CN103788167B - 一种单葡萄糖醛酸甘草次酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高纯度单葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG）的制备方法，采用新鲜甘草为原料，经超声波提取后，取上清液，用盐酸调节pH，离心取沉淀，沉淀用去离子水洗2-3次后置于真空干燥箱中干燥，得GAMG粗品。称取一定量的GAMG粗品，加水，用浓氨水调节至pH8-9，待完全溶解后，加入有机溶剂萃取，两相分层清晰后，取水层，再通过半制备型高效液相色谱仪进一步纯化后得到高纯度GAMG。采用本发明制备GAMG，操作简单，实验步骤少，污染小，成本低，周期短，纯度可达99.5%以上。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高纯度单葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG）的制备方法。
背景技术
甘草是我国一种传统的中草药，其主要成份甘草酸具有抗炎症、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏等作用，而且它是一种甜味剂，甜度约是蔗糖的170倍。单葡萄糖醛酸甘草次酸（glycyrrhetic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide, GAMG）作为甘草酸的衍生物，两者具有相似的生物活性，其在抗炎和抗过敏活性上等同或超过甘草酸，而且具有显著的抗癌作用。GAMG是一种新型的天然甜味剂，甜度约是GL的5倍。因此，GAMG具有重要的研究价值。因此，寻找提取纯化GAMG的最佳工艺条件，工艺流程成为GAMG利用要解决的首要问题。
发明内容
本发明的目的在于针对目前在制备GAMG过程中所存在的工艺复杂以及纯度不高的问题，提供一种制备高纯度GAMG的新方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种GAMG的制备方法，以甘草为原料，采用高效液相色谱法制备高纯度GAMG，它包括以下步骤：
（1）取新鲜甘草，以体积比1:10与含0.5%氨水的70%乙醇水溶液混合后，超声波萃取1~2h后，离心取上清液；
（2）将上清液用盐酸调pH至3~4，酸沉过夜，离心取沉淀，用去离子水洗2-3次后，至于真空干燥箱中干燥，得GAMG粗品；
（3）取GAMG粗品粉末，加水溶解并用氨水调至pH8-9，待完全溶解后，加入等体积的有机溶剂萃取2-3次后，取水层；
（4）将水层pH调回至5，采用C18反相硅胶色谱柱，甲醇和水作为流动相，等度/梯度洗脱，经过半制备型液相色谱仪进行最后一步的分离纯化后，收集到的GAMG的纯度高于99.5%。
本发明的有益效果是可选用新鲜甘草或者甘草粗提物来制备GAMG，过程简单、易控制，工艺技术简化，生产成本低，该半制备的色谱条件可同比放大，适用于工业级生物医药用液相制备色谱装置，以实现高纯度GAMG的工业化生产。高效液相色谱测定中，总杂质峰小于0.45%，单一杂质峰不超过0.2%。此产品完全符合欧洲药典标准。
附图说明
图1是上样5mg纯化GAMG的色谱图
图2是上样10mg纯化GAMG的色谱图
图3是上样2mg纯化GAMG的色谱图
图4是GAMG纯品液相色谱法测定图
具体实施方式
实施例1
1.取1kg已粉碎后的新鲜甘草粉末与10倍体积含0.5%氨水的70%乙醇水溶液混合后，超声波萃取1h后，离心取上清液；
2. 用浓盐酸调节上清液pH至3~4，酸沉过夜，离心取沉淀，用去离子水洗2-3次后，至于真空干燥箱中干燥，得GAMG粗品；
3.称取GAMG 粗品0.5g，加入50ml水中，用氨水调pH至8后，待GAMG粗品完全溶解后，加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，取水层；
4.将水层pH调回至5，采用半制备型液相色谱仪进行最后一步的分离纯化，色谱柱尺寸为Φ10×250mm，C18反相硅胶填料为江苏汉邦科技有限公司产品，粒径为10um，上样量5mg，流动相为纯甲醇-水溶液，梯度度洗脱条件为，0~25min，甲醇65%~80%；25~50min，甲醇80%~80%，流速4ml/min，柱温为20℃，紫外检测波长为230nm，收集保留时间在36.5~38.5min的馏分。经HPLC分析纯度≥99.6%。
实施例2
1.取1kg已粉碎后的新鲜甘草粉末与10倍体积含0.5%氨水的70%乙醇水溶液混合后，超声波萃取1.5h后，离心取上清液；
2. 用浓盐酸调节上清液pH至3~4，酸沉过夜，离心取沉淀，用去离子水洗2-3次后，至于真空干燥箱中干燥，得GAMG粗品；
3.称取GAMG粗品0.5g，加入50ml水中，用氨水调pH至9后，待GAMG粗品完全溶解后，加入等体积的丙酮萃取三次，取水层；
4.将水层pH调回至5，采用半制备型液相色谱仪进行最后一步的分离纯化，色谱柱尺寸为Φ10×250mm，C18反相硅胶填料为江苏汉邦科技有限公司产品，粒径为5um，上样量10mg，流动相为纯甲醇-水溶液，梯度度洗脱条件为，0~20min，甲醇60%~75%；20~35min，甲醇75%~85%，流速4ml/min，柱温为25℃，紫外检测波长为230nm，收集保留时间在36~40min的馏分，经HPLC分析纯度≥99.5%。
实施例3
1.称取甘草粗提物0.5g，加入50ml水中，用氨水调pH至8后，若有未溶解物，离心，取上清液；
2.加入等体积的氯仿于上清液中，萃取三次，取水层；
4.将水层pH调回至5，采用半制备型液相色谱仪进行最后一步的分离纯化，色谱柱尺寸为Φ10×250mm，C18反相硅胶填料为江苏汉邦科技有限公司产品，粒径为10um，上样量2mg，流动相为纯甲醇-水溶液，流动相为70%甲醇-水溶液，等度洗脱，流速4ml/min，柱温20℃，收集保留时间在17~19min的馏分。采用的紫外光度检测器的检测波长为230nm，经HPLC分析纯度≥99.7%。
Claims (5)
1.一种单葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG）的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将甘草和含0.5%氨水的70%乙醇水溶液混合后，超声波萃取1~2h，离心取上清液；
（2）将上清液用盐酸调pH至3~4，酸沉过夜，离心取沉淀，用去离子水洗2-3次后，置于真空干燥箱中干燥，得GAMG粗品；
（3）将GAMG粗品用水溶解并用氨水调pH至8-9，经有机溶剂萃取2-3次后，取水层；
（4）将水层pH调回至5，采用甲醇和水做流动相，使用半制备型高效液相色谱仪制备得到高纯度GAMG。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤（3）中所述的有机溶剂优选乙酸乙酯、丙酮或氯仿。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤（4）中半制备型高效液相色谱仪采用固定相为C18的反相硅胶填料，色谱柱规格：内径10~50mm、长度150~300mm，填料粒径为5~10μm，流动相以等度或梯度洗脱的方式洗脱GAMG样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述的等度洗脱方式为，流动相甲醇与水的体积比（V/V）范围为7:3~9:1，柱温20~35℃，流速4~30ml/min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述的梯度洗脱方式为，流动相为甲醇-水体系，体积比为65:35~80:20，柱温20~35℃，流速4~30ml/min。
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