[go: up one dir, main page]

CN103820452A - 一种sgRNA片段及其应用 - Google Patents

一种sgRNA片段及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103820452A
CN103820452A CN201410067479.0A CN201410067479A CN103820452A CN 103820452 A CN103820452 A CN 103820452A CN 201410067479 A CN201410067479 A CN 201410067479A CN 103820452 A CN103820452 A CN 103820452A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
dna
sgrna
gene
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410067479.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103820452B (zh
Inventor
郑敦武
黎妃凤
刘津
欧阳应斌
俞晓峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Race (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Race (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Race (suzhou) Biological Technology Co Ltd filed Critical Race (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201410067479.0A priority Critical patent/CN103820452B/zh
Publication of CN103820452A publication Critical patent/CN103820452A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103820452B publication Critical patent/CN103820452B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种sgRNA片段，其DNA序列包括一段固定序列和一段DNA识别序列。sgRNA可识别目的基因上的双链上的不同靶位点，可与一种核酸酶结合并通过识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行随机剪切，随后从切口处脱落，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。本发明还公开了一种基因定点改造方法。本发明还公开了一种基因打靶试剂盒。本发明阐述了可用于小鼠Myod1基因的一系列sgRNA，其打靶效率高，构建时间短，费用低廉，可高效的应用于小鼠Myod1基因打靶。

Description

一种sgRNA片段及其应用
技术领域
本发明属于基因修饰技术领域，具体涉及一种sgRNA片段及其应用。 
背景技术
目前市场上同样能达到myod1基因编辑修饰的产品有ZFN靶点识别模块以及TALE靶点识别模块，都是依靠ZFN靶点识别模块以及TALE靶点识别模块特异识别一段DNA序列，并利用Foki核酸酶对双链DNA进行切割，造成DNA断裂后可以启动细胞对DNA的修复，从而实现特定位点的基因操作如基因敲除、基因敲进、基因突变及基因修复等。 
ZFNs(zinc-finger nucleases，ZFNs)曾被认为是最有潜力的基因改造技术，它实现了基因的靶向操作，并得到了广泛的应用。ZFNs的DNA识别域是由一系列锌指蛋白模块串联组成，每个锌指蛋白模块识别并结合DNA链上一个特异的三联体碱基，将目的基因对应的一系列锌指蛋白模块串联在一起即可特异性识别目的基因。然而从商业公司获得高效的ZFNs需要支付高昂的费用，从锌指核酶委员会及Addgene上获得的ZF模块质粒，自行组装针对特定DNA序列的ZFNs，所需的工作量大，花费也十分昂贵，而且最终产生的ZFNs在细胞内会产生细胞毒性，因此有必要发展更为高效的基因定点修饰技术。 
TALEs(transcription activator-like effectors，TALEs)被认为是ZFNs的替代者，TAL的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸，双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系。因此，欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元串联克隆即可，TALE蛋白DNA序列识别结构域能够识别单个碱基对的特性要比锌指蛋白的3碱基识别更富灵活性，在设计的时候可变性更强，它的出现提高了模块蛋白识别DNA链的特异性，可构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶。但是它也是基于蛋白识别碱基序列，工作量较大。 
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供一种sgRNA片段。 
本发明的另一个目的是提供一种含有sgRNA片段的表达载体。 
本发明的又一个目的是提供一种基因定点改造方法。 
本发明的又一个目的是提供一种基因打靶试剂盒。 
技术方案：为了解决上述问题，基于对CRISPR/Cas系统的研究，CRISPR/Cas系统是通过RNA介导的DNA内切酶进行基因组编辑操作，它们就是CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA（trans-acting CRISPR RNA,tracrRNA)。这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。向导RNA包括一段20bp左右的DNA识别区与一段固定序列，其DNA识别区与靶位点处碱基互补，引导Cas9蛋白在结合区随机剪切DNA双链，随后Cas9自行脱落，形成DSB（Double Stranded Breaks）缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制（non-homologous end joining,NHEJ）修复目的基因双链。在修复的过程中易形成移码突变，导致靶位点处基因失去功能。若同时转入基因修饰过的目的基因片段，可靶向定点敲除、插入、突变、修复相应碱基位点。 
本发明的技术方案是：一种sgRNA片段，所述sgRNA片段的DNA序列包括一段固定序列和一段DNA识别序列，其中，所述DNA识别序列是可与目的基因两条链中的一条链碱基互补的DNA序列，所述固定序列为 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT。所述固定序列如SEQ ID NO.1所示。 
其中，上述sgRNA片段的DNA序列具有如下结构：5’Xy-NGG-固定序列-3’，其中X代表A、T、C、G四个碱基中任意一个，y代表DNA识别序列长度，长度为19-21bp。 
其中，上述DNA识别序列其碱基序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.343。 
其中，上述NGG为sgRNA片段通过识别目的基因的PAM（protospacer-adjacent motif）位点，其中N代表A、T、C、G中任意一个。 
一种含有sgRNA片段的表达载体，该表达载体含有权利要求1所述的sgRNA片段。 
其中，上述表达载体可以为pCR-Blunt II-TOPO载体，但不仅限于这种载体，应为所有sgRNA的表达载体。 
一种基因敲除方法，利用所述的sgRNA片段识别目的基因上的双链上的不同靶位点，可与一种核酸酶结合并通过识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行随机剪切，随后从切口处脱落，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。这种核酸酶可以是任意可与sgRNA结合并能发挥上述作用的核酸酶，可以是Cas9核酸酶（CRISPR-associated genes编码，Cas gene编码）。不仅限于Cas9核酸酶。 
其中，所述的sgRNA片段与核酸酶发挥作用的数量为一个或以上。sgRNA或sgRNA表达载体，与Cas9mRNA或Cas9表达载体共转细胞，均可以达到高效修饰小鼠Myod1基因。 
其中，上述sgRNA的表达盒可由U6启动子和上述的sgRNA的DNA序列组成（任意可启动sgRNA表达的启动子）；所述的sgRNA的DNA序列包括一段固定序列和可与目的基因两条链中的一条碱基互补的DNA识别序列组成。 
一种基因打靶试剂盒，包括如下（1）和（2）： 
（1）上述的sgRNA片段；含有sgRNA片段的的表达载体；Cas9mRNA或者Cas9表达载体； 
（2）含有如下DNA片段的重组克隆载体：依次由U6启动子、AflII酶切位点和sgRNA片段的DNA序列及一段终止序列TTTT依次连接而成。 
有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：不同sgRNA打靶载体的构建只需20个碱基的变换，极大的减少了打靶载体构建的时间与金钱成本，且经设计出的sgRNA的打靶效率普遍达到80%以上，比Tales与ZFNs拥有不可比拟的优势。本发明阐述了可用于小鼠Myod1基因的一系列sgRNA，其打靶效率高，构建时间短，费用低廉，可广泛的应用于真核生物基因打靶。 
附图说明
图1菌落PCR得到的sgRNA1和sgRNA2基因片段电泳图；泳道1、2、3：sgRNA1；泳道4、5、6：sgRNA2，泳道7：1000bp DNA Marker； 
图2酶切鉴定Myod1A-gRNA1表达载体和Myod1A-gRNA2表达载体的电泳图；泳道1、2、3：Myod1A-gRNA1表达载体酶切后；泳道4、5、6：Myod1A-gRNA1表达载体酶切后；泳道7、8、9：10000bp DNA Marker。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。 
其中，Easy Pfu购买于北京全式金生物技术有限公司，AP211-11；Gibson AssemblyTM Cloning Kit购买于北京博迈斯生物科技有限公司NEB，E2611S；Premix Taq：宝生物工 程(大连)有限公司（Takara），D331A；BamH I:北京博迈斯生物科技有限公司NEB，R0136S；SalI:北京博迈斯生物科技有限公司NEB，R0138S。 
实施例1： 
目的基因：小鼠Myod1基因。Myod1基因的全长参见SEQ ID NO：344。Ensembl基因编号:ENSMUSG00000009471。Myod1基因含3个外显子，包括以ATG起始密码子的exon1、exon2和以TAG终止的exon3。 
在exon1内寻找目标位点，构建sgRNA（exon1：sgRNA1）表达载体，利用sgRNA1引导Cas9在目标位点产生断裂。sgRNA1：TGCTCATCCTCACGAGC^GCCTGG（-strand），其中sgRNA1的TGG为PAM识别位点。 
在Myod1基因全长上选取部分序列作为结合目标序列，命名为Myod1A，Myod1A的序列为： 
Myod1A5’TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC-3’Myod1A3’ACGTGGGTCCGGGTCCGCGAGCACTCCTACTCGTACACGCGCGCG-5’sgRNA1：TGCTCATCCTCACGAGCGCC； 
sgRNA1中的部分序列TGCTCATCCTCACGAGCGCC正好能与上述序列中的GGCGCTCGTGAGGATGAGCA互补配对从而识别目标序列。 
实施例2sgRNA片段的表达载体的构建 
1、线性化sgRNA1克隆载体pCR-Blunt II-TOPO： 
sgRNA1克隆载体：依次包括小鼠U6启动子、sgRNA片段的DNA识别序列、sgRNA片段的DNA序列的固定序列以及TTTTTT终止序列的环状质粒。用AflII酶进行酶切得到线性化的sgRNA克隆载体。 
2、引物设计：（其中GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为sgRNA片段的DNA序列，由于使用U6启动子，则往往使得20bp的sgRNA识别序列的前面加上一个碱基G，或者把sgRNA5‘端第一个碱基替换为G） 
Primer-F：TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 
Primer-R：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAATAGTTGAACTTTTTCACCGTGGCTCAGCCACGAAAAAAA 
PCR扩增，PCR反应体系如下： 
Figure DEST_PATH_GDA0000485894180000031
PCR扩增条件： 
Figure DEST_PATH_GDA0000485894180000032
Figure DEST_PATH_GDA0000485894180000041
上述引物进行退火延伸，得到140bp双链DNA片段。 
3、利用Gibson assembly[Gibson et al.2009plus supplementary methods].将140bpDNA片段连接到线性化sgRNA1克隆载体pCR-Blunt II-TOPO，得到完整的sgRNA片段的表达质粒。 
4、转化，菌落PCR鉴定，质粒酶切鉴定。 
1）挑取转化后的单克隆菌落，进行菌落PCR鉴定 
PCR鉴定引物： 
Product primer F：gRNA1-鉴定-F：TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG（共用上游引物） 
Product primer R：Myod1A-gRNA1vector-R： 
GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGGCGCTCGTGAGGATGAGCAC， 
菌落PCR反应体系： 
Figure DEST_PATH_GDA0000485894180000042
菌落PCR反应条件： 
Figure DEST_PATH_GDA0000485894180000043
得到的产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到产物为379bp片段，如图1所示。 
2）质粒酶切鉴定 
用BamH I酶切鉴定Myod1A-sgRNA1表达载体，应得到长度为451bp和3524bp的片段；用Sal I酶切鉴定Cas9表达载体，应得到长度为1475bp，2188bp和5890bp的片段。 
Myod1A-sgRNA1表达载体酶切体系： 
Myod1A-sgRNA1表达载体:2μL（1μg） 
Cutsmart buffer:      2.5μL 
BamH I:          0.5μL（10U） 
水：             20μL 
上述酶切体系在37℃，反应1小时。 
Cas9表达载体酶切体系： 
Cas9表达载体:    2μL（1μg） 
Cutsmart buffer: 2.5μL 
Sal I:           0.5μL（10U） 
水：             20μL 
上述酶切体系在37℃，反应1小时。 
用琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示。 
3）测序鉴定（由上海Invitrogen测序） 
将步骤2）得到的片段测序，结果正确。 
实施例3试剂盒的应用 
1、试剂盒中包含了所有Myod1的打靶sgRNA质粒，将其与Cas9质粒转化至小鼠ES细胞中是按照下列方法：将sgRNA表达质粒（4Kb，2ng/μL）与Cas9表达质粒(9.6Kb，4.8ng/μL)等摩尔浓度混合注射到细胞中即可。 
2、本实施例注射了66个B6受精卵，存活53个受精卵（存活率：0.81），移植到2个代孕母鼠体内，获得5个12.5天胎龄的胚胎。 
3、用引物Rosa-F/Rosa-R对14个样品进行PCR扩增，PCR产物分别送往上海生工，Invitrogen公司进行测序，小鼠myod1基因敲除的效率达到80%以上。 
Rosa-F:TCACCGTCTTTCAATTCTG 
Rosa-R:TGGCGTTGCGCAGGATCTCCACC 
结果如下： 
突变位点主要发生在PAM位点后发生6bp（CCTGG）的删除。 
序列数据： 
野生型： 
野生型：TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
主峰：TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
1号样品：生工测序结果： 
野生型：TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
主峰：TGCACCCAGGCCCAGGC---------GATGAGCATGTGCGCGCGC 
套峰：TGCACCCAGGCCCAGG------CGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
（主峰：删除9bp；套峰：删除6bp+替换1bp） 
2号样品：生工测序结果： 
野生型：TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
主峰：TGCACCCAGGCCCAGGC------GAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
套峰：TGCA--------------------AGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
（主峰：删除6bp；套峰：删除20bp） 
3号样品：生工测序结果： 
野生型：TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
主峰：TGCACCCAGGCCCAGGC------GAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
套峰：TGCACCCAGGCCCAGG--------TGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
(主峰：删除6bp；套峰：删除8bp+替换1bp) 
4号样品：生工测序结果： 
野生型：TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
主峰：TGCACCCAGGCCCAGGCGGGGGGAAAACCCCCCCCCCCCTCCCCC 
5号样品：生工测序结果： 
野生型：TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
主峰：TGCACCCAGGCCCAGGCGCTCGTGAGGATGAGCATGTGCGCGCGC 
实施例4 
与实施例3基本相同，所不同的在于采用的sgRNA不同，分别采用了5’Xy-固定序列-NGG3’，其中固定序列为序列表中的SEQ ID NO.1，其中Xy的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.343，将上述sgRNA分别命名为sgRNA2～sgRNA343，并将上述序列进行打靶小鼠ES细胞实验，其中成功率达到了85%以上。 
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 
Figure IDA0000470288330000031
Figure IDA0000470288330000041
Figure IDA0000470288330000061
Figure IDA0000470288330000081
Figure IDA0000470288330000091
Figure IDA0000470288330000101
Figure IDA0000470288330000111
Figure IDA0000470288330000121
Figure IDA0000470288330000131
Figure IDA0000470288330000141
Figure IDA0000470288330000151
Figure IDA0000470288330000161
Figure IDA0000470288330000171
Figure IDA0000470288330000181
Figure IDA0000470288330000191
Figure IDA0000470288330000201
Figure IDA0000470288330000221
Figure IDA0000470288330000231
Figure IDA0000470288330000241
Figure IDA0000470288330000251
Figure IDA0000470288330000261
Figure IDA0000470288330000281
Figure IDA0000470288330000301
Figure IDA0000470288330000311
Figure IDA0000470288330000341
Figure IDA0000470288330000351
Figure IDA0000470288330000361
Figure IDA0000470288330000371
Figure IDA0000470288330000381
Figure IDA0000470288330000401
Figure IDA0000470288330000421
Figure IDA0000470288330000431
Figure IDA0000470288330000451
Figure IDA0000470288330000461
Figure IDA0000470288330000471
Figure IDA0000470288330000481
Figure IDA0000470288330000491
Figure IDA0000470288330000501
Figure IDA0000470288330000511
Figure IDA0000470288330000521
Figure IDA0000470288330000541
Figure IDA0000470288330000551
Figure IDA0000470288330000561
Figure IDA0000470288330000581
Figure IDA0000470288330000591
Figure IDA0000470288330000601

Claims (10)

1.一种sgRNA片段，其特征在于，所述sgRNA片段的DNA序列包括一段固定序列和一段DNA识别序列，其中，所述DNA识别序列是可与目的基因两条链中的一条链碱基互补的DNA序列，所述固定序列为GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT。
2.根据权利要求1所述的一种sgRNA片段，其特征在于，所述sgRNA片段的DNA序列具有如下结构：5’Xy-NGG-固定序列-3’，其中X代表A、T、C、G四个碱基中任意一个，y代表DNA识别序列长度，长度为19-21bp。
3.根据权利要求1所述的一种sgRNA片段，其特征在于，所述DNA识别序列其碱基序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.343。
4.根据权利要求2所述的一种sgRNA片段，其特征在于，所述NGG为sgRNA片段通过识别目的基因的PAM位点，其中N代表A、T、C、G中任意一个。
5.一种含有sgRNA片段的表达载体，其特征在于，该表达载体含有权利要求1所述的sgRNA片段。
6.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pCR-BluntII-TOPO载体。
7.一种基因敲除方法，其特征在于，利用权利要求1所述的sgRNA片段可识别目的基因上的双链上的不同靶位点，可与一种核酸酶结合并通过识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行随机剪切，随后从切口处脱落，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。
8.根据权利要求7所述基因敲除方法，其特征在于，所述的sgRNA片段与核酸酶发挥作用的数量为一个或以上。
9.根据权利要求7所述的基因敲除方法，其特征在于，所述sgRNA的表达盒由U6启动子和所述的sgRNA片段的DNA序列，及一段终止序列TTTTTT组成；所述的sgRNA片段的DNA序列包括一段固定序列和可与目的基因两条链中的一条链碱基互补的DNA识别序列组成。
10.一种基因打靶试剂盒，其特征在于，包括如下（1）和（2）：
（1）权利要求1所述的sgRNA片段；权利要求5所述的含有sgRNA片段的表达载体；
（2）含有如下表达载体，但不仅限于下列表达载体：DNA片段的重组克隆载体：依次由U6启动子、AflII酶切位点和sgRNA完整碱基序列及一段终止序列TTTTTT依次连接而成。
CN201410067479.0A 2014-02-27 2014-02-27 一种sgRNA片段及其应用 Active CN103820452B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410067479.0A CN103820452B (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种sgRNA片段及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410067479.0A CN103820452B (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种sgRNA片段及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103820452A true CN103820452A (zh) 2014-05-28
CN103820452B CN103820452B (zh) 2016-09-07

Family

ID=50755741

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410067479.0A Active CN103820452B (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种sgRNA片段及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103820452B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105316322A (zh) * 2015-09-25 2016-02-10 北京大学 一种sgRNA碱基错配靶位点文库及其应用
CN105316321A (zh) * 2015-09-25 2016-02-10 北京大学 一种sgRNA分子及其应用
CN105316335A (zh) * 2015-09-25 2016-02-10 北京大学 一种特异性sgRNA分子及其应用
CN108103586A (zh) * 2017-10-13 2018-06-01 上海科技大学 一种CRISPR/Cas9随机文库及其构建和应用
CN111808820A (zh) * 2020-06-01 2020-10-23 贵州省种畜禽种质测定中心 基于CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法
CN114540325A (zh) * 2022-01-17 2022-05-27 广州医科大学 靶向dna去甲基化的方法、融合蛋白及其应用
CN117987436A (zh) * 2024-04-03 2024-05-07 南京鸿明生物科技有限公司 一种双链靶dna序列的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343120A (zh) * 2013-07-04 2013-10-09 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468A (zh) * 2013-07-04 2013-11-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN103388006A (zh) * 2013-07-26 2013-11-13 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343120A (zh) * 2013-07-04 2013-10-09 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468A (zh) * 2013-07-04 2013-11-06 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN103388006A (zh) * 2013-07-26 2013-11-13 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
方锐等: "CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术", 《生物化学与生物物理进展》 *
晁珊珊等: "长丝裂腹鱼MyoD1 基因的克隆及序列分析", 《安徽农业科学》 *
李辉等: "CRISPR/Cas9 新型基因打靶系统的研究进展", 《江苏农业科学》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105316322A (zh) * 2015-09-25 2016-02-10 北京大学 一种sgRNA碱基错配靶位点文库及其应用
CN105316321A (zh) * 2015-09-25 2016-02-10 北京大学 一种sgRNA分子及其应用
CN105316335A (zh) * 2015-09-25 2016-02-10 北京大学 一种特异性sgRNA分子及其应用
CN105316322B (zh) * 2015-09-25 2018-12-07 北京大学 一种sgRNA碱基错配靶位点文库及其应用
CN108103586A (zh) * 2017-10-13 2018-06-01 上海科技大学 一种CRISPR/Cas9随机文库及其构建和应用
CN111808820A (zh) * 2020-06-01 2020-10-23 贵州省种畜禽种质测定中心 基于CRISPRCAS9技术构建MyoD1基因敲除的MDBK细胞系的方法
CN114540325A (zh) * 2022-01-17 2022-05-27 广州医科大学 靶向dna去甲基化的方法、融合蛋白及其应用
CN114540325B (zh) * 2022-01-17 2022-12-09 广州医科大学 靶向dna去甲基化的方法、融合蛋白及其应用
US11965187B2 (en) 2022-01-17 2024-04-23 Guangzhou Medical University Targeted DNA demethylation method, fusion protein and application thereof preliminary class
CN117987436A (zh) * 2024-04-03 2024-05-07 南京鸿明生物科技有限公司 一种双链靶dna序列的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103820452B (zh) 2016-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210147879A1 (en) Large Gene Excision and Insertion
CN103820452A (zh) 一种sgRNA片段及其应用
EP3744844A1 (en) Extended single guide rna and use thereof
US8748134B2 (en) Transcription activator-like effector assembly
US9587252B2 (en) Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing
Sun et al. Site‐S pecific Gene Targeting Using Transcription Activator‐L ike Effector (TALE)‐B ased Nuclease in Brassica oleracea
KR102151065B1 (ko) 동물 배아의 염기 교정용 조성물 및 염기 교정 방법
KR20200091850A (ko) 키메라 게놈 조작 분자 및 방법
US20180105834A1 (en) A method of site-directed insertion to h11 locus in pigs by using site-directed cutting system
CN106467909A (zh) 一种通过核苷酸定点替换获得抗草甘膦水稻的方法
CN113789317A (zh) 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑
CN104560995B (zh) 一对特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用
US20250075233A1 (en) Multiplex editing with cas enzymes
CN104531685A (zh) 特异识别猪H11位点的sgRNA及其编码DNA和应用
KR102151064B1 (ko) 매칭된 5' 뉴클레오타이드를 포함하는 가이드 rna를 포함하는 유전자 교정용 조성물 및 이를 이용한 유전자 교정 방법
CN105647885B (zh) Cas9融合蛋白及其编码序列
WO2023016021A1 (zh) 一种碱基编辑工具及其构建方法
ES2923629T3 (es) Métodos para la introducción sin cicatrices de modificaciones dirigidas en vectores de direccionamiento
Sun et al. Organoid Easytag: an efficient workflow for gene targeting in human organoids
KR102839528B1 (ko) 연장된 단일 가이드 rna 및 그 용도
HK40023048A (zh) 大的基因的切除以及插入
CN104357422A (zh) 转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
CN117126876A (zh) 一种在基因组中定点插入外源序列的方法
GB2594339A (en) Enzymes with RUVC Domains
Yamamoto et al. G3: Genes, Genomes and Genetics

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant