CN103698175B - 金黄色葡萄球菌疫苗成品的解离及含量测定方法和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供了一种疫苗成品的解离及抗原含量测定的方法和检测试剂盒。该方法能够实现蛋白抗原与佐剂的快速完全解离，同时对疫苗成品中的复杂抗原进行定量检测，解决了疫苗研发中抗原解离和成品抗原含量测定中存在的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及疫苗成品的解离及抗原含量测定方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，以下简称金葡菌，有“嗜肉菌”的别称。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性炎症为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感染具有重要的战略及现实意义。
随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA）自1961年被首次发现至今，目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的医院內感染病原菌之一。同时，因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行，且呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，被称为“第一超级细菌”。
本发明人采用反向疫苗学技术，成功的从金黄色葡萄球菌ATCC国际标准株MRSA252中筛选到了疫苗候选抗原，这些抗原包括HI、mSEB、SpA5和MntC。将这些蛋白抗原在组氨酸缓冲液的存在下与磷酸铝佐剂吸附后制备成的疫苗成品免疫动物后，保护率在85%以上，有效性远远高于国内外同类产品研究水平。
在重组蛋白类疫苗的研发中，蛋白抗原与佐剂吸附后的稳定性也是必须的检测指标，这就需要准确测定疫苗成品中的抗原含量。而疫苗成品多是抗原蛋白与佐剂吸附后的胶体状复合物，如何采用适当的方法让蛋白抗原与佐剂完全解离且不破坏抗原的性质，是需要重点解决的难题。目前的报道中，有采用柠檬酸钠、盐酸胍等方法将蛋白与佐剂解离的方法，但普遍存在解离不完全，解离时间偏长等问题。同时，如果要测定蛋白类疫苗成品中抗原的含量，常采用的方法是将抗原与佐剂解离后，采用SDS-PAGE、ELISA或者HPLC等方法鉴定。但本发明的重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原成分复杂，而且其中几个蛋白质的分子量接近，采用SDS-PAGE法测定时分子量相近的蛋白容易叠加在一起，采用HPLC测定时也存在几个峰融合的现象，不容易准确定量测定。采用ELISA测定需要相应的四个蛋白的单抗，研发成本提高，周期延长。
发明内容
鉴于上述存在的具体问题，本发明提供一种快速有效解离疫苗成品并检测抗原含量的方法。
本发明的方法包括以下步骤：
（1）将解离液与疫苗溶液以0.5～2:1的体积比混合；其中所述解离液是1.5-2.5M的碳酸钠溶液；优选地，所述解离液的浓度是2M，与疫苗溶液的体积比是1:1；
（2）测定抗原含量；优选地，使用针对不同抗原的抗血清，对不同浓度的抗原标准品及成品解离后样品同时进行蛋白质印迹检测，通过酶学反应的显色，结合灰度扫描仪对各条带进行灰度扫描，建立标准曲线，得到灰度值与抗原浓度之间的关系，通过回归方程求得成品中所含抗原的含量。
优选地，所述疫苗成品中包含抗原和佐剂。
优选地，所述疫苗成品中包含多种抗原，如2、3、4、5、6种抗原。
在另一方面，本发明提供一种用于本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包括：解离液和抗原含量测定试剂。优选地，所述解离液是1.5-2.5M的碳酸钠溶液；进一步优选地，所述解离液是2M的碳酸钠溶液；所述抗原含量测定试剂是蛋白质印迹检测试剂。
通过该方法能够实现蛋白抗原与佐剂的快速完全解离，同时对疫苗成品中的复杂抗原进行定量检测，解决了疫苗研发中在抗原解离和成品抗原含量测定的问题。
附图说明
图1、实施例1的蛋白抗原与佐剂的解离时间的确定；M为蛋白质分子量标准，1、2和3分别为解离10、20和30min结果。
图2、本发明的解离方法与其它解离方法的比较：M为蛋白质分子量标准，1、2、3和4分别为柠檬酸钠、盐酸胍、柠檬酸和碳酸钠解离法。
图3、实施例2的蛋白质印迹检测疫苗抗原的结果。
图4、实施例2的四种抗原标准品浓度与灰度值的标准曲线。
具体实施方式
经过多方面的摸索，发明人采用碳酸钠成功实现了蛋白抗原与佐剂的成功解离问题，整个过程在10min内完成。同时，在抗原含量测定方面，采用四种抗原的兔抗血清，对不同浓度的抗原标准品及成品解离后样品同时进行蛋白质印迹检测，通过酶学反应的显色，结合灰度扫描仪对各条带进行灰度扫描，建立标准曲线，得到灰度值与抗原浓度之间的关系，通过回归方程求得成品中所含抗原的含量。该方法操作简便，重复性好，可以实现疫苗成品抗原含量的定量检测。
以下实施例所使用的抗原蛋白与各种试剂如下：
1）实验材料
重组金黄色葡萄球菌疫苗四种抗原原液，四种抗原分别为SpA5（SEQIDNO.1）、MntC（SEQIDNO.2）、mSEB（SEQIDNO.3）和HI（SEQIDNO.4），各蛋白原液浓度为50μg/ml；
上述的四组分重组金黄色葡萄球菌疫苗成品，其中各组分浓度为50μg/ml；
分别针对四种抗原的兔多抗血清：采用重组金黄色葡萄球菌疫苗成品按照D0，D14，D21的免疫程序免疫新西兰大耳白兔三次，末次免疫后14天采血所得。
2）实验仪器
纯水仪（ELGA）、电子天平（MettlerToledo）、灌胶模具（BIORAD）、蛋白凝胶成像仪（BIORAD）、电泳装置（BIORAD）、半干胶转移仪（BIORAD）
3）实验试剂
三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、甲醇、氯化钠、盐酸、吐温20、脱脂奶粉、DAB显色液试剂盒、30%丙烯酰胺、过硫酸铵、1.5MTris-HCl(pH8.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED、1.0MTris-HCl(pH6.8)、5×蛋白上样缓冲液，PVDF膜（Milipore），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（BD公司）。
4）试剂配制
解离液：2M碳酸钠；
电转缓冲液：称取Tris3.03g与甘氨酸14.41g，200ml甲醇，加水定容至1L，4℃保存；
10×TBS缓冲液：称取Tris24.228g与氯化钠87.75g，加适量水溶解，用盐酸将pH值至7.5，加水稀释至1L，4℃保存；
TBST洗涤液：将10×TBS缓冲液稀释成1×TBS缓冲液，加入0.5%吐温20，配成1×TBST洗涤液；
10×SDS-PAGE电泳缓冲液：称取Tris3.03g与甘氨酸14.41g，SDS1g，加双蒸水溶解，定容至1L；
5×蛋白上样缓冲液：250mMTris-HCl（pH6.8）、10％（W/V）SDS、0.5％（W/V）溴酚蓝、50％（V/V）甘油、5％（W/V）β-巯基乙醇；
封闭液：5%(w/v)脱脂奶粉溶于100mmol/LTTBS(Tris(pH7.5)，吐温200.1%(v/v)，NaCl0.9%(w/v))。
实施例1：蛋白抗原与佐剂的解离时间的确定
以重组金黄色葡萄球菌疫苗为例，取疫苗成品一支，取其中的疫苗成品600μL在5000rpm下常温离心10min，吸弃上清300μL后加入300μL的解离液（2MNa2CO3），常温混悬处理，震荡时间分别为10min、20min和30min，静置5min后取上清40μL加入10μL的5×蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳。结果如图1所示：解离时间为10min、20min和30min后，电泳结果各个条带粗细很相似，从上往下依次为HI（48.2kDa），MntC（32.9kDa），SpA5（32.7kDa）和mSEB（28.1kDa），解离情况和时间没有明显差别，因此确定最终的解离时间为10min。
实施例2：本发明解离方法与其它解离方法的比较
本发明解离方法采用实施例1中的解离方法，解离时间为10min。采用的对照方法与上面的解离操作一致，只是加入的解离液的配方和解离时间不一样。对照方法有三种，具体如下：①1M的柠檬酸钠，常温解离1h；②2M盐酸胍，常温过夜解离；③0.1M的柠檬酸，常温解离1h。结果如图2所示：与对照方法相比，碳酸钠解离后的抗原蛋白电泳条带明显比其它方法明显，说明其解离更为完全。更为重要的是，本发明方法的解离时间更短，方便操作。这些结果表明，本发明的方案与现有报道的方法相比更有优势。
实施例2：疫苗成品抗原含量的测定
方法：
电泳样品的制备：取适量抗原原液，用双蒸水稀释至浓度分别为10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL、90μg/mL，加入5×蛋白上样缓冲液至蛋白上样缓冲液浓度为1×，100℃加热5分钟。同时取疫苗成品一支，混匀后吸取600μL与1.5mLEP管中，5000rpm离心10min，吸取上清300μL去掉，加入2M的Na2CO3溶液300μL并混匀，待溶液清亮后离心取适量上清，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟。
SDS-PAGE电泳：各浓度抗原上样量均为20μl，将电压调至80v电泳约20分钟，将电压调至160v电泳至溴酚蓝离玻璃板边缘约0.5ml处停止电泳。
转膜：将2块滤纸块用电转缓冲液浸透，PVDF膜1张用甲醇浸湿，用半干胶转移仪进行转移，电压20v，转膜20分钟。
印迹反应：转膜后取出PVDF膜，用TBST洗涤液，洗膜3次，每次10分钟。将PVDF膜置于封闭液中，4℃封闭过夜。取出PVDF膜，用TBST洗涤液，洗膜3次，每次10分钟。用1×TBS缓冲液将自制一抗（兔多抗）稀释5000倍，将封闭完成的PVDF膜置于一抗中37℃孵育1小时。取出PVDF膜，用TBST洗涤液，洗膜3次，每次10分钟。用1×TBS缓冲液将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗稀释5000倍，将PVDF膜置于二抗中37℃孵育40分钟。取出PVDF膜，用TBST洗涤液，洗膜4次，每次10分钟。按照DAB显色液试剂盒说明书进行显色，显色程度适当时水洗终止反应。结果判定：抗原标准品结果应呈现明显渐粗色带，采用蛋白凝胶成像仪对其进行灰度扫描，建立标准曲线，求得疫苗成品中所含各种抗原的含量。
结果：
采用不同浓度（10μg/ml，30μg/ml，50μg/ml，70μg/ml，90μg/ml）的抗原标准品作为对照，进行蛋白质印迹检测，结果如图3所示，通过与不同抗原制备的兔多抗均能发生明显的显色反应，在相应的分子量位置出现明显的显色带。随着各种抗原浓度的增加，条带的大小呈现出明显的梯度。
通过凝胶成像仪对各个条带进行灰度值扫描，得到表1结果。同时根据灰度值与抗原浓度的对应关系制备标准曲线，得到图4的结果，结果表明：不同抗原标准品蛋白质印迹条带灰度值与其浓度之间存在明显的直线相关，相关系数R2值均在0.98以上，可用于疫苗成品中抗原含量的测定。
表1：不同抗原标准品蛋白质印迹条带灰度值扫描结果
采用同样的方法对疫苗成品解离样品的蛋白质印迹条带进行灰度值扫描，通过图4中的公式计算得到四种抗原HI、mSEB、MntC、SpA5的含量分别为：46.03μg/ml，49.87μg/ml，48.82μg/ml和46.72μg/ml，与实际含量50μg/ml接近，属于正常范围，同时也证明采用本发明建立的方法能实现蛋白与佐剂的完全解离。以上结果也表明可以通过蛋白质印迹结合灰度值扫描建立标准曲线的方法测定疫苗成品中的抗原含量。
表2：疫苗成品四种抗原含量测定结果
Claims (5)
1.一种金黄色葡萄球菌疫苗成品的解离及抗原含量测定的方法，包括：
(1)将解离液与疫苗溶液以0.5～2:1的体积比混合，其中所述解离液是1.5-2.5M的碳酸钠溶液；
所述疫苗成品中包含抗原和佐剂，通过所述解离液实现所述抗原与所述佐剂的解离；
(2)测定疫苗成品中抗原含量，其过程为：使用针对不同抗原的抗血清，对不同浓度的抗原标准品及成品解离后样品同时进行蛋白质印迹检测，通过酶学反应的显色，结合灰度扫描仪对各条带进行灰度扫描，建立标准曲线，得到灰度值与抗原浓度之间的关系，通过回归方程求得成品中所含抗原的含量；
所述抗原为蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述解离液的浓度是2M，与疫苗溶液的体积比是1:1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述疫苗成品中包含多种抗原。
4.一种用于如权利要求1-3任一项所述的疫苗成品的解离及抗原含量测定方法的试剂盒，包括解离液和抗原含量测定试剂，其中所述解离液是1.5-2.5M的碳酸钠溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述抗原含量测定试剂是蛋白质印迹检测试剂。
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