CN103789241A - 一株ι-卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用 - Google Patents

Abstract

一株ι-卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用，涉及一种嗜纤维素菌属的细菌。ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A的保藏编号为CGMCC No：8694。ι-卡拉胶水解酶的生产方法：将活化的ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A涂布于ι-卡拉胶固体培养基上，挑取单菌落接入种子培养基中培养，得种子液；按1%～5%的接种量将种子液接种到发酵液中，摇床培养，得发酵上清液；4℃条件下，将所得发酵上清液经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素层析，透析除盐，真空冷冻干燥，得到ι-卡拉胶水解酶。ι-卡拉胶寡糖可在制备抗菌药物，抗病毒药物、免疫调节剂、抗氧化剂等中应用。

Description

一株ι-卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用

技术领域

本发明涉及一种嗜纤维素菌属的细菌，特别是涉及一株ι-卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用。

背景技术

卡拉胶(Carrageenan)，又名鹿角胶、角叉胶等，是从红藻中提取的一种高分子亲水性多糖，以重复的α-(1→4)-D-半乳吡喃糖-β-(1→3)-D-半乳吡喃糖(或3,6内醚-D-半乳吡喃糖)二糖单元为基本骨架连接而成。根据是否含有3,6内醚-D-半乳吡喃糖、硫酸基的含量以及硫酸基在分子中的位置不同，将卡拉胶主要分为κ-、λ-、ι-3族。

卡拉胶因具有优良的热可逆凝胶化、抗蛋白凝胶、亲水无毒等性能而广泛应用于食品工业中。目前卡拉胶已广泛应用于果冻、软糖、冰淇淋、肉制品、啤酒等食品工业中，主要作用表现在凝胶、增稠和蛋白反应性3个方面。随着人们对卡拉胶结构和功能认识的深入，其应用领域不断拓宽，尤其在医药领域的应用变得日益广泛。

已有研究成果表明，卡拉胶具有多种生物活性，如抗凝血、抗病毒、免疫调节、抗氧化等，但由于卡拉胶相对分子质量过大，使其溶解性和吸收性受到影响，限制了其在医药领域的应用。卡拉胶寡糖与之相比，相对分子质量较小，溶解性、稳定性和安全性都有所增加，且生物活性也具有一定程度的提高。

目前降解卡拉胶的方法有物理法、化学法、酶解法。其中酶降解法是制备寡糖的一个重要途径，由于其具有特异性，可选择性地酶解切断糖链上的特定位点，从而制得特定的寡糖；并且反应条件温和，降解过程易于控制，在多糖降解中的运用日益增多。目前，国内外学者对卡拉胶寡糖进行的研究，已有成果表明卡拉胶寡糖在功能性食品、医药等领域具有一定的应用价值和开发前景。因此，利用从海洋微生物中提取到的卡拉胶降解酶制备卡拉胶低分子量活性片段,成为卡拉胶工业高值化研究的重要方向。寻找具有能降解卡拉胶的菌种是十分必要的。

中国专利CN1544623公开一种κ－卡拉胶降解酶及其制备方法和应用，一种酶能使κ－卡拉胶降解，用于制备卡拉胶低聚糖，能够降解κ－卡拉胶的β－1，4－糖苷键，故亦称为κ－卡拉胶降解酶，该酶的分子量为30,000Da。制备该酶时，将海洋噬纤维菌用2216E培养基28－35℃摇瓶培养后，将培养液离心获得发酵酶液，将酶液超滤浓缩后，以40％－80％的(NH4)2SO4盐析收集沉淀蛋白，冷冻干燥。

中国专利CN102994408A公开一种卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用，涉及一种新土地杆菌属的细菌，其命名为卡拉胶降解菌13-Q，即Pedobacter hainanensis sp.13-Q，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.5564。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一株能分泌卡拉胶降解酶的菌株。

本发明的第二目的在于提供一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法。

本发明的第三目的在于提供ι-卡拉胶寡糖在制备抗菌药物，抗病毒药物、免疫调节剂、抗氧化剂等中应用。

所述能分泌卡拉胶降解酶的菌株为ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A，分离自福建省东山岛，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No：8694。菌落形态特征为：在ι-卡拉胶固体培养基上生长良好，菌落黄色，圆形，表面略突起，光滑，反光，不透明，短杆状，边缘整齐，革兰氏染色阴性，不生孢，可运动。

菌株的生理学特征为：生长需要NaCl，无NaCl时几乎不能生长，高浓度的NaCl抑制其生长，0.2%的ι-卡拉胶能促进卡拉胶降解酶的产生。最适生长温度为28～32℃。

根据16S rRNA序列分析比对结果，所述的菌株鉴定为Cellulophaga sp.KL-A。

遗传学特征：所述ι-卡拉胶降解菌的16S rRNA碱基序列，序列共1075bp。

与Genebank国际基因序列数据库记录的最相似的菌株Cellulophaga lytica的相似性为99%。

所述一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法，包括以下步骤：

1）将活化的ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A涂布于ι-卡拉胶固体培养基上，挑取单菌落接入种子培养基中培养，得种子液；

2）按1%～5%的接种量将种子液接种到发酵液中，摇床培养，得发酵上清液；

3）4℃条件下，将步骤2）所得发酵上清液经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素层析，透析除盐，真空冷冻干燥，得到ι-卡拉胶水解酶。

在步骤1）中，所述ι-卡拉胶固体培养基的组成为：质量浓度为0.5%～1%的碳源，0.3%～0.5%的氮源，2%的氯化钠，0.5%的硫酸镁，0.1%的氯化钙，0.03%的硫酸亚铁，0.1%的磷酸氢二钾，0.2%的ι-卡拉胶的水溶液；所述碳源可选自葡萄糖，甘油，半乳糖，蔗糖，乙酸钠，淀粉等中的一种，优选葡萄糖；所述氮源可选自蛋白胨，酵母粉，牛肉膏，硫酸铵，硝酸钠，尿素等中的一种，优选酵母粉；所述培养的条件可为30℃，200rpm培养30h。

在步骤2）中，所述摇床培养的条件可为30℃，200rpm摇床培养30h。

所述ι-卡拉胶水解酶降解ι-卡拉胶，降解产物为2个ι-卡拉胶寡糖，聚合度分别为2～4糖和6～10糖。

所述ι-卡拉胶寡糖可在制备抗菌药物，抗病毒药物、免疫调节剂、抗氧化剂等中应用。海水养殖中，对虾的存活率能提高20%～30%。

本发明具有以下技术效果：

1、ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A在ι-卡拉胶的诱导下合成ι-卡拉胶水解酶，单因子筛选得到最佳碳氮源分别是葡萄糖和酵母粉。通过响应面优化培养基和培养条件，获得的ι-卡拉胶水解酶活力达到226.73U/mL。与国内外已报道的相比，所述的ι-卡拉胶降解菌水解酶生产能力大为提高，具有一定开发前景。

2、本发明提供的ι-卡拉胶降解菌能稳定的产生较高含量的水解酶，利用此水解酶能够制备与其他细菌不同聚合度的卡拉胶寡糖。

3、本发明提供的ι-卡拉胶水解酶的分子量为70kD，专一性水解ι-卡拉胶，不能水解κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、琼胶，纤维素，几丁质和淀粉，水解的产物最终为2～8糖，得到的ι-卡拉胶寡糖具有很高的商业应用价值。

4、本发明提供的ι-卡拉胶水解酶具有一定的热稳定性，42℃热处理1h能保持90%的酶活性。

附图说明

图1为ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A降解ι-卡拉胶产物的薄层层析图。

图2为ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A在ι-卡拉胶平板上的降解效果（降解圈）。

具体实施方式

实施例1

ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A的分离纯化。

采集福建省东山岛附近海域的新鲜活体海藻叶片后，加入无菌海水清洗，放入初筛培养基中，摇瓶培养2～3天。将培养液在含有初筛培养基的琼脂平板上划线，培养3天。将在琼脂平板上形成透明圈的菌落转移到新的琼脂平板上培养，重复划线，直至获得纯培养物。初筛培养基成分（质量体积比）：ι-卡拉胶0.2%，NaCl1.5%，NaNO₃0.2%，MgSO₄·7H₂O0.05%，CaCl20.01%，磷酸铁0.005%，pH值7.5。

将初筛分离到的纯培养物接种到复筛培养基中，摇床培养。然后将培养液在复筛固体培养基上划线，将产生最大降解圈的菌落挑取出来进行下一步实验。所有筛选出来的菌株，分离纯化后保存。

复筛培养基成分（质量体积比）：ι-卡拉胶0.2%，酵母粉0.1%，NaCl1.5%，NaNO₃0.2%，MgSO₄·7H₂O0.05%，CaCl₂0.01%，磷酸铁0.005%，pH值7.5。

实施例2

单因子筛选碳氮源

1、分别选取几种不同的碳源，浓度为10g/L，以5g/L的蛋白胨作为固定氮源，另加2g/L的ι-卡拉胶和15g/L的NaCl，配制培养基，接种量为3%，培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养48h，DNS法测酶活，碳源对ι-卡拉胶水解酶发酵的影响如表1所示，葡萄糖为最佳碳源。

表1

碳源	葡萄糖	甘油	半乳糖	蔗糖	乙酸钠	淀粉
							酶活力(U/mg)	287.6	201.3	234.7	168.2	171.1	168.2

2、以15g/L葡萄糖为固定碳源，分别选取几种不同的氮源，浓度为5g/L，另加2g/L的ι-卡拉胶和15g/L的NaCl，配制培养基，接种量为3%，培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养48h，DNS法测酶活，氮源对ι-卡拉胶水解酶发酵的影响如表2所示，酵母粉为最佳氮源。

表2

氮源	蛋白胨	酵母粉	牛肉膏	硫酸铵	硝酸钠	尿素
							酶活力(U/mg)	277.5	213.6	198.6	178.8	201.4	205.7

实施例3

利用ι-卡拉胶降解菌制备ι-卡拉胶寡糖

1）将所述菌株接种于ι-卡拉胶固体培养基上，在30℃培养3天；

2）将固体培养基上单菌落接种于250mL摇瓶培养基中，30℃，200rpm培养3天。

3）按体积比3%将种子培养基接入1L发酵培养基中，30℃，200rpm培养3天，获取发酵物。

4）将发酵液在4℃条件下，12000g离心15min以去除菌体，留上清液备用。

5）向上清液中逐渐加入硫酸铵至40%饱和度（按硫酸铵4℃溶解度表加入固体硫酸铵），缓慢搅拌避免产生气泡导致酶失活，4℃静置沉淀过夜后，10000rpm冷冻离心去除杂蛋白。再向上清液中逐渐加入硫酸铵至70%饱和度，4℃静置过夜后，10000rpm冷冻离心10min收集沉淀，用少量4℃遇冷的去离子水溶解。

6）溶解后的溶液置于透析袋中（MWCO：12000），透析袋置于预冷的20mM Tris-HCl，pH7.5的缓冲液中除盐，多换几次缓冲液，然后4℃透析过夜。将溶液装载在DEAE-纤维素层析柱上，用浓度为0.1M KCl溶液洗脱，收集具有ι-卡拉胶酶活性的馏分。馏分在相同的缓冲液中透析，真空冷冻干燥，得到ι-卡拉胶水解酶。

7）将上述的ι-卡拉胶水解酶干粉溶于去离子水中，酶液加入ι-卡拉胶底物溶液（100mL体系中ι-卡拉胶0.5-2g，酶液0.5-2mL，其余量为水，pH7.5），于30℃条件下酶解反应24h，反应结束后置于沸水10min终止反应，得到ι-卡拉胶寡糖溶液粗品。

8）向上述溶液加入2倍体积的无水乙醇，离心去除分子量大的组分，其余可溶性组分于40℃旋转蒸发进行浓缩至20mL，然后再加入3倍体积的无水乙醇使低聚糖沉淀，离心收集沉淀物，经脱盐，旋转蒸发浓缩得到降解产物粗品。

9）将氯仿，戊醇（或正丁醇）按体积比4∶1比例混合，得到混合试剂。将混合试剂与卡拉胶寡糖溶液按体积比1∶3混匀，100rpm振摇30min，10000g离心1min去除不溶物，经真空旋转仪蒸发去除水分，烘干，得到卡拉胶寡糖产物。产物即可作为薄层层析的样品。

Claims (10)

1.一株ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：8694。

2.一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将活化的ι-卡拉胶降解菌（Cellulophaga sp.）KL-A涂布于ι-卡拉胶固体培养基上，挑取单菌落接入种子培养基中培养，得种子液；

2）按1%～5%的接种量将种子液接种到发酵液中，摇床培养，得发酵上清液；

3）4℃条件下，将步骤2）所得发酵上清液经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素层析，透析除盐，真空冷冻干燥，得到ι-卡拉胶水解酶。

3.如权利要求2所述一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法，其特征在于在步骤1）中，所述ι-卡拉胶固体培养基的组成为：质量浓度为0.5%～1%的碳源，0.3%～0.5%的氮源，2%的氯化钠，0.5%的硫酸镁，0.1%的氯化钙，0.03%的硫酸亚铁，0.1%的磷酸氢二钾，0.2%的ι-卡拉胶的水溶液。

4.如权利要求3所述一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法，其特征在于所述碳源选自葡萄糖，甘油，半乳糖，蔗糖，乙酸钠，淀粉中的一种，优选葡萄糖。

5.如权利要求3所述一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法，其特征在于所述氮源选自蛋白胨，酵母粉，牛肉膏，硫酸铵，硝酸钠，尿素中的一种，优选酵母粉。

6.如权利要求2所述一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法，其特征在于在步骤1）中，所述培养的条件为30℃，200rpm培养30h。

7.如权利要求2所述一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法，其特征在于在步骤2）中，所述摇床培养的条件为30℃，200rpm摇床培养30h。

8.如权利要求2～7中任一所述一种ι-卡拉胶水解酶的生产方法所生产的ι-卡拉胶水解酶在制备降解产物中的应用，所述降解产物为ι-卡拉胶寡糖。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述ι-卡拉胶寡糖包括聚合度为2～4糖的ι-卡拉胶寡糖和聚合度为6～10糖的ι-卡拉胶寡糖。

10.如权利要求8或9所述应用，其特征在于所述ι-卡拉胶寡糖在制备抗菌药物，抗病毒药物、免疫调节剂、抗氧化剂中应用。

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