CN103782166A - 用于定量样品中目标分析物的组合物、方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种通过质谱法定量目标分析物的方法，所述方法包括获得质谱信号，所述质谱信号包括第一校准物信号、包括第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且潜在包含目标分析物。所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。所述方法还包括使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号，以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述目标分析物。

Description

用于定量样品中目标分析物的组合物、方法和试剂盒

相关申请

本申请要求2011年6月6日提交的欧洲专利申请第11168854.5号，以及2012年5月21日提交的美国临时申请第61/649,413号的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明通常涉及用于定量样品中一种或更多种目标分析物的组合物、试剂盒、方法和装置。本发明更特别地涉及质谱法分析，其中存在的单个样品包含第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，并且其中第一校准物、第二校准物，以及相应的目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。

发明背景

质谱法(MS)是生命科学中的主要发现工具。通过使用该分析技术，有可能通过离子化所述样品中含有的样品或分析物分子，并且然后测量所得到的离子的质荷比来分析样品的分子组成。通过MS实验获得的质谱可用于鉴别、表征，以及定量感兴趣的分析物的丰度。特别地，液相色谱-质谱法(LC-MS)最近已经被用于药物和生物活性化合物的定量，主要由于LC/MS/MS赋予的高选择性、灵敏度、速度，和简单。

对于样品中目标分析物的定量，通常必须首先建立校准曲线，所述校准曲线表示由所用的特定分析方法获得的分析信号(例如，MS光谱或质谱图中的峰面积或峰高)与目标分析物的量之间的关系。因此，在分析样品之前，必须测定一系列校准标准的分析信号(例如，六个不同浓度的分离目标分析物)并且必须定期(例如，每天)进行该外部校准。然而，该程序降低生产率，增加每个样品的成本，并且此外，使得仅一个样品的分析无效。

发明概述

本发明提供用于通过质谱法定量样品中的目标分析物的组合物、试剂盒、方法和装置，而不依赖于常规校准及其相关的的缺点和劣势。通常，本发明提供MS分析，其中存在包含第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物的单个样品，并且其中第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。

除了消除常规校准品的无效以外，本发明提出基质效应的问题，所述问题造成在样品中目标分析物的定量分析中使用MS的主要问题(例如，因为与目标分析物共同提取的基质可能改变信号响应，导致差的分析准确度、线性和重现性)。例如，不同个体的样品可能在所用的分析体系中具有不同的行为并且可能与校准标准的行为不同。因此，使用常规方法的准确分析需要提供基于基质的校准标准，例如，不含目标分析物并且含有校准标准的基质。然而，可能难以获得此类不含目标分析物的基质，特别是对于通常预期存在于该基质中的目标分析物(例如，血浆中的甾体)。

此类基于基质的校准物标准的其它问题包括：(i)需要获得常规质量和组合物中大量不含目标分析物的基质；(ii)病原体测试，如果基质为人或动物来源；(iii)基质的处理、贮藏和稳定性；和(iv)基质中校准物的处理、贮藏和稳定性。此外，待分析样品可能性质非常多样化，例如，不同身体样品(例如，毛发和血浆)。因此，此类多样化样品的基质也可显著不同，从而需要两个不同组的校准标准，一个组匹配身体样品，并且一个组匹配环境样品。因此，适用于多种样品的校准标准和定量方法是有利的，所述样品例如，临床化学领域相关的样品(例如，用于定量代谢产物的血浆)，环境保护领域相关的样品(例如，用于定量药物的污水)，或食品工业领域相关的样品(例如，用于研究食品样品的保留样品，例如，动物或植物来源的食品例如乳、面包、蛋、肉，或其提取物)。

然而常规方法可能需要将内标物加至样品(例如，因为常规校准物不在样品中并且，因此，须经与目标分析物不同的基质)，本发明不需要内标物因为内部校准物须经与目标分析物完全相同的基质。基本上出于相同原因，本发明可采用比常规方法更少的校准物，并且可能会获得相同的或更好的准确度和/或精密度。

因此，本发明的物质、方法、试剂盒和装置符合样品中目标分析物的有效定量的需求，特别是如果待分析样品的数量少于校准标准的数量。此外，本发明还符合对普遍适用于多种样品的校准标准和定量方法的需要，所述样品例如，临床化学领域相关的样品(例如，用于定量代谢产物的血浆)，环境保护领域相关的样品(例如，用于定量药物的污水)，和食品工业领域相关的样品(例如，动物或植物来源的食品例如乳、面包、蛋、肉，或其提取物)。

通过提供以不同浓度包括两种(或更多种)内部校准物的可用于定量样品中的目标分析物的组合物，本发明符合这些，以及其它需要。内部校准物和目标分析物可根据它们在质谱仪中的行为而彼此区分。该校准标准可以稳定、易于处理和/或适用于高通量分析。

本发明提供的一个优势是可进行样品分析内的内部校准，从而避免对外部校准的需要。因此，通过使用内部校准有可能通过进行一个样品的单次分析来定量分析物，使得每次分析得到结果从而增加生产率并且降低每个样品的成本。本发明的至少一些实施方案的进一步优势在于校准标准存在于与目标分析物完全相同的基质中并且因此，每个样品具有其自身基质完全匹配的校准标准，从而减少或消除基质效应。与常规方法相比，本发明的又一优势是降低产生结果的时间并且增加生产量的潜力。

本发明的内部校准物组合物、试剂盒和方法广泛适用于多种样品，所述样品例如，临床化学领域相关的样品(例如，用于定量代谢产物的血浆)，环境保护领域相关的样品(例如，用于定量药物的污水)，和食品工业领域相关的样品(例如，动物或植物来源的食品例如乳、面包、蛋、肉，或其提取物)。此外，因为内部校准物被加至待分析样品中，可以与处理目标分析物完全相同的方式处理它们，并且因此可被用于补偿样品制备期间的样品和/或分析物损失。

内部校准物包括这样的化合物，所述化合物在化学组成、结构和理化性质方面类似于相应的目标分析物，但是根据内部校准物和目标分析物在质谱仪中的行为可与目标分析物区分开。例如，内部校准物可模拟相应的目标分析物使得内部校准物的理化性质的至少一种基本上与目标分析物相应的理化性质相同。在各种实施方案中，通常在质谱仪中分析之前通过用于处理样品的一种或更多种技术，内部校准物及其相应的目标分析物无法有效地彼此区分。例如，内部校准物及其相应的目标分析物无法根据以下的一种或更多种而区分：溶解度(在溶剂，例如，水或有机溶剂，或溶剂的混合物中)、保留时间(在分离技术，例如液相色谱中)、亲和力(例如，对所述目标分析物的特异性抗体的亲和力)、解离常数、对于酶(例如，水解酶、转移酶)的反应性和/或特异性。在一些实施方案中，内部校准物通常不存在或以可忽略不计(或者说是可补偿的)的初始量存在于待分析样品中。在一些实施方案中，内部校准物通常为合成化合物，例如，不是天然存在(例如，在样品中)的化合物或其天然丰度低于质谱仪的检测限。

基于在质谱仪中的行为可区分的性质包括以下情况：其中两种或更多种化合物(例如第一或第二内部校准物和目标分析物；或第一和第二内部校准物)由于它们的质量差异(即，可通过MS仪器，或在给定截断处分辨的质量的差值)、碎片图，或其组合的差异，可通过质谱仪彼此区分。这两种化合物之间质量的差值可来源于不同同位素(例如，两种化合物中的一种中的低丰度同位素对比两种化合物中的另一种中的高丰度同位素)或不同化学部分(例如，不同实验式)的存在。

两种或更多种化合物的任何两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)可由于它们的碎片图中的差异通过分质谱仪彼此区分。两种或更多种化合物(例如一种内部校准物及其相应的目标分析物；或两种内部校准物)可在质谱分析期间基本上以相同方式成为碎片，从而对于同位素类似物，生成化学组成和结构类似的碎片(对于化学类似物，碎片可以是不相似的)。在一些情况下，两种或更多种化合物可具有相同质量和实验式，但是不同质量的碎片(例如，4D维生素D和2D、2¹³C维生素D)。

例如，两种或更多种化合物的任何两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)由于它们的质量差异(即，可通过MS仪器，或在给定截断处分辨的质量的差值)可通过质谱仪彼此区分。两种化合物的质量(例如，第一内部校准物和目标分析物)可相差至少1(或2、3、4、5，…)质量单位，其中两种化合物是同位素类似物。其中化合物是化学类似物(例如，不同于经验式)，所述类似物可相差低于一个质量单位和/或非整数量。

一方面，本发明的特征为用于通过质谱法定量目标分析物的方法。所述方法包括获得质谱信号，其包括第一校准物信号、包含第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物。第一已知量和第二已知量不同，并且单个样品中的第一校准物、第二校准物以及目标分析物可通过质谱法各自区分。所述方法还包括使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。

在另一方面，本发明的特征为用于通过质谱法定量目标分析物的组合物。组合物包含第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中单个样品中的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法各自区分。

在又一方面，本发明的特征为用于通过质谱法来定量目标分析物的试剂盒。试剂盒包括第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。试剂盒还包括对以下的说明：(i)获得质谱信号，包括来自单个样品的第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物和(ii)使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。

在又一方面，本发明的特征为计算机可读介质，包括计算机可执行指令(例如，本发明的方法的物理实施方案)。计算机可执行指令适于获得包括来自单个样品的第一校准物信号，包括第二校准物信号，并且可能包含目标分析物信号的质谱信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物。第一已知量和第二已知量不同。单个样品中的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法各自区分。计算机可执行指令还适于使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。

在再一方面，本发明的特征为用于通过质谱法来定量目标分析物的装置。所述装置包括被配置成通过合并可能包含目标分析物的单个样本中第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物来制备所述单个样品的样品处理器。所述装置还包括被配置成生成的质谱信号包括第一校准物信号，包括第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号的质谱仪，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中单个样品中的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法各自区分。此外，装置包括数据处理器，其被配置成使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。

在各种实施方案中，本发明还包括(i)通过在可能包含目标分析物的单个样本中合并第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物来制备单个样品；以及(ii)使用质谱仪由单个样品生成质谱信号。

在一些实施方案中，本发明还包括在获得质谱信号之前分离第一校准物、第二校准物，以及来自单个样品的其它组分的目标分析物。分离可包括色谱法以及第一校准物、第二校准物，以及目标分析物共洗脱。分离可包括色谱法和第一校准物、第二校准物，以及目标分析物分别洗脱。分离可包括固相提取法、液相色谱法、气相色谱法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法，以及超临界流体色谱法的至少一种。

在某些实施方案中，本发明还包括(i)由第一校准物信号和第二校准物信号获得校准曲线；以及(ii)使用校准曲线以及目标分析物信号来定量目标分析物。本发明可包括使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来代数地定量目标分析物。

在各种实施方案中，第一校准物和第二校准物各自为目标分析物的不同类似物、衍生物、代谢产物，或有关化合物。第一校准物和第二校准物可各自为目标分析物的不同稳定同位素类似物。例如，一组或多组内部校准物的内部校准物(例如，所有组的内部校准物的内部校准物)可以是相应的目标分析物的同位素标记的类似物、相应的目标分析物的衍生物，或相应的目标分析物的代谢产物，优选相应的目标分析物的同位素标记的类似物。适合的同位素包括²H、¹¹B、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁴S、³⁶S、⁷⁴Se、⁷⁶Se、⁷⁷Se、⁷⁸Se和⁸²Se。

本发明包括具有用于目标分析物的一种或更多种其它内部校准物(例如，除了第一和第二校准物以外，用于目标分析物的1、2、3、4、5、6、7、8、9等内部校准物)的实施方案。类似地，本发明包括分析单个样品中两种或更多种分析物的小组的实施方案(例如，对于第二目标分析物、任选的第三目标分析物、任选的第四目标分析物、任选的第五目标分析物、任选的第六目标分析物、任选的第七目标分析物、任选的第八目标分析物、任选的第九目标分析物等的每一个用两种或更多种其它内部校准物)。

在一些实施方案中，本发明还包括(i)由质谱信号获得来自单个样品的第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号，所述单个样品包含第三已知量的第三校准物，包含第四已知量的第四校准物，并且可能包含其它目标分析物，其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、目标分析物，以及其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分；以及(ii)使用第三校准物信号，第四校准物信号，以及其它目标分析物信号来定量单个样品中的其它目标分析物。本发明可进一步包括(i)由质谱信号获得来自单个样品的第五校准物信号、第六校准物信号，以及第二其它目标分析物信号，所述单个样品包含第五已知量的第五校准物，包含第六已知量的第六校准物，并且可能包含第二其它目标分析物，其中第五已知量和第六已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、第五校准物、第六校准物、目标分析物、其它目标分析物，以及第二其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分；以及(ii)使用第五校准物信号、第六校准物信号，以及第二其它目标分析物信号来定量单个样品中的第二其它目标分析物。

在某些实施方案中，本发明还包括(i)由质谱信号获得来自单个样品的第三校准物信号，所述单个样品进一步包含第三已知量的第三校准物。第一已知量、第二已知量和第三已知量不同。第一校准物、第二校准物、第三校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。定量目标分析物进一步包括使用第三校准物。本发明可进一步包括由质谱信号获得来自单个样品的第四校准物信号，所述单个样品进一步包含第四已知量的第四校准物。第一已知量、第二已知量、第三已知量，以及第四已知量不同。第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物和目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。定量目标分析物进一步包括使用第四校准物。

在各种实施方案中，本发明还包括第三已知量的第三校准物以及第四已知量的第四校准物，其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物，目标分析物，以及其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。本发明可进一步包括第五已知量的第五校准物和第六已知量的第六校准物，其中第五已知量和第六已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、第五校准物、第六校准物、目标分析物、其它目标分析物，以及第二其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。

在一些实施方案中，本发明还包括第三已知量的第三校准物，其中第一已知量、第二已知量，和第三已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。本发明可进一步包括第四已知量的第四校准物，其中第一已知量、第二已知量、第三已知量，以及第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。

在某些实施方案中，本发明还包括限定至少一种样品接受器的样品架，其中第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物均包含在至少一种样品接受器内。

在各种实施方案中，本发明还包括限定至少一种样品接受器的样品架，其中第一已知量的第一校准物、第二已知量的第二校准物、第三已知量的第三校准物，以及第四已知量的第四校准物均包含在至少一种样品接受器内。

在各种实施方案中，本发明还包括第三已知量的第三校准物和第四已知量的第四校准物，其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物，目标分析物，以及其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分；以及对以下的说明：(i)由质谱仪获得来自单个样品的第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号，所述单个样品包含第三已知量的第三校准物，包含第四已知量的第四校准物，并且可能包含其它目标分析物，以及(ii)使用第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号来定量单个样品中的其它目标分析物。

在一些实施方案中，本发明还包括适于以下的计算机可执行指令：(i)引导自动代码阅读器以基于与所述给定样本有关的代码测定给定样本中的一种或更多种待测试分析物的列表；以及(ii)引导自动校准物系统以合并所述给定样本与所述一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。

在某些实施方案中，本发明还包括被配置成在获得质谱信号之前分离来自单个样品的其它组分的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物的分离系统。分离系统可包括固相提取、液相色谱、气相色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱，以及超临界流体色谱设备中的至少一种。提取、色谱，或电泳装置可耦接于质谱仪(在线模式)或不耦接于质谱仪(离线模式)。

在各种实施方案中，样品处理器进一步包括(i)自动代码阅读器，其被配置成基于与给定样本有关的代码测定给定样本中一种或更多种待测试分析物的列表；以及(ii)自动校准物系统，其被配置成合并给定样本与一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。自动校准物系统可被配置成递送给定样本至样品接受器，所述样品接受器包含一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。自动校准物系统可被配置成为一种或更多种分析物的每一种递送第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物至包含给定样本的样品接受器。

在某些实施方案中，目标分析物是包含至少3个碳原子的有机分子。目标分析物可以是甾体(例如，甾体激素或性激素，例如睾酮、皮质醇、雌酮、雌二醇、17-OH-孕激素或醛固酮)；免疫抑制药物(例如，环孢菌素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司，或霉酚酸)；甲状腺标志物(例如，促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白、三碘甲状腺原氨酸(T3)、游离T3、甲状腺素(T4)、游离T4，或铁蛋白)；维生素或其代谢产物(例如，维生素D2或维生素D3的25-羟基-、1,25-二羟基-或24，25-二羟基-形式)；心脏标志物(例如，肌钙蛋白或脑钠肽)；α-胎蛋白；或滥用药物(例如，阿片剂)。

在各种实施方案中，样品可包括身体样品、环境样品、食品样品、合成样品或其组合。身体样品可包括体液(例如，血浆或尿液)、粪便、身体组织(例如，活检样品)，或其提取物。环境样品的实例包括水(例如，饮用水、江河水、表面水、地下水、可饮用水、污水、流出物、废水，或沥出液)、土壤、空气、沉积物、植物群、动物群，或其提取物。食品样品可包括动物或植物来源的食品(例如，乳、面包、蛋或肉)或其提取物。合成的样品的实例为来自工业工艺、其过程中样品或其提取物的反应混合物的样品。所述工业工艺可以是生物工业工艺(例如，使用含有遗传信息并且自身能够再生或在生物系统中再生的生物材料的工艺，例如使用转染的细胞的发酵工艺)或非生物工业工艺(例如，诸如药物的化合物的化学合成或降解)。

在一些实施方案中，通过用于目标分析物的内部校准物定义的范围(例如，量或浓度)可跨越样品中目标分析物的分析范围，或预期的分析范围。(i)以最高量存在的内部校准物和(ii)以最低量存在的内部校准物之间的比例可以是至少2(例如，2︰1、3︰1、4︰1、5︰1、6︰1、7︰1、8︰1、9︰1、10︰1等)。

下面的附图和实施例更详细地描述了本发明，使用附图和实施例仅用于说明目的而非限制。

附图详述

图1示出了用于选择内部校准物和以适用于分析的比例合并它们的示例性方法。

图2示出了用于定量一种或更多种样品的示例性方法。

图3显示了根据本发明的一方面的实例装置。

图4显示了使用本发明的内部校准方法分析样品的典型色谱图的实例。

图5显示了由图4中显示的数据生成的样品特异性校准曲线的实例。

图6显示了使用内部校准方法测量的睾酮QC数值与已知睾酮浓度的对比。

图7显示了TargetLynx生成的睾酮的外部校准线。

图8显示了分析的46个血清样品中的每一种的单个内部校准线，包括样品46的五个相同样品。

图9显示了对应于观察到的最小和最大斜率的血清样品22和42的单个内部校准线。

图10显示了在46个血清样品中使用外部校准和用三种内部校准物的内部校准测定的睾酮浓度的对比。

图11显示了在46个血清样品中使用外部校准和用三种内部校准物加上原点的内部校准测定的睾酮浓度的对比。

图12显示了使用表11和12描述的LC和MS/MS条件的来自实验2的实例质谱图。上面给出了通过TargetLynx测定的各内部校准物和分析物的色谱峰的积分的峰面积。

图13显示了来自实施例2中的实验1的十个IPT样品的单个内部校准线。图例指示IPT样品的鉴别。回归计算中包括原点。

图14显示了来自实施例2中实验2的十九个IPT样品的单个内部校准线。图例指示IPT样品的鉴别。回归计算中包括原点。

图15显示了用于定量实施例3中尿液中的氢吗啡酮的内部校准线。

图16显示了通过实施例3中的内部校准和外部校准测定的3个QC和UTAKQC的平均氢吗啡酮浓度值的相关性。

图17显示了用于实施例3中实验2中的QC复制的内部校准分析的单个校准线。

图18显示了通过外部和内部校准测定的氢吗啡酮浓度值之间的相关性。

本发明的其它特征和优点根据以下详细描述和权利要求是显然的。

发明详述

本发明提供用于定量样品中的目标分析物的组合物、试剂盒、方法和装置。本发明采用第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法在样品中各自区分，以定量样品中的目标分析物。第一校准物、第二校准物，和/或目标分析物例如可根据同位素取代和/或化学官能团取代来区分。以下详细描述提供关于以下的其它详情：分析物和校准物，然后是组合物、试剂盒、方法和装置，并且最后是说明性实例。

分析物

继续上文的概述，分析物或目标分析物可基本上包含质谱仪中可检测的感兴趣的任何分子。目标分析物可以是临床化学、医学、兽医、法医化学、药理学、食品工业、工作安全，和环境污染感兴趣的一种或更多种。通常，目标分析物是包括至少1个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碳原子的有机分子。目标分析物可包括直至1,000、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20，或15个碳原子。分析物也可包括无机分析物(例如，磷化合物、硅化合物、无机聚合物等)。

临床化学目标分析物可包括生物体(例如，人体、动物体、真菌、细菌、病毒等)中存在的任何有机化合物。例如，临床化学目标分析物包括但不限于核苷碱基(例如，腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)，它们的类似物(例如，7-脱氮鸟嘌呤)，以及衍生物(例如，单、二、三磷酸盐或环磷酸盐)；激素(例如，甾体激素)；氨基酸；蛋白(例如，脑钠肽)；代谢产物(例如，肌酸酐、胆红素)；心脏标志物(例如，肌酸激酶-MB)；肝标志物(例如，天冬氨酸盐转氨酶)；神经递质(例如，GABA、甘氨酸、生物胺(例如多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、组胺、血清素)，乙酰胆碱、腺苷、大麻素)；药物以及它们的代谢产物(例如，镇静剂、镇定剂、抗高血压剂、麻醉剂)。

人类医学和兽医目标分析物可包括任何有机化合物，所述有机化合物在受试者中可用于疾病或病状的诊断、预防或治疗。例如，人类医学和兽医目标分析物包括但不限于疾病标志物(例如，肿瘤相关抗原)；紫外线屏蔽剂，造影剂；预防性或治疗剂(例如，变态反应原、抗生素、抗真菌剂、抗细菌剂、抗组胺剂、抗肿瘤剂、镇痛剂、减食欲剂、抗蠕虫剂、抗痉挛剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、止泻剂、抗组胺剂、抗炎剂、抗偏头痛制剂、止恶心剂、抗帕金森病药物、止痒剂、抗精神病剂、解热剂、镇挛剂、抗胆碱剂、拟效感神经剂、黄嘌呤衍生物、包括钙通道阻滞剂、β阻滞剂、抗心律不齐剂、抗高血压剂、利尿剂、血管舒张剂的对心血管有效的试剂；CNS兴奋剂、抗咳嗽和感冒的试剂、解充血剂、激素、安眠剂、免疫抑制剂、驱虫剂、肌肉松弛剂、抗副交感神经剂、拟副交感神经剂、神经兴奋剂、镇静剂、镇定剂、生理活性肽和蛋白)。

法医化学目标分析物可包括取自犯罪现场的样品中存在的任何有机化合物，例如来自受害者尸体的样品(例如，组织或液体样品、毛发、血液、精液、尿液等)。例如，临床化学目标分析物包括但不限于毒性剂、药物以及它们的代谢产物(例如，镇静剂、镇定剂、抗高血压剂和麻醉剂)、核酸、DNA、RNA、杀虫剂、天然产品、污染物和工业化合物。

药理学目标分析物可包括药物或其代谢产物或可用于药物的设计、合成和监测的任何有机化合物。例如，药理学目标分析物包括但不限于预防性和/或治疗剂，它们的前药、中间体和代谢产物。

食品工业和农业目标分析物可包括与食品、饮料，和/或其它食品工业/农业产品的安全性的监测相关的任何有机化合物。来自食品工业领域的目标分析物的实例包括但不限于甾体、增塑剂、病原体标志物、杀虫剂、杀真菌剂、污染物、变态反应原(例如谷蛋白和坚果蛋白)、真菌毒素、海洋毒素，和抗生素(例如，虾中的氯霉素)。

工作场所安全性目标分析物可包括可能存在于工作场所的任何有机可能危害化合物。例如，工作场所安全性目标分析物包括但不限于已经设定其职业暴露限度(例如，由商业、政府、管理，或行政机构)的溶剂、低挥发性物质、污染物、致癌物、毒素、杀虫剂、杀真菌剂，和任何有机物质。

环境污染(或工业)目标分析物可包括可危害环境的任何有机化合物(例如，环境中的生物体)。例如，环境污染(或工业)目标分析物包括但不限于持久性有机污染物(例如艾氏剂、氯丹、DDT、狄氏剂、异狄氏剂、七氯、六氯苯、灭蚁灵、多氯化联苯、多氯化二苯并-对-二恶英、多氯化二苯并呋喃，和毒杀芬)、聚环状芳香烃(例如苯并[a]蒽和)、挥发性有机化合物，和环境异生物质(例如镇痛剂，例如，醋氨酚、乙酰水杨酸、双氯芬酸、可待因、布洛芬；抗生素，例如，大环内酯抗生素、磺酰胺、氟喹诺酮、氯霉素、泰洛星、甲氧苄啶、红霉素、林可霉素、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶；抗痉挛剂、例如，卡马西平、扑米酮；β-阻滞剂，例如，美托洛尔、普萘洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、纳多洛尔；X射线介质，例如，碘普罗胺、碘帕醇、碘海醇、泛影酸；细胞抑制剂；甾体和激素，例如，17α-炔雌醇、美雌醇、19-炔诺酮)。分析物也可包括无机分析物(例如，磷化合物、硅化合物、无机聚合物等)。分析物也可包括油和石油化学品(例如，矿物油等)。

目标分析物可包括氨基酸(例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys，Met、Ser、Thr、Tyr、His、Lys、Arg、Asp、Glu、Asn、Gln、硒代半胱氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、甲基赖氨酸、羧基谷氨酸)、肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白；核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、DNA、RNA、肽-核酸；糖、单糖、二糖、寡糖、多糖、淀粉、复合碳水化合物；脂质、脂肪酸、脂肪、复合脂质、甾体；维生素(A、B₁、B₂、B₆、B₉、B₁₂、C、D、D₂、E、F、K、K₁、K₂)；激素(例如肽激素(例如，TRH和加压素)、脂质激素(例如，甾体激素和类花生酸)、单胺来自芳香氨基酸(例如，甲状腺素和肾上腺素))、雄激素类(例如，合成代谢甾体、雄烯二酮、脱氢表雄酮、双氢睾酮、睾酮)、雌激素类(例如，雌二醇、雌三醇、雌酮、17α-炔雌醇、美雌醇)、孕激素类(例如，孕激素、19-炔诺酮)、孕激素类(例如，炔雌酮、异炔诺酮、炔雌酮乙酸盐、双醋块诺醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、甲基炔诺酮、去氧孕烯、孕二烯酮、诺孕酯、屈螺酮、地诺孕素、屈螺酮、烯诺孕酮(nestorone)、醋酸诺美孕酮和曲美孕酮)；甾体、例如昆虫甾体(例如，蜕皮甾酮)、脊椎动物甾体(例如，性甾体/激素、皮质类固醇(包括糖皮质激素和盐皮质激素(例如，氢化可的松、可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、曲安奈德、曲安西龙醇(triamcinolone alcohol)、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、醋酸氟轻松、醋酸氟轻松、氯氟舒松、倍他米松、地塞米松、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、二丙酸阿氯米松、氟尼缩松、二丙酸倍氯米松))、合成代谢甾体(例如，睾酮、去甲睾酮、以及它们的衍生物(例如在17-α位烷基化(例如，甲基或乙基)、或在17-β位酯化))、胆固醇及其衍生物(例如，羟固醇和胆汁酸))、植物甾体(例如植物甾醇类和油菜类固醇(例如，β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇))、真菌类甾体(例如麦角甾醇)；工业聚合物(该聚氯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯酰胺)以及它们的单体；小有机分子例如药物和类药分子或其碎片。

在各种实施方案中，特别感兴趣的目标分析物包括甾体(优选甾体激素或性激素，例如睾酮、皮质醇、雌酮、雌二醇、17-OH-孕激素或醛固酮)；免疫抑制药物(例如环孢菌素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司，或霉酚酸)；甲状腺标志物(例如促甲状腺激素(TSH)、甲状腺球蛋白、三碘甲状腺原氨酸(T3)、游离T3、甲状腺素(T4)、游离T4，或铁蛋白)；维生素或其代谢产物(例如维生素D2或维生素D3的25-羟基-、1,25-二羟基-或24，25-二羟基-形式)；心脏标志物(例如肌钙蛋白或脑钠肽)；α-胎蛋白；载脂蛋白，或滥用药物(例如氢吗啡酮、其它阿片药物，或治疗性药物)。

样品

通常，样品是包括至少一种目标分析物(例如，以上所公开的分类或类别的分析物，以及基质)的组合物。样品可包括固体、液体、气体、混合物、材料(例如，中间体一致性的材料，例如，提取物、细胞、组织、生物体)或其组合。在各种实施方案中，样品是身体样品、环境样品、食品样品、合成样品、提取物(例如，通过分离技术获得)，或其组合。

身体样品可包括来自个体身体的任何样品。在该上下文中，个体可以是动物，例如哺乳动物，例如人。其它实例个体包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、牛，或马。个体可以是患者，例如，患有疾病或疑似患有疾病的个体。身体样品可以是例如为了科学或医学测试目的，例如用于研究或诊断疾病(例如，通过检测和/或鉴别病原体或生物标记物的存在)而取得的体液或组织。身体样品也可包括细胞，例如，个体身体样品的病原体或细胞(例如，肿瘤细胞)。这些身体样品可通过包括组织活检(例如，钻取活检)的已知方法和通过取得血液、支气管吸出物、痰、尿液、粪便，或其它体液而获得。示例性的身体样品包括体液(humor)、全血、血浆、血清、脐带血(特别地，通过经皮脐带血取样(PUBS)获得的血液、脑脊液(CSF)、唾液、羊水、母乳、分泌物、败液、尿液、粪便、胎便、皮肤、指甲、毛发、脐、胃内容物、胎盘、骨髓、外周血淋巴细胞(PBL)，和固体器官组织提取物。

环境样品可包括来自环境，例如天然环境(例如，海洋、土壤、空气和植物群)或人造环境(例如，运河、隧道、建筑物)的任何样品。该环境样品可用于发现、监测、研究、控制、减轻，以及避免环境污染。示例性的环境样品包括水(例如，饮用水、江河水、表面水、地下水、可饮用水、污水、流出液、废水，或沥出液)、土壤、空气、沉积物、生物群(例如，土壤生物)、植物群、动物群(例如，鱼)，和土体(例如，开挖料)。

食品样品可包括来自食品(包括饮料)的任何样品。此类食品样品可用于各种目的，包括例如，(1)检查食品是否安全；(2)检查在食用食品时食品是否含有有害的污染物(保留的样品)或食品是否不含有害的污染物；(3)检查食品是否仅含许可的添加剂(例如，法规遵从性)；(4)检查它是否含有准确水平的强制性成分(例如，食品标签上的声明是否准确)；或(5)分析食品中含有的营养素的量。示例性的食品样品包括动物、植物或合成来源的食品(例如，乳、面包、蛋或肉)、肉、饮料，及其部分，例如保留样品。食品样品也可包括水果、蔬菜、豆类、坚果、含油种子、含油水果、谷类、茶、咖啡、中草药浸泡液(herbal infusions)、可可、啤酒花、草药、调味料、含糖植物、肉、脂肪、肾、肝、内脏、乳、蛋、蜂蜜、鱼，和饮料。

合成的样品可包括来自工业工艺的任何样品。所述工业工艺可以是生物工业工艺(例如，使用含有遗传信息并且自身能够再生或在生物系统中再生的生物材料的工艺，例如使用转染的细胞的发酵工艺)或非生物工业工艺(例如，诸如药物的化合物的化学合成或降解)。合成的样品可用于检查和监测工业工艺的进展，以测定期望的产品的产率，和/或测量副产品和/或起始材料的量。

校准物

继续上文的概述，校准物或内部校准物是这样的化合物：在化学组成(例如，经验式)、结构(例如，原子排布和键合)，和/或理化性质方面类似于相应的目标分析物，但是可通过内部校准物和目标分析物在质谱仪中的行为而区分。校准物和分析物可具有至少相同的共有基本结构(例如，特征性的单环或多环结构，例如甾烷)。

在很多实施方案中，化合物仅在它们的化学组成和/或分子量方面略有不同。例如，组合物和/或质量的差异可能是由于(i)用同系物基团替代一种基团(例如，同系物基团可具有多一个或少一个碳原子(例如，可将乙基(亚乙基)视为甲基和丙基(亚甲基和亚丙基))的同系物)；(ii)官能团的修饰(例如，氨基的乙酰化；酯化；甲基化；羟化；水合；生物素化；酰胺、酯、硫酯、缩醛、缩酮基团的裂解；脱羧作用；脱甲基化；脱水)；(iii)将原子替代为元素周期表的相同族的另一原子(例如，将一种卤素替代为另一种卤素)；以及(iv)将原子替代为所述原子相应的同位素(例如，将¹H替代为²H)。

此外，内部校准物可模拟相应的目标分析物使得内部校准物的理化性质的至少一种基本上与目标分析物相应的理化性质相同。理化性质可包括任何可测量的性质，所述性质的数值描述了化合物的物理和/或化学状态。例如，理化性质包括但不限于尺寸、质量、吸光度、发射、电荷、电势、等电点(pI)，流速(例如，保留时间)、磁场、自旋（spin）、溶解度、粘度、对其它物质(例如，抗体、酶)的反应性或亲和力、毒性、在给定环境中的化学稳定性，在特定物理条件下、在另一化学物质的存在下进行一系列特定转化(例如，分子解离、化学组合、氧化还原反应)的能力、极性，和疏水性/亲水性。

在各种实施方案中，通过在质谱分析之前通常用于处理样品的一种或更多种技术，内部校准物及其相应的目标分析物无法有效地彼此区分。例如，基于溶解度(在溶剂，例如，水或有机溶剂，或溶剂的混合物中)、保留时间(在分离技术，例如液相色谱中)、亲和力(例如，对所述目标分析物的特异性抗体的亲和力)、解离常数、对于酶(例如，水解酶、转移酶)的反应性和/或特异性，无法区分内部校准物及其相应的目标分析物。

内部校准物通常不存在或以可忽略不计(或者说是可补偿的)的初始量存在于待分析样品中。内部校准物可以是合成的化合物，例如，不是天然存在(例如，在样品中)的化合物或其天然丰度低于质谱仪的检测限。例如，内部校准物可以是相应的目标分析物的同位素标记的类似物，相应的目标分析物的衍生物，或相应的目标分析物的代谢产物。

同位素涉及具有相同质子数但中子数不同的核素(即，它们具有相同的原子数，并因此是相同的化学元素)。相同化学元素的不同同位素通常具有基本上相同的化学特征，并且因此在化学和/或生物系统中表现基本相同。因此，相应的目标分析物的同位素标记的类似物包括在化学组成和结构方面基本上与目标分析物相同的化合物，区别在于目标分析物的至少一个原子被其同位素替代。

在各种实施方案中，目标分析物的至少一个原子是最丰富的天然存在的同位素，并且校准物的取代的同位素是最不丰富的同位素。例如，目标分析物可包括具有¹H(¹²C、¹⁴N、¹⁶O，或⁸⁰Se)的位置并且校准物可将该位置的原子替代为²H(分别为¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁶S和⁷⁴Se)。同位素的天然丰度可低于49%(例如，低于所有现有同位素的总量的40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%，或0.01%)。同位素标记的类似物可使用稳定同位素。

原子的稳定同位素可以是非放射性的或放射性的。如果稳定同位素是放射性的，它的半衰期太长以至于无法测量，例如比宇宙年龄更长的半衰期，例如，13.75x10⁹年或更长的半衰期。稳定同位素包括但不限于²H、⁶Li、¹¹B、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、²⁵Mg、²⁶Mg、²⁹Si、³⁰Si、³³S、³⁴S、³⁶S、³⁷Cl、⁴¹K、⁴²Ca、⁴³Ca、⁴⁴Ca、⁴⁶Ca、⁴⁸Ca、⁴⁶Ti、⁴⁷Ti、⁴⁹Ti、⁵⁰Ti、⁵⁰V、⁵⁰Cr、⁵³Cr、⁵⁴Cr、⁵⁴Fe、⁵⁷Fe、⁵⁸Fe、⁶⁰Ni、⁶¹Ni、⁶²Ni、⁶⁴Ni、⁶⁵Cu、⁶⁶Zn、⁶⁷Zn、⁶⁸Zn、⁷⁰Zn、⁷¹Ga、⁷³Ge、⁷⁶Ge、⁷⁴Se、⁷⁶Se、⁷⁷Se、⁷⁸Se、⁸²Se、⁸¹Br、⁸⁴Sr、⁹⁶Zr、⁹⁴Mo、⁹⁷Mo、¹⁰⁰Mo、⁹⁸Ru、¹⁰²Pd、¹⁰⁶Cd、¹⁰⁸Cd、¹¹³In、¹¹²Sn、¹¹²Sn、¹¹⁴Sn、¹¹⁵Sn、¹²⁰Te、¹²³Te、¹³⁰Ba、¹³²Ba、¹³⁸La、¹³⁶Ce、¹³⁸Sn、¹⁴⁸Nd、¹⁵⁰Nd、¹⁴⁴Sm、¹⁵²Gd、¹⁵⁴Gd、¹⁵⁶Dy、¹⁵⁸Dy、¹⁶²Er、¹⁶⁴Er、¹⁶⁸Yb、¹⁷⁰Yb、¹⁷⁶Lu、¹⁷⁴Hf、^180m1Ta、¹⁸⁰W、¹⁸⁴Os、¹⁸⁷Os、¹⁹⁰Pt、¹⁹²Pt、¹⁹⁶Hg，和²⁰⁴Pb。优选的稳定同位素的实例包括²H、¹¹B、¹³C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³³S、³⁴S、³⁶S、⁷⁴Se、⁷⁶Se、⁷⁷Se、⁷⁸Se，和⁸²Se。

同位素标记的类似物可将一个至n个原子替代为同位素，其中n是目标分析物分子中原子的个数。在各种实施方案中，同位素标记的类似物可包括1、2、3、…、n个取代基，然后所述取代基可形成一组内部校准物。例如，第一校准物可以是具有一个取代基的类似物，第二校准物可以是具有两个取代基的类似物，第三校准物可以是具有三个取代基的类似物，以此类推。同位素标记的类似物可变化一个或更多个(例如，其中在类似物之间进行超过一次取代和/或其中同位素与最常见的天然存在的同位素相差超过一个质量单位)质量单位。给定类似物在取代位置的原子方面可以是同位素纯的。

同位素纯可意指化合物(例如目标分析物)中所含有的至少95%给定类型的原子(例如，高丰度同位素例如¹H)已经被另一种(优选较不丰富的)相同元素的同位素(例如，²H)取代。例如，至少96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.91%、99.92%、99.93%、99.94%、99.95%、99.96%、99.97%、99.98%，或99.99%或更多种给定类型的原子可被另一种(优选较不丰富的)相同元素的同位素替代。

目标分析物的衍生物包括在化学组成方面类似于目标分析物的化合物，区别在于它们是衍生的。衍生或衍生化涉及化学化合物(起始材料)转化为产物，即，具有类似于起始材料的结构的衍生物。衍生物可呈现一种或更多种改变的(例如，相对于起始材料)理化性质，例如改变的反应性、溶解度、沸点、熔点、聚集状态，或化学组成。改变的理化性质可用于衍生物和/或起始材料的定量和/或分离。衍生化的实例包括还原(含有或不含酶)、氧化(含有或不含酶)、酰化(例如，乙酰化)、烷基化(例如，甲基化)、水解(例如，酯、酰胺、环氧化物基团)、加成(例如，双键或三键的氢化)、缩合(例如，生成亚胺键)、消除(例如，还原消除或水的消除)，和取代(例如，亲核取代或亲电取代)。

代谢产物包括中间体和代谢产物，例如有机化合物通过天然(或设计的)生物化学过程转化、降解和消除。代谢产物可以是，例如，具有低于1500Da的分子量的小分子。代谢产物可以是，或来源于，内源或外源性(例如，药物)化合物。

基于在质谱仪中的行为区分的性质包括以下情况：其中两种或更多种化合物(例如第一和第二内部校准物；第一或第二内部校准物和目标分析物；或第一内部校准物、第二内部校准物，以及目标分析物)可由于它们的质量(即，可通过MS仪器，或在给定截断处分辨的质量的差值)和/或碎片图的差异，通过质谱仪彼此区分。

例如，两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)可由于它们质量的不同通过质谱仪彼此区分。两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)的质量可相差至少1(或2、3、4、5，…)个质量单位，其中所述化合物是同位素类似物。质量的差值可低于一个质量单位，或者是大于一的非整数质量单位。根据仪器分离度和/或所需的分离度截断，质量的差值可以是±0.1、0.01、0.001、0.0001、0.0001质量单位的差值。这些两种化合物之间质量的差值可来源于的存在不同同位素(例如，两种化合物的一个中的低丰度同位素对比两种化合物的另一个中的高丰度同位素)和/或不同化学部分。

任何两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)也可由于它们的碎片图的不同通过质谱仪彼此区分。化合物的碎片图涉及质谱仪中由化合物生成的化合物特异性的碎片组(例如，产物/子离子)。在MS分析期间，两种或更多种化合物(例如，校准物和相应的目标分析物、两种校准物)可以基本上以相同的方式成为碎片，从而生成化学组成和结构类似的碎片。然而，由一种化合物(例如，校准物)生成的碎片可以与由其它化合物(例如，相应的目标分析物)生成的相应的结构类似碎片不同，不同之处在于使用的仪器(或通过预定的截断)可分辨的质量差异。

可用作内部校准物的很多分子可商购获得或者可使用已知的有机合成化学方法制备。例如，可根据以下一般方案来选择内部校准物：(a)使给定目标分析物在质谱仪中成为碎片以便获得它的碎片图；(b)选择所述碎片图的特定碎片；(c)基于步骤(b)中选择的碎片来设计同位素标记的碎片，所述同位素标记的碎片与步骤(b)中选择的碎片的区别在于可分辨的质量差别并且与步骤(a)中获得的碎片图的其它碎片和离子可区分；(d)设计同位素标记的内部校准物，所述同位素标记的内部校准物将在质谱仪中产生步骤(c)中设计的同位素标记的碎片；以及(e)制备所述同位素标记的内部校准物。

图1显示了流程图，所述流程图概述了用于选择根据本发明用于MS基测定的内部校准物的另一示例性方法。

步骤1.1包括选择分析物。可基于用户的需求和/或根据本文所述的分析物的目录和列表选择分析物。

步骤1.2包括测定选择的分析物的MS行为。例如，可通过使用选择用于最终测定(例如，MS，MS/MS，高分辨率等)的MS方法分析所选择的分析物来测定MS行为，以确定诸如分析物质量、离子化特征、碎片特征等的一种或更多种性质。

步骤1.3并入来自步骤1.2的信息以拟定一种或更多种内部校准物结构。例如，当内部校准物是稳定同位素标记的类似物时，适合的标记位置可被鉴别为在前体离子和产物离子(如适用)中提供足够的附加质量，使得分析物和所有内部校准物可彼此区分并且它们的响应可通过MS独立测量。

步骤1.4包括筛选干扰的典型样品，其使用拟定内部校准物的预测MS参数。例如，该步骤可包括分析典型样品(例如，经处理的血浆、尿液、饮用水)的子步骤1.4.1使用拟定内部校准物的拟定MS参数(例如，使用以MRM模式与串联四极MS联用的LC)以监测拟定的内部校准物的特定前体>产物跃迁。该分析可鉴别典型样品中预期的干扰，所述干扰也会干扰测定。因此，如果预期在最终测定中有干扰，则在购买或合成内部校准物之前可以重新设计拟定的内部校准物，从而将开发测定的时间和成本降至最低，并且将开发稳健的、成功的测定的几率最大化。

步骤1.5包括测定是否对一种或更多种内部校准物存在干扰。如果存在干扰，则测定的开发方应当返回步骤1.3，以拟定预期避免干扰的新内部校准物结构。如果不存在材料干扰(或如果可以补偿干扰)，则测定的开发方可进行下一步骤。

步骤1.6包括获得步骤1.5中选择的内部校准物。所选择的内部校准物可获自商业来源或通过定制合成。对于稳定同位素标记的内部校准物，合成可提供在分子的适合部分的适合的同位素标记。对于类似物内部校准物，合成可提供修饰的氨基酸序列，例如用于肽或蛋白分析物的分析。合成可提供一种或更多种期望的性质，允许分析物和内部校准物彼此区分，并使用质谱法独立测量它们的响应。

步骤1.7包括使用优化的MS参数对比分析物的标准参考来分析所选择的内部校准物。例如，该步骤可包括测定各内部校准物对比分析物标准的相对响应的子步骤1.7.1。

步骤1.8包括将相对响应因子或浓度值分配至内部校准物储备物质。由于原子被稳定同位素标记取代(例如，¹H被²H取代)，或在类似物内部校准物、氨基酸的取代；官能团的取代等情况下，内部校准物可具有与母体分析物相比略微不同的离子化效率或碎片效率。或者，在其中仅少量内部校准物可用的情况下，可能无法制备具有准确已知浓度的溶液。因此在特定情况下，有必要测量内部校准物的MS响应对比感兴趣的分析物的已知浓度的响应。在一些实施方案中，已知浓度将起源于参考标准，例如，来自NIST。测量可用于计算相对响应因子和/或将明显的分析物浓度值分配至内部校准物溶液。例如，对于具有90%的相对响应的内部校准物，在特定情况下有利的是，通过将结果除以0.9来校正样品中测定的分析物浓度，或将浓度值分配至内部校准物(即0.9x内部校准物的真实浓度)。

步骤1.9包括以限定的比例制备内部校准物的混合物，使得当并入测定时各校准物表现出分析物的不同已知浓度，并且内部校准物共同形成涵盖适合的范围的校准。可通过各种方法将内标物混合物并入测定，所述方法例如：在样品制备期间手动添加校准物溶液；将限定体积的样品添加至预先装载内部校准物的试管或其它容器；通过样品制备装置将内部校准物溶液自动添加至样品，所述样品制备装置可以直接或间接(例如，经由色谱装置)耦接到质谱仪或可以是集成的分析仪的一部分。也有可能通过以上方法的任一种加入多组内部校准物至单个样品，使得单次测定可生成多种分析物的结果。在上文的概述和下文的组合物部分中讨论了校准物组合物的进一步描述和实例。

表1列出了应用结合图1讨论的方法的结果，以开发稳定同位素标记的和/或类似物内部校准物用于五个不同应用领域中各种分析物的定量。

表1：应用结合图1讨论的方法的结果。注释1：不同稳定同位素标记的肽(用符号^^^、^^和^表示)将分别含有¹⁵N₂或¹³C₆或¹³C₆、¹⁵N₂，提供相对于1.994070Da、6.020129Da或8.014199Da的天然肽质量的质量增加。

用于选择内部校准物的这两种示例性方法是说明性的。本领域普通技术人员将理解，可加入、省去和/或重复单个步骤并且可能有进一步的替代方法。

组合物和试剂盒

进一步总结上文，根据本发明的组合物可包括第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。根据本发明的试剂盒可包括本发明组合物的任何一个或更多个，连同用于实施所述方法和/或采用本发明的装置的说明(和/或其它/附加方法)。

为了定量目标分析物，组合物需要至少两种对应于目标分析物的内部校准物。然而，在特定环境下，包括对应于目标分析物的超过两种的内部校准物可能是有利的(例如，可增加精密度和/或准确度、降低信号噪音和/或干扰或扩大测量范围)。因此，一组内部校准物可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及直至任意个数的用于目标分析物的内部校准物(例如，理论最大值可由可被设计并用于给定目标分析物的校准物的最大个数，例如，可被取代为稳定同位素的位置的个数来确定并且将在目标分析物、其它内部校准物，和样品基质的上下文中产生可用的信号)。组中的各内部校准物应当通过MS可彼此区分以及与目标分析物区分。

为了定量目标分析物，组合物还需要至少两种内部校准物以不同量/浓度存在。在各种实施方案中，各种内部校准物的量不同。然而，特定实施方案可包括基本上相同的量/浓度的两种或更多种内部校准物(例如，只要至少两种内部校准物以不同量/浓度存在)。例如，第三内部校准物的量并非必须不同于第一内部校准物的第一量和第二内部校准物的第二量(例如，第三内部校准物的量可以与第一内部校准物的第一量或第二内部校准物的第二量相同)。

可选择两种或更多种内部校准物的量以促进目标分析物的定量。例如，可选择内部校准物的量以提供在分析物的特定分析范围内(例如，其中已知特定目标分析物在预定的窗口内变化)的准确度和精密度。在另一实例中，可选择内部校准物的量以提供在仪器的分析范围内的最大灵活性(例如，其中目标分析物预期将广泛变化或者将要分析具有不同性质的多种分析物)。

在各种实施方案中，两种或更多种内部校准物跨越待分析样品中目标分析物的一部分或基本上整个分析范围。分析范围可以描述可收集有意义的数据的范围(例如，在预定的统计学参数内)。分析范围可通过质谱仪中内部校准物或目标分析物的检测限和/或样品中目标分析物的预期量来定义。

因此，一种或更多种内部校准物的量大约可为样品中目标分析物的预期量(例如，样品中目标分析物的预期量的…、50%、…、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、…、150%、…)。如果预期样品中目标分析物的量按数量级变化，则一种或更多种内部校准物的量可以是，例如，样品中目标分析物的预期量的…、1%、…、10%、…、100%、…、1000%、…、10,000%。

一种或更多种内部校准物的量可为大约/高于仪器中内部校准物的分析范围的下限(例如，仪器中内部校准物的分析范围的下限的…、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、…、1000%、…、10,000%)。类似地，一种或更多种内部校准物的量可为大约/低于仪器中内部校准物的分析范围的上限(例如，仪器中内部校准物的分析范围的上限的0.1%、…、1%、…、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、…)。

任何两种内部校准物(例如，以最高和最低量存在的内部校准物)的相对量可通过诸如以下的比例来限定：1.1、1.15、1.20、1.25、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、10,000、100,000、1,000,000，或更大。在包括三种或更多种内部校准物的实施方案中，内部校准物的量之间的差值可以是线性的(例如，2x、3x、4x，…)、指数的(例如，10¹x、10²x、10³x，…)、随机的，或其组合或变体。

本发明还涵盖用于定量单个样品中超过一种目标分析物的组合物。例如，用于定量目标分析物和其它目标分析物的组合物(即，单个样品中的两种总分析物)可包括(i)第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中第一已知量和第二已知量不同，和(ii)第三已知量的第三校准物和第四已知量的第四校准物，其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、目标分析物，以及其它目标分析物可在单个样品中通过质谱法各自区分。如果组合物适于定量第二其它目标(即，单个样品中的三种总分析物)，它可以进一步包括第五已知量的第五校准物和第六已知量的第六校准物，其中第五已知量和第六已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、第五校准物、第六校准物、目标分析物、其它目标分析物，以及第二其它目标分析物可通过质谱法在单个样品中各自区分。

例如，对于单个样品中可能存在的各目标分析物可例如通过合并两种或更多种内部校准物来产生用于定量多种分析物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、…总分析物)的进一步的组合物。在一些情况下，例如当具有类似性质的多种分析物有待测量时，多个校准物中的一个或更多个可用于定量多个不同的分析物(例如，在阿片小组中)。如上所述，每种目标分析物的两种内部校准物应当以不同的量存在。此外，在各种实施方案中，目标分析物和内部校准物应当均可通过质谱法在单个样品中区分。不同目标分析物可以各自独立地具有不同数目的相应的内部校准物。不同内部校准物基本上可由目标分析物的不同稳定同位素类似物、类似物、衍生物、代谢产物、有关化合物，或其组合组成。

在某些实施方案中，如果在可选基础上它们在其它方面是可区分的，基于它们在质谱仪中的行为并非严格要求所有内部校准物彼此区分并且与所有相应的目标分析物区分。在质谱仪中分析之前，内部校准物可通过通常用于处理样品的一种或更多种技术而区分。例如，所述技术可包括固相提取、液液提取、色谱法、电泳、沉淀、衍生化，或其组合。内部校准物可根据一种或更多种理化性质而区分。例如，理化性质可包括溶解度(在溶剂，例如，水或有机溶剂，或溶剂的混合物中)、保留时间(在分离技术，例如液相色谱中)、亲和力(例如，对于基质用于所述目标分析物的特异性抗体的亲和力)、解离常数、对于酶的反应性和/或特异性。

本发明的组合物包含干燥制剂和液体制剂(例如，溶液剂、乳剂、混悬剂等)。可通过与内部校准物(例如，其可能与干燥不相容或在液体中不稳定)或样品(例如，可能需要液体以促进混合并且可能需要为水性或有机或平衡的离子/pH以与样品相容)相容性的要求来确定制剂。

液体制剂可包括与内部校准物、样品和MS分析相容的各种无机或有机溶剂，或其混合物。在一些实施方案中，选择与制备、提取或分离相容的溶剂(例如，色谱流动相和介质)。实例溶剂包括水、乙腈、脂族醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇)、六氟丙酮，及其组合。所述溶剂可包括添加剂，例如缓冲盐(例如，醋酸铵)、无机或有机酸(例如，甲酸、三氟乙酸、正磷酸、七氟丁酸)，和/或无机或有机碱(例如，NH₃)。

干燥制剂可通过各种常规干燥技术制备，例如，空气干燥、真空干燥、喷雾干燥、滚筒干燥、介电干燥、冷冻干燥(例如，冻干)、超临界干燥，或其组合。干燥制剂包括基本上不含诸如溶剂(例如，水)的液体的制剂。在各种实施方案中，干燥组合物可被定量为含有低于10%w/w液体(例如，低于9%w/w液体、低于8%w/w液体、低于7%w/w液体、低于6%w/w液体、低于5%w/w液体、低于4%w/w液体、低于3%w/w液体、低于2%w/w液体、低于1%w/w液体、低于0.5%w/w液体，或低于0.1%w/w液体)。

根据本发明的组合物可包括一种或更多种其它物质，例如，改进组合物的稳定性、改进或促进样品的处理，和/或允许、改进或促进目标分析物的分析的物质。该其它物质包括抗微生物剂(例如，抗生素、叠氮化物)、抗氧化剂、还原剂、pH调节剂(例如，无机和/或有机酸、碱或缓冲液)、螯合剂(例如，EDTA)、洗涤剂、离液剂、蛋白酶抑制剂(例如，如果样品中肽/蛋白的降解将被避免)、DNA酶抑制剂(例如，如果样品中DNA的降解将被避免)、RNA酶抑制剂(例如，如果样品中RNA的降解将被避免)、珠粒(例如，破坏细胞膜的珠粒或具有离子交换、磁性、尺寸排阻，和/或分配性质的珠粒)、蛋白酶(例如，如果需要样品中肽/蛋白的降解)、DNA酶(例如，如果需要样品中DNA的降解)、RNA酶(例如，如果需要样品中RNA的降解)，和溶剂(例如，如果组合物为液体制剂的形式)。

在一些实施方案中，组合物(例如，商业试剂盒中使用的组合物)包括质量控制(QC)材料，例如，含有已知量的目标分析物的干燥或液体制剂(单独或与具有对所述目标分析物的特异性的一组内部校准物的一种或更多种内部校准物结合)。在各种实施方案中，在基质中测量QC。试剂盒可包括纯分析物作为用户的QC以供应它们自己的空白基质，或者可选地，试剂盒可包括一种或更多种预先添加的空白基质，或者可通过加至试剂盒中提供的纯QC材料的期望用途来选择。

例如，试剂盒可包括每组内部校准物/目标分析物的QC材料。组合物可包含，例如，单个混合物中的内部校准物和QC材料。试剂盒可包括，例如，内部校准物以及一种或更多种相应的QC材料的一种或更多种混合物。

根据本发明的组合物可包含在限定至少一种样品接受器的样品架中。样品架可以是可密封的(例如，可密封的小瓶、可密封的试管例如即用型试管、可密封的微滴定平板例如6、24或96孔板等)。本领域已知多种样品接受器，例如小瓶、试管和平板。

在各种实施方案中，根据本发明的组合物可包含在具有一种或更多种隔室的样品架中。在一个实例中，样品架的一个或更多个隔室含有内部校准物(即，如上所述的一组或多组内部校准物)，所述内部校准物的量足够用于分析每个隔室一种样品(例如，包括一种或更多种目标分析物)。

在一些实施方案中，样品架限定样品接受器的阵列，各接受器含有或接收相同组合物(即，各目标分析物的两种或更多种内部校准物的组)，从而促进针对普通分析小组分析多个样品。可选地，样品架可限定样品接受器的阵列，每个接受器含有或接收不同组合物(即，各目标分析物的两种或更多种内部校准物的不同组)，从而促进分析单个样品对比多个分析组。

在另一实施方案中，组合物包含在一个隔室(例如可密封的试管或小瓶)中，所述隔室以足够用于多个样品的分析的量和比例含有内部校准物(例如，一组或多组内部校准物)。内部校准物可存在于干燥制剂中，所述干燥制剂可通过加入溶剂重构为液体制剂。可将重构的液体制剂以等分部分加至多个待分析样品的每一个，从而确保每个样品包括相同的质量和内部校准物的量。

根据本发明的组合物可包含在即用型反应试管中，例如，可直接用于样品加工或分析的预等分反应试管。预等分反应试管可含有足以分析一种或更多种样品的量和比例的内部校准物。例如，反应试管可含有3组内部校准物，其中每组含有4种内部校准物并且内部校准物的每组中内部校准物的量彼此不同。试管可牢固密封(例如，通过螺旋盖、咬封盖，或穿刺盖)。示例性试管可具有低于1mL、1至15mL，或1至2mL(例如，1.5mL)范围内的容积。通常，可基于待处理/分析样品的性质和量来选择样品接受器的容积。

校准物可在包括以下的组合物中提供：(i)单个校准物，(ii)目标分析物的两种或更多种校准物的组，(iii)小组，其包括两种或更多种目标分析物的校准物的组，和(iv)其组合和变体。用户或程序装置可在测定中直接使用该组合物(例如，ii或iii)。可选地，用户或程序装置可使用该组合物(例如，i-iv)以制备预定的或定制的组合用于测定特定样品、分析物，或分析物的小组。定制的组合物可能在随机存取操作中和/或在进行来自用单个样品单次运行的多分析物小组中是有利的。因此，本发明组合物提供对基本上任何测定和测定形式的灵活性和适应性。

根据本发明的试剂盒可包括本文描述的组合物的任何一种或更多种，连同用于实施所述方法和/或采用本发明的装置的说明书(和/或其它/其它方法)。下面依次讨论此类方法和装置。

方法

本发明的特征为用于通过质谱法定量目标分析物的方法。所述方法包括获得质谱信号，其包括第一校准物信号、包含第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物。第一已知量和第二已知量不同，并且第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可在单个样品中各自区分(例如，通过质谱法)。所述方法还包括使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。

如上面在校准物和分析物的性质与选择的上下文中所讨论，所述方法可采用超过两种给定分析物的校准物。例如，使用三种校准物的方法可包括由质谱信号获得来自进一步包含第三已知量的第三校准物的单个样品的第三校准物信号，其中(i)第一已知量、第二已知量和第三已知量不同，(ii)第一校准物、第二校准物、第三校准物，以及目标分析物在单个样品中各自区分，并且(iii)定量目标分析物包括使用第三校准物。使用四种校准物的方法可进一步包括由质谱信号获得来自单个样品的进一步包含第四已知量的第四校准物的第四校准物信号，其中(i)第一已知量、第二已知量、第三已知量，以及第四已知量不同，(ii)第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物和目标分析物在单个样品中各自区分，并且(iii)定量目标分析物包括使用第四校准物。

其它校准物可潜在地用于增加目标分析物定量的精密度和/或准确度。也可使用其它校准物，其中预期基质效应使校准物信号模糊或失真，从而确保无论校准物信号有任何问题均可测定准确的校准曲线(或式)。该其它校准物的浓度通常与给定目标分析物的其它校准物的浓度不同。然而，在一些实施方案中，只要给定目标分析物的两种校准物以不同量存在，该其它校准物的浓度可与另一校准物的浓度相同或基本上相同。

如上面在校准物和分析物的性质与选择的上下文中所讨论，所述方法可定量给定样品中的两种或更多种分析物。例如，定量两种分析物(例如，目标分析物和其它目标分析物)的方法可包括(i)由质谱信号获得来自单个样品的第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号，所述单个样品包含第三已知量的第三校准物、包含第四已知量的第四校准物，并且可能包含其它目标分析物(其中第三已知量和第四已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、目标分析物，以及其它目标分析物在单个样品中可各自区分)；以及(ii)使用第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号定量单个样品中的其它目标分析物。定量三种分析物(例如，目标分析物、其它目标分析物，和第二其它目标分析物)的方法可进一步包括(i)由质谱信号获得来自单个样品的第五校准物信号、第六校准物信号，以及第二其它目标分析物信号，所述单个样品包含第五已知量的第五校准物、包含第六已知量的第六校准物，并且可能包含第二其它目标分析物(其中第五已知量和第六已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物、第三校准物、第四校准物、第五校准物、第六校准物、目标分析物、其它目标分析物，以及第二其它目标分析物在单个样品中可各自区分)；以及(ii)使用第五校准物信号、第六校准物信号，以及第二其它目标分析物信号来定量单个样品中的第二其它目标分析物。

用于获得质谱信号的不同方法是本领域已知的。在各种实施中，质谱分析包括离子化一种或更多种化合物以生成带电分子或分子碎片并测量它们的质荷比(参见Sparkman,O.D.(2000).Mass spectrometry desk reference.Pittsburgh:GlobalView Pub.ISBN0-9660813-2-3)。该程序可包括以下步骤：将含有一种或更多种化合物的混合物装载到MS仪器上并且汽化一种或更多种化合物；离子化混合物的组分，以形成带电颗粒(离子)；在分析仪中根据离子的质荷比将它们电磁分离；检测离子(例如，通过定量方法)；以及将离子信号转换至质谱中。

例如，可以用以下模式的任一种来操作质谱仪：(1)全扫描，例如，质谱仪检测m/z刻度的两端(例如0和10000)之间的所有离子；(2)单离子监测(SIM)或单离子记录(SIR)，例如，质谱仪仅检测具有特定m/z数值或位于小的质量m/z范围(例如，1或2个质量单位范围)内的离子；(3)多个反应监测(MRM)，例如，在具有多个质谱仪单位的质谱仪中，至少两个单位以SIM/SIR模式操作。

在质谱仪中分离和测量离子强度后，例如通过将测量的所检测离子的强度对比它们的质荷比(m/z)作图来校正质谱。取决于操作质谱仪的模式(全扫描、SIM/SIR，或MRM)，质谱可包括(1)对应于质谱仪中检测的m/z刻度的两端之间所有离子(前体和产物离子)的峰；(2)对应于以下的峰：(a)具有特定m/z数值或位于非常小的m/z范围内的所有离子以及任选地(b)来自(a)下指定的离子的所有产物离子；或(3)仅一种或更多种所选择的产品/子离子(MRM通道)。

例如，当质谱仪以MRM模式操作时，可产生一组内部校准物和相应的目标分析物的单个质谱。单个质谱将含有各内部校准物的一个峰，并且如果在样品中存在相应的目标分析物，则含有相应的目标分析物的一个峰。可选地，可产生第一组内部校准物和相应的目标分析物的多个质谱，其中多个质谱的每一个仅表示一种内部校准物或相应的目标分析物。对于每一组内部校准物和相应的目标分析物可产生此类单个质谱或多个质谱。

使用MRM通道并且其中将峰强度对比时间(例如如果质谱仪耦接于SPE装置、色谱装置，或电泳装置的保留时间)作图产生的质谱通常描述为质谱图。因此，本文所使用的术语质谱也可涉及质谱图(例如，其中MS以MRM模式操作)。

接着，测定各内部校准物和相应的目标分析物的代表性离子的MS信号强度(或相对信号强度)。质谱中离子的信号强度(例如，对应于这些离子的峰的强度)可根据峰高或峰面积测定，例如根据峰面积例如通过将特定离子的信号强度关于时间积分。可将质量光谱/光谱中离子信号的强度归一化为例如所检测的最强的离子信号的100%。

如在校准物、分析物、组合物，和试剂盒的性质和选择的上下文中所讨论，校准物和相应的目标分析物可根据它们在质谱仪中的行为而彼此区分(例如，由于它们的质量和/或碎片图的差异)。

在一个实施方案中，任何两种或更多种化合物(例如，第一和第二校准物和目标分析物)由于它们质量的不同(例如，由于来自两种化合物的前体离子/母体离子的质量差异)而在质谱仪中彼此区分和分离。两种化合物(例如，第一内部校准物和目标分析物)的质量可相差许多质量单位，所述质量单位是所使用的仪器可分辨的或符合预定的截断。例如，这两种母体/前体离子之间至少1(或2、3、4、5、…)个质量单位的质量的差值可来源于不同同位素(例如，两种母体/前体离子中的一种中的低丰度同位素对比两种母体/前体离子中的另一种中的高丰度同位素)的存在。

在另一实施方案中，任何两种或更多种化合物(例如，第一和第二校准物和目标分析物)由于它们的碎片图的不同而在质谱仪中区分并且彼此分离。可生成如下的碎片图：由进入质谱仪的化合物分离具有相同质荷比的一系列离子(前体或母体离子)；将具有相同质荷比的母体离子稳定化同时它们与气体碰撞，通过碰撞诱导解离(CID)导致它们成为碎片，从而生成产物/子离子。在质量光谱分析期间生成的或来自两种化合物的一种化合物(例如，第一内部校准物)的碎片(例如，产物/子离子)可包括至少一种碎片(例如，产物/子离子)，所述碎片与在质量光谱分析期间生成的或来自两种化合物的另一种化合物(例如，目标分析物)的碎片具有的质量不同。

接着，使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。所述方法包括使用目标分析物信号和校准曲线或代数公式定量目标分析物(即，基于校准物信号)。例如，所述方法可包括(i)由第一校准物信号和第二校准物信号获得校准曲线；以及(ii)使用校准曲线以及目标分析物信号定量目标分析物。可选地，所述方法可包括使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来代数地定量目标分析物。在各种实施方案中(例如，给定目标分析物的两种或更多种校准物，两种或更多种目标分析物，及其组合)，可手动进行(例如，使用铅笔和纸，计算器，或电子表格，例如在一次性、研究，或开发设置中)或自动(例如，使用程序化的机器或专门构建的机器，例如在高通量或商业设置中)定量步骤。

可通过对数据应用适合的回归算法(例如，高斯(Gauss)最小二乘拟合法)获得校准曲线。适合的回归算法可包括以下步骤：(1)选择数学函数(模型)；(2)由实验数据拟合函数；以及(3)验证模型。函数可能在整个分析范围内是线性的，但并非一定如此。其中所述方法为定量多个目标分析物，使用相应的校准物信号产生校准曲线的步骤可对每一组内部校准物进行，从而产生各相应的目标分析物的不同的校准曲线。

如果样品中存在目标分析物，则所述目标分析物的量可使用校准曲线来定量。例如，可通过外推法使用(1)基于对应于目标分析的校准物的校准曲线和(2)目标分析物信号来实现定量。其中所述方法为定量多个目标分析物，可对各目标分析物进行根据相应的校准曲线和目标分析物信号的外推法的步骤，从而定量各相应的目标分析物。

在各种实施方案中，所述方法包括质谱之前的一个或更多个其它步骤。其它步骤可手动或自动进行(例如，在具体地编程或具体地构建的机器中)。

在一个实施方案中，方法还包括(i)通过合并可能包含目标分析物的单个样本中的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物来制备单个样品；以及(ii)使用质谱仪生成来自单个样品的质谱信号。适合的样品制备可根据样品的性质、校准物，以及分析方案而变化。例如，样品制备可包括选择适合的校准物，选择分析面板，和/或选择各种内部校准物的量。

在另一实施方案中，所述方法还包括在获得质谱信号之前处理样品。例如，处理样品可包括分离来自单个样品的其它组分的第一校准物、第二校准物，以及目标分析物。可通过通常用于在MS分析之前加工样品的技术，或此类技术的组合进行处理，以便(1)减少引入质谱仪的化合物的个数；(2)浓缩内部校准物和目标分析物，例如，通过消耗不想要的化合物和/或内部校准物和目标分析物的富集；(3)由可能干扰MS分析的其它化合物分离内部校准物和目标分析物；和/或(4)将至少一组内部校准物和相应的目标分析物与其它组内部校准物和相应的目标分析物分离。该技术可包括固相提取法、液相提取法，以及色谱法(例如，液相色谱法、气相色谱法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法和超临界流体色谱法)的一种或更多种。

图2显示了概述定量一种或更多种样品的示例性方法，各自独立地包括分析物或分析物的小组，在使用内部校准中的流程图。在各种实施中，图2的方法可手动、半自动或自动进行。类似地，可加入、省去，和/或重复一个或更多个步骤。图2的方法(及其变体)也可充当说明书(例如，将以人和/或机器可读格式包括在试剂盒中)、程序(例如，在计算机可读介质中实施的算法或计算机程序)，和/或分析系统(例如，具体地适合的或专门构建的机器)的基础。

步骤2.1包括等待样品被提交用于分析。样品可包括质量控制样品或系统适用性样品，以及常规样品(例如，可能包括目标分析物的样品)。因为所述方法不需要分析单独的系列的校准物(例如，校准物和目标分析物在单个样品中)，可根据所要求的分析(例如，所述方法为随机存取方法)以任何顺序而非作为分组的批次提交样品。在一些实施方案中，将条形码标记或其它唯一识别符附于样品，以便通知用户或自动系统将哪个内部校准物组加至样品并因此还指导用户或自动系统以使用适合的LC和/或MS参数。

步骤2.2包括确定(例如，根据条形码标签)给定样品需要哪种校准物。

步骤2.3包括将内部校准物引入样品中。可以不同方式将内部校准物加至样品，例如，以适合自动或手动工艺以及允许在一次测定中确定单个分析物或一组分析物。例如，步骤2.3.1显示了其中将对应于分析物的校准物手动加至样品中的实施方案，步骤2.3.2显示了其中将样品加至容器中的实施方案，所述容器用校准物预装载(例如，以溶液或以干燥形式)，而步骤2.3.3显示了其中将自动系统用于加入一组或多组内部校准物的实施方案(例如，按照，例如，通过样品的条形码识别)。

步骤2.4包括制备样品用于分析。样品制备可包括本文讨论的各种技术的任一种，例如，蛋白沉淀、固相提取、液液提取、免疫亲和纯化、亲和纯化等。样品制备可在线或离线进行。

步骤2.5包括通过MS分析样品(例如，使用MS来测量响应，例如目标分析物和相应的校准物的色谱峰面积)。

步骤2.6包括检查来自步骤2.5的数据质量。如果数据不合格，可再次提交样品用于分析(例如，返回步骤2.1)。如果数据合格，则验证的MS响应数据2.7可用于定量目标分析物。

步骤2.8包括选择用于定量目标分析物的适合的计算方法。步骤2.8.1中说明了一个选项，所述选项包括使用所测量的对内部校准物的响应生成每种目标分析物的样品特异性校准线，连同它们分配的浓度值。步骤2.8.2中说明了另一个选项，所述选项包括使用所测量的对内部校准物的响应生成每种目标分析物的样品特异性校准线，连同它们的已知浓度值和所测量的相对响应因子。

步骤2.9包括基于所测量的MS响应和样品特异性校准线计算单个样品中的目标分析物浓度。在替代实施方案中，可使用目标分析物信号和相应的校准物信号代数地计算目标分析物浓度。

步骤2.10包括报告结果。在各种实施方案中，可将结果存储(步骤2.10.1)在计算机中(例如，实验室信息管理系统或LIMS中)。在各种实施方案中，可以用户可读格式(例如打印的报告或屏幕显示)报告结果(步骤2.10.2)。报告方法并非相互排斥并且可通过两种或更多种技术将结果报告和/或存储。

然而，步骤2.1至2.6最直接涉及用于进行所述方法的具体地编程或具体地构建的机器，以下步骤2.8至2.10最直接涉及计算并且报告结果的基于软件的工艺。可通过单个装置完成两种工艺(例如，其中在还控制MS和样品处理硬件的计算机上进行计算)。然而，因为步骤是分开的，样品处理和分析步骤可与计算和报告步骤平行持续，从而增加装置的速度和效率。

可在有形的物品中实施本发明的方法。例如，可将所述方法包括作为试剂盒中的说明书和/或所述方法可在包括计算机可执行指令的计算机可读介质中(例如，用于操作实施所述方法装置)。说明书可包括用于执行、改变，或修改本文所述的任何一种或更多种方法，并且可在硬拷贝中(例如，手册、打印输出件等)或在软拷贝中(例如，电子的、在计算机内存或存储器中、在显示器上等)实施的指示。同样，计算机可读介质(例如，磁盘存储器、固态内存等)可包括用于执行、改变，或修改本文所述的任何一种或更多种方法的计算机可执行指令。

分析系统

本发明的特征为用于通过质谱法定量目标分析物的装置。在各种实施方案中，装置被配置成实施本发明的方法，以及其变更和组合。

图3示出了实例装置300，包括样品处理器310，其被配置成通过在可能包含目标分析物的单个样本中合并第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物来制备单个样品。所述装置300还包括质谱仪320，所述质谱仪320被配置成生成质谱信号，所述质谱信号包括第一校准物信号、包括第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，其中第一已知量和第二已知量不同，并且其中第一校准物、第二校准物，以及目标分析物可在单个样品中通过质谱法各自区分。此外，装置300包括数据处理器330，所述数据处理器330被配置成使用第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号来定量单个样品中的目标分析物。在一些实施方案中，装置300还包括预处理和/或分离系统340，所述分离系统340被配置成在获得质谱信号之前从所述单个样品的其它组分分离第一校准物、第二校准物以及所述目标分析物。预处理可包括SPE、液液提取、沉淀等。分离可包括色谱法，例如LC、HPLC、UPLC、SFC等。预处理和/或分离系统340，或其组件的亚组，可以离线或在线模式操作。

样品处理器310可基于常规样品处理设备。适合的样品处理器的实例包括TecanEVO(离线)和Waters AQUITY SPE Manager(在线)。本领域已知的方法可采用样品处理器，所述方法包括加入条形码阅读器、真空歧管、离心机、移液管和机器人，以及撰写以预定的方式控制装置的脚本。

在一些实施方案中，样品处理器310可适用于随机存取操作和/或可在进行来自用单个样品单次运行的多分析物小组中。例如，样品处理器310可包括(i)自动代码阅读器，其被配置成基于与给定样本有关的代码测定给定样本中一种或更多种待测试分析物的列表；以及(ii)自动校准物系统，其被配置成合并给定样本与一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。

其中，提前制备校准物(例如，具有预定的测定设置的小瓶或平板的形式)，其中自动校准物系统可被配置成递送给定样本至样品接受器，所述样品接受器包含一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。可选地，其中在线制备校准物(例如，根据预定的配方，为给定样品定制或由单个校准物组分定做)，自动校准物系统可被配置成递送所述一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物至包含所述给定样本的样品接受器。

质谱仪320(以及本发明的方法的任一种的质谱仪)基本上可以是包括适用于产生质谱的离子源、分析仪，和检测器的任何仪器。质谱仪可含有多个质谱仪单位(MSⁿ其中n=2、3、4、…)和/或可耦接于其它仪器，例如色谱装置或电泳装置(例如，分离系统340，例如在LC/MS/MS中)。

质谱仪320可包括诸如以下的离子源：电喷射离子化(“ESI”)离子源；大气压光电离(“APPI”)离子源；大气压化学电离(“APCI”)离子源；基质辅助激光解吸电离(“MALDI”)离子源；激光解吸电离(“LDI”)离子源；大气压电离(“API”)离子源；硅上解吸电离(“DIOS”)离子源；电子碰撞(“EI”)离子源；化学离子化(“CI”)离子源；场电离(“FI”)离子源；场解吸(“FD”)离子源；电感耦合等离子体(“ICP”)离子源；快原子轰击(“FAB”)离子源；液相二次离子质谱(“LSIMS”)离子源；解吸电喷雾电离(“DESI”)离子源；镍-63放射性离子源；大气压基质辅助激光解吸电离离子源；以及热喷雾离子源。

质谱仪320可包括质量分析器例如四极质量分析器；2D或线性四极质量分析器；保罗(Paul)或3D四极质量分析器；2D或线性四极离子阱质量分析器；保罗或3D四极离子阱质量分析器；潘宁(Penning)阱质量分析器；离子阱质量分析器；磁式扇形质量分析器；离子回旋共振(“ICR”)质量分析器；傅里叶变换离子回旋共振(“FTICR”)质量分析器；静电或轨道阱质量分析器；傅里叶变换静电或轨道阱质量分析器；傅里叶变换质量分析器；飞行时间质量分析器；正交加速飞行时间质量分析器；以及线性加速飞行时间质量分析器。质谱仪可包括离子迁移分析仪。

质谱仪320可包括诸如以下的离子源：电喷射离子化(“ESI”)离子源；大气压光电离(“APPI”)离子源；大气压化学电离(“APCI”)离子源；基质辅助激光解吸电离(“MALDI”)离子源；激光解吸电离(“LDI”)离子源；大气压电离(“API”)离子源；硅上解吸电离(“DIOS”)离子源；电子碰撞(“EI”)离子源；化学离子化(“CI”)离子源；场电离(“FI”)离子源；场解吸(“FD”)离子源；电感耦合等离子体(“ICP”)离子源；快原子轰击(“FAB”)离子源；液相二次离子质谱(“LSIMS”)离子源；解吸电喷雾电离(“DESI”)离子源；镍-63放射性离子源；大气压基质辅助激光解吸电离离子源；以及热喷雾离子源。

数据处理器330可包括适用于使用MS信号来定量目标分析物的计算机。例如，运行MassLynx的WindowsPC可用于控制系统、收集数据，和/或生成色谱图。可开发MassLynx模块用于进行内部校准物计算。内部校准物计算也可手动进行或使用常规电子表格程序例如Microsoft Excel、脚本，或其它计算机程序进行。

在各种实施方案中，数据处理器330可与分析系统的任何一种或更多种组分连通。例如，数据处理器可与样品处理器310连通，以确保(i)适合的校准物与样品结合，(ii)适当地制备样品，和/或(ii)适当地分析样品。数据处理器可与质谱仪320连通以控制质谱仪和/或从质谱仪接收信号用于分析。类似地，数据处理器可与分离系统340连通以控制分离系统和/或从分离系统接收信号用于分析。数据处理器330可适于实施各种其它功能(参见，例如，结合图2描述的功能)，例如质量控制、数据贮藏、数据报告等。

通常，分离系统340可将一种或更多种校准物/分析物彼此分离和/或与至少一部分样品(例如，基质、污染物)分离。分离系统340可包括用于在获得质谱信号之前从单个样品的其它组分分离校准物和目标分析物的至少一种分离系统、色谱系统，或类似系统(例如，液相色谱设备、气相色谱设备、亲和设备、免疫亲和设备、超临界流体色谱设备等)。在分离之前，分离系统340也可采用一个或更多个样品制备/预处理步骤。例如，至少一部分样品可通过固相提取(例如，正相固相提取(SPE)、反相SPE、离子交换SPE、分子排阻SPE、亲和力SPE或其组合)、液体-液体提取、沉淀、衍生化，或其任何组合来预处理。分离可包括，例如，色谱法(例如，液相色谱例如HPLC、超临界流体色谱法(SFC)、超高效液相色谱(UPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)、纳升-LC(nano-LC)，特别地正相色谱法、反相色谱法、离子-交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和力色谱法)或气相色谱法)，电泳(例如，毛细管电泳)。分离系统340可耦接于质谱仪(在线模式)或不耦接于质谱仪(离线模式)。

实施例

除非另外指出，根据生产商的信息、本领域已知的方法，或如文献中所述进行所有技术(包括试剂盒和试剂的使用)：所述文献例如Tietz Text Book ofClinical Chemistry第3版(Burtis,C.A.&Ashwood,M.D.，编著)W.B.SaundersCompany,1999;Guidance for Industry.Bioanalytical Method Validation.USA:Centre for Drug Evaluation and Research,US Department of Health and SocialServices,Food and Drug Administration,2001；和Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.。下面在这些参考文献中使用并描述的方法通过引用整体并入本文。

实施例1：在单次分析中使用多点校准的睾酮分析(内部校准)。

概述：常规定量LC/MS/MS需要用各批次的样品分析一组基于基质的校准物。这将技术限定为批次分析模式，延迟到第一结果的时间和试剂盒，并且要求生产商提供并处理无分析物的基质。当感兴趣的分析物普遍存在于基质(例如，内源性激素、维生素、肽等)中时，这是特别困难的。该实例描述了定量LC/MS/MS方法，其中每个样品补充有分析物的多个稳定同位素标记的类似物。在已知的跨越分析测量范围的独特浓度下加入每个类似物。类似物和分析物可根据它们的MS特征彼此区分，使得在单次分析中，可同时测量对类似物和分析物的响应。该使得构建单个校准曲线，以及生成来自单个样品的单次分析的每个样品的结果。该实例证明，通过使用稳定同位素标记的内部校准物，可精确并准确定量人血清中的睾酮。通过该实施例示出的方法允许随机进行LC/MS/MS分析，相对常规方法减少第一结果的时间，并且通过去除对来源基质的需要而简化试剂盒的生产。

方法

校准物的制备：对于常规测定(例如，对比)，在10ng/mL、100ng/mL，或1000ng/mL下制备睾酮添加溶液。通过将睾酮添加至空白基质(例如，可商购的双炭处理的血清(double charcoal stripped serum))的1.0mL等分部分来制备六种单独的校准物。校准物的最终浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和15.0ng/mL。

对于内部校准测定，使用三种可商购的稳定同位素标记的内部校准物(二-、三-和戊-氘代睾酮)。研究内部校准物MS/MS特征，选择各自的特定MRM跃迁(参见表2和图4)。所选择的跃迁代表相同模式的碎片(参见式1)，但是对于各内部校准物是独特的，因为氘的并入引起质量漂移。

表2：睾酮和所选择的内部校准物的MS/MS特征。

图4显示了使用内部校准方法用于分析样品的典型色谱图的实例，特别是目标分析物(睾酮)和相应的内部校准物(睾酮的d2、d3和d5类似物)。

式1显示了睾酮(T)的结构和拟定碎片方案以生成来自A环的m/z97碎片。各内部校准物中氘原子的位置为：T-d2：1,2；T-d3：16,16,17；T-d5：2,2,4,6,6。

式1：

制备各内部校准物的单个贮备液，并由每份贮备液制备0.5ng/mL稀释液。如下所述，使用表2中描述的特定MRM跃迁，通过UPLC/MS/MS分析稀释液。将来自各稀释液的五个相同样品进样的平均积分峰面积与未标记的睾酮所获得的数值对比，并计算相对响应因子(表3)。

表3显示了内部校准物与睾酮(T)贮备液的对比。将来自各内部校准物的五重复分析物的平均积分峰面积与未标记的睾酮的平均积分峰面积对比以测定相对响应。

表3：内部校准物与睾酮(T)贮备液的对比。注释：变异系数(CV)是概率分布的离散度的归一化量度(即，SD与平均值的比例)。

图5显示了由图4中显示的数据生成的样品特异性校准曲线的实例。根据睾酮MRM中测量的峰面积，浓度计算为2.85ng/mL(虚线)。相对响应因子用于分配浓度值至内部校准物贮备液(例如，分配的睾酮-d2贮备液的浓度为1.095x睾酮贮备液的浓度)。将内部校准物贮备液添加至60%MeOH以生成含有根据分配的浓度的以下浓度的各内部校准物的单个溶液：2.2ng/mL睾酮-d2、44.0ng/mL睾酮-d3，以及110ng/mL睾酮-d5。

患者样品：将来自常规血清睾酮测量的五十个匿名残留(left-over)样本用于该研究。样品中的五个的体积不足以进行通过常规和内部校准LC/MS/MS测定的测试。将这五个样品用于制备两种测定中作为样品#46分析的混合物(pool)，所述混合物还用于内部校准测定中精密度的初步评估。

样品制备：

对于常规测定

1.将100μL各基质校准物(N=6)或100μL各患者样品(N=46)置于单独的埃彭道夫管(Eppendorftube)中。

2.向各管中加入内标物(在60%MeOH中的睾酮-d3；10μL)。

3.涡旋混合。

4.加入1.0mLMTBE至各管，加盖并涡旋混合。

5.在室温下在15,000RPM下离心5min。

6.回收尽可能多的上层(有机)相至Waters最大回收小瓶中，并在氮气流下减少至干燥。

7.将残余物再溶于75μL60%MeOH，并通过UPLC/MS/MS分析(参见下文)。

对于内部校准测定

1.将100μL各患者样品(N=46)置于分离埃彭道夫管中。

2.向各管中加入内部校准物混合物(10.0μL)。

3.涡旋混合。

4.加入1.0mLMTBE至各管，加盖并涡旋混合。

5.在室温下在15,000RPM下离心5min。

6.回收尽可能多的上层(有机)相至Waters最大回收小瓶中，并在氮气流下减少至干燥。

7.将残余物再溶于75μL60%MeOH，并通过UPLC/MS/MS分析(参见下文)。

超高效液相色谱–串联质谱法(UPLC/MS/MS)：使用WatersACQUITYUPLC体系进行色谱。使用WatersCSH氟苯基柱(2.1mmx50mm)分析样品(15μL)，用含有醋酸铵和甲酸的甲醇和水梯度洗脱，如表4中所示。运行时间为3.5min，进样之间的间隔为约4min。分离结果显示在表4中，其中流动相A为水中的2mM醋酸铵和0.1%甲酸，流动相B为甲醇中的2mM醋酸铵和0.1%甲酸。

时间(分钟)	流速(mL/min)	%A	%B	曲线
					0	0.35	40	60	-
1.80	0.35	36	64	7
					1.81	0.35	0	100	6
2.80	0.35	40	60	11
					3.50	0.35	40	60	6

表4：睾酮分析的UPLC梯度特征。

将来自UPLC柱的洗脱液导入Waters Xevo TQ串联四极质谱仪的电喷射离子源，其以多个反应监测(MRM)模式操作。对于常规测定，使用100ms的驻留时间来监测两次MRM跃迁(睾酮和睾酮-d3；参见表5)。

将TargetLynx软件用于进行峰面积积分、计算响应(分析物峰面积/内标物峰面积比)、生成六点外部校准线以及计算各血清样品中的分析物浓度。对于内部校准测定，使用60ms的驻留时间来监测表6中显示的所有四个MRM通道。使用TargetLynx软件测定积分的峰面积，将Microsoft Excel用于构建各血清样品的单个内部校准曲线(使用线性回归分析)。

结果

常规(外部校准)测定：通过TargetLynx软件生成并由六个单独的校准物的响应构建的单个外部校准线显示于图7中。校准线上的每个点表示单独的UPLC/MS/MS分析。根据所观察的MS/MS响应，TargetLynx使用该校准线以自动计算46个血清样品的每一个中的睾酮浓度。结果从TargetLynx导出并总结于表5中。

图6显示了使用内部校准方法测量的睾酮QC数值(Y轴)与已知睾酮浓度(x轴)的对比。

图7显示了TargetLynx生成的睾酮的外部校准线。校准线基于在0.1ng/mL至15ng/mL范围内的浓度下的空白基质中制备的六个单独的校准物的分析。

表5显示了使用常规外部校准的睾酮浓度的46个血清样品的分析。由TargetLynx导出数据。最后一列指示计算的各样品的睾酮浓度。

表5：46个血清样品的睾酮浓度分析。

内部校准测定：将TargetLynx用于进行各分析物收集的四个MRM色谱图的每一个的峰面积积分。将那些数据导出到Microsoft Excel中，其中对于各单个样品，将LINEST函数用于计算等式和对比三种内部校准物所分配的浓度(x轴)作图的积分的峰面积(y轴)的回归线的测定系数(r²)。以两种方式进行线性回归分析；包括或不包括原点(0,0)。对于各样品，使用回归线的公式和积分的睾酮峰面积计算睾酮的浓度。数据总结于下面的表6和表7中。

表6显示了使用内部校准方法的46个血清样品分析的结果和回归分析。分析了样品46的五个单独等分部分(T=睾酮)。

表6：使用内部校准方法的46个血清样品分析的结果和回归分析。

表7显示了使用内部校准方法的46个血清样品分析的结果和回归分析（不包括原点）。分析了样品46的五个单独等分部分（T=睾酮）。

表7：使用内部校准方法的46个血清样品分析的结果和回归分析(不包括原点)。

图8中显示了50次分析的每一次的单个内部校准线(45个样品加上样品46的五个相同样品)。各种内部校准线的斜率在不同样品之间变化，这可能由于导致回收率差异和离子抑制的差异的基质差异。图8示出了本发明如何提供各样品中各目标分析物的单个校准。

图9显示了对应于观察到的最小和最大斜率的血清样品22和42的单个内部校准线(40%差异)。圆圈代表三种内部校准物加上用于构建线性回归线的原点。交叉表示该样品中睾酮的峰面积和相应的浓度。

结果的对比：将使用内部校准方法所得结果(回归分析包括原点或不包括原点)与使用常规校准通过线性回归分析所得结果进行对比(图10和图11)。

图10显示了在46个血清样品中使用外部校准和用三种内部校准物的内部校准测定的睾酮浓度的对比。图11显示了在46个血清样品中使用外部校准和用三种内部校准物加上原点的内部校准测定的睾酮浓度的对比。两种对比(图10和图11)均显示与r²>0.99非常一致，并且斜率接近于1。两个斜率均>0.96，这表明当使用内部校准方法对比常规外部校准方法时平均差别低于4%。

不精密度的估计：为了估计内部校准测定的日内精密度，分析混合的血清样品(样品46)的五份单独的等分部分。结果显示于表8并且表明在约2ng/mL的睾酮浓度下的不精密度<3%。

表8：当进行校准数据的回归分析时内部校准测定的日内不精密度估计(包括或不包括原点)。

讨论

该研究中所用的内部校准物显示了原理和便利性证据(例如，因为它们可由商业来源获得，而不需要从头合成)但是，预期不能代表最佳可达到的测定结果(例如，因为睾酮、睾酮-d2，和睾酮-d3之间的质量差异小并且存在潜在的同位素干扰)。理论上，将内部校准物设计为具有足量的同位素标记并具有特定位置的同位素标记，使得分析物与内部校准物或与内部校准物之间基本上无干扰。此外，在合成所设计的内部校准物之前，可使用基质样品(例如，人血清)筛选设计的内部校准物的特定MRM跃迁，以确保通常存在于基质中的内源性材料实质上不干扰任何设计的内部校准物。

稳定同位素标记的材料通常少量生产。因此，难以精确称重准确量的稳定同位素材料，以制备可用于制备内部校准物的准确的贮备液。在一些情况下还存在这样的可能：当与未标记的材料对比时，稳定同位素标记的材料可具有略微不同的离子化特征。至少为了这些原因，在各种实施方案中有利的是通过与未标记的材料的所得响应对比将浓度值分配至内部校准物贮备液。在实施例1中，通过与未标记的睾酮的内部贮备液对比来分配内部校准物浓度。相对于公认的国际对照材料，例如经认证的对照材料(例如，由NIST供应)或在计量上可追溯到SI单位的其它对照材料可进行数值分配。这些步骤可用于确保内部校准工艺的准确度。

如实施例1中所示，常规校准需要分析6个单个基质校准物，随后分析待分析样品的批次。需要该批次模式分析以最小化潜在性校准漂移。通常，在相同日期分析的第二批次的样品(使用常规方法)将要求新外部校准曲线。用该常规操作模式，到第一结果的时间与八次分析运行(例如，空白加上六种校准物加上第一样品)的花费的时间相等。使用内部校准，不需要运行外部校准物，因此到第一结果的时间潜在地比外部校准快八倍(例如，在实施例1中约4min对比约32min)。来自批次分析模式的自由允许第一时间随机存取和通过LC/MS/MS的急症样品(stat sample)分析。

实施例1的结果表明，仅使用三种校准物的内部校准可提供与使用常规外部校准用六个校准点获得的结果平均相差低于4%的结果。日内不精密度的初步估计值为<3%，这表明内部校准测定是精密且准确的。单个内部校准线显示了样品间相当大的变化(例如，直至40%的校准线斜率的差异)，这可能由于基质效应，表明内部校准物表现与预期一样。内部校准物在不同条件下的行为的进一步研究(例如，离子抑制的不同程度，模拟的差回收率，模拟的差仪器性能等)可用于开发用于内部校准线的斜率的可接受标准，使得可拒绝差的质量数据。

实施例2：单次分析中使用多点校准的全血中西罗莫司的分析

引言：在该实施例中，本发明用于测量全血中免疫抑制药物西罗莫司的浓度。对于该分析物存在外部质量保证方案(国际能力验证(International ProficiencyTesting)[IPT]方案；http://www.bioanalytics.co.uk/Results2012.php)。IPT方案向参与实验室每个月提供三个QA样品。实验室将报告结果返回至方案并且处理数据，以便根据数据的标准差测定各QA样品的平均值以及可接受的结果的限度。将本发明用于定量IPT样品中的西罗莫司并且根据IPT方案出版的可接受标准确定结果的可接受性。如下所述，用不同的加入内部校准物的方法进行两次单独的实验。而且，重复地制备并分析低、中和高QC样品，以提供测定精密度的初步评价。

方法

内部校准物选择：西罗莫司的多个标记形式不可用，并且因此可如下所示使用结构类似的化合物(类似物)。研究分析物和内部校准物的MS/MS特征，并选择各自的特定MRM跃迁。在基于所选择的MRM跃迁的单个LC/MS/MS分析中，分析物和所选择的内部校准物可彼此区分。

表9：西罗莫司和所选择的内部校准物的MS/MS特征。

内部校准物相对响应(“数值分配”)：当使用类似物内部校准物时，尤其重要的是考虑与分析物对比由内部校准物生成的MS/MS信号的强度的任何差异。例如，可引起差异，因为样品制备期间(提取效率)的行为差异或因为分析期间的行为差异例如离子化效率、碎片特征等。分别在10ng/mL的最终浓度下，将分析物和三种内部校准物添加至乙腈：水(2：1，v：v)。制备五个相同样品，并使用UPLC/MS/MS分析(参见下文)。将依维莫司、d6-依维莫司和32-脱甲氧基雷帕霉素的平均积分峰面积与西罗莫司的平均积分峰面积对比，并计算相对响应因子，其中相对响应因子=(平均校准物峰面积)/(平均西罗莫司峰面积)。相对响应因子用于分配“分析物等效物”浓度值至内部校准物贮备液，其中：分析物等效物浓度=(内部校准物浓度)x(相对响应因子)。相对响应计算显示于下面的表10中。

表10：类似内标物的相对响应因子的测定。

样品制备

1.将50μL全血置于埃彭道夫管中

2.向各管中加入0.1M硫酸锌(200μL)

3.涡旋混合

4.加入500μL乙腈

5.在5℃下在12,500RPM下离心5min

6.将200μL上清液转移至Waters最大回收小瓶中并通过UPLC/MS/MS进行分析在实验1中，步骤4中的乙腈含有内部校准物依维莫司(0.3ng/mL)、32-脱甲氧基雷帕霉素(3ng/mL)和d6-依维莫司(9ng/mL)。当将相对响应因子和样品(50μL)与内部校准物混合物(500μL)的比例考虑在内时，内部校准物浓度分别相当于在2.7ng/mL(依维莫司)、21.0ng/mL(32-脱甲氧基雷帕霉素)和108ng/mL(依维莫司-d6)下在样品中存在的西罗莫司。

在实验2中，在步骤1下将内部校准物直接添加至样品中。在这种情况下，内部校准物浓度相当于样品中在约1.65ng/mL(依维莫司)、17.5ng/mL(依维莫司-d6)和22.1ng/mL(32-脱甲氧基雷帕霉素)下存在的西罗莫司。

UPLC/MS/MS分析

仪器：将耦接于以电喷雾阳性离子化模式操作并且配有Z-喷雾离子源的WatersTQD质谱仪的

用于所有分析。系统操作和数据采集的所有方面均使用MassLynx4.1软件控制。使用TargetLynx进行数据处理(色谱峰面积积分)。通过峰面积的线性回归分析对比内部校准物浓度，使用Microsoft Excel计算试样中西罗莫司浓度。

UPLC条件：

流动相A：水，含有2mM乙酸铵+0.1%甲酸

流动相B：甲醇，含有2mM乙酸铵+0.1%甲酸

弱洗涤溶剂：水，1000μL

强洗涤溶剂：甲醇，500μL

密封垫洗涤：20%甲醇水溶液

柱：ACQUITYHSSC18SB2.1x30mm1.8μm，带有柱前过滤器

柱温：50℃

进样体积：37.5μL(PLNO,配有100μL环和250μL样品注射器)3μL溢流，预装载

运行时间：2.25分钟

下面表11给出了UPLC条件。

表11.用于分析西罗莫司的色谱条件。

表12.用于分析西罗莫司的MS/MS条件。

图12显示了使用上面描述的LC和MS/MS条件的来自实验2的实例质谱图。

数据处理：将TargetLynx用于进行各样品收集的四个MRM色谱图的每一个的峰面积积分。将那些数据导出到MicrosoftExcel中，其中对于各单个样品，将LINEST函数用于计算等式和对比三种内部校准物所分配的浓度(x轴)作图的积分的峰面积(y轴)的回归线的测定系数(r²)。以两种方式进行线性回归分析；包括或不包括原点(0,0)。对于各样品，使用回归线的公式和西罗莫司峰的积分面积计算西罗莫司的浓度。

结果

试验1：使用上述方法分析十个西罗莫司IPT样品。内部校准物跨越约2ng/mL至100ng/mL的浓度范围。所构建的包括原点的单个校准线显示于图13中。回归参数和计算的西罗莫司浓度显示于表13和14中。对于所有十个样品，西罗莫司的计算浓度在IPT方案的可接受的范围内(即IPT最小值≤结果≤IPT最大值)，无论计算时包括或不包括原点，这表明内部校准方法提供可接受的结果(表13和14)。

表13：试验1：使用三种内部校准物测定的十个IPT样品中的西罗莫司浓度。所有样品的计算结果在方案可接受的范围内(即IPT最小值≤结果≤IPT最大值)

表14：试验1：使用三种内部校准物加上原点测定的十个IPT样品中的西罗莫司

浓度。所有样品的计算结果在方案可接受的范围内(即IPT最小值≤结果≤IPT最大值)

试验2：在第二实验中，内部校准物跨越大约2ng/mL至22ng/mL的浓度范围，并分析了十九个西罗莫司IPT样品。所构建的包括原点的单个校准线显示于图14中，并且所计算的西罗莫司浓度显示于表15表16中。对于所有十九个样品，西罗莫司的计算浓度在IPT方案的可接受范围内(无论计算时包括或不包括原点)。

表15：实验2：使用三种内部校准物测定的十九个IPT样品中的西罗莫司浓度。

所有样品的计算结果在方案可接受的范围内(即IPT最小值≤结果≤IPT最大值)。

表16：实验2：使用三种内部校准物加上原点测定的十九个IPT样品中的西罗莫司浓度。所有样品的计算结果在方案可接受的范围内(即IPT最小值≤结果≤IPT最大值)

除了IPT样品以外，分析了低(约2.5ng/mL)、中(约7.5ng/mL)和高(约15ng/mL)全血西罗莫司QC的十个相同样品。结果显示于表17中，并且表明在三个QC中测定内不精密度低于6%。

表17：跨越测定的分析范围的三个QC样品的测定内不精密度。

结论

1.可使用内部校准获得全血样品中西罗莫司浓度的测量的准确且精密的结果。

2.其中感兴趣的分析物的稳定同位素类似物是不可用的，可使用结构类似物，前提条件是小心测量相对响应因子。

3.有用的是包括原点(x=0，y=0)作为其它校准物。

4.跨越约2ng/mL至约100ng/mL范围的三种校准物足以提供样品的准确的结果，所述样品具有聚集在范围约2ng/mL至约15ng/mL的浓度值，这表明内部校准在宽的动态范围内用少量校准物可提供准确的定量。

5.该实例证明，对于一些分析物至少，在样品制备工艺中的不同阶段可引入具有可接受的结果的内部校准物。该灵活性在自动仪器的开发和优化中可能是重要的，以便在常规实验室中实施本发明。

实施例3：单次分析中使用多点校准的人尿液中氢吗啡酮的分析。

引言：氢吗啡酮是强效的半合成的阿片药物。将它用于在极端情况下提供缓解疼痛并且其中吗啡是无效的。药物可能有成瘾性，因此小心地控制其使用和治疗后的停药。氢吗啡酮是逐渐滥用的许多处方药中的一种。因此，监测氢吗啡酮浓度的方法对于临床毒理学和法医毒理学应用都是重要的。

方法

外部校准：通过添加氢吗啡酮至空白人尿液中来制备外部校准物。

质量控制样品：通过以约187.5ng/mL，375ng/mL和1250ng/mL氢吗啡酮浓度添加氢吗啡酮至空白人尿液的相同样品等分部分来制备低、中和高QC。含有100ng/mL氢吗啡酮的市售尿液QC也获自UTAK。

内部校准物选择：所选择的内部校准物以及它们的特定MRM跃迁显示于表18中。

表18：分析物、所选内部校准物以及它们的特定MRM跃迁。

样品制备

1.将250μL尿液样品/校准物/QC等分至2mL埃彭道夫管中，并添加10μL内部校准物混合物。

2.将125μL四硼酸盐缓冲液(四硼酸二钠十水合物的饱和溶液)加至260μL具有内部校准物的尿液样品/校准物/QC中。

3.加入750μL提取混合物(DCM:MeOH[90:10])并涡旋30s。

4.在13000rpm下离心5min。移去下面的有机层并转移至洁净的埃彭道夫管。

5.重复有机提取并将提取物收集于相同的埃彭道夫管中。

6.在N₂下在40℃下干燥提取物约10min，直至干燥。

7.再溶于200μL流动相A（1.25x浓度步骤）中，并转移至总回收小瓶用于UPLC/MS/MS分析。

UPLC/MS/MS

使用ACQUITYUPLC分析样品提取物，梯度为乙腈在0.2mM甲酸铵缓冲液中(表19)，WatersTQD质谱仪以ESI+ve模式操作(表20)。

使用如下详述的液体-液体提取程序从尿液样品提取氢吗啡酮：

表19：LLE后用于分析尿液样品的色谱条件。A=0.2mM甲酸铵，B=乙腈。

表20：内部校准物、分析物和内标物中每一种的MS/MS条件

实验1

通过分析0.1μg/mL氢吗啡酮与0.1μg/mL稀释于溶剂的各内部校准物的混合物来测量内部校准物的MS/MS响应。内部校准物和计算的相对响应显示于表21中。

表21：相对于对氢吗啡酮的响应同等浓度的各内部校准物的MS/MS响应。

使用计算的相对响应因子，制备内部校准物的混合物使得当将10μL添加至250μL样品时，最终表观浓度为50ng/mL、500ng/mL或1500ng/mL(表21)。

还在以下浓度下制备了一系列传统外部校准物：20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、750ng/mL、1000ng/mL和1500ng/mL。

将使用内部校准分析的QC样品添加三种内部校准物的混合物，以得到50ng/mL、500ng/mL和1500ng/mL的最终表观浓度(表21)。

将常规内标物(氢吗啡酮-d6)加至外部校准物并加至用于通过外部校准分析的QC样品。

使用上述条件，通过液液提取和LC/MS/MS处理所有样品。

结果

将每个QC水平的五个相同样品使用传统外部校准分析两次，并使用内部校准方法分析两次。通过两种校准方法重复分析UTAKQC的单个制剂。分析结果显示于表22和23中，并且实例内部校准线显示于图15中。

表22：使用内部校准测定的五个相同样品每个分析两次(QC)或两个相同样品每个分析两次(UTAK)的结果的平均值.

表23：使用外部校准测定的五个相同样品每个分析两次(QC)或两个相同样品每个分析两次(UTAK)的结果的平均值。

内部校准方法的结果与外部校准方法的结果密切相关(图16；R²=1.000)，但是斜率(图16；0.84)表明在该实验中，内部校准方法对真实浓度低估约16%。

实验2

数值分配：在第二实验中，将内部校准物添加至空白人尿液的五个相同样品等分部分。还将内标物(羟吗啡酮)加至样品以及一系列外部校准物。所有样品均通过液液提取处理并通过LC/MS/MS分析，如上所述(参见方法)。这使得使用常规技术将准确测量的各内部校准物的表观浓度对照氢吗啡酮外部校准线。

使用内部校准物的这些分配的数值(代替实验1中所用的相对响应因子)，再次制备50ng/mL、500ng/mL和1500ng/mL的目标最终表观浓度的内部校准物的新鲜混合物。使用内部校准分析低、中和高QC的五个相同样品和UTAKQC的2个相同样品，并且通过常规外部校准分析各QC的两个相同样品。各样品的单个内部校准显示于图17中。

通过内部校准和外部校准的QC分析的结果显示于表24和图18中。

表24：在实验2中使用外部和内部校准测定的QC样品平均氢吗啡酮浓度值。

再次地，使用两种校准程序所得结果之间存在良好相关性(图18；R²=0.9962)并且在这种情况下，1.08的斜率指示两种方法之间良好的一致性(平均误差≤8%)。

讨论

在第一个实验中，将简单的相对响应因子用于计算内部校准物的表观浓度。该工艺不考虑样品制备工艺的任何影响。通过内部校准测定的QC数值与通过外部校准测定的那些密切相关(R²=1.000；图16)，但是在该实验中，相关线的斜率(0.84；图16)指示通过内部校准低估浓度约16%。

在第二个实验中，通过与外部校准线对比来分配内部校准物浓度。在该工艺中，在尿液基质中制备所有内部和外部校准物并对其进行液液提取样品制备工艺。结果显示使用外部和内部校准测定的QC数值中相当接近的一致性(图18；R²=0.9962和斜率=1.07)，这表明液液提取样品制备工艺可促成实验1中明显差的一致性。

结论

可使用内部校准法稳定同位素标记的类似物和稳定同位素标记的结构类似物的混合物来准确定量人尿液中的氢吗啡酮。

可以开发内部校准物数值分配的多个方法以确定各分析物/基质/样品制备方法结合的最好办法。

总结

内部校准可提供对常规校准准确且精密的替代并且可允许随机存取分析(这是常规的批次分析模式所不允许的)。因此，对于用户，内部校准可为第一结果提供降低的时间、简化流程、降低试剂消耗，并为每个样品提供基质完全匹配的校准。对于生产商，内部校准可提供新组合物、试剂盒，和仪器设计，以及由于不需要单独的基质而简化的生产工艺。

本文中值范围的引用仅仅意图充当单独涉及落在范围内的每个不同值的简易方法。除非另外指出，将每个单个值并入说明书，如同其被单独引用一样。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、生产商的质量标准和说明书)均通过引用整体并入本文。

除非上下文另有指示，说明书应理解为公开并且涵盖所描述的方面、实施方案和实施例的所有可能的排列和组合。本领域普通技术人员应理解，可通过为说明目的而提供的所总结和描述的方面、实施方案和实施例以外的方式实践本发明，并且应理解本发明仅由以下权利要求限制。

Claims (35)

1.一种通过质谱法定量目标分析物的方法，所述方法包括：

获得质谱信号，其包括第一校准物信号、包含第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，

其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和

使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述目标分析物。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

通过合并在可能包含所述目标分析物的单个样本中的所述第一已知量的所述第一校准物和所述第二已知量的所述第二校准物来制备所述单个样品；和

使用质谱仪由所述单个样品生成所述质谱信号。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

在获得所述质谱信号之前，将所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物与所述单个样品的其它组分分离。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离包括色谱法和所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物共洗脱。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离包括色谱法和所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物分别洗脱。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述分离包括固相提取法、液相色谱法、气相色谱法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法，以及超临界流体色谱法中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的方法，其中定量所述目标分析物包括：

由所述第一校准物信号和所述第二校准物信号获得校准曲线；和

使用所述校准曲线和所述目标分析物信号来定量所述目标分析物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中定量所述目标分析物包括：

使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号，以及所述目标分析物信号来在代数上定量所述目标分析物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一校准物和所述第二校准物各自为所述目标分析物的不同的稳定的同位素类似物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一校准物和所述第二校准物各自为所述目标分析物的不同类似物、衍生物、代谢产物，或有关化合物。

11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

由所述质谱信号获得第三校准物信号、第四校准物信号，以及来自所述单个样品的其它目标分析物信号，所述单个样品包含第三已知量的第三校准物，包含第四已知量的第四校准物，并且可能包含其它目标分析物，

其中所述第三已知量和所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述目标分析物，以及所述其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和

使用所述第三校准物信号、所述第四校准物信号，以及所述其它目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述其它目标分析物。

12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括：

由所述质谱信号获得来自所述单个样品的第五校准物信号、第六校准物信号，以及第二其它目标分析物信号，所述单个样品包含第五已知量的第五校准物，包含第六已知量的第六校准物，并且可能包含第二其它目标分析物，

其中所述第五已知量和所述第六已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述第五校准物、所述第六校准物、所述目标分析物、所述其它目标分析物，以及所述第二其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和

使用所述第五校准物信号、所述第六校准物信号，以及所述第二其它目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述第二其它目标分析物。

13.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

由所述质谱信号获得来自所述单个样品的第三校准物信号，所述单个样品进一步包含第三校准物的第三已知量，

其中所述第一已知量、所述第二已知量，以及所述第三已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物，以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分，和

其中定量所述目标分析物进一步包括使用所述第三校准物。

14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括：

由所述质谱信号获得来自所述单个样品的第四校准物信号，所述单个样品进一步包括第四已知量的第四校准物，

其中所述第一已知量、所述第二已知量、所述第三已知量，以及所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物和所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分，和

其中定量所述目标分析物进一步包括使用所述第四校准物。

15.一种用于通过质谱法定量目标分析物的组合物，其包含：

第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述第一校准物和所述第二校准物各自为所述目标分析物的不同的稳定的同位素类似物、类似物、衍生物、代谢产物，或有关化合物。

17.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含：

第三已知量的第三校准物和第四已知量的第四校准物，其中所述第三已知量和所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述目标分析物，以及所述其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。

18.根据权利要求17所述的组合物，其进一步包括：

第五已知量的第五校准物和第六已知量的第六校准物，其中所述第五已知量和所述第六已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述第五校准物、所述第六校准物、所述目标分析物、所述其它目标分析物，以及所述第二其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。

19.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含：

第三已知量的第三校准物，其中所述第一已知量、所述第二已知量，以及所述第三已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物，以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。

20.根据权利要求19所述的组合物，其进一步包含：

第四已知量的第四校准物，其中所述第一已知量、所述第二已知量、所述第三已知量，以及所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物，以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分。

21.根据权利要求15所述的组合物，其进一步包含：

限定至少一种样品接受器的样品架，其中所述第一已知量的第一校准物和所述第二已知量的第二校准物均包含在所述至少一种样品接受器内。

22.根据权利要求17所述的组合物，其进一步包括：

限定至少一种样品接受器的样品架，其中所述第一已知量的第一校准物、所述第二已知量的第二校准物、所述第三已知量的第三校准物，以及所述第四已知量的第四校准物均包含在所述至少一种样品接受器内。

23.一种用于通过质谱法定量目标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：

第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物，其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和

对以下的说明：(i)获得质谱信号，所述质谱信号包括来自单个样品的第一校准物信号、第二校准物信号，以及目标分析物信号，所述单个样品包含所述第一已知量的第一校准物、包含所述第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，以及(ii)使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号，以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述目标分析物。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述第一校准物和所述第二校准物各自为所述目标分析物的不同的稳定的同位素类似物、类似物、衍生物、代谢产物，或有关化合物。

25.根据权利要求23所述的试剂盒，其进一步包括：

第三已知量的第三校准物和第四已知量的第四校准物，其中所述第三已知量和所述第四已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物、所述第三校准物、所述第四校准物、所述目标分析物，以及其它目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和

对以下的说明：(i)由质谱仪获得来自单个样品的第三校准物信号、第四校准物信号，以及其它目标分析物信号，所述单个样品包含所述第三已知量的所述第三校准物，包含所述第四已知量的所述第四校准物，并且可能包含所述其它目标分析物，以及(ii)使用所述第三校准物信号、所述第四校准物信号，以及所述其它目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述其它目标分析物。

26.根据权利要求23所述的试剂盒，其进一步包括：

限定至少一种样品接受器的样品架，其中所述第一已知量的第一校准物和所述第二已知量的第二校准物均包含在所述至少一种样品接受器内。

27.根据权利要求25所述的试剂盒，其进一步包括：

限定至少一种样品接受器的样品架，其中所述第一已知量的第一校准物、所述第二已知量的第二校准物、所述第三已知量的第三校准物，以及所述第四已知量的第四校准物均包含在所述至少一种样品接受器内。

28.一种计算机可读介质，其包含适于以下的计算机可执行指令：

获得质谱信号，其包括第一校准物信号、包含第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，

其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和

使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的目标分析物。

29.根据权利要求28所述的计算机可读介质，其进一步包含适于以下的计算机可执行指令：

引导自动代码阅读器以基于与所述给定样本有关的代码确定给定样本中待测定的一种或更多种分析物的列表；和

引导自动校准物系统以合并所述给定样本与所述一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。

30.一种用于通过质谱法定量目标分析物的装置，所述装置包括：

样品处理器，其被配置成通过在可能包含目标分析物的单个样本中合并第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物来制备单个样品；

质谱仪，其被配置成生成包括第一校准物信号、包括第二校准物信号，并且可能包含来自单个样品的目标分析物信号的质谱信号，所述单个样品包含第一已知量的第一校准物、包含第二已知量的第二校准物，并且可能包含目标分析物，其中所述第一已知量和所述第二已知量不同，并且其中所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物可通过质谱法在所述单个样品中各自区分；和

数据处理器，其被配置成使用所述第一校准物信号、所述第二校准物信号以及所述目标分析物信号来定量所述单个样品中的所述目标分析物。

31.根据权利要求30所述的装置，其进一步包括：

分离系统，其被配置成在获得质谱信号之前从所述单个样品的其它组分分离所述第一校准物、所述第二校准物以及所述目标分析物。

32.根据权利要求30所述的装置，其中所述分离系统包括固相提取、液相色谱、气相色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱，以及超临界流体色谱设备中的至少一种。

33.根据权利要求30所述的装置，其中所述样品处理器进一步包括：

自动代码阅读器，其被配置成基于与所述给定样本有关的代码确定在给定样本中的一种或更多种待测试分析物的列表；和

自动校准物系统，其被配置成合并所述给定样本与所述一种或更多种分析物的每一种的第一已知量的第一校准物和第二已知量的第二校准物。

34.根据权利要求33所述的装置，其中所述自动校准物系统被配置成递送所述给定样本至样品接受器，所述样品接受器包含所述一种或更多种分析物的每一种的所述第一已知量的第一校准物和所述第二已知量的第二校准物。

35.根据权利要求33所述的装置，其中所述自动校准物系统被配置成递送所述一种或更多种分析物的每一种的所述第一已知量的第一校准物和所述第二已知量的第二校准物至包含所述给定样本的样品接受器。

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