CN103675298B - 免疫性溶血性贫血检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了免疫性溶血性贫血检测的试剂盒，本发明还公开了使用该试剂盒检测的方法。当直接抗人球蛋白试验阳性，抗体释放液抗体筛查试验阴性时判断是药物诱导型溶血性贫血；当直接抗人球蛋白试验阳性，血清/浆抗体筛查试验阳性，抗体释放液抗体筛查试验阳性时判断是温自身免疫性溶血性贫血（含溶血性输血反应）。根据结果准确诊断出免疫性溶血性贫血的种类，指导临床正确选择合适的药物用于对患者的治疗。该方法具有准确性好，适用于试管法或微柱凝胶卡法检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及免疫性溶血性贫血检测试剂盒，本发明还涉及使用该试剂盒检测免疫性溶血性贫血的方法。
背景技术
随着药物品种的大量增加，尤其是抗生素类在临床的大量使用，使得药物诱导型溶血性贫血病例大量增加，由于免疫因素从而引起红细胞大量破坏，临床上出现贫血、黄疸、酱油色尿等溶血表现，轻则影响治疗效果，重则延误病情危及患者生命安全。
如何避免患者因使用药物而导致免疫性溶血性贫血，就必须要对患者进行免疫性溶血性贫血进行及时准确的检测，停止使用能使患者产生免疫性溶血性贫血的药物，指导临床为患者选择合适的药物，来提高治疗效果。
目前，对于药物诱导型溶血性贫血检测在临床均未得到有效开展。其原因是药物诱导型溶血性贫血检测属于免疫血液学检测范围，而免疫血液学检测仅在临床医院的输血科或血库进行，输血科或血库仅负责输血前检查的内容，均未开展药物诱导型溶血性贫血检测工作，因此对于药物诱导型溶血性贫血患者不能得到及时的检测诊断，导致患者致死率高达30%以上。
药物有时会引起对药物本身的抗体形成，形成的药物抗体可以致敏或吸附在患者红细胞上，导致患者红细胞直接抗人球蛋白试验阳性，引起患者红细胞破坏，产生免疫性溶血，患者血色素下降。结果是：1、治疗患者所使用的药物疗效被降低或抑制。2、患者因药物诱导的溶血导致贫血。
为了避免因药物引起的溶血性贫血，提高药物的治疗效果，需要对药物引起的溶血性贫血进行血清学检查，以确定是否是药物引起的溶血性贫血，来指导临床正确选择合适的药物用于对患者的治疗。
目前检测免疫性溶血性贫血尚无检测试剂盒，检测的内容也仅局限于直接抗人球蛋白试验、患者血浆中的意外抗体筛查，根据直接抗人球蛋白试验的阳性或阴性来判断是否是免疫性溶血性贫血，不能检测免疫性溶血性贫血分类及导致免疫性溶血性贫血的原因。本发明不仅可以检测是否是免疫性溶血性贫血，还可以将免疫性溶血性贫血分为两类，即温自身免疫性溶血性贫血或药物诱导免疫性溶血性贫血。
发明内容
本发明的目的在于提供检测免疫性溶血性贫血的试剂盒，使用该试剂盒可以准确判断出免疫性溶血性贫血的原因；本发明还公开了使用该试剂盒的使用方法，该方法准确性好，适用于试管法或微柱凝胶卡法检测。
为实现上述目的，本发明可采用下述技术方案：
本发明所述的检测免疫性溶血性贫血的试剂盒，包括直接抗人球蛋白试剂、抗体释放试剂和抗体筛查试剂。
所述直接抗人球蛋白检测试剂包括抗人球蛋白试剂（抗IgG）、抗人球蛋白试剂（抗C3d）。
所述抗体筛查试剂为广谱抗人球蛋白试剂（抗IgG+C3d）。
所述抗体筛查试剂分别检查血浆和抗体释放液中的抗体。
所述抗体释放试剂是将抗体从红细胞上解离的试剂，即放散洗脱试剂。
所述抗体释放试剂包括热放散试剂、柠檬酸放散试剂、氯仿/三氯乙烯放散试剂、二甲苯放散试剂、甘氨酸-盐酸/乙二胺四乙酸二钠放散试剂。
其含有直接抗人球蛋白试剂有两种，分别是抗IgG和抗C3d，可以将免疫性溶血性贫血分为三类，即IgG抗体引起、C3d引起和IgG合并C3d引起。抗体释放试剂可以将致敏在红细胞上的抗体释放到释放液中。利用意外抗体筛查试剂，分别对患者的血浆中抗体、患者红细胞抗体释放液中的抗体检测，来判定免疫性溶血性贫血属于温自身免疫性溶血性贫血还是药物诱导型免疫性溶血性贫血，即确定免疫性溶血性贫血是温自身免疫性溶血性疾病导致还是患者在治疗过程中所使用的药物导致，来指导临床正确选择合适的药物用于对患者的治疗，并为临床选择合适的药物用于治疗提供依据。
本发明试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
第一步，检测待检样本红细胞是否在体内被致敏，使用直接抗人球蛋白试剂；
第二步，使用抗体释放试剂将结合在红细胞膜表面的抗体释放下来，制备抗体释放液；
第三步，利用抗体筛查试剂筛查血清/浆和抗体释放液中抗体；
第四步，根据第一、三步试验结果判断免疫性溶血性贫血的种类。
本发明的目的在于通过试管法或微柱凝胶卡法检测免疫性溶血性贫血，当直接抗人球蛋白试验阳性，抗体释放液抗体筛查试验阴性时判断是药物诱导型溶血性贫血；当直接抗人球蛋白试验阳性，血清/浆抗体筛查试验阳性，抗体释放液抗体筛查试验阳性时判断是温自身免疫性溶血性贫血（含溶血性输血反应）。
具体实施方式：
下面分别举出试管法试剂盒和微柱凝胶法试剂盒，并说明其检测使用方法。
实施例1：
本发明检测免疫性溶血性贫血（试管法）包括：
1.直接抗人球蛋白试剂：包括抗人球蛋白试剂（抗IgG）、抗人球蛋白试剂（抗C3d）。
2.抗体释放试剂（甘氨酸-盐酸/乙二胺四乙酸二钠放散技术）：包括抗体释放液Ⅰ、抗体释放液Ⅱ、抗体释放液Ⅲ。
3.抗体筛查试剂：广谱抗人球蛋白试剂（抗-IgG+C3d）。
检测方法：
1.直接抗人球蛋白试验：
(1)待检样本新鲜血液样本压积红细胞用生理氯化钠溶液洗涤一次得到压积红细胞，用生理氯化钠液配制成2~4%浓度的红细胞悬液。
(2)取3支试管，分别标记为“IgG”、“C3d”、“对照”，向标记好的试管中分别加入抗人球蛋白试剂（抗IgG）100μl、抗人球蛋白试剂（抗C3d）100μl、0.9%氯化钠溶液100μl（对照）。
(3)分别向标记好的试管中加入待检样本2~4%的红细胞悬液50μl。
(4)混匀，置离心机离心（3000rpm×15秒），观察结果并记录。
2.抗体释放液的制备：
(1)抗体释放液Ⅰ的配制：100g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)溶于蒸馏水或去离子水，定容至1000ml；
(2)抗体释放液Ⅱ的配制：0.75g甘氨酸(Gly)溶于0.9%氯化钠溶液，定容至100ml，用12mol/LHCl调pH至1.5。
工作液的制备：抗体释放液Ⅰ与抗体释放液Ⅱ按照1:4体积比例混合。
(3)抗体释放液Ⅲ的配制：12.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5.25g氯化钠(NaCl)，溶于蒸馏水或去离子水，定容至100ml。
(4)取试管1支，加入2ml工作液，再加入1ml用0.9%氯化钠溶液洗涤5-6次后得到的待检样本压积红细胞，混匀。
(5)室温孵育2分钟，3000rpm离心1分钟。
(6)将上清液移至另一洁净的试管中，滴加抗体释放液Ⅲ，调pH到7.5为反应终点。
(7)3000rpm离心3分钟，分离上清液，上清液即为抗体释放液。
3.抗体筛查试验：
(1)血清/浆抗体筛查试验：取3支试管，分别标记为“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”。向标记的试管中分别加入待检样本血浆100μl，再分别向标记好的试管中加入不规则抗体筛查红细胞试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的2~4%的红细胞悬液各50μl。
(2)抗体释放液抗体筛查试验：取3支试管，分别标记为“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”。向标记的试管中分别加入抗体释放液100μl，再分别向标记好的试管中加入不规则抗体筛查红细胞试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的2~4%的红细胞悬液各50μl。
(3)混匀，置37°C水浴孵育30分钟。取出后用0.9%氯化钠溶液洗涤三次，末次沥干，再分别加入广谱抗人球蛋白试剂（抗-IgG+C3d）100μl。
(4)置离心机离心（3000rpm×15秒），观察结果并记录。
当直接抗人球蛋白试验阳性，抗体释放液抗体筛查试验阴性时判断是药物诱导免疫性溶血性溶血性贫血；当直接抗人球蛋白试验阳性，血清/浆抗体筛查试验阳性，抗体释放液抗体筛查试验阳性时判断是温自身免疫性溶血性贫血（含溶血性输血反应）。
实施例2：
本发明检测免疫性溶血性贫血（微柱凝胶法）包括：
1.直接抗人球蛋白试剂：微柱凝胶卡包括抗人球蛋白试剂（抗IgG）凝胶柱、抗人球蛋白试剂（抗C3d）凝胶柱、空白凝胶管。
2.抗体释放试剂：包括抗体释放液Ⅰ、抗体释放液Ⅱ、抗体释放液Ⅲ。
3.抗体筛查试剂：微柱凝胶卡包括广谱抗人球蛋白试剂（抗IgG+C3d）凝胶柱。
检测方法：
1.直接抗人球蛋白试验：
(1)患者新鲜血液样本压积红细胞用生理氯化钠溶液洗涤一次得到压积红细胞，用生理氯化钠液配制成0.5~1%浓度的红细胞悬液。
(2)取直接抗人球蛋白试验微柱凝胶卡，每份待检患者样本标记3孔。向标记的每孔中加入患者样本0.5~1%的红细胞悬液50μl。
(3)轻叩混匀，置微柱凝胶卡配套专用离心机离心，观察结果并记录。
2.抗体释放液的制备：同实施例1。
3.抗体筛查试验：
(1)血清/浆抗体筛查试验：取抗体筛查微柱凝胶卡，每份待检患者样本标记3孔，分别标记为“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”。向标记的每孔中加入不规则抗体筛查红细胞试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的0.5~1%的红细胞悬液各50μl，再分别加入待检样本血浆25μl。
(2)抗体释放液抗体筛查试验：取抗体筛查微柱凝胶卡，每份待检患者样本标记3孔，分别标记为“Ⅰ”、“Ⅱ”、“Ⅲ”。向标记的每孔中加入不规则抗体筛查红细胞试剂Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的0.5~1%的红细胞悬液各50μl，再分别加入抗体释放液25μl。
(3)轻叩混匀，置免疫微柱孵育器37°C孵育15分钟。取出后置微柱凝胶卡配套专用离心机离心，观察结果并记录。
当直接抗人球蛋白试验阳性，抗体释放液抗体筛查试验阴性时判断是药物诱导型溶血性贫血；当直接抗人球蛋白试验阳性，血清/浆抗体筛查试验阳性，抗体释放液抗体筛查试验阳性时判断是温自身免疫性溶血性贫血（含溶血性输血反应）。
Claims (3)
1.一种免疫性溶血性贫血检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为微柱凝胶法试剂盒，它包括：
（一）.直接抗人球蛋白试剂：微柱凝胶卡包括抗IgG抗人球蛋白试剂凝胶柱、抗C3d抗人球蛋白试剂凝胶柱、空白凝胶管；
（二）.抗体释放试剂：包括抗体释放液Ⅰ、抗体释放液Ⅱ、抗体释放液Ⅲ；
（三）.抗体筛查试剂：微柱凝胶卡包括广谱抗人球蛋白试剂凝胶柱；
所述抗体释放液的制备如下：
(1)抗体释放液Ⅰ的配制：100g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)溶于蒸馏水或去离子水，定容至1000ml；
(2)抗体释放液Ⅱ的配制：0.75g甘氨酸(Gly)溶于0.9%氯化钠溶液，定容至100ml，用12mol/LHCl调pH至1.5；
(3)抗体释放液Ⅲ的配制：12.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，5.25g氯化钠(NaCl)，溶于蒸馏水或去离子水，定容至100ml。
2.根据权利要求1所述的免疫性溶血性贫血检测试剂盒，其特征在于：所述抗体筛查试剂分别检查血浆和抗体释放液中的抗体。
3.根据权利要求1所述的免疫性溶血性贫血检测试剂盒，其特征在于：所述抗体释放试剂是将抗体从红细胞上解离的试剂，即放散洗脱试剂。
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