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CN103698506A - 利用直接免疫pcr检测样品中污染物含量的方法 - Google Patents

利用直接免疫pcr检测样品中污染物含量的方法 Download PDF

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CN103698506A CN201310755464.9A CN201310755464A CN103698506A CN 103698506 A CN103698506 A CN 103698506A CN 201310755464 A CN201310755464 A CN 201310755464A CN 103698506 A CN103698506 A CN 103698506A
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Abstract

本发明公开了一种利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法，包括：取待测物标准品，制备标记DNA-标准品偶联物；将可与待测物特异性结合的抗体固定在支持物上，添加待测样品和标记DNA-标准品偶联物，进行竞争性结合反应，反应完成后洗涤；洗涤完成后，加入PCR反应体系，以标记DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，得到CT值；根据标准曲线，利用CT值计算待测样品中待测物的含量。本发明只需“特异抗体包被—竞争结合—PCR扩增”三个步骤即可完成对环境样品中待测物含量的检测，并且预先将待测物标准品直接与DNA偶联，抗原抗体特异结合，大大提高了检测灵敏度和准确性。

Description

利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法
技术领域
本发明属于环境污染物检测技术领域，具体涉及一种利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法。
背景技术
环境污染物质是随着人类活动而出现、会对人类生存环境以及身体健康产生影响的一类化学物质。比如，沙丁胺醇（SAL）是β-兴奋剂家庭的成员，临床上常用于治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病。由于其还可以促进动物生长，减少动物脂肪蓄积，增加瘦肉产量，因而被国内外许多养殖场用作饲料添加剂。然而，如果过多摄入SAL会对人体健康产生不利影响，包括出现心悸、头疼、目眩、恶心、呕吐，严重者甚至造成肝肾的损伤。因此，包括我国在内的多个国家已将该类药物列为禁用药物以及饲料添加剂。再比如，烟草中含有上千种对人体健康存在潜在威胁的物质，主动吸烟以及被动吸烟都会导致肺炎、肺癌、哮喘、心血管疾病、高血压以及生殖发育等。所有这些环境污染物质虽然分子量小，但却会对人类健康造成巨大的潜在威胁。随着人们生活水平的提高，越来越多的人开始注重生活环境以及身体的健康，因此，为了更准确的反应人体是否暴露于各种环境物质污染中，有必要建立一些快速、简便、高灵敏度的方法来测定生物样品（如尿样、血样等）以及环境样品（如水体、土壤等）中的污染物质的含量。
现有检测环境污染物质含量的方法有毛细管区带电泳法、气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法。但是这些仪器分析方法前处理复杂、耗时多且成本高。相比之下，酶联免疫法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低和样本前处理相对简单等优点。但是，随着人们对健康要求的不断提高，有必要建立一些更高灵敏度的检测方法。
免疫PCR（Immuno-PCR，IPCR）由Sano等人提出，是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术，其主要程序包括：
（一）抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；
（二）加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；
（三）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA复合物；
（四）PCR扩增生物素化DNA部分。
将与抗原结合的特异性抗体通过连接分子与标记DNA结合，再进行PCR扩增，由此定量检测抗原，使敏感性高于ELISA和RIA。但目前免疫PCR技术大多被应用于多种微量蛋白及毒素的检测，用于小分子物质（分子量小于1000道尔顿）检测的研究相对较少。
文献（H.-Y.Chen and H.-S.Zhuang.A Real-Time Immuno-PolymeraseChain Reaction Assay for Detecting Polychlorinated Biphenyls in theEnvironment.Analytical and bioanalytical chemistry,2009,394,1205-1211.）公开了采用免疫PCR检测环境样品中多氯联苯，其主要步骤包括：抗原包被—特异抗体与小分子（即多氯联苯）竞争—加生物素标记二抗—加亲和素—加生物素标记DNA—PCR扩增。
该方法属于间接免疫PCR法，与现有技术中其他免疫PCR方法相同，均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA连接，但一个亲和素分子可以结合四个生物素分子，难以排除检测结果中会存在误差的可能性，而且整个过程步骤繁琐，不利于实际应用。
发明内容
本发明提供了一种利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法，该方法步骤简单，且检测结果灵敏性和准确性均较高。
利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法，包括：
（1）取待测物标准品，制备标记DNA-标准品偶联物；
（2）将可与待测物特异性结合的抗体固定在支持物上，添加待测样品和标记DNA-标准品偶联物，进行竞争性结合反应，反应完成后洗涤；
（3）洗涤完成后，加入PCR反应体系，以标记DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，得到CT值；
（4）根据标准曲线，利用CT值计算待测样品中待测物的含量。
本发明针对待测样品中污染物建立了一套直接免疫PCR检测体系，只需“特异抗体包被—竞争结合—PCR扩增”三个步骤即可完成对待测样品中待测物含量的检测，并且预先将待测物标准品直接与DNA偶联，未在反应体系中引入其他连接分子，抗原抗体特异结合，大大提高了检测灵敏度和准确性。
所述待测样品可以是生物样品，如尿样、血样等，可以是环境样品，如水样，土样等。所述污染物是指分子量小于1000道尔顿的化合物，这类化合物由于不能直接包被到ELASA板上，因此无法用现有的ELISA技术进行含量检测。
步骤（1）中，所述标记DNA-标准品偶联物的制备方法为：
（1.1）在待测物标准品中引入易与羧基或氨基反应的基团，获得标准品衍生物；
引入易与羧基或氨基反应的基团，便于标准品衍生物与载体蛋白上的氨基或羧基偶联，而且增加了待测物标准品暴露在载体蛋白外表面的几率。基团的引入方式一般是：选择可与待测物标准品反应的小分子物质作为连接臂，该小分子物质上带有易与羧基或氨基反应的基团且反应后该基团保持游离状态。
作为优选，所述基团为羧基、氨基或巯基。
（1.2）将所述标准品衍生物与载体蛋白偶联，获得偶联蛋白；
作为优选，采用NHS活性酯法进行偶联，所述载体蛋白可选用BSA、OVA或KLH。
（1.3）在标记DNA序列中引入5’端羧基或3’端氨基，获得标记DNA衍生物；
标准品衍生物与载体蛋白偶联后，载体蛋白的氨基或羧基被占有，为便于在偶联蛋白上连接标记DNA序列，需在标记DNA序列中引入5’端羧基或3’端氨基。
免疫PCR中的标记DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA纯度，且应有较好的均质性，且尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA，一般可选用质粒DNA或PCR产物。本发明的标记DNA的碱基序列如SEQID No.1所示（本发明标记DNA衍生物是带有5’端羧基的标记DNA），是以HSA基因为模板，以SEQ ID No.2所示的上游引物（上游引物的5’端带有羧基）和SEQ ID No.3所示的下游引物进行PCR扩增获得的PCR产物。
（1.4）将偶联蛋白与标记DNA衍生物偶联，获得所述标记DNA-标准品偶联物。
作为优选，采用NHS活性酯法进行偶联。
例如，利用本发明方法对待测样品中沙丁胺醇（SAL）的含量进行测定时，标记DNA-SAL偶联物的构建方法包括：
（a）在SAL上引入羧基，得到SAL衍生物；其中，可以选用对氨基苯甲酸或溴乙酸乙酯作为连接臂引入羧基；
（b）使SAL衍生物上的羧基与BSA蛋白上的氨基反应，获得BSA-SAL偶联物；
（c）制备带5’端羧基的标记DNA衍生物，并将BSA-SAL偶联物与标记DNA衍生物偶联，得到标记DNA-SAL偶联物。
获得标记DNA-标准品偶联物后，将标记DNA-标准品偶联物和经10-1倍稀释的待测样品以体积比1:1混合后，加入到固定有特异抗体的支持物中，进行竞争性结合反应。所述支持物可选用免疫PCR管或微孔板。竞争反应完成后进行洗涤，除去未反应的待测样品和标记DNA-标准品偶联物，便于准确地对已结合的标记DNA-标准品偶联物的含量进行检测。
洗涤完成后加入PCR反应体系，以标记DNA为模板，以SEQ ID No.4所示的上游引物和SEQ ID No.5所示的下游引物进行实时荧光定量PCR，得到CT值；并根据标准曲线，利用CT值计算待测样品中待测物的含量。
实时荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性20s、52℃延伸30s、72℃延伸15s，总共40个循环；72℃继续延伸10min。
所述标准曲线的制备方法为：
（4.1）制备一组浓度呈梯度分布的待测物标准品；
（4.2）将所述待测物标准品与标记DNA-标准品偶联物以体积比1:1混合，加入到固定有可与待测物特异性结合的抗体的支持物中，进行竞争性结合反应，反应完成后洗涤；
（4.3）洗涤完成后，加入PCR反应体系，以标记DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，记录CT值；
（4.4）绘制得到CT值与待测物标准品浓度的对数值呈正相关的标准曲线。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明建立了利用直接免疫PCR法检测环境样品中某一污染物含量的方法，只需“特异抗体包被—竞争结合—PCR扩增”三个步骤即可完成对环境样品中待测物含量的检测，并且预先将待测物标准品直接与DNA偶联，未在反应体系中引入其他连接分子，抗原抗体特异结合，大大提高了检测灵敏度和准确性。
附图说明
图1为沙丁胺醇衍生物的制备流程图；
图2为BSA蛋白-沙丁胺醇偶联物的制备流程图；
图3为不同浓度沙丁胺醇标准品竞争结合后的PCR扩增曲线，其中，△Rn表示荧光强度，cycle表示PCR循环数；
图4为直接免疫PCR中待测样品中沙丁胺醇含量的标准曲线，其中，CT表示每个PCR免疫管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；log（C）表示待测样品中待测物浓度的对数值。
具体实施方式
实施例1直接免疫PCR检测SAL的含量
1SAL衍生物的制备
以对氨基苯甲酸为连接臂，在SAL上引入羧基，衍生过程如图1所示，包括以下步骤：
（1）将1mL、2.5mmol对氨基苯甲酸溶于5mL、5%NaOH溶液中，4℃搅拌预冷，获得对氨基苯甲酸溶液；
（2）将3mL、3mmol的NaNO2与2.5mL、12%HCl溶液混匀后，逐滴滴加到对氨基苯甲酸溶液中形成重氮化溶液，0-4℃反应至KI-淀粉试纸变蓝后，加少量尿素中止反应；
（3）将2.5mmol的SAL溶于3mL乙腈中，再加入1.5mL、10%NaOH溶液，4℃搅拌预冷，得到SAL溶液；
（4）将得到的重氮化溶液逐滴加到SAL溶液中，搅拌5min后再加入两相催化剂四丁基溴化锭，反应30min，反应液分层，下层水相变为棕黄色的浑浊液，抽滤后得到棕黄色沉淀，用乙醇/水（1：1，v/v）重结晶，得到带羧基的SAL衍生物。
2BSA-SAL偶联物的制备
采用活性酯法使SAL衍生物上的羧基与BSA蛋白上的氨基反应，获得BSA-SAL偶联物，偶联过程如图2所示，包括以下步骤：
（1）按照EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）：NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）:SAL衍生物=1：1.2：1的比例，分别称取EDC3.8mg、NHS4.2mg、SAL衍生物5.0mg，用尽量少的DMF（二甲基甲酰胺）溶解，37℃下活化1.5h得到A液；
（2）称取3mg BSA蛋白用8mL PBS溶解，室温下搅拌，得到B液；
（3）加大B液的搅拌速度（尽量不产生泡沫的情况下所能达到的最大速度），将A液沿壁缓慢地加入到B液中，待A液加入完全后，降低转速，放入4℃条件下反应过夜；
（4）利用0.01M的PBS缓冲液（pH7.4）进行透析，透析完全后，得到BSA-SAL溶液。
3带5’端羧基的标记DNA衍生物的制备
以HSA基因为模板，以a1/a2为引物，用PCR仪进行扩增，其中，
上游引物a1：5’-COOH-AAACAGCTATGACCATGA-3’；
下游引物a2：5’-AGTCACGACGTTGTAAAA-3’。
扩增体系为：
PCR反应体系为：
Figure BDA0000452033300000071
扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min、52℃延伸30s、72℃延伸15s，循环30次；72℃继续延伸10min，最后在4℃保持。
通过DNA凝胶电泳确定条带正确后，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，得到带5’端羧基的标记DNA，长度约200bp，标记DNA的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
4标记DNA-SAL偶联物的制备
采用活性酯法将BSA-SAL与标记DNA衍生物偶联，包括以下步骤：
（1）取20μL标记DNA衍生物至180μL硼酸盐缓冲液中，加入10mg/mL NHS及sμLfo-EDC各4μL，4℃活化10min，获得活化液；
（2）取20μL16.5mg/mL的BSA-SAL溶液加入活化液中，于4℃下温和搅拌2h；
（3）用截留分子量为100KD的超滤管对反应物进行超滤，除去多余的偶联剂和未偶联上的反应物，超滤后的截留物用含有5mM EDTA的100mMPBS缓冲液溶解，得到偶联好的标记DNA-SAL偶联物。
5直接竞争免疫PCR方法的建立
（1）用碳酸盐缓冲液将SAL单克隆抗体稀释至1μg/mL，取30μL/孔加入免疫PCR管中，于37℃包被2h；
（2）用pH7.4的PBST缓冲液（含0.05%Tween-20的10mM PBS）洗涤3次，每次3min，再用pH7.4、含0.4%明胶、1mg/mL鲑鱼精DNA的10mM PBS封闭缓冲液于37℃封闭1h；
（3）于包被以及封闭好的免疫PCR管中，加入30μL经10-4倍稀释的步骤4中合成的标记DNA-SAL偶联物以及30μL不同浓度（10fg/mL～10ng/mL）SAL标准品，于37℃反应1h后，用PBST缓冲液（pH7.4）洗涤5次，每次3min；
（4）向洗干净的免疫PCR管中加入定量PCR反应体系，用荧光定量PCR仪进行测定；
定量PCR反应体系为：
Figure BDA0000452033300000072
Figure BDA0000452033300000081
其中，上游引物b1的碱基序列为：5’-TGACCATGATTACGAATT-3’；
下游引物b2的碱基序列为：5’-AGTCACGACGTTGTAAAA-3’。
扩增程序为：首先94℃预变性30s，然后94℃变性20s、52℃延伸30s、72℃延伸15s，总共40个循环；72℃继续延伸10min，最后在4℃保持。
实时荧光定量PCR分析的结果如图3和图4。
由图3和图4得出本实施例的免疫PCR标准曲线为：y=12.82+1.05x(r=0.997，n=3)，其中y为PCR循环次数，x为待测样品中SAL浓度（fg/mL）的对数值。本实施例对SAL的检测灵敏度达到46fg/mL。
对比例1
按照文献（H.Wang,Y.Zhang,H.Li,B.Du,H.Ma,D.Wu and Q.Wei.Asilver-palladium alloy nanoparticle-based electrochemical biosensor forsimultaneous detection of ractopamine,clenbuterol and salbutamo.BiosensBioelectron,2013,49:14-19.）公开的方法，检测SAL的含量，其灵敏度为1.44pg/mL。
Figure IDA0000452033380000021

Claims (8)

1.利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法，包括：
（1）取待测物标准品，制备标记DNA-标准品偶联物；
（2）将可与待测物特异性结合的抗体固定在支持物上，添加待测样品和标记DNA-标准品偶联物，进行竞争性结合反应，反应完成后洗涤；
（3）洗涤完成后，加入PCR反应体系，以标记DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，得到CT值；
（4）根据标准曲线，利用CT值计算待测样品中待测物的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记DNA-标准品偶联物的制备方法为：
（1.1）在待测物标准品中引入易与羧基或氨基反应的基团，获得标准品衍生物；
（1.2）将所述标准品衍生物与载体蛋白偶联，获得偶联蛋白；
（1.3）在标记DNA序列中引入5’端羧基或3’端氨基，获得标记DNA衍生物；
（1.4）将偶联蛋白与标记DNA衍生物偶联，获得所述标记DNA-标准品偶联物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，标记DNA的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR采用的引物为：
上游引物：5’-TGACCATGATTACGAATT-3’；
下游引物：5’-AGTCACGACGTTGTAAAA-3’。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性20s、52℃延伸30s、72℃延伸15s，总共40个循环；72℃继续延伸10min。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1.2）和步骤（1.4）均采用NHS活性酯法。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将标记DNA-标准品偶联物和经10-1倍稀释的待测样品以体积比1:1混合后，加入到支持物中，进行竞争性结合反应。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的制备方法为：
（4.1）制备一组浓度呈梯度分布的待测物标准品；
（4.2）将所述待测物标准品与标记DNA-标准品偶联物以体积比1:1混合，加入到固定有可与待测物特异性结合的抗体的支持物中，进行竞争性结合反应，反应完成后洗涤；
（4.3）洗涤完成后，加入PCR反应体系，以标记DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，记录CT值；
（4.4）绘制得到CT值与待测物标准品浓度的对数值呈正相关的标准曲线。
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