CN103784968A - 一种壳聚糖-抗生素共价复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖-抗生素共价复合物及其制备方法和应用，所述制备方法包括（1）取壳聚糖和抗生素，以摩尔比例为1:0.1～1:10混合，溶于水中，加入NaCNBH3，避光搅拌，0℃～90℃反应0.5～72小时；（2）将所得混合溶液透析1～5天；（3）将所得透析液干燥，即得。制备所述壳聚糖-抗生素共价复合物的原料易得，合成方法简便；该共价复合物对已经形成的细菌生物膜具有较强的破坏作用，杀菌范围广，有效成分明确，对生物膜的形成具有良好的抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于医药制剂技术领域，具体涉及一种壳聚糖-抗生素共价复合物及其制备方法和应用。
背景技术
生物膜(biofilms,BF)是微生物细胞(如细菌、真菌、原虫)及其产生的细胞外大分子多聚物所形成的一种特殊群落，是高度组织化的多细胞结构。细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于生命或非生命物体表面形成的一种生长方式，由细菌和自身分泌的胞外基质组成。研究人员将这些能形成这类生物膜的细菌称为生物膜细菌(BF细菌)。BF在自然界、某些工业环境（如输水系统、食品加工、航运等领域）、人和动物体内中都可见到细菌生物膜的影响。此外，BF与多种人体相关性感染性疾病的关系也非常密切。当细菌以BF形式存在时耐药性明显增强(10～1000倍)，对抗生素变得不敏感，诱导耐药性产生；还可以抵抗宿主的防御体系，在发病前生长于牙齿、牙龈、皮肤、肺、尿道及其他器官的表面达数月甚至数年，造成顽固性感染，给临床治疗带来严重影响。据估计，65%的人类感染与生物膜有关。BF的耐药机制不同于浮游菌，有效浓度的抗菌药物能迅速杀死浮游生长的细菌和BF表面的细菌，但对BF深处的细菌却难以有效杀灭。由于传统的抗生素如链霉素、庆大霉素、青霉素对细菌BF引起的感染疗效欠佳，因此，临床上急需寻找能够杀灭BF深处细菌的药物。
壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的复合物，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程中广泛应用。链霉素（streptomycin）是继青霉素后第二个生产并用于临床的一种氨基葡萄糖型抗生素，链霉素在临床上的应用非常广泛。
发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题是针对临床上缺乏能够有效杀灭生物膜深处细菌的药物，传统抗生素对细菌生物膜引起的感染疗效欠佳，并且不能阻止细菌生物膜形成的问题，提供了一种壳聚糖-抗生素共价复合物及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种壳聚糖-抗生素共价复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖和抗生素水溶液，将壳聚糖和抗生素按照摩尔比例为1:0.1～1:10混合，加入NaCNBH3，避光搅拌，0℃～90℃反应0.5～72小时；
（2）将步骤（1）所得的水溶液移入截留分子量为1000～14000的透析袋中，透析1～5天，得到透析液；
（3）将步骤（2）所得的透析液干燥，即得。
其中步骤（1）所述壳聚糖为本领域常规壳聚糖。所述壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。其中所述抗生素为本领域常规的抗生素。所述抗生素较佳地为氨基糖苷类抗生素。所述氨基糖苷抗生素是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的糖苷类抗生素。所述抗生素较佳地为链霉素，卡那霉素或庆大霉素。本发明所述抗生素优选地为链霉素。
其中步骤（1）所述壳聚糖和抗生素水溶液混合形成混合液，所述壳聚糖和抗生素的摩尔比较佳地为1:0.1～1:10，更佳地为1:0.5～1:6，最佳地为1:0.5。所述反应的时间较佳地为0.5～72小时，更佳地为10～48小时，最佳地为24小时。所述反应的温度较佳地为0℃～90℃，更佳地为15℃～30℃，最佳地为20℃。
其中步骤（1）所述NaCNBH3的添加量较佳地为所述抗生素含量的30%～50%，添加量最佳地为30%，所述百分比为质量百分比。
其中步骤（2）所述的透析为本领域常规透析方法。所述透析是一种穿过膜的选择性扩散过程，可用于分离分子量大小不同的溶质，低于膜所截留阈值分子量的物质可扩散穿过膜，高于膜截留阈值分子量的物质则被保留在半透膜的另一侧。其中所述透析袋为本领域常规透析袋。所述透析袋的截留分子量较佳地为1000～14000，更佳地为3000～5000，截留分子量最佳地为3500。其中所述透析的时间较佳地为2～5天，更佳地为2～3天，透析时间最佳地为2天。
其中步骤（3）所述的干燥为本领域常规干燥方式。所述干燥较佳地为真空冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、烘干或红外干燥，最佳地为真空冷冻干燥。所述真空冷冻干燥的参数较佳地为：温度-35℃～-45℃，真空度20～30Pa，时间36～48小时。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为：如上所述的制备方法制备所得的壳聚糖-抗生素共价复合物。
所述壳聚糖-抗生素共价复合物中壳聚糖和抗生素的摩尔比较佳地为1:0.1～1:10，更佳地为1:0.5～1:6，最佳地为1:0.5。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三为：如上所述的壳聚糖-抗生素共价复合物在制备抗感染药物中的用途。
本发明所述用途较佳地是指将壳聚糖-抗生素共价复合物作为活性成分，与药学上可接受的辅料制成各种剂型的抗感染药物。其中所述药学上可接受的辅料是本领域常规使用的辅料。所述药物辅料是指生产药品和调配处方时所用的赋形剂与附加剂。
其中所述抗感染药物更佳地为抗细菌感染类药物。所述细菌为本领域常规致病菌。所述细菌较佳地为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。其中革兰氏阳性菌较佳地为单增李斯特菌，其中革兰氏阴性菌较佳地为金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：制备本发明所述壳聚糖-抗生素共价复合物的原料易得，合成方法简便易行；经微生物试验证明，该壳聚糖-抗生素共价复合物对已经形成的细菌生物膜具有较强的破坏作用，杀菌范围广，有效成分明确；该复合物对生物膜的形成具有良好的抑制作用。同时，所述壳聚糖-抗生素共价复合物能够有效降低细菌以生物膜形式存在时产生的耐药性，提高细菌对传统抗生素的敏感性，降低传统抗生素的使用量。
附图说明
图1为壳聚糖-链霉素共价复合物分子量测定图谱。
图2为壳聚糖-链霉素共价复合物红外图谱。
图3为壳聚糖-链霉素共价复合物的核磁共振C谱。
图4为壳聚糖-链霉素共价复合物的核磁共振H谱。
图5为壳聚糖-链霉素共价复合物对细菌生物膜的破坏作用效果图；注：对照为不加任何药的空白对照，L为链霉素，CS为壳聚糖，L+CS为链霉素与壳聚糖的混合物。A代表单增李斯特细菌；B代表金黄色葡萄球菌；C代表铜绿杆菌。
图6为壳聚糖-链霉素共价复合物对生物膜内细菌的抑制作用效果图；注：对照为不加任何药的空白对照，L为链霉素，CS为壳聚糖，L+CS为链霉素与壳聚糖的混合物，A代表单增李斯特细菌；B代表金黄色葡萄球菌；C代表铜绿杆菌。
图7为壳聚糖-链霉素共价复合物对生物膜内细菌的抑制作用效果图；注：对照为不加任何药的空白对照，L为链霉素，CS为壳聚糖，L+CS为链霉素与壳聚糖的混合物。A代表单增李斯特细菌；B代表金黄色葡萄球菌；C代表铜绿杆菌。
图8为壳聚糖-链霉素共价复合物在生物膜形成过程中的抑菌效果图；注：对照为不加任何药的空白对照，L为链霉素，CS为壳聚糖，L+CS为链霉素与壳聚糖的混合物。A代表单增李斯特细菌；B代表金黄色葡萄球菌；C代表铜绿杆菌。
图9为壳聚糖-链霉素共价复合物在生物膜形成过程中的抑菌效果图；注：对照为不加任何药的空白对照，L为链霉素，CS为壳聚糖，L+CS为链霉素与壳聚糖的混合物。A代表单增李斯特细菌；B代表金黄色葡萄球菌；C代表铜绿杆菌。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。本发明所用试剂和原料均市售可得。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
取壳聚糖50mg，链霉素45.3mg分别溶于20ml去离子水中，并加入0.372g氰基硼氢化钠（NaCNBH3），置于黑暗处15℃条件下300rpm，搅拌10h，将溶液加入拦截分子量为3000的透析袋，在去离子水中透析2天，真空度20pa，-35℃冷冻干燥48小时，即得摩尔比1:0.1的壳聚糖-链霉素复合物85.8mg。经HPLC凝胶分析系统（Waters公司生产）测定，（测试温度25℃，流动相：3mmol乙酸钠，流动相流速0.5ml/min.标准品采用葡聚糖），壳聚糖-链霉素共价复合物的相对分子量为7026Da，鉴定结果如图1所示。
实施例2
取壳聚糖100mg，链霉素452.5mg分别溶于30ml去离子水中，并加入0.744g NaCNBH3置于黑暗处20℃，300rpm，搅拌24h，将溶液加入拦截分子量为3500的透析袋，在去离子水中透析2天，真空度30Pa，-45℃冷冻干燥48小时，即得摩尔比1:0.5的壳聚糖-链霉素共价复合物497.3mg。所得壳聚糖-抗生素共价复合物红外光谱采用Bruker公司生产的红外仪检测，采用溴化钾压片法。（董炎明;王勉;吴玉松;阮永红.纤维素科学技术6,9(2),42-55(2001)）。所得壳聚糖-链霉素共价复合物红外鉴定图谱如图2所示，其中2880～2900cm-1出现的吸收峰为链霉素上残余的醛基，1650cm-1是N-H，1360~1250cm-1是C-N，1153~1031cm-1为C-O。
实施例3
取壳聚糖150mg，链霉素2.714g分别溶于40ml去离子水中，并加入1.16g NaCNBH3，置于黑暗处25℃，300rpm，搅拌36h，将溶液加入拦截分子量为4000的透析袋，在去离子水中透析3天。在真空度20Pa，-45℃冷冻干燥48小时，即得摩尔比1:2的壳聚糖-链霉素共价复合物2.55g。将所得壳聚糖-抗生素共价复合物溶于氘代水，采用Bruker公司生产的核磁共振仪检测。所得壳聚糖-链霉素共价复合物的核磁共振C谱如图3所示，其中10ppm是甲基上的碳原子，30ppm是亚甲基，60~100ppm之间是糖环，160ppm是链霉素上残余的醛基。
实施例4
取壳聚糖50mg，链霉素1.81g分别溶于20ml去离子水中，并加入0.372g NaCNBH3，置于黑暗处30℃条件下300rpm，搅拌48h，将溶液加入拦截分子量为4500的透析袋，在去离子水中透析4天，真空度30Pa，-45℃冷冻干燥48小时，即得摩尔比1:4的壳聚糖-链霉素共价复合物1.66g。将所得壳聚糖-抗生素共价复合物溶于氘代水，采用Bruker公司生产的核磁共振仪检测。所述壳聚糖-链霉素共价复合物的核磁共振H谱如图4所示，其中1.0ppm是甲基，2.0ppm是壳聚糖上未去乙酰化的羰基，3.0~4.0ppm是糖环，4.5~5.0ppm是水，5.0~5.5ppm是链霉素上的头碳上的氢。
实施例5
取壳聚糖50mg，链霉素2.72g分别溶于20ml去离子水中，并加入0.372g NaCNBH3，置于黑暗处25℃，300rpm，搅拌48h，将溶液加入拦截分子量为5000的透析袋，在去离子水中透析5天，真空度30Pa，-40℃冷冻干燥36小时，即得摩尔比1:6的壳聚糖-链霉素共价复合物2.51g。
实施例6
取壳聚糖150mg，链霉素13.75g分别溶于20ml去离子水中，并加入6.785g NaCNBH3，置于黑暗处0℃，300rpm，搅拌72h，将溶液加入拦截分子量为14000的透析袋，在去离子水中透析5天，烘干36小时，即得摩尔比1:10的壳聚糖-链霉素共价复合物12.28g。
实施例7
取壳聚糖50mg，卡那霉素58.3mg分别溶于20ml去离子水中，并加入17.49mg氰基硼氢化钠（NaCNBH3），置于黑暗处90℃条件下300rpm，搅拌72h，将溶液加入拦截分子量为14000的透析袋，在去离子水中透析1天，红外干燥48小时，即得摩尔比1:0.1的壳聚糖-卡那霉素复合物85.8mg。
实施例8
取壳聚糖50mg，链霉素2.72g分别溶于20ml去离子水中，并加入0.816g NaCNBH3，置于黑暗处25℃，300rpm，搅拌48h，将溶液加入拦截分子量为5000的透析袋，在去离子水中透析5天，喷雾干燥，即得摩尔比1:6的壳聚糖-链霉素共价复合物2.51g。
实施例9
取壳聚糖150mg，链霉素2.714g分别溶于40ml去离子水中，并加入0.81g NaCNBH3，置于黑暗处60℃，300rpm，搅拌0.5h，将溶液加入拦截分子量为1000的透析袋，在去离子水中透析1天。所得透析液在真空度20Pa，干燥48小时，即得摩尔比1:2的壳聚糖-链霉素共价复合物2.55g。
效果实施例1壳聚糖-链霉素共价复合物对细菌生物膜的破坏作用
微生物：单增李斯特菌CMCC 54004、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、铜绿假单胞菌ATCC9027。
药物：实施例1-9制备所得壳聚糖-链霉素共价复合物，药物对照壳聚糖（青岛云宙生物科技有限公司）、链霉素（阿拉丁）。
试验方法：在96孔培养板各孔中加0.1ml含5×108～109的细菌，放入37℃培养箱中培养24小时，让细菌帖壁形成生物膜。吸去培养液，用PBS（0.1mol/L)洗涤三次，每孔加90μl LB培养基和10μl药物。药物为壳聚糖-链霉素共价复合物（其中壳聚糖和链霉素的摩尔比分别为1:0.1，1:0.5，1:2，1:4，1:6，1:10），壳聚糖（CS），链霉素（L），以及壳聚糖和链霉素的混合物（CS+L）（其中壳聚糖和链霉素质量比为1:1），所述药物浓度均为0.25mg/ml。每组平行6孔。置于37℃培养箱中培养24h。吸去药物，用PBS（0.1mol/L)小心洗涤三次，每孔加0.1ml 99％甲醇溶液固定细菌15分钟。吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml 0.1%结晶紫染液，室温中放置20分钟。轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。测定前，每孔加0.1ml 33％醋酸脱色，充分振荡后在595nm处测定光吸收度。试验重复三次。
三次重复试验结果表明，壳聚糖-链霉素共价复合物对上述三种细菌形成的生物膜具有显著的抑制、破坏作用，并且在24h内都具有显著的效果，其结果如图5（A、Ｂ、Ｃ）所示。
效果实施例2壳聚糖-链霉素共价复合物对生物膜深处细菌的抑制作用
菌株：同效果实施例1。
药物：同效果实施例1。
试验方法：在96孔培养板各孔中加0.1ml含5×108～109的细菌，放入37℃培养箱中培养24小时，让细菌帖壁形成生物膜。吸去培养液，用PBS（0.1mol/L)小心洗涤三次，每孔加90μl培养基和10μl不同的药物（同效果实施例1），每组平行6孔。置于37℃培养箱中培养24h。吸去药物，用PBS（0.1mol/L)小心洗涤三次，每孔加90μl培养基和10μl MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，0.22μm过滤)，继续孵育3h，终止培养，3500rmp离心5min，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加100μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。490nm波长下，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。试验重复三次。
三次重复试验结果表明，在24h内，壳聚糖-链霉素共价复合物对生物膜深处的上述三种细菌具有显著的抑制、杀死作用，其结果如图6（A、Ｂ、Ｃ）所示。
效果实施例3壳聚糖-链霉素共价复合物对生物膜深处细菌的抑制作用
菌株：同效果实施例1。
药物：同效果实施例1。
在96孔培养板各孔中加0.1ml含5×108～109的细菌，放入37℃培养箱中培养24小时，让细菌帖壁形成生物膜。吸去培养液，用PBS小心洗涤三次，每孔加90μl培养基和10μl药物（同效果实施例1），每组平行6孔。置于37℃培养箱中培养24h。吸去药物，用PBS小心洗涤三次，加入0.1ml0.2%Triton X-100裂解1h后，稀释点板、计数。
试验结果表明，不同摩尔比例的壳聚糖-链霉素共价复合物在24h内对生物膜深处的上述三种细菌具有显著的抑菌、杀菌效果，其结果如图7（A、Ｂ、Ｃ）所示。
效果实施例4壳聚糖-链霉素共价复合物在生物膜形成过程中的杀菌作用
菌株：同效果实施例1。
药物：同效果实施例1。
试验方法：在96孔培养板各孔中加90μl含5×108～109的细菌的溶液，同时加入10μl不同的药物（同效果实施例1），每组平行6孔，放入37℃培养箱中培养24小时。吸去药物，用PBS（0.1mol/L)小心洗涤三次，每孔加90μl培养基和10μl MTT溶液（浓度为5mg/ml，用PBS配制，0.22μm过滤)，继续孵育3h，终止培养，3500rmp离心5min，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加100μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。490nm波长下，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。试验重复三次。
试验结果表明，壳聚糖-链霉素共价复合物在所述三种细菌生物膜形成过程的24h内，具有显著的抑菌和杀菌作用，其结果如图8（A、Ｂ、Ｃ）所示。其中壳聚糖和链霉素摩尔比为1∶0.5的壳聚糖-链霉素共价复合物杀菌效果较好，链霉素的使用量较低。
效果实施例5壳聚糖-链霉素共价复合物在生物膜形成过程中的杀菌作用
菌株：同效果实施例1。
药物：同效果实施例1。
试验方法：在96孔培养板各孔中加90μl含5×108～109的细菌，同时加入10μl不同的药物（同效果实施例1），每组平行6孔，放入37℃培养箱中培养24小时。吸去96孔板内液体，用PBS（0.1mol/L)小心洗涤三次，加入0.1ml 0.2%Triton X-100裂解1h后，稀释点板、计数。
试验结果表明，壳聚糖-链霉素共价复合物在上述三种细菌生物膜形成过程的24h内，具有显著的抑菌和杀菌作用，其结果如图9（A、Ｂ、Ｃ）所示。其中壳聚糖和链霉素摩尔比为1∶0.5的壳聚糖-链霉素共价复合物杀菌效果好，链霉素的使用量较低。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种壳聚糖-抗生素共价复合物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖和抗生素水溶液，将壳聚糖和抗生素按照摩尔比例为1:0.1～1:10混合，加入NaCNBH3，避光搅拌，0℃～90℃反应0.5～72小时；
（2）将步骤（1）所得的水溶液移入截留分子量为1000～14000的透析袋中，透析1～5天，得到透析液；
（3）将步骤（2）所得的透析液干燥，即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述抗生素为庆大霉素、链霉素或卡那霉素。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述抗生素为链霉素。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述壳聚糖和抗生素的摩尔比例为1:0.5～1:6。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述NaCNBH3的添加量是所述抗生素含量的30%～50%，所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反应的温度为15℃～30℃，所述反应的时间为10～48小时。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述透析袋截留分子量为3000～5000，所述透析的时间为2～5天。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述干燥的方式为真空冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、烘干或红外干燥。
9.一种如权利要求1～8任一项所述的制备方法制备所得的壳聚糖-抗生素共价复合物。
10.如权利要求9所述的壳聚糖-抗生素共价复合物在制备抗感染药物中的用途。
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