CN103768157A - 一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中兽药技术领域，公开了一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物及其制备方法。该药物包括以下质量配比的原料药：紫锥菊30～50份，黄芪30～45份，黄芩10～25份，金银花10～25份，连翘5～15份。该药物用于防治禽新城疫、法氏囊病，能有效抑制畜禽细菌、病毒性疾病蔓延和扩散，适用于禽新城疫、传染性法氏囊病预防及治疗，兼有药物与营养剂双重功能，可作为免疫增强剂和促进剂，增强畜禽机体免疫力，提高防病抗病力。

Description

一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物及其制备方法

技术领域

本发明属于中兽药技术领域，具体涉及一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物及其制备方法。

背景技术

新城疫（newcastle disease,ND）是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。雏鸡最易感染，成鸡易感性较低，病鸡是本病的主要传染源，病毒可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。临床以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。鸡发病多呈急性、亚急性和慢性经过，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。

目前，鸡新城疫病的防治存在如下问题：一是病源因素复杂，潜伏期2～15天或更长，有病毒、细菌、支原体等混合感染，单纯靠疫苗不能有效预防。二是由于抗生素和化学抗菌药物的大量使用，病原微生物产生了广泛的耐药性，使治疗效果不断下降，临床又不得不加大剂量并延长给药时间，大幅度提高了治疗难度与成本；三是金刚烷胺、病毒唑等抗病毒药物广泛禁用，临床难以找到比较对症的特效药，速发型病鸡死亡率高，有幸存活下来的鸡，出现阵发性痉挛，肌肉震颤，颈部扭转，角弓反张等神经症状，食用价值明显降低，甚至被淘汰。四是血清治疗也有一定危险，有可能带来其他疾病的发生。由于中药的成分较复杂，使得病原对某一单一成分不产生耐药性，其作用广泛，相对安全，因此中药的应用具有重要意义。

目前，也有采用中药防治禽新城疫病的报道。但尚存在下列问题：一是目前治疗新城疫病的中药以内服或拌料散剂剂型为主，不能混饮给药，现代集约化饲养场使用不便；二是多数停留在经验方水平，未进行规范的临床试验，不能从现代传染病学角度证明其有效性；三是未从现代药理学角度阐明其作用机理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物及其制备方法，用于防治禽新城疫、法氏囊病，能有效抑制畜禽细菌、病毒性疾病蔓延和扩散，适用于禽新城疫、传染性法氏囊病预防及治疗，兼有药物与营养剂双重功能，可作为免疫增强剂和促进剂，增强畜禽机体免疫力，提高防病抗病力。

为了达到上述问题，本发明是通过以下技术方案予以实现。

技术方案一：

一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，其特征在于，包括以下质量配比的原料药：

紫锥菊30～50份，黄芪30～40份，黄芩16～20份，金银花15～20份，连翘8～12份，采用水提柱分离醇洗脱法制备有效成分。

进一步地，所述原料药的质量配比为：紫锥菊30～50份，黄芪30～40份，黄芩16～20份，金银花15～20份，连翘8～12份。

更进一步地，所述的原料药的质量配比为：紫锥菊40份，黄芪40份，黄芩17.5份，金银花17.5份，连翘10份。

技术方案二：

一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以质量份数计，称取紫锥菊30～50份，黄芪30～40份，黄芩16～20份，金银花15～20份，连翘8～12份；粉碎后过60目筛，以1:12(m/v)的料液比于80℃下回流水提取3次,每次为2h，收集提取液；

（2）合并提取液，滤过，浓缩后，采用AB-8树脂吸附分离，以4BV/h上柱吸附,先用5BV去离子水以2BV/h洗去杂质,再用6BV的体积浓度30%乙醇以2BV/h上柱进行解吸，得到高含量紫芪洗脱液，洗脱液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.16～1.22的黄褐色流浸膏；

（3）再以质量份数计，称取无水葡萄糖1～2份、白色淀维粉4～5份，依次与流浸膏充分混合均匀后，分成等量两部分，一部分中加入枸橼酸湿法或喷雾干燥法制粒制成酸性颗粒，干燥备用；另一部分中加入弱碱性材料碳酸氢钠湿法或喷雾干燥法制粒制成碱性颗粒，干燥备用；最后，再将酸性颗粒和碱性颗粒混合均匀，整粒，得到兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）本发明提供的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，用于防治禽新城疫、传染性法氏囊病，能有效抑制畜禽细菌、病毒性疾病蔓延和扩散，适用于禽新城疫、传染性法氏囊病的预防及治疗，兼有药物与营养剂双重功能，可作为免疫增强剂和促进剂，增强畜禽机体免疫力，提高防病抗病力。与抗生素及其他药物治疗禽新城疫病产生药物残留、产生的耐药性相比，安全性显著提升、效果确切；其推广应用，可有效降低禽肉、蛋产品中药物残留的风险。

（2）本发明提供的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物的制备方法，精选紫锥菊、黄芪、黄芪、金银花及连翘中药材，采用提取分离技术，结合现代化泡腾颗粒制剂技术，制备而成兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物（简称紫芪泡腾颗粒）。提前喂服本发明药物可显著降低新城疫发病率，其保护率达89.6%；新城疫病鸡服用24h后，临床症状基本消失，治疗组疗效极显著优于感染组。

（3）本发明提供兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，为纯中药泡腾颗粒药物，用于防治禽新城疫、传染性法氏囊病，可混饲或混饮给药，与传统的中药散剂相比，具有使用方便、作用迅速、生物利用度高等特点。

（4）本发明兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物的制备方法，首次分离纯化得到5%紫锥菊菊苣酸、85%高含量黄芪多糖有效活性成分，并运用现代制剂缓释控释技术，添加泡腾辅药成分，制备出的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物为紫锥菊黄芪多糖缓释控释泡腾颗粒。

（5）本发明有效的建立了紫芪泡腾颗粒的工艺筛选模型和质量控制检测体系，获得工艺稳定、质量可控的中兽药新制剂。

（6）本发明在传统中兽药制剂的基础上，优选对畜禽免疫力及呼吸道疾病疗效显著的中药材，利用药物缓释控释技术，开发出兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，为中兽药现代化和绿色养殖提供便利。

具体实施方式

本发明提供的一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，采用具有清热解毒、宣肺平喘、燥湿止痢、提升免疫力的中药组方，采用水提柱分离醇洗脱法，在高效提取有效成分的同时，减少纤维素、鞣质、色素等无效成分对成品溶解性能的影响；最后制成溶解性好、便于混饮给药的泡腾颗粒药物。下面结合具体的组方及其制备过程，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

本实施例的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，由下述质量配比的原料药制成：紫锥菊40份，黄芪40份，黄芩17.5份，金银花17.5份，连翘10份。

具体操作步骤：

（1）按照质量配比，将紫锥菊、黄芪、黄芩、金银花和连翘5味中药饮片，混合均匀，加入总质量12倍的水常压下煎煮提取2小时，收集煎煮提取的煎液，然后再加入同样质量的水再煎煮提取2次，收集提取液。

（2）合并提取液，滤过，浓缩，采用AB-8树脂吸附分离，以4BV/h上柱吸附,先用5BV去离子水以2BV/h洗去杂质,再用6BV的体积浓度30%乙醇以2BV/h上柱进行解吸，得到高含量紫芪洗脱液，洗脱液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.19的流浸膏，产品为黄褐色。

（3）再以质量份数计，称取无水葡萄糖2份、白色淀维粉4份，依次与流浸膏充分混合均匀后，分成等量两部分，一部分中加入枸橼酸湿法或喷雾干燥法制粒制成酸性颗粒，干燥备用；另一部分中加入弱碱性材料碳酸氢钠湿法或喷雾干燥法制粒制成碱性颗粒，干燥备用；最后，将两种干颗粒混合均匀，整粒（干颗粒水分≤2%），得到用于防治禽新城疫、传染性法氏囊病的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物。

实施例2

本实施例的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，由下述质量配比的原料药制成：紫锥菊45份，黄芪45份，黄芩20份，金银花20份，连翘12份。

具体操作步骤：

（1）按照质量配比，将紫锥菊、黄芪、黄芩、金银花和连翘5味中药材粉碎后，混合均匀，加入总质量10倍的水常压下煎煮提取2小时，收集煎煮提取的煎液，然后再加入同样质量的水再煎煮提取2次，收集提取液。

（2）合并提取液，滤过，浓缩，采用AB-8树脂吸附分离，以4BV/h上柱吸附,先用5BV去离子水以2BV/h洗去杂质,再用6BV的体积比30%乙醇以2BV/h上柱进行解吸，得到高含量紫芪洗脱液，洗脱液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.20的流浸膏，产品为黄褐色流浸膏。

（3）再以质量份数计，称取无水葡萄糖2份、白色淀维粉5份，依次与流浸膏充分混合均匀后，分成等量两部分，一部分中加入枸橼酸湿法或喷雾干燥法制粒制成酸性颗粒，干燥备用；另一部分中加入弱碱性材料碳酸氢钠湿法或喷雾干燥法制粒制成碱性颗粒，干燥备用；最后，将两种干颗粒混合均匀，整粒（干颗粒水分≤2%），得到用于防治禽新城疫、传染性法氏囊病的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物。

实施例3

本实施例的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，由下述质量配比的原料药制成：紫锥菊32份，黄芪45份，黄芩10份，金银花20份，连翘15份。

具体操作步骤：

（1）按照质量配比，将紫锥菊、黄芪、黄芩、金银花和连翘5味中药材粉碎后，混合均匀，加入总质量12倍的水常压下煎煮提取1.5小时，收集煎煮提取的煎液，然后再加入同样质量的水再煎煮提取2次，收集提取液。

（2）合并提取液，滤过，浓缩，采用AB-8树脂吸附分离，以4BV/h上柱吸附,先用5BV去离子水以2BV/h洗去杂质,再用6BV的30%乙醇以2BV/h上柱进行解吸，得到高含量紫芪洗脱液，洗脱液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.18的浸膏，产品为黄褐色流浸膏。

（3）再以质量份数计，称取无水葡萄糖1份、白色淀维粉5份，依次与流浸膏充分混合均匀后，分成等量两部分，一部分中加入枸橼酸湿法或喷雾干燥法制粒制成酸性颗粒，干燥备用；另一部分中加入弱碱性材料碳酸氢钠湿法或喷雾干燥法制粒制成碱性颗粒，干燥备用；最后，将两种干颗粒混合均匀，整粒（干颗粒水分≤2%），得到用于防治禽新城疫、传染性法氏囊病的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物。

实施例4

本实施例的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物药物，由下述质量配比的原料药制成：紫锥菊48份，黄芪40份，黄芩12份，金银花25份，连翘8份。

（1）按照质量配比，将紫锥菊、黄芪、黄芩、金银花和连翘5味中药材粉碎后，混合均匀，加入总质量12倍的水常压下煎煮提取2.5小时，收集煎煮提取的煎液，然后再加入同样质量的水再煎煮提取2次，收集提取液。

（2）合并提取液，滤过，浓缩，采用AB-8树脂吸附分离，以4BV/h上柱吸附,先用5BV去离子水以2BV/h洗去杂质,再用6BV的体积浓度30%乙醇以2BV/h上柱进行解吸，得到高含量紫芪洗脱液，洗脱液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.21的流浸膏，产品为黄褐色流浸膏。

（3）再以质量份数计，称取无水葡萄糖1份、白色淀维粉4份，依次与流浸膏充分混合均匀后，分成等量两部分，一部分中加入枸橼酸湿法或喷雾干燥法制粒制成酸性颗粒，干燥备用；另一部分中加入弱碱性材料碳酸氢钠湿法或喷雾干燥法制粒制成碱性颗粒，干燥备用；最后，将两种干颗粒混合均匀，整粒（干颗粒水分≤2%），得到用于防治禽新城疫、传染性法氏囊病的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物。

本发明兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物（紫芪泡腾颗粒药物）可用于动物免疫抑制、免疫缺陷及病毒性感染疾病，适用于禽新城疫病预防及治疗，兼有药物与营养剂双重功能，可作为免疫增强剂和促进剂，增强畜禽机体免疫力，提高防病抗病力。由于紫锥菊含有丰富的菊苣酸、多酚，咖啡酸衍生物和多糖，提高非特异性T细胞的活性，产生干扰素，促进淋巴细胞的分泌，通过增加粒细胞与白细胞的数目而发挥作用，提高单核细胞与中性病毒的趋药性而产生溶菌作用，能有效抑制畜禽细菌、病毒性疾病蔓延和扩散，具有较强的抗菌抗病毒作用。黄芪含丰富黄芪多糖、皂甙类、黄酮类、氨基酸类有效成分，其中黄芪多糖可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗应激、抗氧化等作用，可在兽药、畜牧养殖中广泛应用。

以下通过临床动物试验来说明本发明的有益效果，通过实验对制剂稳定性、安全性进行考察。

试验1  本发明药物体外抗肉鸡新城疫病毒试验

1 实验方法

1.1 材料

鸡胚:9～11d低免疫鸡胚，购自西安畜牧公司；种毒:鸡新城疫病毒株，由西北农林科技大学禽病教研室保存。

1.2 试验药物

紫芪泡腾颗粒（按实施例1法制备，自制）；芪贞增免颗粒（市售）；芪板青颗粒（市售）；

1.3 药物细胞毒性测定（MTT法）

鸡胚成纤维细胞（CEF）制备：选择9-10日龄发育良好的SPF胚，用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。再用PH7.2的PBS冲洗两次。用镊子捏成小块（2-3mm3）,用PH7.2的PBS冲洗两次。鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。期间配制细胞培养液，组成为：MEM培养基、2%双抗、7.5%碳酸氢钠加入2%、6%牛血清、3%谷氨酰胺加入1%。消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。将细胞分散液倒入带6～8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。按上述方法操作重虑一遍。计数，每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个，分装，置于37℃含5%CO₂(二氧化碳）培养箱中培养24～48h。

待上述制备鸡胚成纤维细胞（CEF）长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔加入100μL。置于5%CO₂（二氧化碳）培养箱中培养24h～48h，使细胞生长成单层备用。将药物用细胞培养液连续对倍稀释(原液1：5、1：10、1：20、1：40……1：640)。稀释后再把不同浓度的药物加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μL，每个浓度重复4孔，同时设立细胞对照孔(不加药，只加培养液)，再每孔补加100μL细胞培养液，置37℃，5%CO₂培养箱内培养。培养48h后，弃培养液上清，每孔加入含5mg/mL噻唑蓝（MTT）的细胞培养基（DMEM）培养液20uL，继续培养1h，弃MTT上清，每孔加入溶解液二甲基亚砜（DMSO）150uL，振荡5～10分钟，待结晶完全溶解后，置酶标仪570nm处测定OD值（OD值为每孔在570nm处与630nm处吸光度的差值），参考波长为630nm,并根据公式计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。

细胞存活率(%)=试验孔的OD值/对照孔的OD值×100

1.4 细胞半数感染量(TCID₅₀)测定

将培养成单层的细胞传至96孔细胞培养板上，置于5%CO₂孵箱中培养24h。将病毒液用维持液（含2%小牛血清的MEM营养液）10倍连续稀释(10^-1…10^-8)。将培养成单层的CEF各孔的培养液弃去，每孔洗涤2次，各孔加入不同浓度的病毒液100μL，37℃吸附1.5h，各孔再补加100μL维持液（含2%犊牛血清的MEM营养液），每个浓度4个重复，设正常细胞对照孔。逐日观察各孔细胞病变(CPE)，连续观察7d，记录CPE情况。

1.5 抗鸡新城疫病毒（NDV）药效测定

1.5.1 预防组

弃去96孔细胞培养板上已长满的CEF上清液，试验选用最大无毒浓度（TD0）药液，用维持液倍比稀释7个浓度，取每个浓度药液100μL作用1h，每孔再加入10TCID50（细胞半数感染量）的NDV100μL，吸附1.5h，每个浓度4个重复。并设立细胞对照、病毒对照。置于37℃，5%CO₂培养箱中培养48h后，弃上清液，用MTT法测定细胞OD值，判定不出现细胞病变的药物最高稀释倍数。

1.5.2 治疗组

弃去单层CEF细胞上清液后，每孔加入10TCID₅₀的NDV100μL，吸附1.5h，弃去病毒液。已感染病毒的细胞孔内加入无毒范围内各稀释度药物100μL，每个浓度4个重复。各孔补加0.1mL维持液。置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。其他同上。通过OD值计算出抑制指数:

1.6 结果处理

根据计算出的细胞存活率和病毒抑制率，用统计学软件SPSS13.0Probit回归法，计算药物的半数毒性浓度(TC₅₀)和半数有效浓度(IC₅₀)，根据公式计算药物的治疗指数:药物的治疗指数(TI)=TC₅₀/IC₅₀

2 实验结果

2.1 药物对细胞毒性的测定结果

表1 不同药物浓度时细胞的存活率(%)

A:为芪板青颗粒组；B:为芪贞增免颗粒组；

C:紫芪泡腾颗粒（按实施例1法制备，自制）

根据公式计算细胞存活率和TC₅₀，药物对CEF细胞的毒性表现为:细胞折光性增加、粘连、皱缩、脱落、吸光值明显下降。由上表可知各组药物在93.75mg/mL浓度范围内未见明显的细胞毒性，随着药液浓度的升高对细胞毒性增大，存活细胞越少。经回归分析，药物浓度与活细胞存在关系，P<0.05。芪板青颗粒组、芪贞增免颗粒组和紫芪泡腾颗粒组的半数毒性浓度分别为120.3mg/mL、96.9mg/mL、87.3mg/mL。

2.2 新城疫病毒TCID₅₀测定结果

表2 新城疫病毒TCID₅₀测定

Reed-Muech公式计算:使半数细胞出现CPE的剂量在10^-4-10^-5之间，距离

=0.7lgTCID₅₀=-4+0.7(-1)=-4.7

TCID₅₀=10^-4.7，也就是说病毒的10^-4.7的浓度以0.1mL接种一组细胞孔后，

使50%细胞感染，即有50%细胞病变的可能性。

2.3 药物对新城疫病毒增殖的抑制作用

2.3.1 预防组对新城疫病毒增殖的影响（见表3）

表3 预防组对新城疫病毒增殖的抑制作用

由上表可以看出，芪板青颗粒组（A）、芪贞增免颗粒组（B）、紫芪泡腾颗粒组（C）分别在46.88mg/mL、23.44mg/mL、11.72mg/mL时显示抗病毒作用，随着药物浓度的增加抗病毒活性增强，但芪板青颗粒组和芪贞增免颗粒组当到达最高浓度时仍不能完全抑制病毒，而紫芪泡腾颗粒组在93.75mg/mL时即可抑制病毒增殖率到达92.3%。紫芪泡腾颗粒表现出明显的抗病毒作用，且效果明显优于芪板青颗粒和芪贞增免颗粒。

2.3.2 治疗组对新城疫病毒增殖的影响（见表4）

表4 治疗组对新城疫病毒增殖的抑制作用(%)

表4可以看出，芪板青颗粒(A组)、芪贞增免颗粒(B组)、紫芪泡腾颗粒

组(C组)分别在46.88mg/mL、23.44mg/mL、11.72mg/mL时显示抑制病毒的作用，而且抑制病毒的效果与药物浓度成明显的正相关。紫芪泡腾颗粒组在最高浓度时抑制病毒增殖率到达93.6%，表现出明显的抗病毒作用，紫芪泡腾颗粒组抗病毒作用明显优于芪板青颗粒组和芪贞增免颗粒组。药物在最高浓度时对病毒的抑制率最大，经回归分析，药物浓度与病毒抑制率之间呈线性关系(P<0.05)，药物浓度越大，抑制病毒繁殖效果越好，存留细胞越多，其OD值越高。

3、试验结果分析

3.1 紫锥菊、黄芪、金银花、黄芩对NDV有直接灭活作用，阻止NDV对细胞的吸附以及NDV的增殖。本试验结果初步提示各试验组均对NDV有一定的抑制作用，显示了一定的抗病毒活性。

3.2 本试验结果显示，紫芪泡腾颗粒组的抑制病毒作用明显优于芪板青颗粒组和芪贞增免颗粒组，差异显著(P<0.05)。紫芪泡腾颗粒对NDV有一定杀灭作用，能够抑制NDV的复制，阻止NDV对细胞的吸附作用。

试验2 本发明药物对禽法氏囊病的治疗效果试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

2012年9月，在西安某养殖场600只56日龄，病程4天，发病500多只，死亡65只。

1.1.2 试验药品

紫芪泡腾颗粒（按实施例1法制备，自制）；

芪贞增免颗粒（市售）；

1.2 方法

1.2.1 疾病诊断

对发病鸡只进行临床诊断，病鸡主要表现为精神沉郁，低头缩颈，食欲减退，饮欲增加，羽毛松乱，无光泽，蹲伏在一起，不愿走动，排灰色或黄褐色稀便，个别鸡粪便带血。剖检可见气管淤血，胸部、大腿内侧肌肉有条纹状出血，腺胃基部点状出血，肌胃与腺胃交界处出现糜烂性溃疡；十二指肠、盲肠、直肠均有出血，肾肿大，淤血；输尿管可见明显的尿酸盐沉积；法氏囊显红褐色，呈未成熟葡萄样肿大，剖开法氏囊，腔内有黄白色干酪样物，褶皱肿胀，表面有密集针尖状出血点，脾脏轻度肿大，表面有坏死灶，肝脏呈暗褐色。

1.2.2 试验方法

试验分组：将健康鸡分为1组；将初步确诊后的病鸡随机分为5组，每组100只。A组：紫芪泡腾颗粒高剂量组（药物浓度：2000mg/L）；B组：紫芪泡腾颗粒中剂量组（药物浓度：1000mg/L）；C组：紫芪泡腾颗粒低剂量组（药物浓度：500mg/L）；D组：芪贞增免颗粒对照组（药物浓度：1000mg/L）；E组：健康对照组。将溶解好的药液给鸡自由饮用，连用5d后观察患鸡治愈情况。

1.2.3 结果指标评价指标

治愈率：试验期间经饮水给药后精神好转，鸡法氏囊病临床症状没有出现，判定为治愈；根据治愈鸡只数计算治愈率。

有效率：试验鸡在用药后的精神状态典型好转，但仍出现鸡法氏囊病的症状均属有效；根据存活鸡只数计算有效率。

1.2.4 数据处理

采用SPSS软件对试验数据进行分析和处理。

2 结果与分析

表1 药物对鸡法氏囊病的治疗效果

2.1 药效治疗结果与分析

紫芪泡腾颗粒对鸡法氏囊病的治疗效果表1。紫芪泡腾颗粒高、中、低剂量组治疗鸡法氏囊病的治愈率分别为90%、88%和72%，总有效率分别为100%、98%和89%；芪贞增免颗粒组的治愈率为74%，有效率为91%。χ²检验结果显示，在治愈率上，紫芪泡腾颗粒高剂量组和中剂量组对鸡法氏囊病的治愈率差异不显著（χ²=0.224，P＜0.05）；高、中剂量组的治愈率分别与低剂量组比较差异极显著（χ²=8.678，P＜0.01；χ²=8.000，P＜0.01），高剂量组和芪贞增免颗粒组相比差异极显著（χ²=8.682，P＜0.01）；中剂量组与芪贞增免颗粒组相比差异显著（χ²=6.373，P＜0.05）。在有效率上，紫芪泡腾颗粒高剂量组和中剂量组对鸡法氏囊病的治愈率差异不显著（χ²=0.205，P＜0.05）；高剂量组和中剂量与低剂量组相比差异极显著（χ²=11.656，P＜0.01；χ²=6.964，P＜0.01）；中剂量组与芪贞增免颗粒组差异显著（χ²=4.724，P＜0.05）。试验结果表明，高、中剂量紫芪泡腾颗粒对鸡法氏囊病的治疗效果均显著优于低剂量的紫芪泡腾颗粒和芪贞增免颗粒组。

试验3 本发明药物对鸡免疫增强作用试验

1 试验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

30日龄非免疫白公鸡90只，随机分成3组，每组30只，采用5层育雏笼饲养，自由饮水和采食。

1.1.2 试验药品及饲料

紫芪泡腾颗粒(按实施例1法制备，自制)；

左旋咪唑（西安智诚生物科技有限公司提供）；

鸡新城疫Clone30 IV苗（英特威公司提供）。

白雏鸡全价料（陕西正大饲料有限公司提供）。

1.1.3 试剂与设备

试剂RPMI1640营养液（HVO公司产品：ConA）；MTT（噻唑蓝）、淋巴细胞分离液、10%小牛血清、6%台盼蓝、肝素钠；紫外可见分光光度计、细胞培养板、CO₂培养箱、倒置显微镜。

1.2 试验方法

试验分3组。即紫芪泡腾颗粒试验组、左旋咪唑对照组、空白对照组。紫芪泡腾颗粒试验组按每L水添加紫芪泡腾颗粒1g自由饮水3天，左旋咪唑对照组按1%自由饮水3天，空白对照组饮自来水，不给药。在用药3天后用2羽份/只Cloe30，滴鼻、点眼。

各组随机抽取10只鸡于免疫0、7、14、21、28天翅静脉无菌采血，分离血清，低温冰箱保存，用于鸡新城疫抗体测定。对分离的血清用微量血液凝集抑制试验进行HI效价测定。

无菌采鸡心脏血10ml,加肝素1ml抗凝，置于超净工作台内，再加入10ml含10%小牛血清的RPMI1640完全营养液，混匀后分为5部分，每份4ml。血样沿离心管管壁小心加于4ml淋巴细胞分离液上层，2500r/min离心15min,吸取白色淋巴细胞层，移入另一无菌离心管，加RPMI1640完全营养液2-3ml,吹散淋巴细胞，2500r/min离心15min,淋巴细胞再用RPMI1640完全营养液洗涤2遍，离心。0.6%台盼蓝染色，活淋巴细胞计数，无血清RPMI1640完全营养液调整细胞浓度为4×10⁶个/ml。

取RPMI1640完全营养液（含10%小牛血清）加入无菌细胞培养板，每孔50uL；再加前项淋巴细胞悬液50uL/孔，合计每孔100uL；另以无细胞RPMI1640完全营养液调零。细胞培养板置于CO2培养箱培养66小时，取出，置于超净工作台内，加浓度为5mg/mlMTT15uL/孔，继续培养4小时后取出，置于超净工作台内，加10%SDS-0.01mol/L HCL100ul/孔，继续培养2小时后取出，室温放置5min,测定OD570nm的吸光值。

免疫28天后各组随机捕杀10只鸡，采用器官重量法进行免疫器官（腔上囊、胸腺和脾脏）指数的测定。

1.3 试验结果处理

试验数据采用SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 鸡新城疫抗体效价检测

由表1可看出，受试药物组7、14、28天新城疫抗体效价显著高于对照药物组和空白对照组（P<0.05）；对照药物组与空白对照组新城疫抗体效价差异不显著（P>0.05）；说明紫芪泡腾颗粒对鸡的体液免疫有增强作用。

表1 本发明对鸡新城疫抗体效价的影响

注：凡右上角标注相同字母者，差异不显著，标注不同字母者，差异显著。下同。

2.2 外周血T细胞测定

由表2结果表明，受试药物组与对照药物组均能显著提高淋巴细胞转化率（P<0.05)，增强细胞免疫功能，提高抗病能力。

表2 本发明对鸡T细胞总数的影响（OD570nm的光吸值）

2.3 免疫器官指数的测定

受试药物组腔上囊、脾脏、胸腺指数均高于空白对照组与对照药物组（P<0.05），与上述结论是一致的，即具有较强的免疫增强功能。

表3 本发明对鸡免疫器官指数的影响

2.4 结论

本发明紫芪泡腾颗粒对鸡新城疫体液免疫有增强作用，可明显促进淋巴细胞的增值与发育，显著提高鸡腔上囊、胸腺和脾脏指数，促进免疫器官的发育，从而增强机体的特异性与非特异性免疫功能，且效果强于左旋咪唑对照组。

以上试验结果表明：本发明对改善家禽机体免疫力，提高机体抗病力、防治家禽病毒性呼吸道疾病等疗效确切，明显优于市售一般产品，可用于临床家禽法氏囊病、新城疫等病毒性疾病的预防和治疗，同时还可用于提升家禽机体免疫机能，减少发病率，降低养殖风险及成本。

试验4 本发明紫芪泡腾颗粒的稳定性试验

1、温度加速试验

将紫芪泡腾颗粒（3个批次)按试生产包装，放在盛饱和氯化钠溶液的密闭干燥器中(相对湿度约为75%)，再将干燥器置于隔水式电热恒温培养箱中维持40℃温度。在温度加速试验6个月的试验期内每个月取样考察颗粒性状、粒度、溶解性、水分、鉴别、有效成分含量等。

2、长期稳定性试验

将紫芪泡腾颗粒制剂（3个批次)按试生产包装，置于相对湿度约为65%，环境温度为30℃，阴凉、干燥、避光处保存12月，每隔一个月取样考察颗粒性状、粒度、溶解性、水分、鉴别、有效成分含量等。

试验结果与分析讨论

3、温度加速试验结果

从第3个月起有效成分含量开始略微下降，但含量下降并不明显，范围在0.1%～0.5%之间；从第7个月开始，含量下降幅度较大，达1.3%～2.3%，接近前四个月的总和，但总的下降范围在允许的范围之内；其余指标没有明显的变化，未见颗粒性状、粒度、溶解性、水分变化。

4、长期稳定性试验结果

紫芪泡腾颗粒比较稳定，在室温(大约16℃～25℃范围)、避光、阴凉干燥的环境下，其含量下降很少，在试验期的18个月菊苣酸、黄芪多糖含量下降范围在0.2%～1.3%。性状没有可见的变化，棕黄色颗粒，气香，味甘。

5、评价结论

将紫芪泡腾颗粒按试生产产品包装，在40℃恒温下观察6个月、置于阴凉、干燥、避光处保存18个月，其颗粒性状、粒度、溶解性、干燥失重、菊苣酸、黄芪多糖含量均未见显著变化，说明紫芪泡腾颗粒高温（40℃）保存半年或室温长期保存（1年半）时稳定性良好。

试验5 本发明紫芪泡腾颗粒的急性毒性试验

1、试验方法

首先通过预实验，找出引起小鼠100%和0死亡的紫芪泡腾颗粒药物量范围，为正式试验提供依据。正式试验，根据预试验结果设计正式试验。具体方法如下：

将20只大鼠和20只小鼠，雌雄各半，禁食12h后分别称重。之后经口灌服紫芪泡腾颗粒水溶液，24h内分2次灌胃，使大鼠和小鼠经口灌服的最终剂量达到5000mg/kgb.w。

经口染毒当天每次给予受试物后持续观察30min，并最后一次给药结束后第2h再观察一次，之后每天观察1次，仔细记录动物的中毒表现和特点，毒性反应出现和消失的时间、死亡时间。连续观察14天。观察期内动物自由采食和饮水。观察期结束后将所有存活鼠处死，进行眼观病理学检查。

2、试验结果

表1-1 本发明药物急性毒性试验结果

当大鼠和小鼠24h内经口染毒剂量达到5000mg/kgb.w时，在试验观察期内所有鼠均存活，且采食、饮水、排便等正常，未出现中毒反应。观察期结束后处死存活鼠，眼观病理学检查亦均未发现明显可见的病理变化。结果表明：大小鼠对紫芪泡腾颗粒的毒性没有差异，紫芪泡腾颗粒大小鼠经口染毒，LD50大于5000mg/kg。

3、讨论

综上所述，在试验条件下，未发现本发明紫芪泡腾颗粒对大鼠的生长发育产生影响，本试验结果表明，紫芪泡腾颗粒性质稳定，使用安全范围大，属于微毒级药物，适合口服给药，完全可用于临床。

Claims (4)

1.一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，其特征在于，包括以下质量配比的原料药：紫锥菊30～50份，黄芪30～45份，黄芩10～25份，金银花10～25份，连翘5～15份。

2.如权利要求1所述的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，其特征在于，紫锥菊30～50份，黄芪30～40份，黄芩16～20份，金银花15～20份，连翘8～12份。

3.如权利要求1所述的兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物，其特征在于，紫锥菊40份，黄芪40份，黄芩15份，金银花15份，连翘10份。

4.一种兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以质量份数计，称取紫锥菊30～50份，黄芪30～40份，黄芩16～20份，金银花15～20份，连翘8～12份；粉碎后过60目筛，以1:12(m/v)的料液比于80℃下回流水提取3次,每次为2h，收集提取液；

（2）合并提取液，滤过，浓缩后，采用AB-8树脂吸附分离，以4BV/h上柱吸附,先用5BV去离子水以2BV/h洗去杂质,再用6BV的体积浓度30%乙醇以2BV/h上柱进行解吸，得到高含量紫芪洗脱液，洗脱液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.16～1.22的黄褐色流浸膏；

（3）再以质量份数计，称取无水葡萄糖1～2份、白色淀维粉4～5份，依次与流浸膏充分混合均匀后，分成等量两部分，一部分中加入枸橼酸湿法或喷雾干燥法制粒制成酸性颗粒，干燥备用；另一部分中加入弱碱性材料碳酸氢钠湿法或喷雾干燥法制粒制成碱性颗粒，干燥备用；最后，再将酸性颗粒和碱性颗粒混合均匀，整粒，得到兽用抗病毒中药紫芪泡腾颗粒药物。