CN103820362A

CN103820362A - 一种生物合成庆大霉素x2工程菌的构建及其应用

Info

Publication number: CN103820362A
Application number: CN201410030147.5A
Authority: CN
Inventors: 洪文荣; 张熠; 林强
Original assignee: Rong De Bio Tech Ltd Gulou District Fuzhou City; Fuzhou University
Current assignee: Rong De Bio Tech Ltd Gulou District Fuzhou City; Fuzhou University
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-01-23
Also published as: CN103820362B

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及生物合成庆大霉素X2基因工程菌的构建及其应用。利用微生物分子遗传学技术，使绛红小单孢菌中庆大霉素的生物合成关键基因失活，阻断庆大霉素生物合成代谢流，定向积累庆大霉素X2。本发明通过构建重组质粒pFU503，并将pFU503导入绛红小单孢菌GK1101，借助框内敲除技术，灭活genB3基因的功能，筛选双交换菌株，发酵产物检测，新组分鉴定，确认为庆大霉素X2产生菌。本发明所构建工程菌，遗传性状稳定，可大量积累庆大霉素X2，填补了国内外研究空白。所构建的工程菌生产工艺简单，发酵调控容易，合成效率高，提取精制方便，产品质量稳定，几乎达到洁净的生产境界，具有重要的产业化应用价值，可产生极大的经济效益。

Description

一种生物合成庆大霉素X2工程菌的构建及其应用

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及生物合成庆大霉素X2基因工程菌的构建及其应用。具体涉及利用分子遗传学技术，敲除绛红小单孢菌M.purpurea GK1101中庆大霉素生物合成关键基因genB3，阻断庆大霉素X2的后续修饰，积累庆大霉素X2，可应用于药物开发研究。

背景技术

微生物是药物的重要来源，是微生物制药的基础。小单孢菌能产生许多重要的抗生素和微生物酶，其合成的氨基糖苷类抗生素在临床上具有重要的应用价值，自瓦克斯曼发现链霉素以来，氨基糖苷类抗生素已经在临床上应用了70年，而且至今仍然是临床上不可缺少的抗感染药物。随着科学家对药用微生物研究的不断深入，小单孢菌被认为是寻找新化合物、新型药物或其他具有生理活性物质的重要资源。

庆大霉素是一类由小单孢菌产生的广谱抗感染氨基糖苷类抗生素。几十年的研究证明，庆大霉素经过不同化学基团修饰，可有效对付^-耐药菌感染。庆大霉素的结构特征是：由2-脱氧链霉胺(2-DOS)，绛红糖胺和加拉糖胺通过糖苷键连接而成。因绛红糖胺取代基团和取代位置的不同，形成了庆大霉素A、B、X和C族等化合物。庆大霉素A、B、X是庆大霉素生物合成途径的中间产物，是开发抗原虫药物的重要化合物。此外，庆大霉素类衍生物还具有抗HIV效果。因此利用分子遗传学技术定向改造庆大霉素生物合成途径，对积累庆大霉素单组份中间代谢产物具有重要的科学意义和现实意义。

随着分子生物学技术的发展，分子遗传学技术已成为后基因组时代阐明基因功能及工程菌构建的重要手段。庆大霉素生物合成基因簇（GenBake accession nos.：JQ975418，AJ628149，AY524043，AJ575934）的构建与测序，为研究该类药物的深度开发奠定了坚实基础。生物信息学的发展，为庆大霉素生物合成基因功能的预测及其生物合成途径的阐明创造了条件。根据生物信息学知识及已有研究成果推断庆大霉素生物合成基因簇上的genB3基因可能编码氨基转移酶，有可能是催化绛红糖胺C6′的氨基转移。理论推测，敲除绛红小单孢菌M.purpurea GK1101（专利：201110331534.9）中genB3基因，可能定向积累庆大霉素X2，得到主产庆大霉素X2的基因工程菌。

氨基寡糖功能研究，特别是抗原虫，抗病毒，抗肿瘤功能方面的研究，是当前国际研究的热点。氨基寡糖被药物学家看作是最有可能成为抗病毒和抗肿瘤药物的一类化合物。庆大霉素B族、X族化合物早已被证明具有抗原虫，抗病毒功效，是开发新型药物的重要前体。庆大霉素生物合成过程，含有许多重要的氨基寡糖，但是它们仅仅是氨基寡糖生物合成的中间体，要获得这些重要的化合物，十分困难，国内外少见取得突破。本研究通过生物信息学技术，结合微生物分子遗传学操作技术，在建立了系统的小单孢菌基因组改造的基础上，成功地实现了对绛红色小单孢菌该基因组的改良，在国际上首次得到了主产庆大霉素X2工程菌，为产业化生产庆大霉素X2奠定了坚实基础，为进一步开发新型药物奠定了创造了条件。本发明是在前一发明专利（201110331534.9）的基础上，进一步拓展，是前一发明专利的深化，属系列性专利。

发明内容

本发明的目的在于提供生物合成庆大霉素X2基因工程菌的构建及其应用，通过构建重组质粒pFU503，并将pFU503导入绛红小单孢菌GK1101，借助框内敲除技术，灭活genB3基因的功能，筛选双交换菌株，发酵产物检测，新组分鉴定，确认为庆大霉素X2产生菌。本发明所构建工程菌，遗传性状稳定，可大量积累庆大霉素X2，填补了国内外研究空白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生物合成庆大霉素X2工程菌，所述的工程菌为绛红色小单孢菌，该菌株被命名为Micromonospora purpurea GKB3226，该菌株已于2013年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，其保藏编号为CGMCC No.8597。

工程化庆大霉素生物合成菌株绛红色小单孢菌（包括棘孢小单孢菌），迫使庆大霉素生物合成停止在庆大霉素X2位点，不再进一步修饰，形成其它庆大霉素混合物，大量积累庆大霉素X2。

在已敲除genK基因的绛红色小单孢菌GK1101基础上，进一步敲除genB3基因。

敲除genB3基因的关键序列，以达到丧失该基因功能为最终目的。

基因工程菌的构建方法，主要包括以下步骤：

A.同源重组质粒pFU503的构建；

B.同源重组质粒pFU503导入绛红色小单孢菌GK1101；

C.接合子的筛选；

D.工程菌组分的鉴定。

利用所述的基因敲除方法，经PCR分别获得genB3基因上下游大约2000bp的两个片段，作为交换臂，将两者同时连接到pKC1139中，得到同源重组质粒pFU503。

转化是以E coliET12657/pUZ8002介导的结合转移方法。

借助抗性标记，筛选双交换工程菌，删除特定DNA序列，获得经生物合成且积累庆大霉素X2的工程菌。

所述的生物合成庆大霉素X2工程菌，在抗生素药物制备中的应用。

基因敲除的方法是：借助PCR技术，扩增genB3上下游序列各2000 bp左右的片段，作为同源交换臂，两个交换臂连接到穿梭载体pKC1139上，得到同源重组质粒pFU503，载体pKC1139上的安普霉素抗性基因作为后续研究的筛选标记。

重组质粒pFU503通过E.coliET12657(pUZ8002)介导，经结合转移进入绛红小单孢菌M.purpurea GK1101。接合子能在含抗性（安普霉素 Am^R）筛选平板上萌发和生长，经松弛培养数代，再从中筛选安普霉素敏感（Am^S）菌株，通过PCR技术检测，DNA测序验证，确认得到主产庆大霉素X2的基因工程菌株GKB3226。

发酵液经酸碱处理和离子交换树脂提取，除杂精制后，代谢产物采用MS法检测，进行最终确认。

其中基因genB3的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，基因genB3的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的优点在于：利用分子遗传学技术，通过基因敲除法，构建genB3和genK基因缺失的工程菌。该基因工程菌阻断庆大霉素生物合成途径中的关键步骤，迫使代谢过程停留在特定位点，积累庆大霉素X2，填补了国内外工业生产庆大霉素X2的技术空白。同时阐明了genB3基因的功能，对庆大霉素生物合成途径的研究，具有重要的生物学意义。对开发氨基寡糖药物，具有现实意义。

附图说明

图1是庆大霉素X2的化学结构。

图2是genB3敲除方案示意图。

图3是穿梭质粒pFU503及其酶切电泳验证图。（M1:DL5000 DNA Marker、1：EcoR I /Xba I酶切结果、2：EcoR I /XhoI酶切结果、3：XhoI/Xba I酶切结果、M2：λ-EcoT14 I digest DNA Marker）。

图4是genB3基因同源重组及双交换原理图。（1：双交换菌株GKB3226 PCR产物、2:出发菌株GK101 PCR产物、M1:DL5000 DNA Marker）。I：质粒游离存在； II：染色体片段； III：染色体回复突变； IV：染色体双交换

图5出发菌株GK1101与工程菌GKB3226代谢产物的MS图谱（GK1101为出发菌株，450.2为庆大霉素C1a，464.3为庆大霉素C2b；GKB3226为工程菌，483.2为庆大霉素X2。

具体实施方式

实施例1：

1. 穿梭质粒pFU503的构建

根据本实验室构建的庆大霉素生物合成基因簇序列( GenBank Accession Number JQ975418)，利用Verctor NTI 11.5软件，分别在genB3基因上下游扩增交换臂，设计两对引物，分别命名P21/P22、P23/P24。P21（5′- GAATTC CGTGTACGTCCCCTGAATCC-3′，EcoRI），P22（5＇- CTCGAGGGGAGATCCTGACCAGTGAG -3＇，XholI），P23（5＇- CTCGAG TACAACAGCTCCGGCGAGAT-3＇，XholI）,P24（5＇- TCTAGA TACGTCAACGTGCACGGGGT-3＇，XbaⅠ）。提取绛红色小单孢菌染色体DNA，以染色体DNA为模板，利用引物P21/P22，扩增上游交换臂JHB1，长度为2141bp。PCR扩增产物经DNA试剂盒回收，克隆至pMD19-T，得到阳性克隆子，命名为pFU501；利用引物P23/P24，扩增下游交换臂JHB2，长度为2289bp。PCR扩增产物同样经DNA试剂盒回收，克隆至pMD19-T，得到阳性克隆子，命名为pFU502。质粒pFU501（需提供来源）通过(EcoRⅠ/XholⅠ)双酶（需提供来源）切，回收2141bp片段；质粒pFU502（需提供来源）经（XholⅠ/XbaⅠ）双酶切，回收2289bp片段；与此同时，pKC1139经（EcoRⅠ/XbaⅠ）双酶切，回收大片段；将交换臂JHB1、JHB2和pKC1139三个片段混合，酶连。将酶产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，挑取抗性菌落于LB培养液中过夜扩增培养，提取得到阳性克隆子，命名为pFU503。pFU503通过三种不同的限制性内切酶酶切：EcoR I /Xba I双酶切得到6446bp和4442bp，EcoR I /XhoI双酶切得到2147bp、1669bp、7072bp，Xba I/XhoI双酶切得到4777bp、3816bp、2295bp，其酶切电泳验证结果见图3，证明质粒pFU503与预测吻合。穿梭质粒pFU503上含有敲除了genB3基因中998个碱基对的△genB3序列和安普霉素抗性基因aacⅣ（图3）。穿梭载体pFU503构建完毕。

2. 穿梭质粒pFU503导入绛红小单孢菌GK1101

将穿梭质粒pFU503转入E.coli ET12567 (pUZ8002)中，得到供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002，pDB303)。然后通过结合转移的方法，转化绛红小单孢菌GK1101，37℃培养10h后，用安普霉素和萘啶酸（终浓度分别为50μg／mL和25μg／mL）水溶液覆盖，37℃继续培养，直至长出转化子；将所获得的安普霉素抗性转化子，在含有安普霉素(50μg／mL)的斜面培养基上，于37℃条件下反复培养，直至彻底消除游离质粒。随机挑取一株命名为绛红小单孢菌GKB32。经提取染色体DNA，PCR检测，DNA测序，确定为单交换突变株。

3．筛选双交换菌株

将表型为安普霉素抗性的单交换突变株：绛红小单孢菌GKB32，转接到不添加安普霉素的平板上，连续松弛培养三代以上，分离单菌落，挑取单菌落分别影印到不含安普霉素和含安普霉素(安普霉素50μg/mL)的平板上，进行敏感性鉴别培养，结果从2660多株中，筛选到6个安普霉素敏感菌株。设计双交换验证引物P25/P26（P25:GCCTCCTTGGTCGGGTTGAA，P26：TTCTCGGCGATGATCGAGTC），对安普霉素敏感型菌株进行检测，从中得到1株表型符合双交换菌株的突变株，命名为绛红小单孢菌GKB3226，双交换菌株原理见图4。双交换检测的PCR产物经电泳检测和DNA序列，与预测的双交换突变结果相吻合，证明绛红小单孢菌GKB3226为敲除了genB3基因的双交换工程菌。

对双交换菌株GKB3226进行发酵，去除菌丝渣，收集发酵液。提取滤液中的代谢产物，通过MS定性检测，结果显示：产物的主峰为483 [M+H]⁺，其分子量与庆大霉素X2的482吻合，而161.75、242.13、322.19为其Ⅱ级和Ⅲ级离子碎片峰，质谱图见图5。

实施例2：

绛红色小单孢菌GKB3226代谢产物的制备

1．绛红色小单孢菌GKB3226菌株的发酵培养

种子培养基：葡萄糖0.1%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黄豆饼粉1.0%，KNO₃ 0.05%，CaCO₃ 0.5%，pH7.0。

发酵培养基：玉米淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，黄豆饼粉2.0 %，KNO₃ 0.01%，(NH₄)₂SO₄0.1%，CaCO₃ 0.5%，淀粉酶0.025%，pH7.5。

将实例1中步骤3获得的绛红色小单孢菌GKB3226，发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落，转接于斜面培养基，37℃培养10天，挖块接种于种子培养基（装量为50mL／250mL三角瓶），37℃摇床培养36 h(转速为250rpm)。按10%接种量转种于发酵培养基（装量为50mL/250mL三角瓶），37℃发酵培养120 h(转速为250rpm)。

20000升发酵罐培养，搅拌转速180转/分钟，通气量1：0.5~1.0 (M³ /M³·min)，培养基，培养温度，接种量比例，发酵时间等类同于摇瓶发酵。

2 代谢产物提取精制

A、粗提

发酵液稀释后分别酸化、碱化，过滤除蛋白和菌丝渣后，用732树脂静态吸附6~8小时。收集吸附饱和树脂，用0.5M HCl溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，而后用0.01%氨水进行碱洗，当流出液达pH 9.0以上时，串联到等体积的711树脂柱上，收集树脱液。

B、精制、结晶

洗脱液经薄膜浓缩到约300000ug/mL，用12当量浓硫酸调至pH5.5~6.0．活性炭脱色到透光度达92%以上，在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加入95%以上乙醇，进行结晶，时间3—4小时，之后经液固分离，85%乙醇溶液淋洗，得湿成品。湿成品真空干燥（真空度500mmHg以上，温度60⁰C，干燥6小时），即得庆大霉素X2成品，收率80%以上。

C、代谢产物质谱分析

绛红色小单孢菌GKB3226的代谢产物经安捷伦质谱仪分析，结果见图5。图5-GK1101中450.3和464.3的峰，对应的组分依次是庆大霉素C1a和C2b；图5-GB3226中483.2的峰，对应的是庆大霉素X2，而161.75、242.13、322.19的峰，是庆大霉素X2的Ⅱ级和Ⅲ级离子碎片峰。因此，从图5中的GK1101（上）和GB3226（下）比较可以看出，工程菌绛红色小单孢菌GKB3226主要合成庆大霉素X2，是一株生物合成组分高度单一的工程菌，非常适合于产业化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学、福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司

<120> 一种生物合成庆大霉素X2工程菌的构建及其应用

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1353

<212> DNA

<213> 基因genB3的DNA序列

<400> 1

atggattctg ccaacttgac gaaccggggg ctggtcgagc gggcccgccg ggtgaccgca 60

gcggagaact acgacatcgg gacccgcttc tcggcgatga tccagtcggg cgacggcgcg 120

tggctgaccg acgtcgaggg caaccgctac gtcgacctca ccgcctccag cgggacgatc 180

atcctgggtc accggaatca ggcggtgacc gaggcgatca cgcggcagat tcaggatttc 240

ggtacggcgt tcgcgtcgac gctgtcggtt ccgcgggtgg agttggcgga gcggttgtgc 300

gagcggtacg agtgtgcgga gaaggtcgtc ttccacaaga ccggctccga gggcacggcg 360

atggcggccc gcctggcgcg ggcggcgacc ggtcgcgagt tgatcctgtc gtgcgggtac 420

cacggctggc acgagtggca gttggcgggc gagacgttcg ggtaccagca gaccaccggt 480

gtggtcggtt tcgggtacaa cgagaaggcc ctggcgaaga tgctggaggc cttcggtaac 540

gaggtcgccg gggtgctgat ctcgccggag ctgttgtact tcgacgtcga gttctaccag 600

cgcatgtatg cgttgtgcgc gcggtacgac gtgccgttca tgatggacga ggtgtacacg 660

gggttccggg cggggccgaa gggtgtgcac gggttgggcg tgccggctga cgtggtggtg 720

gtcagcaagg gtctggcgaa cggtcattcg ttggcggcgg tgatgggtcg ccgggacatc 780

atcgacgcgt acgacgtgtc ggggatccag gggacgtaca cgcgggaggt gccgccgatg 840

gcggcggcgc tggcggttat ggatgtgctc gacacgccgg gtgtgtacga gcacgcggag 900

gcgatgggtc gtcggctggc ggacgggatg cgggagatcc tgaccagtga gggcattccg 960

aactgggtgg gcggcccggc cctgatgttc gacacggtgc tgccgaacga cgatctgggt 1020

tgggagatct acaagacggc gcacgacttc ggggtgtatt tcgaggactc cgggacgcag 1080

ctggtgacga cggcgttcga cgatgcggcg gtggaccacg cgttgtcggc gttccggaag 1140

gcgacgcgtc aggtgatcgc ggatcggccg gacatcgcgc cgacgtcggg tggcgagttg 1200

accgaggagc ggaagctcga cttcgcggag gaggccttcg gtggtctgct gcgtgacgac 1260

gagcggacga acgcgctgat cgacgcgacc atcgagcagg tcgtgagccg ggaccggagc 1320

atcaagccgg ttctcatccc cgcacagaac tga 1353

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 基因genB3的氨基酸序列

<400> 2

Met Asp Ser Ala Asn Leu Thr Asn Arg Gly Leu Val Glu Arg Ala Arg

1 5 10 15

Arg Val Thr Ala Ala Glu Asn Tyr Asp Ile Gly Thr Arg Phe Ser Ala

20 25 30

Met Ile Gln Ser Gly Asp Gly Ala Trp Leu Thr Asp Val Glu Gly Asn

35 40 45

Arg Tyr Val Asp Leu Thr Ala Ser Ser Gly Thr Ile Ile Leu Gly His

50 55 60

Arg Asn Gln Ala Val Thr Glu Ala Ile Thr Arg Gln Ile Gln Asp Phe

65 70 75 80

Gly Thr Ala Phe Ala Ser Thr Leu Ser Val Pro Arg Val Glu Leu Ala

85 90 95

Glu Arg Leu Cys Glu Arg Tyr Glu Cys Ala Glu Lys Val Val Phe His

100 105 110

Lys Thr Gly Ser Glu Gly Thr Ala Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Ala

115 120 125

Ala Thr Gly Arg Glu Leu Ile Leu Ser Cys Gly Tyr His Gly Trp His

130 135 140

Glu Trp Gln Leu Ala Gly Glu Thr Phe Gly Tyr Gln Gln Thr Thr Gly

145 150 155 160

Val Val Gly Phe Gly Tyr Asn Glu Lys Ala Leu Ala Lys Met Leu Glu

165 170 175

Ala Phe Gly Asn Glu Val Ala Gly Val Leu Ile Ser Pro Glu Leu Leu

180 185 190

Tyr Phe Asp Val Glu Phe Tyr Gln Arg Met Tyr Ala Leu Cys Ala Arg

195 200 205

Tyr Asp Val Pro Phe Met Met Asp Glu Val Tyr Thr Gly Phe Arg Ala

210 215 220

Gly Pro Lys Gly Val His Gly Leu Gly Val Pro Ala Asp Val Val Val

225 230 235 240

Val Ser Lys Gly Leu Ala Asn Gly His Ser Leu Ala Ala Val Met Gly

245 250 255

Arg Arg Asp Ile Ile Asp Ala Tyr Asp Val Ser Gly Ile Gln Gly Thr

260 265 270

Tyr Thr Arg Glu Val Pro Pro Met Ala Ala Ala Leu Ala Val Met Asp

275 280 285

Val Leu Asp Thr Pro Gly Val Tyr Glu His Ala Glu Ala Met Gly Arg

290 295 300

Arg Leu Ala Asp Gly Met Arg Glu Ile Leu Thr Ser Glu Gly Ile Pro

305 310 315 320

Asn Trp Val Gly Gly Pro Ala Leu Met Phe Asp Thr Val Leu Pro Asn

325 330 335

Asp Asp Leu Gly Trp Glu Ile Tyr Lys Thr Ala His Asp Phe Gly Val

340 345 350

Tyr Phe Glu Asp Ser Gly Thr Gln Leu Val Thr Thr Ala Phe Asp Asp

355 360 365

Ala Ala Val Asp His Ala Leu Ser Ala Phe Arg Lys Ala Thr Arg Gln

370 375 380

Val Ile Ala Asp Arg Pro Asp Ile Ala Pro Thr Ser Gly Gly Glu Leu

385 390 395 400

Thr Glu Glu Arg Lys Leu Asp Phe Ala Glu Glu Ala Phe Gly Gly Leu

405 410 415

Leu Arg Asp Asp Glu Arg Thr Asn Ala Leu Ile Asp Ala Thr Ile Glu

420 425 430

Gln Val Val Ser Arg Asp Arg Ser Ile Lys Pro Val Leu Ile Pro Ala

435 440 445

Gln Asn

450

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> P21

<400> 3

gaattccgtg tacgtcccct gaatcc 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> P22

<400> 4

ctcgagggga gatcctgacc agtgag 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> P23

<400> 5

ctcgagtaca acagctccgg cgagat 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> P24

<400> 6

tctagatacg tcaacgtgca cggggt 26

Claims

1.一种生物合成庆大霉素X2工程菌，其特征在于：所述的工程菌为绛红色小单孢菌，该菌株被命名为绛红色小单孢菌（Micromonospora purpurea）GKB3226，已于2013年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，其保藏编号为CGMCC No.8597。

2.根据权利要求1所述的一种生物合成庆大霉素X2工程菌，其特征在于：工程化庆大霉素生物合成菌株绛红色小单孢菌，包括棘孢小单孢菌，迫使庆大霉素生物合成停止在庆大霉素X2位点，不再进一步修饰，形成其它庆大霉素混合物，大量积累庆大霉素X2。

3.根据权利要求1所述的一种生物合成庆大霉素X2工程菌，其特征在于：在已敲除genK基因的绛红色小单孢菌GK1101基础上，进一步敲除genB3基因。

4.根据权利要求1所述的一种生物合成庆大霉素X2工程菌，其特征在于：敲除genB3基因的关键序列，以达到丧失该基因功能为最终目的。

5.根据权利要求1所述的一种生物合成庆大霉素X2工程菌，其特征在于：基因工程菌的构建方法，主要包括以下步骤：

A. 同源重组质粒pFU503的构建；

B. 同源重组质粒pFU503导入绛红色小单孢菌GK1101；

C. 接合子的筛选；

D. 工程菌组分的鉴定。

6.根据权利要求5所述的一种生物合成庆大霉素X2工程菌，其特征在于：利用所述的基因敲除方法，经PCR分别获得genB3基因上下游大约2000bp的两个片段，作为交换臂，将两者同时连接到pKC1139中，得到同源重组质粒pFU503。

7.根据权利要求5所述的一种生物合成庆大霉素X2工程菌，其特征在于：转化是以E coliET12657/pUZ8002介导的结合转移方法。

8.根据权利要求5所述的一种生物合成庆大霉素X2工程菌，其特征在于：借助抗性标记，筛选双交换工程菌，删除特定DNA序列，获得经生物合成且积累庆大霉素X2的工程菌。

9.一种如权利要求1所述的生物合成庆大霉素X2工程菌，在抗生素药物制备中的应用。