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CN1037736A - 收集和探测微生物的方法和设备 - Google Patents

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CN1037736A
CN1037736A CN89103097A CN89103097A CN1037736A CN 1037736 A CN1037736 A CN 1037736A CN 89103097 A CN89103097 A CN 89103097A CN 89103097 A CN89103097 A CN 89103097A CN 1037736 A CN1037736 A CN 1037736A
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CN
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CN89103097A
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里查德·卡尔文·埃伯索尔
弗兰克·托马斯·盖洛明尼
罗伯特·埃米特·塔特诺尔
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EI Du Pont de Nemours and Co
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Abstract

本发明涉及一种从难分离的环境样品(如油井样 品及类似样品)中，收集、浓缩、检测微生物的方法，该 方法用于微生物的分析和鉴定；还涉及实施上方法的 装置。

Description

本发明涉及一种从难分离的环境样品（如油井样品及类似样品）中收集、浓缩和回收微生物的方法，以及实施该方法的设备。上述方法可用于分析和鉴定微生物。
环境微生物的污染导致每年的设备和产品失效损失达数百万美元。由于微生物污染使产品变质，污染，腐蚀，成为劣质品，以及降低热交换能力。为监测和控制有害的微生物群，需要一种能在现场使用，对微生物浓缩和回收的简单的样品加工技术。
硫酸盐还原细菌（SRB）是对环境危害性最大的一种生物体。它们将引起石油加工和炼制（C.O.Obuekwe等，微生物工艺应用，26，389-393，（1987）），冷却水系统（J.W.McCroy.冷却塔水的微生物学，化学出版公司，纽约，（1980）），废水处理系统（G.Kobrin等，废水处理槽，典型例，R.E.Tatnall编，材料性能，20，41～48，（1981）），浆液和纸生产（A.Piluso，材料性能，20，41～48（1981））中使用的金属腐蚀并且应力断裂。SRB产生的硫化氢较之氰化氢更为致命，硫化物产品也可通过其它生物体产生硫酸（P.Bos等，金属中的硫氧化细菌微生物学，18～27（1983）），使城市污水系统的混凝土迅速遭到破坏。SRB生物体污染排水沟（J.R.Postagte，在硫酸盐还原细菌中，Cambridge大学出版，纽约，（1984））已成为严重的问题，一方面造成缺氧，另一方面，产生毒性的硫化氢，二者的共同作用将抑制海洋生命。
直到最近，环境微生物的微生物探测仅局限于实验室培养液。一般说，这种培养方法是很慢的，要求几天或几周才能完成。它不适于需要控制生物体的现场检测。因此培养方法仅在监测和控制生物体方面有有限的意义。为了加快或省去这种培养方法，已研究出许多新的直接检验方法。但因为样品复杂，微生物的种类繁多，以及分析不灵敏，因而还有许多困难。
环境样品，如土壤，污物，地表水，尤其天然原油是复杂的混合物。这种混合物为即含固体又含易溶成分的多相物质。样品成份中常含有高浓度的固体沉淀物，胶体，乳状物，易溶的和不溶的盐，生物聚合物，生物降解碎片，惰性物质，污染的工业和天然化学物质。多相而复杂的环境样品能阻碍直接检测或使检测失效。微生物可粘附在微粒上，因此通过一般依赖液体过滤的方法来提供微生物难以用于检测。同样，样品中含有的化学或易溶物质也会干扰和抑制检测方法。如当颜色是分析手段时，样品的颜色可能影响试验结果。
在许多情况下，样品材料所含微生物的量较小（102～105细胞/gm），这使得微生物和/或它们的产品的直接检测变得更加复杂。此外，在许多时候，微生物包含的不是单个的菌株或单个种属，而是集合了多种不同类型的生物体。由于这些原因，直接检测方法要求较高的灵敏度，并应具有较宽范围的特性或生物体选择特性，如U.S.4，592，994所述。由于要求高灵敏度和宽范围特性，直接检测处理细胞和它们的产品（如直接的免疫测定法）将存在化学干扰。
围绕这些问题，就要求能够浓缩现场样品中的少量生物体，并且不受干扰物质影响的样品处理方法。这些干扰物质妨碍分析，引起误差，结果失真。通常的处理方法包括离心，膜渗滤或化学沉淀等过程。
硅藻土过滤（DE）和木炭吸附等化学处理被广泛用于饮用水处理和废水处理中（Linstedt等，水研究，8，753-760（1947））。这些大规模的生产方法研究表明，上述过程在筛除碎屑，除去砂砾，澄清和生物过滤方面是有效的。这与工厂的操作参数和效率有关。最终的水过滤液基本上不含有颗粒和微生物。
由K.P.Lang′e等（J.Am水工程协会，78，76-84，（1986））报导的小型的工厂试验表明：100%寄生菌贾第虫属兰（伯）氏鞭毛虫属（Giardia lamblia）囊可通过DE过滤在一较宽范围的条件下被除去。较小的生物体如大肠杆菌状的细菌也可以除去，但要受DE的等级的限制。一种硅藻土过滤器能从海水中除去异养细菌（J.Illingworth等，水产养殖，17，181～187，（1979））。借助于化学试剂和涂层的DE，可滤去病毒。R.De Leon等，水的研究，20，583～587，（1986）表明：roto病毒和f2大肠杆菌噬体即使通过严格混合的介质过滤也不能除去。然而，加入少量明矾和聚合物絮凝剂可以改进病毒的去除率。T.S.Brown等，J.Am.水工程协会，66，98～102（1974），证实：通过DE过滤可从水中除去病毒，即从水中去除T2噬菌体和脊髓灰质炎病毒。然而，除去这些病毒还取决于病毒特性，如调节适当的PH值和选择有效的DE涂层。
通常DE过滤适用于不含有高浓度的沉淀物或水藻的水处理，上述沉淀物或水藻会使过滤介质紧固，背压升高而阻滞流体流动。仅DE本身的生物过滤不能用在含高沉淀物或混合物的样品中，如水/油乳状液（K.P.Lang′e等，J.AWWA，78，76～84（1986））。由于上述原因，DE生物过滤技术仅局限于满足如下条件的大工业和城市工厂：密度高于水的样品必须经过预处理;流体流动的流体动力学可以控制;DE床层参数维持一定。因而，试图用这种过滤方法从油井样品中分离SRB，由于过滤器堵塞太快而归于失败。
渗滤是DE生物过滤最早采用的方式。然而，该过程操作缓慢，同时还必须非常注意不破坏最初的DE床层的孔结构。这要求大部分设备其液体压力在过滤过程自始至终都要加以控制。该设备不适于分析测试和现场使用。
DE生物过滤的第二种方式是细颗粒或胶体的吸附作用;其中，微生物被二次吸附。DE表面上的电荷和在水样品中的胶体限制了这种方法的使用。
将化学物质直接加入到水中或同DE过滤联合作用，可以防止生物过滤过程中的问题。这种物理/化学的处理方法是基于拌随沉淀的化学絮凝过程以去除悬浮固体的方法。典型的絮凝剂是铝或铁盐，可有效地除去磷和颗粒。Linstedt等，水研究，8，753～760（1974）表明明矾和其它的化学试剂能有效地从废水中除去易溶的磷酸盐，浊水，细菌和重金属。Lee等，Lab.Pract.，23，297～298（1974）论述了采用硫酸铝钾化学絮凝有效地用于从单体培养液中通过沉淀回收细菌。
化学絮凝是易于适应的过程，它一般不用于已获得的微生物的分析测定。絮凝过程定量地取决于絮凝剂的浓度，样品中存在的竞争的荷电物质量和微生物上的电荷。如果参与竞争的物质方面样品材料很广，微生物就不能够重复回收。絮凝剂太多也会阻止絮凝。此外，絮凝剂可与进一步分析样品所需的试剂反应，或防止该反应发生。絮凝剂可以增溶或改变细胞的化学成份是非常重要的。这样，絮凝剂会损坏微生物的免疫反应。由于这些原因，使用化学添加剂没有成为收集，回收微生物和从它们当中除去污染的溶解物的有效方法。
US4，515，697公开了一种用于絮凝微量水藻或其它有机颗粒而不用添加试剂的方法。该方法是将含有欲富集的微量水藻或其它有机颗粒的溶液，以一定速度通过一固定的颗粒床层。所述的速度可使微量水藻或其它有机颗粒在过程中聚集，絮凝，并粘附在颗粒材料床层上。该专利中公开了使用砂子，陶瓷和烧制粘土颗粒作颗粒材料，但该专利并没有说明怎样定量收集。
同样，WO87/00199公开了硅藻土可以不可逆地捕捉微生物或内部结构类似的颗粒，以及用硅藻土在纤维材料浓缩细菌。由此方法及浓缩过程，即可实现培养细菌实施生物反应和化学反应。但该专利没有说明如何有效地回收细菌。
GB2，189，317公开了用氢氧化三钛悬浮液，使硫酸盐还原细菌固定不动以便通过ELISA方法检测。
本发明的目的是提供一种用来从环境样品中收集和回收微生物的价廉的方法。该方法可以用于现场，便于直接检测微生物和（或）其产品。本发明的进一步目的是提供一种用于免疫测定法或其它检测方法时，用来浓缩生物体，并使其不干扰溶解物的方法。本发明的另一个目的是提供一种采用廉价的普通生物过滤材料制得的以完成上述目的的装置。
一种从样品中收集微生物的方法包括：在样品容器内，将样品和吸附剂在流体介质中混合，摇动混合物，悬浮微生物和吸附剂材料均匀地分布在样品流体中;在样品容器上配置一吸附剂收集帽，挤压样品流体通过吸附剂床层和吸附剂收集帽，排出样品流体;可选择地清洗吸附剂滤饼和在样品回收装置内捕捉并吸附的微生物，重新悬浮滤饼颗粒，回收被微生物吸附剂富集和浓缩的微生物细胞和其组分，从吸附剂颗粒中分离微生物以便检测和（或）分析。
一种收集微生物的方法，使用1～20g含固体物小于5%的样品，将其放入一个为样品体积3～10倍的样品容器内，每毫升流体样品同10～60mg硅藻土（DE），珍珠岩（MgAlSiO3）或碱金属型或氢型沸石粘土颗粒组成的吸附剂混合，至少一半的吸附剂颗粒尺寸约为2～10微米。具体吸附剂选自硅藻土Cat＃1939-01J.B.Baker，Celite4\4，Kenite4\4 200，Celatom4\4，Cuno4\4M-901，Cuno4\4m802，Perflo4\4 200，Perflo4\4 63，Perflo 4\4 30;将样品和吸附剂混合物摇动5～30砂，悬浮微生物和吸附剂颗粒，使其均匀地遍及样品流体;在样品容器上配制一吸附剂收集帽，挤压样品流体使其通过吸附剂收集帽中收集的吸附剂层;排出样品流体，可选择地在样品回收装置中清洗吸附剂层或滤饼，每次使用的清洗液约是初始样品体积的10%;通常，将吸附剂颗粒和细胞再悬浮以回收欲收集的细胞;使稠密的吸附剂沉降，浓缩上层清液中的微生物用于后面的检测和（或）分析。
本发明的方法包括从样品中收集微生物，其中，样品首先与吸附剂颗粒混合。吸附剂为一种能捕捉或吸附微生物的颗粒材料，其孔径约为20μm，微生物不能通过;吸附剂密度大约为1.0g/cc，本发明性能优良的吸附剂包括：J.T.Baker硅藻土（Cat.＃1939-01），Celite4\4，Kenite4\4    200，Celatom4\4    FW6，Cuno4\4    M-901，Cuno4\4m802，Perflo4\4    200，Perflo4\4    63，Perflo4\4    30，Alite4\4    150，Alite    4\4    180，及其混合物。其中，J.T.Baker硅藻土（Cat.＃1    1939-01），Celite4\4，Kenite4\4    200，Calatom4\4    FW6，Cuno4\4M-901，Cuno4\4m802，Perflo4\4    200，Perflo4\4    63，Perflo4\4    30为优选的吸附剂。水，土壤和其它物质样品重量为0.5～100g，优选范围是1～20g。如果样品是干燥的或半固体物质，则应加入悬浮液，形成含有小于10%固体的悬浮液，固体含量最好小于5%;如样品基本上为液体，则不必加悬浮液;液固混合物的液体部分作为样品液体。
本发明方法包括采用如图1所示的样品回收装置。该装置由样品容器和吸附剂收集帽两部分组成。图1中，样品容器由一柔性管状壳体13构成，其一端开孔，适于气密地与吸附剂收集帽相连，样品容器适于转移吸附剂至收集帽。管状壳体部分容积是样品体积的2～20倍，最好为3～10倍。前述使用的微生物吸附剂（或溶剂（S））放在容器内。
收集帽12有一空心的锥形管14，在管14的一端开有狭小的孔15，另一端开有大孔17，管的顶端形成狭窄的孔道以夹持多孔固定环16，其材料为聚乙烯或其它惰性纤维材料或类似的材料。大孔17与样品容器气密性地连接，样品容器11用于盛装吸附剂和样品。小孔15的直径为1.4～14mm，最好为2.8～6.9mm，多孔固定环16位于管的狭窄区域内并被固定。所要求的样品体积，决定了盛装样品和吸附剂的管的尺寸，帽的大孔直径为5.6～56mm，最好为5.6～20.8mm。帽的大口径部分有一腔室（容器室）23收集吸附剂和样品固体。该容器室所需容积是吸附剂固体体积的1.5～5倍。
如上所述，将样品流体18置于样品容器11内，摇动样品和吸附剂颗粒19，使含有的微生物和吸附剂材料悬浮而均匀地遍布于样品流体。吸附剂材料可随意用于混合物中。为了提高吸附功能，可通过化学涂覆或接枝聚合对吸附剂颗粒进行表面处理。通过这些手段，颗粒表面得到改进，以提供适宜的用于细胞相互作用或改变其表面性质（如润湿性）的zeta势，离心交换特性。吸附剂的用量取决于样品体积。每毫升样品流体所需吸附剂在10～170mg之间，最好为10～60mg。通常操作时，人工摇动样品-吸附剂混合物5～30秒，可使样品完全成为悬浮液19;使所使用的特种吸附剂颗粒悬浓将取决于样品的类型和必要的摇动的程度。
吸附剂收集帽12连接于样品容器上（见图B），头朝下地将样品回收装置和管端倒置，如图C。让悬浮材料部分沉淀，直到厚1～5mm的吸附剂薄层形成在管内20处。密度较大的吸附剂首先沉淀，一般该过程可在10～60秒内完成，这取决于悬浮样品的粘度和微生物吸附剂的密度。为不降低微生物的回收率，可采用较长的沉淀时间。
挤压样品容器使样品流体被迫穿过吸附剂层而被排出。该步骤能去除一些易溶物质，这些易溶物质的存在会干扰以后的检测分析。如果必要，可吸入清洗液并洗提吸附层20。通常，清洗液体积等于或小于原始样品流体体积。最好使用较少的清洗液。一般清洗液为原始样品流体体积的10%，这对排除易溶物是有效的，这取决于溶解物的浓度和干扰的机制。
在吸附剂层20中富集和浓缩的生物体被转移回样品容器内而用于检测和（或）分析。首先加入“检测流体”22，倒转样品回收装置，使样品容器11在帽12的下面（如图D），摇动装置，使流体中的吸附剂和所夹持的微生物重新絮凝。如果希望完全回收生物体，则让固体沉淀，拿去吸附剂帽后，轻轻倒出含有重新絮凝的微生物的上层清液。在一较佳的实施例中，检测生物体细胞内或溶剂化的成份是有重义的，在检测液一吸附剂混合物中的微生物被溶解了，然后，检测液22从固体中分离出来，这可以通过挤压样品容器使流体通过吸附剂收集帽得以完成。生物体可以通过对检测液中的吸附剂-微生物混合物进行声处理而溶解出来。另外检测液也可含溶解剂（S）。
本发明所述的方法，使用硅藻土，DE，或类似的吸附剂颗粒，其中至少一半的颗粒尺寸在2～10微米之间;特别设计的样品回收装置，能充分回收微生物（回收率至少60%），本发明易于除去干扰的溶解物，最终的微生物易于鉴别或分析;另外，本方法现场使用方便，迅速，价格低廉。
实例和对照实验
下列实例和对照实验有助于完整地说明所采用的样品加工方法和样品回收装置。
试剂和材料：
现场样品：产品油井样品（有关11）取自Conoco    NorthEast    Cherokee钻井场。将从油田生产水中分离析出的已知Desulfovibrio    desulfuricans    G100A纯净菌株的细菌添加到样品中。
细胞检测：当样品中SRB浓缩到一定程度时，使用相衬显微镜在Petroff-Hauser计数器内直接检测以确定其细胞数。
然而，通常SRB浓度太低，不能直接用显微镜检测。为此，可采用对照SRB生物体腺苷-5′-硫酸磷（APS）还原酶的免疫测定法间接地测定，该方法公开于US专利申请号为946，547中。在所有已知的SRB生物体中均发现APS还原酶为一种细胞内的酶。如前所述，样品经超声处理大约60秒，从而破开细菌的细胞，释放出APS还原酶。
试验缓冲剂：三缓冲剂（TRIS    BUFFER）（50mM，PH7.5）氯化钠（75mM），0.1%低泡洗涤剂（SL-18），BSA（0.1%），叠氮化物（0.02%）。
TRIZMA＊HCL （mwt.157.6）6.35gm
TRIZMA＊BASE （mwt.121.14）1.18gm
氯化钠    （mwt.58.45）4.38gm
牛血清白蛋白    1.00gm
SL-18聚Tergent4\4    1.0ml
叠氮化钠    0.20gm
纯化水    1000ml
＊三-氢-甲基氨甲烷，由Sigma Chemical Corporation生产。将试剂溶解于水中，pH值调节到7.4～7.6之间。
清洗液：三缓冲剂（50mM，pH7.4），叠氮化物
（0.05%）
TRIZMA＊HCl 6.61GM
TRIZMA＊BASE 0.97GM
叠氮化物    0.50GM
水    1000Ml
将溶液的pH值调节到7.3～7.4之间，用一无菌的过滤器过巳芤海?°贮藏。
PNP显色试剂，在二乙醇胺缓冲剂内混合溶解了的0.1%P-硝基苯磷酸盐制得试剂：上缓冲剂组成为：
二乙醇胺    97ml
MgCl20.1g
叠氮化钠    0.2g
精制水    1000ml
APS还原酶免疫法
典型的免疫测定法检验如下：按照Imagawa，J.Biochem.92，1413（1982）中所述的方法，首先将2.0μl家兔抗-APS碱性磷酸酶抗体共轭溶液加到0.2ml试验缓冲液的样品材料中。如果样品材料包含的是完整的细胞，则首先对试验混合物声处理90秒，将混合物置于室温下3分钟，然后加入单个的（直径为4.0mm）固相抗APS抗体试剂粒状物，在室温下搅拌混合物15分钟，用1.0ml新鲜的试验缓冲剂分4次连续清洗粒状物，然后用0.5ml    PNP显色试剂于室温下平衡15分钟。采用Flow    Laboratories（Mclean，VA22102）微滴定板指示器在405nm测量溶液（0.2ml）的颜色变化。
对照实验A
现场样品对直接SRB测定法的影响
该对照实验表明在含有干扰物质的油流体样品中离析和检测微生物所遇到的困难。从石油生产装置获取的四种含水样品和从工业冷却塔获取的附加样品被用来试验。通过APS还原酶免疫法确定SRB检测的容许含量，上述样品中可含有化学物质和固体物质。可以直接检测样品，也可以在排降假定的污染之后检测。上述样品代表了油生产各阶段各类型水，包括从注水现场注入的水，从井口直接抽出的生产水和从分离罐分离的水。每种样品接种SRB，浓度达2×106细胞/ml，SRB培养物也是样品来源之一。如上所述，证明可能存在干扰物质;每次样品都做了直接（即没有清洗或其它处理）检测，也在离析和清洗存在的细胞之后进行了检测。
直接试验是将每种样品取出0.2ml，经声处理90秒，按照上述APS还原酶测定法检测以用于SRB浓缩。为制备没有干扰物的样品，每种样品取出1.0ml，用0.45μm无菌膜过滤器过滤。取2.0ml试验缓冲液通过过滤器漂洗过滤器收集的固体沉淀物，再用1.0ml强脉冲试验缓冲剂反冲洗掉每个过滤器上的固体。取已过滤的细胞的悬浮部分（0.2ml），经声处理，用APS还原酶免疫测定法进行APS还原酶测定。表A给出过滤器APS的响应值。同样用二种处理方式以测试SRB培养物（0.2ml）。
表A中列出了试验结果的比较值，说明在大部分现场试验样品中存在有抑制物质。如上所述，数字代表了按照APS还原酶免疫测定法目测所得到的密度读数。
表A
样品类型    直接APS响应值    过滤器APS响应值    变化%
（O.D.405nm）    （O.D.405nm）
培养物＊0.95 1.00 5
油样品A    0.79    1.19    34
油样品B    0.77    1.34    43
油样品C    1.14    1.10    4
油样品D    0.80    1.26    34
冷却水    1.22    1.28    5
＊从实验室SRB培养液中取出的没有抑制的对照样品。
实例1
从油井生产水样品中收集和回收硫酸盐-还原细菌（SRB）。
取没有抑制的油样品，向该样品中加入SRB，浓度达2×106SRB/ml样品，在1.5ml上述配制的油样品中加入50mg J.T.Baker（Phillipsburg，NJ08865）硅藻土（DE）（＃1939-01），摇动盛放混合物的样品容器15秒，然后沉降1.0分钟直至形成薄的DE层。挤压含油的上层清液通过DE层并排出。
为测定回收的细菌细胞，将1.5ml试验缓冲剂加入到容器中，帽附在容器上，帽内DE固体以滤饼的形式被回收。连同滤饼取下吸附剂收集帽，在样品容器内使样品混合物重新絮凝，并经声处理90秒而释放出APS酶。让DE沉淀，取200μl含酶的上层清液（检测液）用APS还原酶免疫测定法检测。
为测定回收SRB的相对效率，比较上述试验样品和对照实验样品的结果。对照实验样品其SRB通过下述步骤回收：首先通过-0.45μm的无菌膜过滤器，然后挤压脉冲1.5ml的新鲜试验缓冲液反洗过滤器上的细胞。取200μl该溶液，用声处理90秒，然后按上述方法检测。在该样品上标注对照实验标记。
为测定100%细胞回收（100%对照实验），直接测试接种的油样品。
表1所示结果表明：从油/水样品中采用DE生物过滤处理以回收SRB细胞是有效的。上油/水样品对用0.45μm无菌膜过滤器给出大体相同的细胞回收率。
表1
油    处理    试验结果    回收率%
（O.D.405nm）
试验    DE    1.39    77%
对照实验    0.45μm过滤器    1.47    82%
100%对照本底    无    1.78    100%
实例2
从油井样品中回收SRB细胞吸附剂浓度对回收率的影响。
该实例说明用于从微生物呈悬浮状的流体中回收微生物时，吸附剂用量将影响微生物回收的完整性。
从J.T.Baker，Supra，（Cat.＃1939-1）购买来的各种数量不同的硅藻土装入上述的7个样品回收装置中。取2ml从生产油井中得到的含1×106SRB细胞/ml的液体样品，将其加入到每个样品的回收装置中。处理样品，按照上述的APS还原酶免疫测定法检测。
表2所示结果表明，吸附剂浓度影响细胞回收率。用这种尺寸的油井样品，使用的吸附剂量为每毫升样品40～80mg时可获得最佳回收率。
表2
硅藻土mg/ml样品    平均试验响应值（0.D.405nm）
5    0.86
10    1.07
15    1.49
25    1.50
40    1.61
60    1.64
80    1.60
160    1.68
实例3
改变SRB细胞浓度对细胞的回收率
下面实例表明，微生物可在环境样品经常出现的较宽范围的细胞密度下有效地回收细胞。
在该实例中，如材料部分所述，生产油井样品接种多种浓度的SRB，浓度达到0.5×106细胞/ml样品，用这些样品采用本发明的吸附剂方法测量细胞回收率。每个样品回收装置中盛有80mg吸附剂/ml样品，并通过0.45μm无菌膜过滤器过滤。
为说明两种方法的相对的回收率，对照样品不含有抑制剂溶解物，该样品是通过接种50mM的三缓冲剂而制得的，缓冲剂的细胞密度同接种油田样品一样。全部样品经声处理90秒，然后用APS还原酶免疫法进行APS还原酶检测。等分对照实验试样（1.5ml），不用任何处理而直接分析。由对照实验样品决定的APS还原酶量被认为是代表着包含于每种浓度的接种SRB内100%的可探测的APS酶。
采用本发明的方法，取不同细胞密度的每种样品1.5ml回收细胞。将每种样品1.5ml通过一0.45μm无菌膜过滤器（Gelman，Sciences    Inc.Ann    Arbor，MI48106）。而完成回收细胞过程。然后取2.0ml清洗液通过过滤器清洗回收的细胞。进一步，用1.5ml样品缓冲剂进行强的反冲洗而从过滤器上得到的回收的细胞，反冲洗是用10ml注射液使流体通过过滤膜而完成的。
表3所示结果表明用本发明的方法对所有试验的细胞密度都可以有效地回收细胞。采用无菌的膜过滤器而完成本发明，样品中几乎100%的可检测的免疫APS还原酶可被测量。这些结果表明本发明中使用的微生物吸附剂不仅能很好地回收微生物，而且不干扰检测试剂或分析。
表3
细胞密度对细胞回收的影响
添加SRB    对照实验样品    发明的吸附剂方法    0.45μm过滤器
细胞数/ml    （O.D.405nm）    （O.D.405nm）    （O.D.405nm）
0.5×1071.69 1.78 1.64
0.5×1060.80 0.76 0.67
0.5×1050.16 0.19 0.12
0.5×1040.05 0.08 0.04
0    0.04    0.07    0.08
后3列是以APS还原酶免疫测定法测定APS还原酶密度时，于405nm下目测读数。需要指出，在细胞浓度0.5×104SRB细胞/ml或小于该密度时，试验是不灵敏的。
实例4
吸附剂类型对SRB细胞回收的影响
如实例1取（100mg）不同类型的吸附剂材料装入样品回收装置内，按上述实例操作，将含有约5×108SRB/ml的培养液（2.0ml）加入到每个样品的回收装置中。然后在吸附剂材料上回收SRB，原始样品中SRB数和滤液中的SRB数，使用相衬显微镜由Petroff-Hauser计数器来直接测定细胞读数，SRB是被吸附剂保持在上述滤液中并从中汽提出来。测试的物质如表4所示。所有测试的物质细胞回收率大于65%，这些物质均适宜于本发明。采用不同类型的吸附剂材料可获得足够的细胞回收率。各种类型的DE，珍珠岩，粘土，其颗粒尺寸至少有一半在2～10微米之间，用于本发明可获得足够的微生物回收率（至少60%）。
表4
吸附剂类型对SRB回收率的影响
材料名称    材料性质    SRB回收率%    颗粒尺寸
Celite4\41硅藻土 88
Kenite4\4 2002硅藻土 90 2～20
Kenite4\4 7002硅藻土 42 6～40
Kenite4\4 30002硅藻土 00 10→40
Celatom4\4FW63硅藻土 61 平均6
Celatom4\4FW603硅藻土 00 平均19
Celatom4\4FW403硅藻土 39
Cuno4\4M-9014硅藻土 66
Cuno4\4m8024硅藻土 96
Perflo4\4 2005珍珠岩 75
Perflo4\4 635珍珠岩 83
Perflo4\4 305珍珠岩 81
Alite4\4 1506Na沸石/粘土 86
Alite4\4 1806H沸石/粘土 71
1详见Johns Manville Corporation的“Tech Information Bulltin”
2详见Witco Chemical Company的“Toch Information Bulletin”
3详见Eagle Pitcher Company的“Tech Information Bulletin”
4详见“Tech Information Bulletin”
5详见“Tech Information Bulletin”
6详见“Tech Information Bulletin”

Claims (7)

1、一种从含有各种杂质的难分离的流体样品中分离和检测微生物的方法，包括如下步骤：
a.将一种流体样品同一种可吸附或捕捉微生物细胞的吸附剂颗粒混合；
b.搅拌上述混合物，使上述流体中的吸附剂颗粒，微生物和其它固体杂质呈基本均匀的悬浮液：
c.将上述悬浮液通过一过滤器，该过滤器基本上能将含有捕捉或吸附了微生物的吸附剂颗粒保持为滤饼；
d.可选择地清洗基本上含全部溶解的杂质的滤饼；
e.在纯净的液体中重新悬浮所说的含有微生物的吸附颗粒，上述纯净液体对所说的微生物是不活泼的，这使所说的吸附剂颗粒与所说的微生物分离；
f.使所说的吸附剂颗粒沉淀，释放出所说的微生物进入上层清液。
2、一种从含有各种杂质的难分离的流体样品中分离和检测微生物的方法，包括如下步骤：
a.将一种流体样品同一种可吸附或捕捉微生物细胞的吸附剂颗粒混合;
b.搅拌上述混合物，使上述流体中的吸附剂颗粒，微生物和其它固体杂质呈基本均匀的悬浮液;
c.将上述悬浮液通过一过滤器，该过滤器基本上能将含有捕捉或吸附了微生物的吸附剂颗粒保持为滤饼;
d.可选择地清洗基本上含全部溶解杂质的滤饼;
e.在纯净的液体中重新悬浮所说的含有微生物的吸附剂颗粒，上述纯净液体对所说的微生物是不活泼的;
f.使微生物细胞破裂释放出可检测的细胞组分;
g.检测所说的组分，以测量所说的微生物。
3、按照权利要求2的方法，其特征是所说的吸附剂颗粒选自硅藻土颗粒，珍珠岩颗粒，沸石粘土颗粒，大部分颗粒径为2～10微米。
4、按照权利要求2的方法，其特征是步骤“f”中通过声处理“破裂”细胞，用免疫测定法检测微生物。
5、按照权利要求2的方法，其特征是通过一多孔的塞子过滤步骤“c”的悬浮液，孔的尺寸约为20微米。
6、按照权利要求3的方法，其特征是流体为油井样品，所说的微生物为硫酸盐还原的细菌。
7、一种从含有杂质的难分离的流体中分离微生物的装置，该装置包括一面开孔的样品容器和收集帽两个部分;收集帽为一空心的管状体，在帽的一端开一小孔，另一端开一大孔，在开孔之间的区域适于夹持一堵塞物或过滤材料，大口孔适于气密性地与所说的样品容器的开孔端相连接。
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