CN103743910B - Ctbs蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，CTBS是啮齿类动物精子上特有的精卵结合受体，CTBS蛋白仅在啮齿类动物的精子上具有特异性表达，在人的精子上并不表达该蛋白，且CTBS抗体能抑制小鼠的精卵结合。所筛选到的精卵结合抑制剂为地喹氯铵，其半抑制常数＜100nM。本发明采用地喹氯铵作为鼠类的生育控制药物进行使用，能有效的控制啮齿类动物的精卵结合，达到控制鼠类的种群数量，实现无需农药即可控制鼠害目的，且其天敌食用该药物却不会产生危害。

Description

CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用。

背景技术

地喹氯铵(Dequaliniumchloride，CAS#522-51-0)，作为一种PKC抑制剂作为抗癌药物进行使用，其IC50为7-18μM，同时它也是一种选择性蜂毒明肽敏感型钾离子通道阻断剂，其IC50为1.1μM^[1,2，3,4]。近年来，地喹氯铵作为一种阳离子表面活性剂用于非抗生素类的抗菌药物(药名为“克菌定”)。最近，发现地喹氯铵还可在纳摩尔水平上抑制微生物来源的几丁质水解酶的活性^[5]。地喹氯铵对人体的毒性甚微，不影响人类的生殖，对眼和皮肤有刺激作用。对小鼠的致死量为：口服150-1000mg/kg体重，皮下注射70mg/kg体重，静脉注射1.9mg/kg体重；对兔子和狗的口服致死量为500mg/kg体重(MSDS)。

而二-N-乙酰壳二糖酶，即Di-N-acetylchitobiase(简称CTBS)是几丁质水解酶的一种，在哺乳动物中，只在啮齿类和人类体内的肝脏有表达^[6，7，8]。

物种的生殖隔离是一种普遍的自然现象，卵子透明带上的碳水化合物与精子上蛋白质的相互作用是其中的机制之一。有报道表明，寡糖LewisX能结合到小鼠精子，并可特异地抑制小鼠的体外受精，提示其精子上识别LewisX的蛋白可能参与了小鼠的生育隔离^[9]，但仅是一种猜测。

鼠害是指鼠类对农业等生产造成的危害。鼠类属哺乳纲(Mam-malia)啮齿日(Rodentia)动物，共有1600多种。鼠类繁殖次数多，孕期短，产仔率高，性成熟快，数量能在短期内急剧增加；它的适应性很强，除南极大陆外，在世界各地的地面、地下、树上、水中都能生存，不论平原、高山、森林、草原以至沙漠地区都有其踪迹，常对农业等生产酿成巨大灾害。

因此急需提供一种能控制鼠类生育的药物，尤其是抑制鼠类的精卵结合的抑制剂，并且该抑制剂能在野外抑制鼠害且其天敌食用无害，无需采用农药对鼠害进行抑制。

本发明参考文献如下：

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发明内容

本发明的目的在于提供一种CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，并筛选到一种能抑制鼠类的精卵结合的地喹氯铵抑制剂，该抑制剂可用于控制鼠类的种群数量，从而达到无需采用农药即可控制鼠害的效果，并且鼠类的天敌食用该药物无害。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用。

上述的CTBS为二-N-乙酰壳二糖酶，即Di-N-acetylchitobiase，简称为CTBS。

我们经研究发现CTBS是啮齿类动物精子上特有的精卵结合受体，CTBS仅在啮齿类动物的精子上表达，并且CTBS抗体可以抑制小鼠的体外授精，而在人的精子上并不表达这一蛋白。

经筛选获得的抑制剂地喹氯铵通过抑制小鼠的精卵结合可以有效地抑制小鼠的体外受精，而对人体的毒性作用甚微。经研究发现，所述地喹氯铵是所述鼠类的精卵结合中精子上特异性表达的受体蛋白CTBS抑制剂，CTBS是鼠类的精卵结合中必不可少的蛋白，因此将地喹氯铵作为鼠类的生育控制药物进行使用，并且地喹氯铵可以抑制小鼠的体外受精，所述抑制剂地喹氯铵与CTBS结合的亲和力强，抑制鼠类的精卵结合的活性高，实验表明其抑制精卵结合的半抑制常数＜100nM；进一步的，其半抑制常数是50nM。

因此，地喹氯铵作为鼠类的生育控制药物，可以用于控制鼠类的种群数量，从而达到控制鼠害的目的。

本发明采用CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点筛选精卵结合抑制剂，经筛选获得的地喹氯铵能有效的控制啮齿类动物的精卵结合，达到控制鼠类的种群数量，实现无需农药即可控制鼠害目的，且其天敌食用该药物却不会产生危害。

附图说明

图1为地喹氯铵对小鼠体外受精的抑制图。

图2A为LewisX受体的鉴定思路图。

图2B为利用LewisX探针找到的小鼠精子蛋白图。

图2C为蛋白的质谱分析图谱。

图3为CTBS的抗体抑制LewisX结合到小鼠精子的图片。

图4为LewisX在小鼠精子上的结合位置与CTBS在小鼠精子的定位结果图片。

图5A为重组的人源CTBS与小鼠卵子透明带发生相互作用的示意图。

图5B为重组的人源CTBS与小鼠卵子透明带发生相互作用的明场和荧光照片。

图5C为CTBS抗体的乳胶颗粒富集到的RFP或RFP-CTBS蛋白免疫印迹分析。

图6为CTBS抗体对小鼠精子顶体反应的诱导效应图。

图7为不同浓度的CTBS抗体抑制小鼠的体外受精图。

图8为小鼠、大鼠和人精子裂解液的蛋白印记分析图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

实施例1：

我们经实验发现CTBS在啮齿类动物的精子上表达，并且CTBS抗体可以抑制小鼠的体外授精，而在人的精子上并不表达这一蛋白。其实验方法如下：

(一)小鼠精子上CTBS的发现：

利用路易斯寡糖X(即LewisX，简写为LeX)探针鉴定到了小鼠精子上的CTBS，并证明CTBS能结合到小鼠的卵子透明带。

(1)首先对LewisX受体进行鉴定，其鉴定流程如图2A所示，包括能识别LewisX的类凝集素蛋白的鉴定流程和内源性的含有LewisX修饰的蛋白鉴定流程。其原理是将牛血清白蛋白(BSA)表面修饰LewisX制成拟糖蛋白LeX-BSA，并将该拟糖蛋白进一步修饰上紫外交联试剂[6-(生物素酰氨基)-2-(p-叠氮苯甲酰氨基)己酰氨基]乙基-1，3′-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-NHS-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azidobenzamido)-hexanoamido)ethyl-1,3′-dithiopropionate，简称Sulfo-SBED)作为LewisX探针。该探针经紫外交联到小鼠精子后形成LewisX探针-受体复合物，利用能识别LewisX的四棱莲凝集素(Lotustetragonolobusagglutinin，简称LTA)树脂来分离纯化精子细胞裂解液中的LewisX探针-受体复合物。由于小鼠精子内可能含有内源性LewisX修饰的蛋白，设置了内源性的含有LewisX修饰的蛋白鉴定流程作为对照来区分这类蛋白(对照组)。一般来说，两个流程鉴定到的差异蛋白即有可能是LewisX的受体蛋白。

(2)利用LewisX探针找到的小鼠精子上的蛋白：

利用LewisX探针找到小鼠精子蛋白，如图2B所示。将图2B中的差异条带1、2、3、4取下，用于蛋白的质谱鉴定，如图2C所示的质谱分析图，经分析，有可能与碳水化合物作用的蛋白身份如表1所示。

表1

注：表1中的第一栏为核质比，第二栏为多肽序列，第三栏为蛋白质身份。

(3)CTBS的抗体能抑制LewisX荧光探针结合到小鼠精子：

LewisX荧光探针LeX-BSA-Alexa430由LewisX的拟糖蛋白LeX-BSA加荧光基团Alexa430制备而成。如图3所示，该探针能结合到小鼠附睾尾部取出的成熟精子上(阳性对照)。抗体是由人源的CTBS重组蛋白制备的兔多克隆抗体，购自武汉三鹰生物技术有限公司。

经研究发现只有CTBS的抗体能抑制LeX-BSA-Alexa430结合到小鼠精子，如图3所示。并且，一种弱的几丁质酶抑制剂己酮可可碱(Pentoxifylline，简称PTX)也可以抑制这种结合^[10]，排除了抗体本身的空间位阻效应导致的非特异性的结合抑制。

(4)LewisX在小鼠精子上的结合位置与CTBS在小鼠精子的定位一致：

LewisX荧光探针LeX-BSA-Alexa430由LewisX的拟糖蛋白LeX-BSA加荧光基团Alexa430制备而成。该探针能结合到小鼠附睾尾部取出的成熟精子上，如图4插图所示，结合情况与先前的报道一致^[9]。抗体是由人源的CTBS重组蛋白制备的兔多克隆抗体，购自武汉三鹰生物技术有限公司。通过免疫荧光定位，我们发现LeX-BSA-Alexa430在小鼠精子上的结合位置与小鼠精子的CTBS蛋白定位一致，如图4所示。

(5)重组的人源CTBS(即rCTBS)与小鼠卵子透明带(ZP)发生的相互作用：

A.实验思路如图5A所示，将红色荧光蛋白(RFP)抗体固定到乳胶颗粒上，将表达于293细胞的重组RFP-CTBS蛋白富集到乳胶颗粒上，并加到有小鼠卵子的培养基中。如果CTBS能识别小鼠卵子透明带上的碳水化合物，小鼠透明带上将附着带红色荧光的乳胶颗粒。

B.图5B为明场(左)及红色荧光(右)照片。结果发现只富集到RFP的乳胶颗粒无法结合到小鼠的卵子透明带上(如图5B上一行所示)；而带有RFP-CTBS的乳胶颗粒可以结合到小鼠的卵子透明带上(如图5B中间一行所示)，而CTBS抗体则可以阻碍这一结合(如图5B下一行所示)。右侧的荧光照片证实了上述观察。

C.图5C为蛋白质印迹分析结果，图示结果表明，结合有RFP抗体的乳胶颗粒可以富集RFP或RFP-CTBS。其中白色箭头指的是RFP，黑色箭头指的是RFP-CTBS。

上述结果证明了重组的人源CTBS可以与小鼠卵子透明带发生相互作用。

(二)CTBS参与了小鼠的受精过程。

(1)CTBS抗体对小鼠精子顶体反应的诱导效应：

采用0-30ug/ml之间不同浓度的CTBS抗体诱导小鼠精子的顶体反应，如图6所示，结果证明CTBS抗体可以诱导小鼠精子的顶体反应，这与现有技术报道的小鼠精子上精卵结合有关的受体蛋白所表现出的特点是一致的^[11]。

(2)不同浓度的CTBS抗体抑制小鼠的体外受精：

采用不同浓度的CTBS抗体抑制小鼠的体外受精，如图7所示，结果证明CTBS抗体能很好的抑制小鼠的体外受精，进一步表明小鼠精子上的CTBS的确与小鼠的精卵结合有关。

(三)小鼠、大鼠和人的精子裂解液的蛋白印记分析。

对小鼠、大鼠和人的精子裂解液进行蛋白印记分析，精子裂解液的上样量为小鼠50ug，大鼠60ug，人60ug。抗体是由人源的CTBS重组蛋白制备的兔多克隆抗体，购自武汉三鹰生物技术有限公司；人细胞株Hela细胞裂解液的上样量为10ug；使用阿尔法一微管蛋白(α-tubulin)作为蛋白上样量的参考。结果如图8所示，表明CTBS抗体对人源的CTBS有很高的灵敏度，进一步证明了CTBS不在人精子上表达，而只在啮齿类动物的精子上有表达。

实施例2：地喹氯铵作为抑制小鼠精卵结合的抑制剂实验

将地喹氯铵作为抑制小鼠精卵结合的抑制剂，采用CTBS不同浓度的每个剂量实验用小鼠卵＞50个，重复3次，每个剂量总计用卵＞150个，其实验结果如图1所示，其半抑制常数在50nM，表明地喹氯铵可以很好的抑制小鼠的体外受精。

综上实施例1和实施例2所述的所有结果表明，CTBS是啮齿类动物精子上特异性表达的受体蛋白，其参与了精卵结合的生理过程，且CTBS抗体能抑制小鼠的体外受精。地喹氯铵作为鼠类的生育控制药物可以很好的抑制小鼠的体外受精，实验表明其半抑制常数在50nM。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.CTBS蛋白作为啮齿类动物精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的CTBS蛋白作为啮齿类动物精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，其特征在于，CTBS是啮齿类动物精子上特有的精卵结合受体，CTBS蛋白仅在啮齿类动物的精子上具有特异性表达，在人的精子上并不表达该蛋白，且CTBS抗体能抑制小鼠的精卵结合。

3.如权利要求1或2所述的CTBS蛋白作为啮齿类动物精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，其特征在于，所筛选到的精卵结合抑制剂为地喹氯铵；所述地喹氯铵是鼠类的精卵结合中精子上特异性表达的受体蛋白CTBS的抑制剂。

4.如权利要求3所述的CTBS蛋白作为啮齿类动物精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，其特征在于，所述地喹氯铵抑制鼠类精卵结合的半抑制常数<100nM。