CN103785060B - 一种负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架及其制备方法，该材料由交联的鱼皮胶原支架和负载表皮生长因子的纳米粒子组成。制备方法为鱼皮经脱水、脱脂、酶处理、透析后，制备交联的鱼皮胶原支架，再用负载表皮生长因子的纳米粒子溶液浸润，经冷冻干燥后即得负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架。该支架对所负载的因子有缓慢释放作用，延长了表皮生长因子在创伤处的作用时间。本发明获得的鱼皮胶原支架具有良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性等优点，对创面无毒害，可有效诱导创面愈合，是一种较好的医用材料。

Description

一种负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架及其制备方法

技术领域

本发明属于医疗器械技术领域，具体涉及一种用于治疗糖尿病溃疡的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架及其制备方法。

背景技术

随着生活水平提高、生活模式改变及社会老龄化，糖尿病发病率正逐年上升。糖尿病溃疡是其常见并发症之一，它是由于糖尿病所致血管及神经病变，引起皮肤的异常改变，临床表现为局部糜烂、溃疡、坏死，创面经久不愈，是糖尿病患者严重并发症之一，治疗不及时会造成病变扩散、手术截肢(趾)，甚至危及生命。糖尿病溃疡往往反复发作，迁延不愈，形成顽固难愈性溃疡，严重危害糖尿病病人的健康，降低生活质量，给患者带来极大的社会经济方面的压力和负担。因此，糖尿病溃疡的治疗是临床急需解决的重要课题之一。

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是20世纪60年代发现的一种多肽因子。人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)广泛存在于人体多种组织，具有促进角化细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等细胞的生长作用，在体外研究和体外模型中显示是一种有效的刺激修复因子，具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性。目前己研制出重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF)，具有促进表皮细胞生长、加速创面愈合、缩短愈合时问的作用，且无毒、无化学和物理刺激性，黏膜耐受性好。近年来有关表皮生长因子的应用研究受到国内外学者的广泛关注，已有资料证明rhEGF对肺、肝、肾、胃肠等多种器官损害和体表创伤、烧伤、溃疡等具有较好的治疗作用。

目前，治疗糖尿病溃疡的方式主要是在创面局部直接补充外源性表皮生长因子，但此种给药方式存在以下缺点：表皮生长因子扩散快且半衰期较短，若无载体保护，容易被稀释或降解而失去生物学活性，表现为局部使用的表皮生长因子水剂在接触皮肤创面的数分钟内就可被创面渗出液中的蛋白酶降解破坏，或很快从创面流失。为解决以上问题，本发明将表皮生长因子做成缓释纳米微球，同时负载于具有良好生物学性能和空间结构的鱼皮胶原膜支架中。缓释纳米微球由采用肝素和具有抗菌作用的壳聚糖组成的纳米粒子负载表皮生长因子制备而成。

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的结构蛋白，它具有独特的三螺旋结构，具有低抗原性、无毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特点，被广泛应用于组织工程支架材料、止血海绵、药物控缓释系统、美容外科等医学领域。目前工业和临床上应用的胶原都是从陆生动物如牛、羊、猪等中提取，此类胶原存在被动物自身携带传染病如疯牛病、口蹄疫等病毒污染的风险。国外已限制使用牛源性原料生产医疗器械和药物，我国也禁止进口牛源性明胶用于药品生产的空心胶囊。另一方面，信仰伊斯兰教、回教等地区的人们排斥和拒绝使用以猪皮或猪骨生产的明胶以及用其生产的医药制品。鱼皮胶原除具有与陆生动物胶原同样优良特性外，不存在上述人畜共患的传染性疾病及宗教问题，并具有原材料来源广泛、价廉易得等优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架及其制备方法，该鱼皮胶原支架是一种用于治疗糖尿病溃疡的，对机体无毒害、柔韧性和耐酶性好、具有良好的生物相容性和组织修复性能的皮肤组织工程支架。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架是由交联的鱼皮胶原支架和负载表皮生长因子的纳米粒子组成。

制备方法包括以下步骤：

（1）鱼皮去鳞，剪碎洗净，于10~20倍原料重的含体积分数为0.5~3%H₂O₂的NaOH溶液中搅拌浸泡24-36 h，清水洗至中性；继续加入异丙醇溶液搅拌4 h，纯化水洗3遍，再加入氯化钠溶液搅拌12 h，离心，去除废液，即得预处理的碎鱼皮；

（2）将预处理的碎鱼皮与去离子水以质量比为1:5-1:10混合，匀浆，加入胃蛋白酶，用盐酸调pH=2.0-3.0，酶解16-24 h，过滤，8000-20000 rpm 离心20 min，在上清液中加入氯化钠至最终盐浓度为0.9 mol/L，盐析，8000 rpm离心20 min，弃去上清液，加入10倍体积量的0.5 mol/L 乙酸溶液溶解，过滤除去不溶性杂质；然后在10倍体积量的0.1 mol/L 乙酸溶液中透析12h ，每3 h 换一次溶液，最后用纯水透析至中性，冷冻干燥，交联，纯化水浸泡清洗5-10次，再次冷冻干燥即得鱼皮胶原支架；

（3）搅拌条件下将pH=6.0的壳聚糖-乙酸溶液滴入含表皮生长因子的肝素溶液中，滴加速度10-40滴/min，搅拌速度为500-700 rpm，得到负载表皮生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子溶液；

（4）将鱼皮胶原支架用负载表皮生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子溶液按2ml/cm²比例浸润，冷冻干燥，即得所述的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架。

所述的壳聚糖的分子量为8000-20000，脱乙酰度为70-90%。

所述的鱼皮为鲢鱼、草鱼、青鱼、鳙鱼或鲨鱼的鱼皮。

步骤（1）中所述NaOH溶液浓度为0.01~0.05mol/L，所述异丙醇溶液的体积分数为10~20%，氯化钠溶液的质量分数为1.5~2.5%。

步骤（2）所述胃蛋白酶占鱼皮质量的0.5~2.5%，酶解温度为4-8℃；交联所用交联剂为体积分数0.2-0.3%的戊二醛溶液、体积分数0.2-0.3%的D-核糖溶液或浓度为40-60 mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液，交联时间10-24 h。

步骤（3）壳聚糖-乙酸溶液浓度为1-4 mg/ml，肝素溶液浓度为0.5-2 mg/ml，制得的负载表皮生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子的负载量为3000 IU/ml。

本发明的显著优点在于：本发明采用鱼皮来源的胶原，一方面避免了牛、羊、猪等动物来源胶原可能带来的疯牛病、口蹄疫等传染病病毒，另一方面可有效利用渔业生产下脚料，创造巨大的经济效益；所制备的负载表皮生长因子鱼皮胶原支架有效消除了胶原分子的非螺旋端肽，因此无抗原性，生物相容性良好；在支架中引入了表皮生长因子，可有效诱导创伤部位自体细胞生长，促进创面愈合；采用的生长因子缓释技术，可使表皮生长因子持续释放，有效解决了表皮生长因子在体内半衰期过短等问题。

附图说明

图1为负载表皮生长因子鱼皮胶原支架的截面场扫描电镜图。

图2为糖尿病溃疡模型大鼠创面修复实验结果。

具体实施方式

实施例1：鱼皮胶原支架的制备

（1）将鱼皮解冻，剪碎；

（2）用蒸馏水洗净后，加入其质量20倍的体积分数为1％的过氧化氢和0.01 mol/L氢氧化钠的混合溶液，机械搅拌24 h，每8 h更换一次碱性溶液；

（3）加入体积分数为10％的异丙醇溶液，机械搅拌4 h，纯化水洗净；

（4）加入2.5％的氯化钠溶液，机械搅拌12 h，纯化水洗净；

（5）加入10体积纯化水，用盐酸调pH=2.0-3.0，加入鱼皮质量2.5％的胃蛋白酶，4-8℃下酶解16-24 h，8000-20000 rpm离心20 min，取上清液；

（6）在上述上清液中加入一定量氯化钠至最终盐浓度 0.9mol/L，盐析，8000 rpm离心20 min，弃去上清液；

（7）加入10倍体积的0.5 mol/L的乙酸溶解，过滤除去不溶性杂质。然后在10倍体积的0.1 mol/L 乙酸溶液中透析12 h，每3 h换一次溶液，最后用纯水透析至中性，冷冻干燥；

（8）在0.25%戊二醛溶液中交联24 h，纯化水浸泡清洗，再次冻干。

实施例2：负载表皮生长因子的纳米粒子的制备

（1）将壳聚糖溶解于1%乙酸，透析4天，冷冻干燥，得到纯化的壳聚糖；

（2）称0.2 g壳聚糖溶解于5 ml1%乙酸，0.1mol/LNaOH调节pH值至6.0，定容至100 ml，得到浓度为2 mg/ml壳聚糖溶液；

（3）配制浓度为1 mg/ml肝素溶液，以该溶液为母液，配制含有表皮生长因子10500 IU/ml的肝素混合液；

（4）在4℃，电搅拌下，将2ml 1mg/mL上述肝素混合液逐滴滴入5 ml 2 mg/ml壳聚糖溶液中，滴速为每分钟10-40滴，即可得到分散均匀的负载表皮生长因子的纳米粒子。

实施例3：负载表皮生长因子鱼皮胶原支架的制备

将实施例1中制备的鱼皮胶原支架用负载表皮生长因子的纳米粒子水溶液浸润，比例为2 ml/cm²；浸润后置于-20℃。真空冷冻干燥，即得。

实施例4：负载表皮生长因子鱼皮胶原支架治疗糖尿病溃疡大鼠模型实验

（1）动物模型的制备：取雄性Wistar 大鼠40只，经普通饲料适应性喂养1周后，空腹，尾静脉注射1%链脲佐菌素( 1% STZ) 45 mg/kg，1 周后检测血糖，以血糖≥16. 7mmol /L视为造模成功。

（2）分组及溃疡模型制备：随机选取30 只模型大鼠按血糖和体重分层随机分为3组：负载EGF胶原支架组、负载纳米粒子胶原支架（无EGF）组、模型对照组。3组动物空腹麻醉，背部剃毛，常规消毒，用打孔器于大鼠背部脊柱左侧相同位置打孔(f 2 cm )，深及筋膜层，止血后以无菌纱布包扎，自由饮水与喂食。3 d后溃疡创面有肉芽组织开始生长，溃疡模型制备成功。

（3）动物处理：3 组大鼠单笼喂养，操作前常规消毒，0.9%氯化钠注射液冲洗创面。负载表皮生长因子胶原支架组、负载纳米粒子胶原支架（无EGF）组分别溃疡处外贴敷负载表皮生长因子胶原支架和负载纳米粒子胶原支架（无EGF），模型对照组不做贴敷处理，以上3组动物均用无菌纱布固定和包扎。

（4）动物观察：3 组大鼠均于1、3、5、7、14 d尾静脉取血检测血糖同时进行创面照相，应用计算机图象分析系统进行处理，并计算创面的大小。

（5）数据统计：统计学方法数据以均数± 标准差表示，采用SPSS 软件进行t检验，以p<0.05为数据有显著性差异。

（6）试验结果：结果表明该支架对糖尿病溃疡大鼠模型有良好的治疗作用，与模型对照组比较在第7、14天差异均有高度统计学意义（p<0.01），可明显促进皮肤组织愈合，加快愈合速度。结果见图2。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架的制备方法，其特征在于：支架由交联的鱼皮胶原支架和负载表皮生长因子的纳米粒子组成；

用负载表皮生长因子的纳米粒子溶液浸润鱼皮胶原支架，经冷冻干燥制得所述的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架；包括以下步骤：

（1）鱼皮去鳞，剪碎洗净，于10~20倍原料重的含体积分数为0.5~3%H₂O₂的NaOH溶液中搅拌浸泡24-36 h，清水洗至中性；继续加入异丙醇溶液搅拌4 h，纯化水洗3遍，再加入氯化钠溶液搅拌12 h，离心，去除废液，即得预处理的碎鱼皮；

（2）将预处理的碎鱼皮与去离子水以质量比为1:5-1:10混合，匀浆，加入胃蛋白酶，用盐酸调pH=2.0-3.0，酶解16-24 h，过滤，8000-20000 rpm 离心20 min，在上清液中加入氯化钠至最终盐浓度为0.9 mol/L，盐析，8000 rpm离心20 min，弃去上清液，加入10倍体积量的0.5 mol/L 乙酸溶液溶解，过滤除去不溶性杂质；然后在10倍体积量的0.1 mol/L 乙酸溶液中透析12h ，每3 h 换一次溶液，最后用纯水透析至中性，冷冻干燥，交联，纯化水浸泡清洗5-10次，再次冷冻干燥即得鱼皮胶原支架；

（3）搅拌条件下将pH=6.0的壳聚糖-乙酸溶液滴入含表皮生长因子的肝素溶液中，滴加速度10-40滴/min，搅拌速度为500-700 rpm，得到负载表皮生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子溶液；

（4）将鱼皮胶原支架用负载表皮生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子溶液按2ml/cm²比例浸润，冷冻干燥，即得所述的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架。

2.根据权利要求1所述的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖的分子量为8000-20000，脱乙酰度为70-90%。

3.根据权利要求1所述的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架的制备方法，其特征在于：所述的鱼皮为鲢鱼、草鱼、青鱼、鳙鱼或鲨鱼的鱼皮。

4.根据权利要求1所述的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述NaOH溶液浓度为0.01~0.05mol/L，所述异丙醇溶液的体积分数为10~20%，氯化钠溶液的质量分数为1.5~2.5%。

5.根据权利要求1所述的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述胃蛋白酶占鱼皮质量的0.5~2.5%，酶解温度为4-8℃；交联所用交联剂为体积分数0.2-0.3%的戊二醛溶液、体积分数0.2-0.3%的D-核糖溶液或浓度为40-60 mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，交联时间10-24 h。

6.根据权利要求1所述的负载表皮生长因子的鱼皮胶原支架的制备方法，其特征在于：步骤（3）壳聚糖-乙酸溶液浓度为1-4 mg/ml，肝素溶液浓度为0.5-2 mg/ml，制得的负载表皮生长因子的壳聚糖-肝素纳米粒子的负载量为3000 IU/ml。