CN103721255A - 共同阻断pd-1和tim-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及共同阻断PD-1和TIM-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途，具体涉及PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂及其与现有抗胃癌治疗药物在制备抗胃癌的药物组合物中的用途，该阻断剂或其与现有胃癌治疗药物的组合通过增强T细胞杀伤胃癌细胞的作用起到抗胃癌治疗作用。本发明的组合物对胃癌有显著的治疗效果，且具有毒副作用小、能与现有胃癌治疗药物协同的优点。

Description

共同阻断PD-1和TIM-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途

技术领域

本发明属于生物技术和医药领域，具体涉及一种治疗胃癌的新方法，即共同阻断PD-1和TIM-3信号通路；同时证明了该方法与现有抗胃癌治疗药物合用具有协同效果。据此，本发明提供了PD-1信号通路阻断剂和TIM-3信号通路阻断剂或其与现有抗胃癌治疗药物的联用在胃癌治疗中的应用。

背景技术

在多种小鼠肿瘤模型中有大约半数的肿瘤浸润的淋巴细胞（TumorInfiltration Lymphocytes,TILs）共表达TIM-3与PD-1，并且表现出功能的耗竭，丧失增殖和分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ这些细胞因子的能力。共同阻断PD-1和TIM-3信号通路，被发现与单独阻断PD-1或TIM-3信号通路相比，能更有效地抑制肿瘤生长。在人类癌症中，TIM-3在PD-1⁺的NY-ESO-1特异性的CD8⁺T细胞上高表达，TIM-3⁺/PD-1⁺双阳性的NY-ESO-1特异性CD8⁺T细胞比TIM-3^-/PD-1⁺和TIM-3^-/PD-1^-的NY-ESO-1特异性CD8⁺T细胞功能更加紊乱，分泌更少的IL-2、TNF和IFN-γ，阻断TIM-3信号通路能够增强NY-ESO-1特异性CD8⁺T细胞增值和分泌细胞因子的能力，共同阻断PD-1信号通路则具有显著的协同作用。

先前的一些研究只是对结肠腺肉瘤（MC38和CT26）和纤维肉瘤（WTMCA2）这3种小鼠肿瘤模型进行了研究；在人类肿瘤中的研究，也是针对在黑色素瘤患者中NY-ESO-1特异性的CD8+T细胞的研究。缺乏对人类其他癌症尤其是全球发病率第四，死亡率第二的癌症——胃癌的研究，中国胃癌发病率占全世界的42%，平均每3分钟就有一个中国人死于胃癌。面对中国严峻的胃癌形势，我们希望能够通过共同阻断免疫抑制信号通路的免疫治疗途径来治疗胃癌。

在癌症病人体内。免疫系统是一个整体的存在。通过对整体CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞的研究得出的结果将更全面真实的体现病人在接受PD-1和TIM-3信号通路阻断后能否获得有效的疗效。在黑色素瘤病人中的研究，只是研究了PD-1和TIM-3在NY-ESO-1特异性的CD8⁺T细胞上的表达水平，以及阻断PD-1和TIM-3信号通路后对NY-ESO-1特异性的CD8⁺T细胞活性的影响。先前的研究缺乏整体性的研究PD-1和TIM-3在癌症病人外周PBMC和TIL中CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞中表达水平的研究，以及缺乏在共同阻断PD-1和TIM-3信号通路后对CD4⁺和CD8⁺T细胞活性的影响的评价。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种共同阻断PD-1和TIM-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下。

PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂在制备抗胃癌的药物组合物中的用途。

进一步地，所述药物组合物包括：

1)PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂；

2)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；

和3)任选的，其它抗胃癌药物。

进一步地，所述药物组合物与其它抗胃癌药物联合使用。

进一步地，所述药物组合物包括其它抗胃癌药物。

进一步地，所述PD-1信号通路的阻断剂为抗PD-1单克隆抗体，所述TIM-3信号通路的阻断剂为抗TIM-3单克隆抗体。

进一步地，所述其它抗胃癌药物为烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素中的一种或多种。

进一步地，所述其它抗胃癌药物为顺铂、表柔比星、氟尿嘧啶中的一种或多种。

本发明进一步提供了一种药物组合物，包括：1)PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂；2)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；和3)任选的，其它抗胃癌药物。

本发明更进一步提供了一种药盒，包括：i)含有PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂的容器；ii)含有其它抗胃癌药物的容器；和任选的iii)使用说明书。

本发明还提供了一种治疗胃癌的方法，所述方法包括将本发明的药物组合物或药盒给予需要该治疗的对象，或将PD-1和TIM-3信号通路的阻断剂与其它抗胃癌药物联合给予需要该治疗的对象。

本发明的有益效果是：共同阻断PD-1和TIM-3信号通路能够有效增强T细胞杀伤胃癌细胞的作用，从而为胃癌的临床免疫治疗提供了有力依据，并为为临床用药和胃癌防治提供了新的有效途径。

附图说明

图1为本发明的实施例1的操作流程图。

图2A、图2B、图2C、图2D为本发明的实施例1的胃癌病人外周血单核细胞（PBMC），癌旁胃粘膜（AGM）和肿瘤浸润的淋巴细胞（TILs）的代表性示意图和整合示意图。

其中，整合的数据展示CTLA-4（C）和TIGIT（D）在CD3⁺，CD4⁺和CD8⁺T细胞群中的表达水平。

图3为本发明的实施例1的正常人外周血单核细胞（NDMC），胃癌病人外周血单核细胞（PBMC），癌旁胃粘膜（AGM）和肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL）的代表性示意图。

其中，数据展示PD-1和TIM-3在CD3⁺，CD4⁺和CD8⁺T细胞群中的表达水平。

图4显示了实施例1中，分别来自15个胃癌病人的肿瘤浸润的淋巴细胞，癌旁胃粘膜和外周血单核细胞（TIL，AGM和PBMC），以及9个正常人外周血单核细胞（NDMC）PD-1⁺,TIM-3⁺,PD-1⁺/TIM-3⁺,PD-1⁺/TIM-3^-,PD-1^-/TIM-3⁺和PD-1^-/TIM-3^-所占CD3⁺T细胞的百分率。

图5显示了实施例1中，分别来自15个胃癌病人的肿瘤浸润的淋巴细胞，癌旁胃粘膜和外周血单核细胞（TIL，AGM和PBMC），以及9个正常人外周血单核细胞（NDMC）的PD-1⁺,TIM-3⁺,PD-1⁺/TIM-3⁺,PD-1⁺/TIM-3^-,PD-1^-/TIM-3⁺和PD-1^-/TIM-3^-所占CD4⁺T细胞的百分率。

图6显示了实施例1中，分别来自15个胃癌病人的肿瘤浸润的淋巴细胞，癌旁胃粘膜和外周血单核细胞（TIL，AGM和PBMC），以及9个正常人外周血单核细胞（NDMC）PD-1⁺，TIM-3⁺，PD-1⁺TIM-3⁺，PD-1⁺TIM-3^-，PD-1^-TIM-3⁺和PD-1^-TIM-3^-所占CD8⁺T细胞的百分率。

图7显示了实施例1中，在15个胃癌患者的TIL，AGM和PBMC中，CD3⁺（A和B），CD4⁺（C和D）和CD8⁺（E和F）T细胞中表达PD-1和TIM-3的平均荧光强度（MFI）。p值是用Wilcoxon符号秩和检验计算得到的。

图8A、图8B、图8C、图8D显示了实施例1中，在用抗Tim-3（αTIM-3）和/或抗PD-1（αPD-1）单抗或同型对照（IgG）阻断后，CD4⁺（A和C）和CD8⁺（B和D）TIL中细胞因子的表达。

图9显示了实施例1中，用抗Tim-3（αTIM-3）和/或抗PD-1（αPD-1）单抗阻断增强TIL对AGS的细胞毒性。AGS-GFP与TIL以1:6的形式共培养4h，AGS死亡率用7-AAD染色的细胞流式方法检测。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的发明人经过研究和试验，发现共同阻断PD-1和TIM-3信号通路能够有效增强T细胞杀伤胃癌细胞的作用，PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂同时使用可明显抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡，从而达到治疗胃癌的效果，并发现该类药物与现有抗胃癌治疗药物合用具有显著的协同治疗胃癌的效果。

PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂

本文中，术语“PD-1信号通路”是指表达于激活T细胞表面的PD-1受体与其配体PDL1（B7-H1，CD274）或PDL2(B7-DC，CD273)接触后，通过磷酸化SHP2等信号通路抑制T细胞激活；术语“TIM-3信号通路”是指TIM-3会在IFN-γ分泌的T细胞表面表达上调，与其配体galectin-9结合后，使Bat-3从TIM-3受体上解离，从而抑制T细胞IFN-γ的分泌和增殖，甚至导致T细胞死亡。

本文中，术语“PD-1信号通路的阻断剂”是指可用于阻断PD-1信号通路的活性物质，术语“TIM-3信号通路的阻断剂”是指可用于阻断TIM-3信号通路的活性物质。术语“阻断剂”是指部分或全部阻止或抑制某一作用的物质。

本发明的阻断剂可为本领域中已知的活性物质，包括：PD-1单克隆抗体、TIM-3单克隆抗体、CTLA-4单克隆抗体、LAG3单克隆抗体，但不限于上述活性物质。

在本发明的一个优选实施方式中，所述阻断剂优选为抗体，更优选为单克隆抗体。所述抗体可通过本领域中已知的方法获得。

本发明的阻断剂能明显发挥的抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡的作用，与现有抗胃癌治疗的药物合用具有显著的协同效果。

其它抗胃癌药物

本发明的阻断剂不仅本身能明显发挥的抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡的作用，其还可与现有抗胃癌药物合用产生显著的协同效果。

所述其它抗胃癌药物包括：烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素。优选为顺铂、表柔比星、氟尿嘧啶。

药物组合物和药盒

本发明提供的药物组合物包括：PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂、药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂、其它抗胃癌药物。

该药物组合物可有效用于胃癌的治疗。如组合物中存在其它抗胃癌药物，则其与PD-1信号通路的阻断剂、TIM-3信号通路的阻断剂三者的摩尔比为（8–40）:1:1。

本文中，术语“药学上或免疫学上可接受的载体”是指用于保健品或药物制剂的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。适用的载体是本领域的技术人员所熟知的，本发明优选稀释剂，具体可选生理盐水（0.9%氯化钠溶液）。

本发明的组合物为液态的溶液剂。

本发明还提供了一种用于胃癌治疗的药盒，包括：容纳有PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂的容器、容纳有其它抗胃癌药物的容器、任选的使用说明书。

在本发明的实施方式中，在给予PD-1信号通路的阻断剂、TIM-3信号通路的阻断剂之前、之后或同时给予其它抗胃癌药物，以产生协同治疗效果。

施用方式

本发明的药物是通过以下哪种给药方式：胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、瘤内、局部给药，或者其他的给药方式，优选静脉注射或静脉滴注。本发明组合物的施用量，按活性物质重量计，通常为每天约0.001-5mg阻断剂/kg体重，较佳地约0.01-1/kg体重，优选0.01-0.5mg/kg体重。

本发明的优点

本发明具有如下的优点：共同阻断PD-1和TIM-3信号通路能够有效增强T细胞杀伤胃癌细胞的作用，从而为胃癌的临床免疫治疗提供了有力依据，并为为临床用药和胃癌防治提供了新的有效途径。

实施例：共同阻断PD-1和TIM-3信号通路对体外培养胃癌癌细胞的 杀伤作用

（一）材料

1.标本及细胞系

1）胃癌组织、癌旁组织和胃癌病人外周血（由苏州大学附属第一人民医院提供）；

2）正常人外周血（由苏州大学附属第二人民医院提供）；

3）胃癌细胞系（AGS来自苏州大学唐中英血液学研究中心）。

2.主要试剂与材料

1）RPMI1640，DMEM高糖培养基（HyClone公司）；

2）胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶（HyClone公司）；

3）细胞培养用青霉素-链霉素（HyClone公司）；

4）Ficoll-paque plus淋巴细胞分离液(GE healthcare公司)；

5）7-AAD染料（BD公司）；

6）LIVE/DEAD固定死细胞染料试剂盒（invitrogen公司）；

7）固定及破膜溶液和破膜/清洗缓冲液（BD公司）；

8）高尔基体阻断试剂（BD公司）；

9）Trizol裂解液（invitrogen公司）；

10）病毒包装质粒ΔR，REV和包膜质粒VSV-G；

11）PersonGen人类T淋巴细胞活化与扩增试剂盒（博生吉公司）。

3.主要仪器与设备

1）FACS AriaⅢ和FACS Caliber流式细胞仪（BD公司）；

2）超净工作台（Thermo公司）；

3）CO₂细胞培养箱（Thermo公司）；

4）低速冷冻离心机（Thermo公司）；

5）高速离心机（Beckman Coulter公司）；

4.主要抗体

1）鼠抗人CD3-FITC，鼠抗人CD4-FITC，鼠抗人CD8-FITC，鼠抗人CD4-APC，鼠抗人PD-1-APC，鼠抗人PD-1-FITC，鼠抗人TIM-3-PE，鼠抗人TIGIT-PerCP Cy5.5，鼠抗人CTLA-4-PerCP Cy5.5，鼠抗人CD8-PE Cy7，鼠抗人IL-2-PE，鼠抗人IFN-γ-PerCP Cy5.5，鼠抗人TNF-α-APC，鼠抗人CD3-PerCP Cy5.5，鼠抗人CD8-PerCP Cy5.5（BD公司）；

2）鼠抗人PD-1单克隆抗体、鼠抗人CD3单克隆抗体（博生吉公司）；

3）鼠抗人TIM-3单克隆抗体clone2E2（Millipore公司）；

4）正常小鼠IgG抗体（invitrogen公司）。

（二）方法

按照常规细胞培养方法，在37℃、5%CO₂的环境培养人细胞。包括胃癌细胞系：AGS、AGS-GFP；从胃癌病人的胃癌组织中提取的肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL）；从胃癌病人或正常人外周血中提取的T淋巴细胞。AGS、AGS-GFP、TIL、T细胞用含10%FBS DMEM培养基培养。

图1为本发明的实施例1的操作流程图，如图1所示，本实施例具体包括如下步骤：

1.建立GFP-luc阳性AGS细胞系

1.1GFP-luc慢病毒制备

1.1.1质粒转化

1）取100μl感受态细胞置于冰浴中；

2）向感受态细胞悬液中加入1ng目的质粒（GFP-luc、ΔR、REV或VSV-G），轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30min；

3）将离心管置于42℃水浴中放置60s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min；

4）向离心管中加入900μl无菌SOC培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45min（150rpm/min）；

5）将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞涂布于含有氨苄抗生素（Ampicillin，Amp）的LB固体培养基上，倒置平板，37℃培养12h。

1.1.2质粒提取

1）挑选上述LB平板上的单克隆置于3ml LB培养基（Amp）中，37℃摇床振荡培养12h（250rpm/min）；

2）12h后，吸取1ml菌液至200ml LB培养基（Amp）中，37℃摇床振荡培养18h-20h（250rpm/min）；

3）按照Axygen质粒大量提取试剂盒说明书提取质粒，用紫外分光光度计检测质粒浓度和纯度，置于-20℃保存。

1.1.3慢病毒包装

1）细胞培养：取6×10⁶个293T细胞接种于100mm细胞培养皿中，过夜，待细胞汇合度达到90%时，更换6ml新鲜DMEM培养基；

2）3h后进行包装病毒，向EP管中加入450μl无菌水，加入下述质粒，混匀；

质粒	DNA含量（μg）
		目的质粒（GFP-PDL1、GFP-luc）	10
ΔR	6.5
		REV	3.5
VSV-G	2.5

3）逐滴加入50μl CaCl₂，混匀；

4）另准备新的1.5ml EP管，加500μl2×HBS；

5）将2）3）加入4），混匀，室温静置15min，可见浑浊；

6）将上述混合液加入293T细胞中，十字法混匀，培养箱培养24h；

7）24h后更换6ml新鲜培养基，继续培养；

8）48h后收集第一批病毒，并加入6ml新鲜培养基；

9）72h后收集第二批病毒，此时可用荧光显微镜观察GFP荧光强度检测转染效率；

10）收集的病毒离心取上清，用0.22μm的滤膜过滤，分装后-80℃保存。

1.2超速离心法浓缩病毒

1）在超净工作台中，将6个金属套管和盖子喷上75%酒精，倒扣在滤纸上，风干备用。

2）收集的培养上清，1200rpm,5min（为了除去293T细胞）。

3）将离心获得的上清0.22um滤膜过滤除菌。

4）将病毒（已过滤）转移至6个超速离心管中，35ml/tube。

5）将离心管放入金属管中，拧紧盖子，25000rpm，90min。

6）将离心管小心取出，倒掉上清，倒扣在用酒精消毒的滤纸上，吸干残余培养基。

7）向离心管底部直接加入预先配制的病毒溶解液。

8）将离心管放入50ml普通离心管中，拧紧盖子，封口膜封好，涡旋振荡40-60min

9）收集管底的病毒重悬液，10000rpm，1min（除去细胞碎片）。

10）将离心获得的上清分装到冻存管中，100ul/tube，-80℃保存。

1.3病毒的滴度测定

1）第一天：24孔板铺3×10⁵个293T细胞，每孔加入1ml培养基。

2）第二天：取两个孔中细胞计数（应该得到6-8×10⁵个），取平均值。病毒以十倍梯度稀释，总体积250ul，每个稀释度转染2-3个孔。

3）第三天：向每孔中加1ml培养基。

4）第五天：流式分析293T细胞GFP阳性率，按5-10%的阳性率计算病毒滴度。

1.4GFP-luc慢病毒转染AGS细胞

5×10⁵AGS细胞悬浮于250μl DMEM培养基，24孔板中铺板，按比率（1:10）加入GFP-luc病毒，混匀。两天后根据GFP荧光分选得到AGS-GFP细胞。

2.分离并制备淋巴细胞单细胞悬液

2.1组织细胞分离

1）将一块组织放在40-50目的不锈钢组织滤网上，保证组织浸没在PBS中；

2）用手术刀切出间距大约2mm贯穿性切口；

3）转动注射器的活塞部分，使组织穿过滤网；

4）将细胞悬液用200μm尼龙网筛过滤，并收集到离心管中；

5）1000RPM，离心10min；

6）PBS重悬细胞。

2.2T细胞或PBMC制备

1）将稀释后的血液或PBS重悬的组织细胞用移液管沿管壁缓慢叠加于Ficoll上；

2）离心：400g，30min；

3）收集上层血浆层和Ficoll交界面的单个核细胞，移入一新的离心管中；

4）PBS洗涤细胞两次；

5）用培养基或PBS重悬细胞。

3.表型分析(流式分析)

使用Ficoll分离的来自病人或正常人的PBMC或来自病人TIL或病人癌旁组织T细胞与CD3-FITC或CD4-FITC或CD8-FITC，PD-1-APC，TIM-3-PE抗体共同孵育，最后加入7-AAD区分活细胞，或者使用TIGIT-PerCP Cy5.5或CTLA-4-PerCP Cy5.5抗体孵育。在FACS AriaⅢ流式细胞仪上检测，再用FlowJo软件（Tree Star公司）分析结果。

4.T细胞体外激活

使用Ficoll分离的来自病人或正常人的PBMC或病人TIL细胞计数1×10⁶，每周一次加入100μl PersonGen人类T淋巴细胞活化与扩增试剂，每隔一天加入30U/ml IL-2，两周后T细胞处于对数生长期，然后收集细胞进行后续试验。

5.胞内细胞因子染色

1）2×10⁶体外激活的TIL与2×10⁵AGS胃癌细胞混合，在10μg/ml正常小鼠IgG，抗TIM-3或/和抗PD-1单克隆抗体存在下共同孵育；

2）2小时后1：1000加入高尔基体阻断试剂；

3）5小时后收集细胞，PBS清洗；

4）用

固定死细胞染色试剂染色；

5）用CD4-FITC或CD8-PE Cy7对细胞进行表面染色；

6）固定及破膜溶液孵育20min；

7）Perm/Wash缓冲液清洗细胞两次；

8）用IFN-γ-PerCP Cy5.5，IL-2-PE和TNF-α-APC进行胞内染色；

9）在FACS AriaⅢ流式细胞仪上检测，再用FlowJo软件（Tree Star公司）分析结果。

6.细胞杀伤实验

1）取4×10⁵AGS-GFP细胞与2.4×10⁶TIL共培养，同时加入10μg/ml正常小鼠IgG，抗TIM-3或/和抗PD-1单克隆抗体，孵育4-6小时；

2）将细胞混合液消化取出，PBS洗两次；

3）加入1μl7-AAD，使用FACS Caliber流式细胞仪上检测。

7.统计分析

运用配对数据t检验和Wilcoxon符号秩和检验方法进行统计学意义分析。GraphPad Prism软件（GraphPad软件公司）用于所有统计学分析。双尾检测，p＜0.05表示结果差异显著，p＜0.01表示结果差异极显著。

8.试验结果

8.1PD-1和TIM-3在胃癌病人T细胞中表达升高

为了确定哪个共抑制分子在胃癌TILs疲惫过程中起到重要作用，分离胃癌组织中的TILs，癌旁胃粘膜中的T细胞，以及胃癌病人和正常人外周血单核细胞（PBMC），然后分析CTLA-4、TIGIT、PD-1和TIM-3在CD3⁺，CD4⁺和CD8⁺T细胞中的表达。

CTLA-4在病人PBMC CD3⁺/CD4⁺T细胞中基本不表达，但在CD8⁺T细胞表达较高；CD3⁺/CD4⁺/CD8⁺TIL中CTLA-4高表达（图2A和C）。但是从平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）分析结果看，CTLA-4在TIL中的表达与CTLA-4在PBMC T细胞中的表达基本无差异（图2C）。

TIGIT在胃癌病人CD3⁺/CD4⁺TIL中的表达比在正常人CD3⁺/CD4⁺T细胞中的表达升高，TIGIT在胃癌病人CD8⁺TIL中的表达水平比在正常人CD8⁺T细胞中的表达水平降低。TIGIT阳性细胞的比率占来自胃癌病人癌旁组织（AGM）中的CD3⁺和CD4⁺T细胞中是最高的（图2B和2D）。用MFI分析TIGIT得到相似结果（图2D）。

PD-1⁺细胞在CD3⁺TIL中所占比率为（60.18±23.57%）明显高于PD-1⁺细胞所占病人PBMC CD3⁺T细胞中的比率（35.85±19.34%；p=0.0126）；同时PD-1⁺细胞占病人PBMC CD3⁺T细胞的比率明显高于正常人PBMC CD3⁺T细胞中PD-1⁺细胞的比率（11.70±6.436%，p=0.0022；图3和4A）。PD-1在CD4⁺/CD8⁺T细胞中的表达情况与PD-1在CD3⁺T细胞中的表达结果一致，在CD4⁺/CD8⁺TIL中表达最高，在胃癌病人外周CD4⁺/CD8⁺T细胞中表达显著降低，在正常人外周CD4⁺/CD8⁺T细胞中表达更显著降低（图3,5A和6A）。运用MFI分析PD-1在胃癌病人CD3⁺，CD4⁺和CD8⁺TIL和PBMCs中的表达得到相同结果（图4A,5A和6A）。在胃癌病人癌旁粘膜组织中和TILs中，表达PD-1的CD3⁺,CD4⁺and CD8⁺T细胞的比率相似（图4A,5A和6A）。

TIM-3⁺细胞在CD3⁺TIL中所占比率（44.89±29.42%）明显高于TIM-3⁺细胞所占病人PBMC CD3⁺T细胞中的比率（26.77±17.25%；p=0.0119）；TIM-3⁺细胞所占病人PBMC CD3⁺T细胞的比率明显高于TIM-3⁺细胞所占正常人PBMC CD3⁺T细胞中的比率（10.78±11.54%,p=0.0314；图2和3B）。TIM-3在CD4⁺T细胞中的表达情况与TIM-3在CD3⁺T细胞中的表达结果一致（图3和5B）。TIM-3在正常人PBMC、病人PBMC、癌旁胃粘膜和TILs CD8⁺T细胞之间都不存在表达差异，虽然表达呈上升趋势（34.29±14.31%,46.51±18.70%,56.16±24.77%,60.08±24.07%）（图3和6B）。很明显，病人PBMC CD3⁺/CD4⁺T细胞TIM-3的表达水平是正常水平的2.5倍，CD3⁺/CD4⁺TILs TIM-3的表达水平是正常水平的4.5倍。运用MFI分析TIM-3在胃癌病人CD3⁺/CD4⁺TILs和PBMCs中的表达得到相同结果（如图7B,C,D）。在胃癌病人癌旁粘膜组织中和TILs中，表达TIM-3的CD3⁺,CD4⁺and CD8⁺T细胞的比率相似（图4B,5B和6B）。

有研究表明，胃癌病人胃癌组织中PD-1⁺CD4⁺/PD-1⁺CD8⁺T细胞的数目都明显高于胃癌病人正常胃粘膜组织中PD-1⁺CD4⁺/PD-1⁺CD8⁺T细胞的数目。但我们的结果显示癌旁胃粘膜和TIL中T细胞表达的PD-1和TIM-3无显著差异（如图4A,B；5A,B和6A,B）。而且，我们也观察到TIGIT⁺细胞占来自AGM的CD3⁺和CD4⁺T细胞比率高于CD3⁺和CD4⁺TILs（图2D）。这些结果提示癌旁胃粘膜组织类似于胃癌组织处于免疫抑制状态，从而造成了T细胞的疲惫。

8.2PD-1⁺TIM-3⁺T细胞比率在胃癌PBMCs中增加

相比正常人PBMC，病人PBMC T细胞中PD-1和TIM-3的表达都明显上升,在大部分TIL中PD-1和TIM-3进一步表达升高。接着我们分析PD-1和TIM-3在相同或是不同的T细胞亚群中表达。

相比正常人PBMC，病人PBMC中PD-1⁺/TIM-3⁺所占CD3⁺T细胞比例分别明显升高（2.228±4.196%vs11.70±11.70%,p=0.0348；图4C）；相比正常人PBMC，病人PBMC中PD-1⁺/TIM-3^-T细胞所占CD3⁺T细胞比例分别明显升高（9.467±4.177%vs22.06±11.13%,p=0.0053；图4D）。但是，比较病人和正常人PBMC中PD-1^-/TIM3⁺所占CD3⁺T细胞比例则没有明显差异（如图3和4E）。PD-1⁺/TIM-3⁺，PD-1⁺/TIM-3^-和PD-1^-/TIM3⁺细胞占胃癌病人和正常人CD4⁺T细胞的比率与在CD3⁺T细胞中的比率一致，这里就不赘述（图5C,5D和5E）。相比正常人PBMC，PD-1⁺/TIM-3⁺/CD8⁺T细胞在病人PBMC中表达明显上升(2.225±3.957%vs15.09±9.652%,p=0.0017；图6C)；而PD-1⁺/TIM-3^-/CD8⁺和PD-1^-/TIM-3⁺/CD8⁺T细胞在病人PBMC中的表达则无明显差异(p=0.0795；p=0.9263；图3，6D和6E）。换句话说，病人PBMC中PD-1⁺/TIM-3⁺双阳性的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞比正常水平分别增加了5倍、5倍、7倍；PD-1⁺/TIM-3^-的CD3⁺、CD4⁺T细胞也比正常水平均增加了2倍；病人PBMC中PD-1^-/TIM-3⁺的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞与正常PBMC相比没有显著升高。这些结果显示，在胃癌病人中，TIM-3表达的上调专门发生在表达PD-1的T细胞上；然而，PD-1表达的上调可以发生在不表达TIM-3的T细胞上。

8.3PD-1⁺TIM-3⁺T细胞比率在胃癌TILs中进一步增加

PD-1⁺/TIM-3⁺细胞所占CD3⁺TILs的比率明显高于病人PBMC CD3⁺T细胞中的比率（33.68±27.20%vs11.70±11.70%,p=0.0082；图4C）。可是，比较TIL和病人PBMC CD3⁺T细胞中PD-1^-/TIM-3⁺或者PD-1⁺/TIM-3^-各自所占的比率，结果无差异（p=0.4721和p=0.3994；图4D和4E）。PD-1⁺/TIM-3⁺，PD-1⁺/TIM-3^-和PD-1^-/TIM3⁺细胞占CD4⁺T细胞的比率与在CD3⁺T细胞中的比率一致，这里就不赘述（图3,5C,5D和5E）。相比病人PBMC，在TIL中PD-1⁺/TIM-3⁺/CD8⁺细胞比例明显上升(15.09±9.652%vs33.52±15.80%,p=0.0058；图6C)，PD-1^-/TIM-3⁺/CD8⁺T细胞比例则下降(31.42±15.83%vs26.56±17.55%,p=0.0094；图6E)，而PD-1⁺/TIM-3^-/CD8⁺细胞的比例则无差异(17.16±14.04%vs18.00±15.18%,p=0.0887；图6D)。我们的结果显示，PD-1⁺/TIM-3⁺TIL代表了TIL的主要部分（占CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺TIL的比率分别达到了33.68±27.20%、40.47±24.25%、33.52±15.80%）。在胃癌病人TILs中，PD-1⁺/TIM-3⁺细胞比率高于PD-1⁺/TIM-3^-和PD-1^-/TIM-3⁺细胞。来自其它肿瘤模型的研究结果也显示所有TIM-3⁺TIL共表达PD-1，并且TIM-3⁺/PD-1⁺TILs代表了T细胞浸润肿瘤的最主要部分。在胃癌病人或正常人PBMCs中，PD-1⁺/TIM-3⁺细胞比率都低于PD-1⁺/TIM-3^-和PD-1^-/TIM-3⁺细胞。因此，来自胃癌病人的TILs比来自病人的T细胞表现出更严重的功能耗竭。

8.4阻断PD-1和TIM-3增强TIL分泌细胞因子

为了证明PD-1和TIM-3是胃癌免疫治疗的靶点，有必要通过阻断PD-1和TIM-3来检测TILs的细胞因子分泌是否得到增强。由于直接从胃癌组织分离得到的TILs数量有限，我们对TILs进行了体外扩增。两周后，TILs的数量从1X10⁶增加到了5X10⁷。随后将2X10⁶的TILs与2X10⁵胃癌细胞混合，用抗TIM-3或/和抗PD-1的单抗或IgG阻断5h后，流式细胞仪分析CD4⁺和CD8⁺TIL分泌细胞因子的改变。

单独阻断TIM-3信号通路，只有CD4⁺TILs表达的IFN-γ和IL-2有所增加，CD8⁺TILs没有改变。单独阻断PD-1信号通路，CD4⁺/CD8⁺TILs表达的IFN-γ和IL-2均有所增加，但是TNF-α没有增加（图8）。联合使用抗TIM-3和抗PD-1的单抗共同阻断，观察到CD4⁺和CD8⁺TILs分泌IFN-γ和TNF-α明显增加，以及CD8⁺TILs分泌IL-2明显增加。单独阻断其中一条信号通路CD8⁺TILs分泌不到5%的TNF-α，联合阻断这两条通路有32%的CD8⁺TILs分泌的TNF-α，所以说PD-TIM-3信号通路的抑制作用能够通过共同阻断这两条信号通路所打破。

8.5阻断PD-1和TIM-3增强TILs细胞毒性

为了确定通过阻断PD-1和TIM-3信号通路是否能够增强TILs的细胞毒性。2.4x10⁶TIL与4x10⁵AGS-GFP细胞在IgG，抗TIM-3和/或抗PD-1单抗的存在下共培养4h，4h后用细胞流式的方法检测AGS-GFP细胞的死亡率，7-AAD阳性的细胞即为死细胞。

单独阻断PD-1或TIM-3信号通路TIL对AGS细胞的细胞毒性比IgG抗体阻断都有所增强。而且，共同阻断PD-1和TIM-3信号通路，TIL对肿瘤细胞的杀伤效果明显强于单独阻断PD-1或TIM-3信号通路（如图9）。

9.讨论

我们观察到TIGIT⁺CD8⁺TILs的比率低于病人外周TIGIT⁺CD8⁺T细胞的比率。先前的研究表明在长时间接触肿瘤抗原后T细胞会高表达共抑制因子TIGIT。但是矛盾的结果是共抑制因子TIGIT却在CD8⁺TILs中表达降低了，这个现象有待进一步研究。

PD-1已经确认在黑色素瘤，肾细胞癌和非小细胞肺癌患者的TILS中高表达。最新的研究成果证明，PD-1在胃癌病人的CD4⁺和CD8⁺T细胞中高表达，并且PD-1的表达水平与PD-L1的表达水平正相关。TIM-3的多态性研究显示TIM-3基因启动子区域存在一个危险的基因变体，是中国人群中胃癌发生的一个风险因素。但是没有直接证据显示TIM-3是否在胃癌病人中高表达，是否与PD-1的高表达存在联系。我们的结果显示PD-1和TIM-3在胃癌病人PBMC T细胞和TILs中都高表达，而且PD-1⁺/TIM-3⁺TILS占总TILS的比例在1/3以上，同时PD-1⁺/TIM-3⁺TILs比正常人PBMCPD-1⁺/TIM-3⁺T细胞增加了10-14倍（图4A,4B,5A,5B,6A和6B）。胃癌病人外周PD-1⁺/TIM-3⁺T细胞的水平比正常人外周的PD-1⁺/TIM-3⁺T细胞增加了5至7倍（图4C,5C和6C）。PD-1和/或TIM-3的表达与T细胞的功能耗竭或紊乱有关。我们的结果提示胃癌病人的TILs比外周T细胞表现出更严重的功能耗竭，胃癌病人外周T细胞比正常人外周T细胞表现出更严重的功能耗竭。

相比正常人外周血细胞，PD-1⁺/TIM-3⁺细胞和PD-1⁺/TIM-3^-细胞占TILs和胃癌病人外周T细胞的比率都明显升高（除了PD-1⁺/TIM-3^-细胞占CD8⁺TILs和胃癌病人外周CD8⁺T细胞的比率），但是PD-1^-/TIM-3⁺细胞比率却没有升高，提示TIM-3的上调表达与PD-1的上调表达呈正相关。而且，我们发现胃癌病人PBMC/TILs比正常人PBMCs中升高的PD-1表达量（增加了3-5倍）略微高于胃癌病人PBMC/TILs比正常人PBMCs中升高的TIM-3表达量（增加了2.5-4.5倍），暗示PD-1不单在胃癌病人外周T细胞的表达上调，而且在TILs中的表达上调可能稍稍早于TIM-3的表达上调。

相比病人PBMC，PD-1^-/TIM-3⁺/CD8⁺TILs比率有所下降的同时，PD-1⁺/TIM-3⁺/CD8⁺TILs比率有所上升。值得注意的是，CD8⁺TILs中PD-1^-/TIM-3^-T细胞比率与病人PBMC CD8⁺T细胞中PD-1^-/TIM-3^-T细胞比率之间差异没有达到统计学意义（图6C，6D和6E）。这就说明，TIL中PD-1⁺/TIM-3⁺/CD8⁺T细胞很可能直接来源于PBMC中PD-1^-/TIM-3⁺/CD8⁺T细胞。一致的结果在小鼠肿瘤模型的研究显示，在肿瘤微环境中TIM-3⁺/CD8⁺T细胞由于应对环境的暗示会产生PD-1表达上调的现象。同时由于TIM-3在正常人外周血CD8⁺T细胞中表达很高（34.29±14.31%,图5B）。人们认为CD8⁺T细胞在外周的时候就开始表达TIM-3，TIM-3⁺/CD8+T细胞的死亡或者耗竭是受TIM-3的配体galectin-9的表达水平所调节的，这个时候TIM-3⁺/CD8⁺T细胞没有接触到galectin-9，所以并没有表现出严重的功能耗竭。但当TIM-3⁺/CD8⁺T细胞迁移至高表达galectin-9肿瘤组织周围后就形成了PD-1⁺/TIM-3⁺/CD8⁺T细胞，相比PD-1^-/TIM-3⁺/CD8⁺T细胞就表现出更严重的功能耗竭。与PD-1⁺/TIM-3⁺/CD8⁺TIL来源于PD-1^-/TIM-3⁺/CD8⁺T细胞不同，由于PD-1⁺/TIM-3^-或者PD-1^-/TIM-3⁺的CD3⁺/CD4⁺TIL细胞群比率没有明显变化，因此新增加的PD-1⁺/TIM-3⁺/CD3⁺/CD4⁺TIL可能主要来源于PBMC PD-1^-/TIM-3^-/CD3⁺/CD4⁺T细胞。我们排除PD-1⁺/TIM-3⁺细胞比率的增加及PD-1^-/TIM-3^-和PD-1^-/TIM-3⁺细胞比率的降低是通过PD-1⁺/TIM-3⁺细胞自身增殖造成的。因为PD-1⁺/TIM-3⁺细胞比PD-1或TIM-3单阳性细胞表现出更严重的功能耗竭，失去增殖能力和分泌细胞因子的能力被认为是T细胞功能耗竭。

PD-L1在胃癌中高表达已被证实，而且PD-L1⁺的癌症患者比PD-L1^-的患者存活几率更低。最近，PD-1在胃癌中高表达也被报道，该研究也认为胃癌中PD-1⁺TIL比PD-1^-TILs分泌更少的IFN-γ。抗PD-1和抗PD-L1抗体在小鼠和人类中都有很深入的研究。但到目前为止，尚未发现使用抗PD-1或抗PD-L1的单抗进行阻断试验，来评估胃癌中PD-1⁺TIL功能是否能够得到恢复的报道。我们的实验结果表明使用抗PD-1的抗体可以增强CD8⁺和CD4⁺TIL分泌IFN-γ和IL-2的能力，同时抗PD-1的抗体具有增强TIL杀伤胃癌细胞的能力（图8和图9）。我们的结果显示出抗PD-1抗体用于胃癌免疫治疗的广阔的前景。

目前评估抗TIM-3抗体抗肿瘤效果时，主要是分析小鼠中PD-1⁺/TIM-3⁺CD8⁺T细胞，或者人类中NY-ESO-1肿瘤特异性PD-1⁺/TIM-3⁺CD8⁺T细胞缺失细胞因子分泌的功能。最近报道的对结肠腺肉瘤（MC38和CT26）和纤维肉瘤（WTMCA2）这3种小鼠肿瘤模型的研究比较了抗TIM-3单抗对CD8⁺和CD4⁺T细胞活力的影响，结果发现有效的抗TIM-3治疗主要是依赖于能够产生IFN-γ的CD8⁺T细胞。在我们的研究中，我们分析了抗TIM-3抗体对人类胃癌中CD8⁺和CD4⁺TILs功能的影响，结果证明单独使用抗TIM-3抗体能够促进CD4⁺TILs分泌IFN-γ和IL-2。但没有看到抗TIM-3的抗体能够进一步促进CD8⁺TIL分泌IFN-γ的现象。这可能与我们的TILs在体外被扩增2周后才进行阻断试验有关，因为扩增过程中TILs得到了一定的活化，从而导致单独使用TIM-3抗体进行阻断试验未能进一步增强其分泌。当联合使用抗PD-1和抗TIM-3的抗体进行阻断时，较单独使用抗TIM-3或抗PD-1的抗体阻断CD8⁺TILs分泌更高水平的IFN-γ，IL-2和TNF-α（图8D），相似的结果也表明联合使用抗PD-1和抗TIM-3的抗体进行阻断时，较单独使用抗TIM-3或抗PD-1的抗体阻断CD4⁺TIL分泌更高水平的IFN-γ和TNF-α（图8C）。我们的结果说明抗TIM-3抗体在PD-1抗体的协同作用下可以促进CD4⁺和CD8⁺TILs分泌细胞因子。

从单独使用抗TIM-3或抗PD-1的抗体阻断后TIL细胞因子的分泌情况来看，抗PD-1抗体使TIL功能恢复的能力强于抗TIM-3抗体（图8D）。这可能是因为TIM-3信号通路比PD-1信号通路在T细胞免疫抑制中所起的作用要弱。PD-1⁺/TIM-3⁺T细胞或PD-1^-/TIM-3⁺T细胞将都有可能是抗TIM-3抗体的靶标。而且PD-1⁺/TIM-3⁺细胞是TIL的主要部分，疲惫的PD-1⁺/TIM-3⁺T是很难通过单独阻断TIM-3信号通路使功能得到恢复的。在肿瘤模型中，抗TIM-3抗体发挥作用的可能机制是使TIM-3⁺细胞减少，有证据表明PD-1^-/TIM-3⁺细胞的减少伴随着PD-1⁺/TIM-3^-细胞数目的增加。但是，这种机制在我们4-5h体外阻断过程中是不可能对CD4⁺和CD8⁺TILs恢复功能起到重要的作用。所以，单独使用抗TIM-3抗体阻断，TIL分泌细胞因子的能力并没有显著增强（图8），TIL杀伤肿瘤细胞的能力也只是略微提高（图9）。

尽管我们观察到，单独阻断PD-1使TIL细胞因子分泌增加，但是并非所有先前的研究都认为单独阻断PD-1/PD-L1能使T细胞功能得到回复。体外通过短暂刺激单独阻断PD-1/PD-L1信号通路同样不能恢复NY-ESO-1肿瘤特异性CD8⁺T细胞的功能。研究表明大约50%PD-1⁺TILs是TIM-3^-/PD-1⁺TILs，代表的是一群激活的T细胞，体外阻断PD-1/PD-L1信号通路能够恢复其功能，在体内则需要联合疫苗使用才能使肿瘤消退，单独阻断PD-1/PD-L1信号通路不能使肿瘤发生消退。相似的研究结果是同时阻断TIM-3和PD-1信号通路，观察到TIL分泌IFN-γ的能力明显强于单独阻断TIM-3或PD-1信号通路。单独阻断PD-1的有效性有待进一步体内外的实验来验证，我们的结果结合前人的研究成果显示共同阻断PD-1和TIM-3表现出对TIL分泌细胞因子和抑制肿瘤生长能力的增强是显而易见的。因此，联合阻断PD-1和TIM-3信号通路是胃癌免疫治疗的有效途径。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (9)

1.PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂在制备抗胃癌的药物组合物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括：

1)PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂；

2)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；

和3)任选的，其它抗胃癌药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物与其它抗胃癌药物联合使用。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括其它抗胃癌药物。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，所述PD-1信号通路的阻断剂为抗PD-1单克隆抗体，所述TIM-3信号通路的阻断剂为抗TIM-3单克隆抗体。

6.根据权利要求2-4任一项所述的用途，其特征在于，所述其它抗胃癌药物为烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素中的一种或多种。

7.根据权利要求2-4任一项所述的用途，其特征在于，所述其它抗胃癌药物为顺铂、表柔比星、氟尿嘧啶中的一种或多种。

8.一种药物组合物，包括：

1)PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂；

2)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；

和3)任选的，其它抗胃癌药物。

9.一种药盒，包括：

i)含有PD-1信号通路的阻断剂和TIM-3信号通路的阻断剂的容器；

ii)含有其它抗胃癌药物的容器；

和任选的iii)使用说明书。

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