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CN103667422B - 人cul4b基因的用途及其相关药物 - Google Patents

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CN103667422B CN201210313850.8A CN201210313850A CN103667422B CN 103667422 B CN103667422 B CN 103667422B CN 201210313850 A CN201210313850 A CN 201210313850A CN 103667422 B CN103667422 B CN 103667422B
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Abstract

本发明公开了人CUL4B基因的用途及其相关药物。本发明公开了人CUL4B基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人CUL4B基因小分子干扰RNA、人CUL4B基因干扰核酸构建体、人CUL4B基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人CUL4B基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中CUL4B基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

人CUL4B基因的用途及其相关药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人CUL4B基因的用途及其相关药物。
背景技术
RNA干扰（RNA interference,RNAi）即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi（Tuschl T，Zamore PD,Sharp PA,Bartel DP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to 23nucleotide intervals.Cell 2000;101:25-33.）。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程（Uprichard,Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.）。
CUL4B（cullin 4b）属于cullin家族，该家族成员与细胞的分裂增殖有密切关系，其变异或异常表达将引起细胞不适当的增殖，而且cullin基因家族成员在多种肿瘤组织中都有异常的表达（Salon C,Brambilla E,Brambilla C,et al.Altered pattern of cul-1protein expression and neddylation in human lung tumors:relationships withCAND 1 and cyclin E protein levels.J Pathol.2007;213(3):303-310.Laura PS,Lorenzo M,Francisco J,et al.Abstract 91:The CUL4A ubiquitin ligase,a putativetarget gene at the 13q34 amplicon and its role in breast cancer pathogenesis&progression.Cancer Research.2012；72(8):91.）。
人cullin家族中CUL4B和CUL4A蛋白质序列同源性高达83%（Sarikas A,HartmannT,Pan ZQ.The cullin protein family.Genome Biol.2011;12:220.），过去的研究常将两者作为一体（CUL4）来研究，对CUL4 CRLs的功能研究多由CUL4A获得，CUL4A在乳腺癌和肝细胞癌中表达上调（Laura PS,Lorenzo M,Francisco J,et al.Abstract 91:The CUL4Aubiquitin ligase,a putative target gene at the 13q34 amplicon and its role inbreast cancer pathogenesis&progression.Cancer Research.2012；72(8):91.），表明CUL4A可能在细胞增殖调控方面发挥重要作用。但近来的研究提示两者可能在部分功能及具体作用机制上存在较大差异。2007年的研究发现，CUL4B基因突变可以导致一种X连锁的智力低下综合症，提示该基因可能是一常见的X连锁的智力低下综合症致病基因（PatrickST,F.Lucy R,Sarah O,Mutations in CUL4B,Which Encodes a Ubiquitin E3 LigaseSubunit,Cause an X-linked Mental Retardation Syndrome Associated withAggressive Outbursts,Seizures,Relative Macrocephaly，Central Obesity，Hypogonadism,Pes Cavus,and Tremor.Am.J.Hum.Genet.2007;80:345–352.），至此CUL4B的重要性才逐渐被认识，CUL4B的功能因此引起了人们极大的兴趣。有研究显示CUL4B低表达可能导致细胞增殖障碍，出现S期阻滞并且造成细胞周期蛋白cyclin E半衰期延长。研究还发现CUL4B主要表达于细胞核内，其N末端的37KKRK40为CUL4B蛋白的核定位信号，并且CUL4B功能的发挥与其正确入核密切相关（Zou YX,Mi J,Cui JP，et al.Characterizationof Nuclear Localization Signal in the N Terminus of CUL4B and Its EssentialRole in Cyclin E Degradation and Cell Cycle Progression.J Biol Chem.2009November 27;284(48):33320–33332.）。以上研究结果表明，CUL4B在调控细胞增殖中发挥着重要的作用。但到目前为止，对于CUL4B在肿瘤细胞增殖调控中的作用及机制知之甚少。
为了深入研究CUL4B在肿瘤细胞增殖中的调节功能，本发明选取骨肉瘤和结肠癌细胞模型，以RNAi为手段研究CUL4B在骨肉瘤和结肠癌发生和发展中的作用。
发明内容
本发明的目的在于公开与人CUL4B（cullin 4B）基因相关的治疗方法及药物，以RNA干扰（RNAi）为手段研究CUL4B基因在肿瘤细胞的存活和凋亡过程中的作用。
本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了CUL4B基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制CUL4B基因的转录或翻译，或能够特异性抑制CUL4B蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
所述肿瘤细胞选自其生长与CUL4B蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优的，所述肿瘤细胞选自骨肉瘤、结肠癌之任一。
所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量为足够降低CUL4B基因的转录或翻译，或者足够降低CUL4B蛋白的表达或活性的剂量。进一步的，所述CUL4B基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
所述分子可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA（esiRNA）或者短发夹RNA（shRNA）。
所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有CUL4B基因的启动子序列或CUL4B基因的信息序列。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。所述小干扰RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与CUL4B基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人CUL4B基因的表达。
进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与CUL4B基因中的靶序列基本相同。较优的，所述CUL4B基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1-18中之任一序列。
所述CUL4B基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默CUL4B基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的CUL4B基因中的片段。
较佳的，所述CUL4B基因来源于人。
本发明第一方面还公开了一种分离的人CUL4B基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
进一步的，所述肿瘤选自骨肉瘤或结肠癌。
所述将分离的CUL4B基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将CUL4B基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将CUL4B基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
所述将CUL4B基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将CUL4B基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内CUL4B基因的表达水平。
所述将CUL4B基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将CUL4B基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人CUL4B基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的CUL4B基因小分子干扰RNA（siRNA）即是以人CUL4B基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将CUL4B基因及其蛋白作为作用对象。
所述将CUL4B基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将CUL4B基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制CUL4B基因的转录或翻译，或能够特异性抑制CUL4B蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中CUL4B基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
所述通过分离的CUL4B基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA（esiRNA）或者短发夹RNA（shRNA）。
所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人CUL4B基因的转录或翻译，或者足够降低人CUL4B蛋白的表达或活性的剂量。以使人CUL4B基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人CUL4B基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人CUL4B基因表达水平的物质给药于患者。
本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中CUL4B基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：
a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与CUL4B基因杂交的核苷酸序列；或者
b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与CUL4B基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与CUL4B基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与CUL4B基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与CUL4B基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与CUL4B基因中的靶序列基本相同。
进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与CUL4B基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA（siRNA）进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源CUL4B基因表达的作用。
更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与CUL4B基因中的靶序列基本相同。
所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与CUL4B基因中的靶序列基本相同，所述CUL4B基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默CUL4B基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的CUL4B基因中的片段。
较佳的，所述CUL4B基因中的靶序列含有SEQ IDNO:1-18之任一序列。
进一步的，所述CUL4B基因来源于人。
所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：30所示，具体为5’-AGCAGUGGAAGCUAUUCAGAA-3’。
SEQ ID NO：30所示的siRNA为以SEQ ID NO:4所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人CUL4B基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源CUL4B基因表达的作用。
进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。
更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:31所示，具体为：5’-AGCAGUGGAAGCUAUUCAGAAUUCAAGAGAUUCUGAAUAGCUUCCACUGCU-3’。
shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人CUL4B基因表达的作用。
编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO:1-18中之任一序列及其互补序列。
本发明第三方面，公开了一种CUL4B基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
所述的人CUL4B基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人CUL4B基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述CUL4B基因干扰核酸构建体为CUL4B基因干扰慢病毒载体。
本发明的CUL4B基因干扰慢病毒载体是将编码前述CUL4B基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述CUL4B基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默CUL4B基因的表达。
进一步的，所述CUL4B基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP）。
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA 1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人CUL4B基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-GFP-CUL4B-siRNA。
本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为骨肉瘤或结肠癌。
本发明的CUL4B基因siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗肿瘤的药物或制剂。CUL4B基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述CUL4B基因siRNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明第四方面，公开了一种CUL4B基因干扰慢病毒，由前述CUL4B基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对CUL4B基因的小分子干扰RNA，从而抑制骨肉瘤或结肠癌肿瘤细胞的增殖。该CUL4B基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，CUL4B基因干扰核酸构建体，和/或CUL4B基因干扰慢病毒。
进一步的，所述药物组合物含有1～99wt%所述双链RNA、shRNA、CUL4B基因干扰核酸构建体或CUL4B基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗骨肉瘤、结肠癌之任一的肿瘤治疗药物中的应用。
该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。
所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
本发明第六方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的CUL4B基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，CUL4B基因干扰核酸构建体，和/或所述的CUL4B基因干扰慢病毒。
综上所述，本发明设计了针对人CUL4B基因的18个RNAi靶点序列，构建相应的CUL4BRNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO：4的RNAi载体pGCSIL-GFP-CUL4B-siRNA能够显著下调CUL4B基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus，简写为Lv）作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-CUL4B-siRNA能够靶向地将针对CUL4B基因的RNAi序列高效导入人骨肉瘤SaoS2细胞和结肠癌RKO细胞，降低CUL4B基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的CUL4B基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人CUL4B基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中CUL4B基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
附图说明
图1：pGCSIL-GFP质粒DNA图谱
图2：CUL4B-RNAi慢病毒侵染人骨肉瘤SaoS2细胞和结肠癌RKO细胞5天后，CUL4BmRNA的表达水平显著降低
图3：CUL4B-RNAi慢病毒侵染人骨肉瘤SaoS2细胞5天后，引起细胞增殖抑制
图4：CUL4B-RNAi慢病毒侵染人结肠癌RKO细胞5天后，引起细胞增殖抑制
具体实施方式
本发明涉及了一组针对人CUL4B基因的小分子干扰RNA（siRNA）序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人CUL4B mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30（优选15-27，更优选19-23）个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源CUL4B基因的表达。
发明人发现，采用RNAi方法下调人CUL4B基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，这一研究成果表明CUL4B基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对CUL4B基因的siRNA，筛选出了可有效抑制CUL4B的表达进而抑制人骨肉瘤SaoS2细胞和结肠癌RKO细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一系列干扰人CUL4B基因的小干扰RNA（siRNA）序列，构建了可特异性沉默CUL4B基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人CUL4B基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调CUL4B基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明CUL4B基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默CUL4B基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
本发明的设计思路为：
本发明通过如下方法来筛选获得一种人CUL4B基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人CUL4B基因序列；预测siRNA位点；合成针对CUL4B基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达CUL4B基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体（Packing Mix，Sigma-aldrich公司）共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默CUL4B基因的慢病毒。
基于上述方法，本发明提供了18个干扰CUL4B基因的有效靶点（具体如SEQ ID NO：1-18所示），构建了特异干扰人CUL4B基因的慢病毒。
同时本发明还公开一种人CUL4B基因RNAi慢病毒（CUL4B-RNAi）及其制备与应用。
本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低CUL4B基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，CUL4B基因可能是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，CUL4B基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的CUL4B基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如［美］Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1针对人CUL4B基因RNAi慢病毒的制备
1.筛选针对人CUL4B基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取CUL4B（NM_003588）基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对CUL4B基因的有效的siRNA靶点。在CUL4B基因的编码序列（CDS）区域内，每隔一个碱基起始获得21个碱基的序列，表1列出了其中18条针对CUL4B基因的有效siRNA靶点序列。
表1靶向于人CUL4B基因的siRNA靶点序列
2.慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点（以SEQ ID NO：4为例）合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列（表2）；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体（上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1），使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37℃，反应1h）的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系（连接体系如表5所示）中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）。
在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物（上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’（SEQ ID NO：23）；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’（SEQ ID NO：24），进行PCR鉴定实验（PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2）。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO：4靶标序列的表达对应RNAi的载体，命名为pGCSIL-GFP-CUL4B-siRNA。
构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’（SEQ ID NO：25）。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列（表3）,其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-CUL4B-siRNA。
表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
5’ 颈 环 颈 3’ SEQ
正义链 CCGG TTCTCCGAACGTGTCACGT TTCAAGAGA ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTG 21
反义链 AATTCAAAAA TTCTCCGAACGTGTCACGT TCTCTTGAA ACGTGACACGTTCGGAGAA 22
通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37℃，反应1h）的载体
表4pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系
试剂 体积(μl)
pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl) 2.0
10×buffer 5.0
100×BSA 0.5
Age I(10U/μl) 1.0
EcoR I(10U/μl) 1.0
dd H2O 40.5
Total 50.0
表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系
试剂 阳性对照(μl) 自连对照(μl) 连接组(μl)
线性化的载体DNA(100ng/μl) 1.0 1.0 1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) 1.0 - 1.0
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0
T4噬菌体DNA连接酶 1.0 1.0 1.0
dd H2O 16.0 17.0 16.0
Total 20.0 20.0 20.0
表6-1PCR反应体系
试剂 体积(μl)
10×buffer 2.0
dNTPs(2.5mM) 0.8
上游引物 0.4
下游引物 0.4
Taq聚合酶 0.2
模板 1.0
ddH2O 15.2
Total 20.0
表6-2PCR反应体系程序设定
3.包装CUL4B-siRNA慢病毒
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-CUL4B-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION LentiviralPackaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix（PVM）20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5%CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。
收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置（Millipore）纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：（1）4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；（2）0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；（3）4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；（4）离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；（5）把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA第一链的序列如SEQID NO:30所示。对照慢病毒的包装过程同CUL4B-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-CUL4B-siRNA载体。
实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测CUL4B基因的沉默效率
处于对数生长期的人骨肉瘤SaoS2细胞和结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×104/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（MOI，SaoS2:10，RKO:10）值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA（逆转录反应体系见表7，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活）。
采用TP800型Real time PCR仪（TAKARA）进行实时定量检测。CUL4B基因的引物如下：上游引物5’-GGGAAAGGAATGGTGAA-3’（SEQ ID NO：26）和下游引物5’-TGCATAGAGCCGGTTAG-3’（SEQ ID NO：27）。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’（SEQ ID NO：28）和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’（SEQ IDNO：29）。按表8中的比例配置反应体系。
表7逆转录反应体系
试剂 体积(μl)
5×RT buffer 4.0
10mM dNTPs 2.0
RNasin 0.5
M-MLV-RTase 1.0
DEPC H2O 3.5
Total 11.0
表8Real-time PCR反应体系
试剂 体积(μl)
SYBR premix ex taq: 10.0
上游引物（2.5μM）： 0.5
下游引物（2.5μM）： 0.5
cDNA 1.0
ddH2O 8.0
Total 20.0
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了CUL4B mRNA的表达丰度。侵染对照病毒（Lv-Scr-siRNA）的细胞作为对照。实验结果（图2）表明，人骨肉瘤SaoS2细胞和结肠癌RKO细胞中CUL4B mRNA的表达水平下调了90.1%和48.3%。
实施例3检测侵染CUL4B-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
处于对数生长期的人骨肉瘤SaoS2细胞和结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×104/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（MOI，SaoS2:10，RKO:10），加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2×104/ml），以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。
铺好板后，置37℃、5%CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器（Thermo Fisher）检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线（结果如图3-图4所示）。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数分别下降了55.4%和86%，表明CUL4B基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种分离的人CUL4B基因在制备或筛选骨肉瘤治疗药物中的用途。
2.一种药物组合物在制备治疗骨肉瘤的肿瘤治疗药物中的用途，所述药物组合物含有降低骨肉瘤细胞中CUL4B基因表达的分离的核酸分子、CUL4B基因干扰核酸构建体、或CUL4B基因干扰慢病毒之任一，所述核酸分子包含：
a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与CUL4B基因杂交的核苷酸序列，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与CUL4B基因中的靶序列基本相同，所述CUL4B基因的靶序列含有SEQ IDNO:4所示序列，所述双链RNA为小干扰RNA，该小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：30所示；或者
b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与CUL4B基因杂交的核苷酸序列，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与CUL4B基因中的靶序列基本相同，所述CUL4B基因的靶序列含有SEQ ID NO:4所示序列，所述shRNA的序列如SEQ ID NO：31所示；所述CUL4B基因干扰核酸构建体含有编码所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA；所述CUL4B基因干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体；所述CUL4B基因干扰慢病毒，由所述干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述干扰慢病毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
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