少是高度不可能的：已检定过的参比样品相对于位于所述对照区中的抗原发生了阳性反应。

在本发明的另一个具体实施例中，用于阳性对照的对照区被提供在该校准条上。在所述对照区中，当校准条已经与患者样品孵育时，显现带。基于阳性对照，检查在同一个测定循环中孵育的校准条以及由此的患者条是否已经与患者样品孵育。

在本发明的另外优选的设计中，可想到在该校准条上提供断开对照区。在断开对照的帮助下，检查检验条的计划孵育期是否已满足。当进行该测定时，通常重要的是：在与用其一起处理的患者条相同的条件下孵育校准条。

另外的实施例设想将根据本发明实施的校准条设置对照区，一旦该校准条已经与结合物孵育，在该对照区上显现带。在此方面，该校准条有利地具有至少两个结合物对照区，这些结合物对照区与不同免疫球蛋白类别的患者样品的抗体起反应。优选地，提供至少一个IgG结合物对照以及一种IgM结合物对照。本发明非常具体的另外的开发此外设想了：除IgG结合物对照区以及IgM结合物对照区之外，还提供IgA结合物对照区。

上述结合物对照区确保了，首先，检查校准条以及还有与其一起孵育的至少一个患者条是否已经与结合物孵育，并且，其次，此外还可能检查是否已经使用对于这一情形正确或必需的结合物。

规定的免疫球蛋白类别的结合物的使用在这方面中是重要的，因为所谓的早期抗体（IgM）和晚期抗体（IgG）取决于特定疾病而形成。包含早期抗体但是不含晚期抗体的患者样品，例如，针对包柔氏螺旋体，正常地显示阳性IgM带以及阴性IgG带。如果，错误地，IgM患者条应已经与IgG结合物孵育，这可能导致对患者具有严重后果的假测定结果，特别地，其可能是假-阴性测定结果，例如，一个未检测出的早期感染。因此，具有用于不同免疫球蛋白类别抗体的检测的分离区的患者条与校准条两者的使用是有利的。

在此方面，同样可想到不仅仅是或至少不仅仅是对正确的结合物的使用进行检查，而且还对抗体类别的存在进行检定。通过以此方式展开施行的测定，可以就患者中是否存在抗体缺乏综合征方面来检定患者样品。测定结果因此可以确保具有相对高的精度。

借助于针对来自另外动物物种的第一抗体的经标记的抗体，抗原与抗体的结合优选是可视的。优选地，在此使用酶结合的兔或山羊抗体。

可替代地，本发明的一个具体另外的开发设想了测定试剂盒以此方式实施：使得与患者样品孵育之后，检验条不与来自另外动物物种的第二抗体孵育，而是直接与抗人IgG孵育，并且随后进行洗涤。

由于根据本发明的测定系统涉及与至少一个校准条一起孵育（这些条因此在相同实验条件下孵育）的患者条，仅仅在该校准条上提供用于阳性对照、阴性对照、结合物对照和/或断开对照的适当对照区并且检查孵育已经进行后的校准条是足够的。可能免除另外的单独对照区，否则常在患者条上提供，并且因此免除更多的空间，该空间以用于所述条上存在的另外抗原。

本发明进一步提供用于检测患者样品中抗体的方法，其中患者条首先被插入到孵育通道中并且与患者样品、结合物以及底物一起孵育并且其中孵育质量随后通过对照工具的目测来捕获。根据本发明的方法针对以下事实是值得注意的：作为对照工具，具有至少两个对照区的单独校准条被插入到另外的孵育通道中并且与参比样品、结合物以及底物一起孵育，并且，在已经进行孵育之后，将在该校准条的至少两个对照区中显现的对照带的颜色强度与至少一个孵育的患者条的至少一个带的颜色强度相比较，并且基于该比较，针对在该患者条上发生的抗体-病原蛋白反应确定质量值。

参照附图并在不限制本发明的总体思路的情况下，本发明将在下文中基于示例性实施例进行更加具体地阐述。在此方面：

图1显示：常规的蛋白印迹带，

图2显示：孵育浴，

图3显示：校准条，并且

图4显示：校准曲线的一个图示。

图1显示蛋白印迹检验条1，用于针对可能的包柔氏螺旋体感染对患者样品进行检查。对于该检定，蛋白印迹条1首先被插入到孵育通道3内并且与患者血清孵育。对于该孵育，典型地使用孵育浴2，如图2中显示的。孵育浴2具有多个孵育通道3，使得可能同时孵育对应数目的检验条。

将酶偶联的结合物以及还将底物与该检验条1或这些检验条进行孵育。可替代地，可想到以这样一种方式配置该测定：使用抗人IgG代替该结合物。下文中，仅以实例的方式通过使用来自另外的动物物种的经标记的第二抗体对该测定的施行进行描述，并且因此不意在限制本发明主题。

如果血清包含基于包柔氏螺旋体感染的抗体，则它们结合到固定在检验条上的病原体蛋白上。然后，在该结合物的帮助下，通过来自另外动物物种（兔、山羊）的、用酶标记的第二抗体对该结合抗体进行检测。所述检测通过添加底物进行，该底物与该结合物的酶适当反应。呈蛋白印迹条上的带的模式，测定结果最终变得清楚，这指示包柔氏螺旋体感染的存在。为此目的，将结合至针对包柔氏螺旋体感染具有特异性的抗体的九种不同抗原固定到图1中描述的患者条1上的检验区6中。

上述测定的施行，更具体地说是孵育步骤的顺序，包括多个可能的误差来源。因此，尤其是在常规血清学中，需要监测单独孵育步骤的质量。为此，在图1中描绘的蛋白印迹条上提供另外的对照区。所提供的对照区是结合物对照区7，其中如果已经发生与结合物的孵育，则带变得清楚，以及还有阳性对照8，该阳性对照指示与患者血清的孵育。因此，患者条1首先具有检验区6，该检验区是其中当发生病原蛋白反应时显示对应带的区域。其次，提供了血清和结合物对照区7，8。此处重要的是结合物对照区7进而分为两个或可能的话三个不同的区域，其中在如果IgG结合物或IgM结合物的每种情况下显现一个带，或存在一个第三区域，IgA结合物已经孵育。图1中描绘的患者条1不另外包括功能或反应对照带。

使用图1中描述的检验条1，可以常规地进行包柔氏螺旋体感染的诊断，其中典型地将多个检验条1插入孵育浴2中，该孵育浴包括多个平行的孵育通道3，并且进行孵育。以此方式，多个患者条1可以在相同时间下孵育并且因此可以针对可能的包柔氏螺旋体感染对不同的患者血清进行检定。在图2中描绘了通常还称作托盘的孵育浴2，该孵育浴具有多个孵育通道3。优选地以此方式设计孵育通道3：使得，首先，条1在孵育通道中具有充足的空间并且可以通过用于孵育的介质良好地流动，并且其次，不必要的大量介质无需用于该孵育。

在图3中，描绘了如在根据本发明实施的测定系统中使用的校准条4。校准条4具有校准区9、结合物对照区7以及还有阳性对照8。校准条4被提供为与这个或这些患者条1一起孵育的单独条，并且因此是在相同实验条件下。对于该孵育，校准条4与患者条1两者都被插入到孵育浴2的分离的孵育通道3中，其中患者条1与患者血清、结合物以及底物一起孵育并且校准条4与参比样品、结合物以及底物一起孵育。

在其校准区，校准条4具有七个区域，其中在实际上占优势的实验室条件下，在每种情况下与参比样品正确孵育后，在其强度上彼此不同的校准带显现。

此外，提供具有三个不同区域的结合物对照区7，其中使用了在这些区域中取决于结合物在每种情况下显现的带，即，取决于是否已经使用IgG结合物、IgM结合物或IgA结合物。因此提供具有多个区域的结合物对照7使得不仅检查结合物是否已经孵育，而且另外检查是否已经使用此时需要的结合物类别的结合物成为可能。

此外，校准条4具有阳性对照区8，其中一旦该条已经与患者血清孵育，即显现带。

为补足阳性对照8，可想到提供已经用抗原薄薄地涂覆的阴性对照区，在此程度上涂覆以使得在标准条件下所述区中不显现带。如果已经进行孵育后这一区域中的带变得清楚，在任何情况下应重复该测定以安全地排除误诊。

除上述对照区之外，另外可能地是在校准条4上提供断开对照区，其中当孵育期已经足够长时显现断开对照带，从而确保可靠的测定结果。

因此，图3中描绘的校准条4首先具有被分成七个区域的校准区9，并且其中一旦孵育已经正确进行则产生不同强度的带，并且其次还有，用于结合物对照7以及阳性对照的区域。

此处重要地是校准区9（其中在与已知的参比样品正确孵育后显现不同强度的对照带）的供应。基于这七个对照带，最终产生校准曲线5，如可在图4中所见的。产生校准曲线5后，首先检查该校准曲线是否位于测定试剂盒对应批的容许限度之内。如果是这种情况，这证明了该测定的正确施行。此外，将在这个或这些患者条1（与校准条4同时孵化）上的检验区6中显现的这些带与校准曲线5的值进行比较，即与校准条4上的校准区9中的七个带的强度进行比较。

基于校准条4上显现的带与患者条1上对应带的比较，首先可能监测所进行的孵育的质量，并且其次，可能进行孵育的患者条1的至少半定量的评估。为此，相对于抗原1至7的、患者条1上的检验区6中所述的带与校准条4上的校准区9中的带进行比较。基于这些带的强度比较，可以推测所检定的患者样品的具体效价。

优选地，校准曲线5的产生以及患者条1上显现的这些带的捕获两者和/或这些患者带与校准带的比较自动进行。已经进行孵育之后，将检验条1放置或卡在适合的底部上，并且对校准条4和患者条1的表面进行拍照或扫描并转移到优选运行一个特定实验室软件的电子数据处理单元上。

作为补充，可想到一个评估软件，以从表示记录的颜色强度的输入信号中减去由背景记录引起的信号比例。

中央数据处理单元评估单独带的强度，使得校准曲线5以及对应的测定结果经由输出单元（优选一个监测仪或一台打印机）输出成为可能。

基于校准条4的校准区9中七个具有不同强度的校准带的强度与这个或这些患者条1上检验区6中所示的这些带的强度的比较，可能获得关于所检定患者样品中抗体浓度的信息并且由此可能获得至少半定量的测定结果。在此重要是校准条4的孵育在与这个或这些患者条1的孵育相同的实验条件下发生。

参考符号清单

1 患者条

2 孵育浴

3 孵育通道

4 校准条

5 校准曲线

6 检验区

7 结合物对照区

8 阳性对照

9 校准区

Claims (5)

1.一种用于检测患者样品中抗体的器具，该器具具有至少一个孵育通道(3)，该孵育通道中能插入一个患者条(1)并且用于将该患者条(1)与患者样品、结合物以及底物一起孵育，并且该器具具有一个用于目测孵育质量的对照工具，

其特征在于，所述对照工具是一个单独校准条(4)，该校准条(4)能插入到一个另外的孵育通道(3)中，并具有以这样的方式实施的至少两个对照区：使得由于与参比样品、结合物以及底物孵育，在这些对照区中的各对照带以这些对照带颜色强度不同的方式变得可视，

并且其中，该器具以这样的方式实施：首先，考虑不同颜色强度能产生一个校准曲线，其次，基于该校准曲线，能确定该患者条(1)上发生的抗体-病原蛋白反应的质量值以及还有关于所检测的患者样品中抗体浓度的信息。

2.如权利要求1中所要求的器具，

其特征在于该校准条(4)上的这些至少两个对照区中的这些对照带在与该患者样品中相同的抗体浓度下以不同颜色强度显现。

3.如权利要求1中所要求的器具，

其特征在于该校准条(4)上的这些至少两个对照区中的这些对照带各自与参比样品中提供的抗体特异性地反应。

4.如权利要求1至3的任一项中所要求的器具，

其特征在于该校准条(4)具有至少一个结合物对照区，一旦该校准条(4)已经与结合物孵育，该结合物对照区中即显现带。

5.如权利要求1至3的任一项中所要求的器具，

其特征在于该校准条(4)具有IgM结合物对照区、IgG结合物对照区、并且还有IgA结合物对照区，一旦该校准条已经与IgM结合物、IgG结合物和/或IgA结合物孵育，在每种情况下，相应结合物对照区中即显现带。