CN103649758B - 狼疮抗凝物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供即使是来自接受华法林、肝素等抗凝血疗法的患者的试样，也不受该抗凝血疗法的影响，且能够与血液凝固因子的缺乏进行鉴别，不使用健康者血浆的简便的LA检测方法的开发。一种狼疮抗凝物的检测方法，其特征在于，包括下述工序（A）、（B）以及（C）。（A）在血液凝固时间的测定前或者测定时，分别向血液试样和该试样的稀释试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物的工序，（B）对工序（A）的各试样测定血液凝固时间的工序，（C）对在工序（B）中得到的各试样的血液凝固时间进行对比的工序。

Description

狼疮抗凝物的检测方法

技术领域

本发明涉及一种在抗磷脂抗体综合征的诊断中使用的检测狼疮抗凝物阳性的方法。

背景技术

狼疮抗凝物（LA）是首先在SLE（系统性红斑狼疮，Systemic LupusErythematosus）患者中被报告的循环抗凝血素。对于LA阳性患者而言，在临床上几乎没有确认到出血趋势，而显示血栓趋势。但是，对于来自LA阳性患者的试样而言，在体外显示活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）的延长趋势。根据其后的研究，明确了LA是针对带阴性电荷的磷脂与像β2-糖蛋白I（β2GPI）或者凝血酶原这样的血液中的蛋白质的复合体的自身抗体，现在已知对于SLE以外的疾病也大多检测出LA。特别是在被统称为“抗磷脂抗体综合征（Antiphospholipid symdrome；APS）”的病状中发生频率高，成为其诊断基准中的检查结果之一（非专利文献1）。

LA被定义为一种不阻碍每个凝血因子活性地阻碍体外磷脂依赖性的凝血反应（APTT、高岭土凝血时间、稀释拉塞尔（Russell）蛇毒时间等）的免疫球蛋白，而并非单一的抗体。例如作为LA的主要抗体的一种，发现了抗心磷脂-β2GPI复合体抗体、抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合体抗体等，存在基于ELISA法的测定体系。但是，不能否认除这些以外的LA责任抗体的存在，即使这些已知的责任抗体全部为阴性，LA也有呈阳性的情况。

作为LA的检测用试剂，通常使用含有磷脂的血液凝固时间测定用试剂。如果样品中含有LA，则LA与试剂中的磷脂结合，因此进行体外的凝血反应所需的磷脂不足，血液凝固时间延长。因此，根据该血液凝固时间的延长，可以判定LA阳性。作为该LA检测用试剂的例子，有APTT、PT、以及稀释拉塞尔蛇毒时间（dRVVT）用的试剂等。

另外，还进行血液凝固修正试验（以下，有时也称为“混合试验”“Mixing text”），即，使用含有磷脂的血液凝固时间测定用试剂，向被检血浆中添加正常血浆，将其血液凝固时间被修正（正常化）的程度图表化而进行判定（非专利文献2）。

作为市售的LA检测用试剂，可利用LA测试“Gradipore”（医学生物学研究所社制）之类的基于dRVVT的测定用试剂。该试剂基于由添加拉塞尔蛇毒引起的凝固时间与由添加拉塞尔蛇毒和过量浓度的磷脂引起的凝固时间之比来判定样品中的LA的有无。

另外，除上述之外，还市售有STACLOT LA（DIAGNOSTICA STAGO公司制）之类的LA检测用试剂。在使用该试剂时，通过观察向被检血浆中加入正常血浆和过量磷脂时与向被检血浆中仅加入正常血浆时的APTT的凝固时间之差来判定样品中的LA的有无。

但是，对于上述现有方法而言，仅仅利用各试剂测定单独的项目时，难以鉴别凝固时间的延长原因是单纯由缺乏凝血因子所致的，还是由针对凝血因子的抑制因子所致的，还是由LA所致的。另一方面，因该原因的不同而导致治疗方针不同，所以其鉴别很重要。因此，这些LA检测方法很少单独使用，推荐组合2种以上的检查，综合判断其结果（非专利文献3）。

非专利文献1:INTERNATIONAL CONSENSUS STATEMENT ON PRELIMINARYCLASSIFICATION CRITERIA FOR DEFINITE ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME，ARTHRITIS＆RHEUMATISM Vol.42,No.7,July1999,pp1309-1311

非专利文献2:检查与技术，Vol.34,No.8,2006年8月,pp735-742

非专利文献3:Update of the guidelines for lupus anticoagulantdetection,Journal of Thrombosis and Haemostasis，7：pp1737-1740（2009）

发明内容

如上所述，为了进行LA检测，必须要组合若干种检查，很复杂，存在对于其结果的解释也需要熟练的问题。例如，在多种LA检测方法中阳性、阴性的判定不同时，需要在考虑各检测方法的原理后作出的解释，而且必须要根据各检测方法的假阴性·假阳性的可能性进行判断，非常难以用现有的LA检测方法鉴别LA的有无。

另外，LA阳性患者大多呈现血栓症状，怀疑LA并开始检查时，大多已经实施抗凝血疗法。但是，对于来自实施抗凝血疗法的患者的试样而言，已知有在APTT、dRVVT中呈假阳性而在混合试验中产生假阴性的情况。

作为抗凝血疗法，紧急时，可使用有速效性且能够静脉内给药的肝素、通过长期给药来预防时，可使用作为口服抗凝血药的华法林。华法林通过对维生素K的作用进行拮抗，从而抑制血液凝固因子中的第II因子（凝血酶原）、第VII因子、第IX因子、第X因子在肝脏中的生物合成。因此，对于华法林服用者而言，由于这些凝血因子的活性降低，所以与LA的有无无关地，APTT、PT、dRVVT大幅度延长。另外，在混合试验中，有时与LA的有无无关地被判定为因子缺乏型。另外，肝素由于使抗凝血酶活化，使抗凝血作用活化而抑制凝固，所以与LA的有无无关地大幅度延长凝血时间。

因此，国际血栓止血学会（ISTH）推荐，在进行LA检测时，对于来自华法林给药患者的试样，为了补充不足的凝血因子，对被检血浆混合等量的健康者血浆后进行测定。对于上述健康者血浆，进行二次离心处理，以使血小板数低于10⁷/mL，且各家自行制备所有血液凝固因子的活性几乎为100%的试样而使用（非专利文献3）。但是，在血液凝固因子中还存在活性非常不稳定且易失活的物质，所以非常难以制备这样的健康者血浆，有不易稳定获得的问题。

另外，在上述健康者血浆的制备中，虽然储留（存积）、混合血浆的人数越多，越能够使凝血因子活性的每个人的波动平均化，但是因设备而导致无法确保健康者的人数，血浆提供者出现偏差，因此还存在批次间的品质产生差别的问题。进而，使用健康者血浆的方法不仅会稀释被检血浆中的LA，有时也会添加健康者血浆中所含的阻碍LA测定的物质（来自磷脂、血小板的破碎膜等），所以特别是LA呈弱阳性时，还存在可能会发生假阴性化的问题。

在利用抗凝血疗法抑制血栓症状期间，该血栓症状的原因的鉴别影响治疗方针，所以很重要。另外，在最初确认LA阳性并开始抗凝血疗法时，也认为监视LA的消长是非常有用的，但是目前不存在简便地实现它的方法。

因此，迫切期望开发即使是来自接受华法林、肝素等抗凝血疗法的患者的试样，也不受该抗凝血疗法的影响、且能够与血液凝固因子的缺乏进行鉴别，不使用健康者血浆的简便的LA检测方法。

因此，本发明人为了解决上述课题进行了各种研究，结果发现，准备血液试样及其稀释试样，在该各试样的血液凝固时间的测定前或者测定时，向各试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物（以下，也称为辅助试剂），对该各试样测定血液凝固时间，只要对这些各试样的血液凝固时间进行对比，就能够不受抗凝血疗法影响地、与现有的方法相比敏感度·特异度也良好地检测LA，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种狼疮抗凝物的检测方法，其特征在于，包括以下工序（A）、（B）以及（C）。

（A）在血液凝固时间的测定前或者测定时，分别向血液试样和该试样的稀释试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物的工序，

（B）对工序（A）的各试样测定血液凝固时间的工序，

（C）对工序（B）中得到的各试样的血液凝固时间进行对比的工序

根据本发明，即使是来自接受华法林、肝素等抗凝血疗法的患者的试样，也能够不受到该抗凝血疗法的影响地、简便且与以往相比敏感度良好地特异地确认LA的有无。因此，不必在意患者是否接受了抗凝血疗法。另外，在用于LA检测的凝固时间测定中，不需要准备健康者血浆，因此，也消除了以往构成问题的健康者血浆的批次间的差别、难以稳定获得的问题。

具体实施方式

本发明的LA检测方法的特征在于进行上述工序（A）、（B）以及（C）。更详细而言，其特征在于，使用血液试样和该血液试样的稀释试样（以下，也简称为稀释试样）作为测定样本，分别添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物，测定血液凝固时间，比较该凝固时间。对于LA阴性患者而言，在使用稀释试样时，由于凝血因子减少，所以与未稀释的试样相比凝固时间延长。对于LA阳性患者而言，在使用稀释试样时，由于凝血因子减少，另一方面LA也减少，所以试剂中的未与LA结合的磷脂量变多，与未稀释的试样相比，凝固时间延长的反应和缩短的反应同时发生。捕获LA（抗体）的磷脂的效价高时，与未稀释的试样相比，凝固时间缩短。

本发明方法所使用的血液试样优选全血或者血浆，通常向从被检者采集的血液中加入枸橼酸钠等抗凝血剂来制备。在这些血液试样中，对于将以往难以进行LA检测的来自被检者的血液试样作为对象的情况，本发明特别有用。作为这样的血液试样，可举出华法林服用者、接受肝素疗法等抗凝血疗法的患者、维生素K缺乏者、以及肝功能不全患者等的血液试样。

稀释试样的稀释倍率优选1.1倍以上，更优选1.1～3倍，进一步优选1.5～3倍。血液试样的稀释所使用的稀释液优选缓冲液。应予说明，预先稀释血液试样时，稀释试样是将其进一步稀释而使用的。

在本发明方法的工序（A）中，向血液试样和稀释试样这两者添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物。用稀释试样对LA阳性患者血浆测定凝固时间时，由凝血因子活性的降低所引起的凝固时间延长与由LA的稀释所引起的凝固时间缩短这两者进行拮抗。对于由于服用华法林等而患者血浆的凝血因子活性降低的情况，凝固时间延长易成为优势。因此，在本发明中，为了抑制由凝血因子活性的降低所引起的凝固时间延长，提高对LA的敏感度，对血液试样和稀释试样均添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物。

作为本发明所使用的缓冲液组合物中含有的血液凝固因子，适当选择使用被认为在被检血液试样中缺乏的血液凝固因子、参与所使用的血液凝固时间测定用试剂的测定反应的凝血因子。具体而言，优选含有选自FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI以及FXII中的血液凝固因子中的至少1种，更优选含有选自FII、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI以及FXII中的1种或2种以上，进一步优选至少含有选自FII、FVII、FIX以及FX中的1种或2种以上。另外，测定PT时，优选含有选自FII、FVII以及FX中的1种或2种以上。测定APTT时，优选含有选自FII、FVIII、FIX、FX、FXI以及FXII中的1种或2种以上，特别优选含有选自FII和FIX中的1种或2种以上。另外，测定dRVVT时，优选含有选自FII和FX中的1种或2种以上。

向被检血液试样中添加缓冲液组合物后，凝血因子的浓度优选为0.01～2.0U/mL，更优选为0.1～1.0U/mL。例如，将被检血液试样与缓冲液组合物以9：1的比例混合时，缓冲液组合物中的凝血因子的浓度优选0.1～20U/mL，更优选为1～10U/mL。

缓冲液的pH只要是不使在辅助试剂中含有的血液凝固因子失活的pH即可，优选pH6～9，更优选为pH6.5～8.0。作为缓冲液，可以适当使用HEPES等Good缓冲液等、公知的缓冲液。缓冲液的浓度只要可保持保存中的缓冲能力即可，优选5～100mM，更优选为5～50mM。

应予说明，也可以向辅助试剂中适当添加公知的物质作为血液凝固因子的稳定化剂。例如，可以添加日本特公平06-050999号公报中公开的甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸等。

在本发明方法中，在血液凝固时间的测定前或者测定时，向血液试样和稀释试样中添加含有上述血液凝固因子的缓冲液组合物。此处，在血液凝固时间的测定前添加缓冲液组合物相当于血液试样和稀释试样的前处理。即，向血液试样和稀释试样中添加上述缓冲液组合物，对血液试样或者稀释试样进行前处理，接着，使用血液凝固测定用试剂来测定血液凝固时间。另一方面，在血液凝固时间的测定时添加，相当于对血液凝固测定用试剂的一部分添加上述缓冲液组合物，测定血液凝固时间。在这些添加时期中，从容易确保缓冲液组合物中含有的凝血因子的保存稳定性的方面考虑，优选在血液凝固时间的测定前向血液试样和稀释试样中添加上述缓冲液组合物。

作为血液凝固时间测定用试剂，只要是对LA显示感受性的磷脂依赖性的血液凝固时间测定用试剂或测定法即可，可以使用测定凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、稀释PT（dPT）、稀释APTT（dAPTT）、高岭土凝血时间（KCT）、以及稀释拉塞尔蛇毒时间（dRVVT）等的公知的试剂。这些公知的试剂是配合测定原理而适当组合下述物质而成的，即，脑磷脂等磷脂、以高岭土等阴性带电体为主成分的接触因子活化剂、氯化钙等产生Ca^2＋的化合物、蛇毒等。作为试剂的形态，可以适当选择使用时被溶解的干燥状态或者溶液状态等。作为上述试剂，均可以使用市售品。作为PT测定用试剂，例如市售有COAGPIA（注册商标）PT-N（SEKISUI MEDICAL公司制）、Thrombocheck PT Plus（Sysmex公司制）、以及STA试剂Series PT（Roche Diagnostics公司制）等。作为APTT测定用试剂，例如市售有COAGPIA（注册商标）APTT-N（SEKISUI MEDICAL公司制）、Thrombocheck APTT-SLA（Sysmex公司制）、APTTLiquid“RD”和PTT-LA试剂“RD”（Roche Diagnostics公司制）等。作为dRVVT测定用试剂，市售有LA测试“Gradipore”（医学生物学研究所社制）。另外，还可以将这些试剂中的1种以上与本发明的含有血液凝固因子的缓冲液组合物（辅助试剂）组合而形成LA检测用的试剂盒。

作为比较血液试样与稀释试样的凝固时间的方法，可以计算它们之比。例如，以血液试样的凝固时间为基准时，利用下述式计算比。

比＝（稀释试样的凝固时间）/（血液试样的凝固时间）

此时，比越大，则稀释试样的凝固时间越延长，所以为LA阴性，比越小，则判断为LA阳性。

用于判断阴性、阳性的cutoff值优选由没有凝固异常的健康者血浆的测定值利用一般的方法以统计学方法计算。例如，从20名以上的健康者血浆的测定值求出平均值和标准偏差（SD），计算平均值＋2SD（根据情况，也可以是平均值-2SD）。或者利用百分位数法等决定。

实施例

通过以下的实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于以下实施例。

＜测定项目＞

（1）APTT筛选试验

使用PTT LA试剂“RD”（DIAGNOSTICA STAGO公司制），利用血液凝固自动分析装置STA-R（Roche Diagnostics公司制）实施测定。对于用于判定的cutoff值，使用20名以上的健康者测定值＋2SD的值。

（2）dRVVT试验

使用LA测试“Gradipore”（医学生物学研究所社制），利用血液凝固自动分析装置STA-R实施测定。对于用于判定的cutoff值，使用20名以上的健康者测定值＋2SD的值。

（3）混合试验

使用PTT LA试剂“RD”（DIAGNOSTICA STAGO公司制），利用血液凝固自动分析装置CP2000（SEKISUI MEDICAL公司制）实施测定。使用Pooled Normal Plasma（以下PNP，Precision Biologic Inc.）作为正常血浆。样本混合比例设定为0、10、20、50、100%，使用CP2000的混合试验功能，采用自动稀释进行测定。如果绘图后向上方突起，则判定为LA阳性。

（4）APTT试验变型（本发明的方法）

使用COAGPIA APTT-N（SEKISUI MEDICAL公司制）和后述的含有血液凝固因子的缓冲液（以下，辅助试剂），用表1所示的测定参数利用血液凝固自动分析装置CP2000（SEKISUIMEDICAL公司制）实施测定。具体而言，首先，将向被检血浆45μL中添加5μL的辅助试剂而得到的试样作为样本，测定APTT（条件1）。接着，向用HBS（50mM HEPES pH7.5，150mM氯化钠）稀释被检血浆而得到的稀释试样（血浆25μL：HBS20μL）中添加5μL的辅助试剂，将得到的试样作为样本，测定APTT（条件2）。将条件1的APTT设为A秒、条件2的APTT设为B秒时，计算B/A（Ratio）作为用于判定的测定值。由于在后述的本发明1、2中根据稀释时的凝固时间缩短来判别LA的有无，所以Ratio小的试样为阳性。对于用于判定的cutoff值，使用20名以上的健康者血浆的测定值-2SD的值。

表1

测定参数

＜辅助试剂＞

将HBS（50mM HEPES pH7.5，150mM氯化钠）作为基础溶液，向其中添加表2所示的血液凝固因子，制备辅助试剂1和辅助试剂2。血液凝固因子全部使用HaematologicTechnologies Inc.制的血液凝固因子。

应予说明，在后述的表3～表6中，将使用了辅助试剂1时的结果作为“本发明1”来表示，将使用了辅助试剂2时的结果作为“本发明2”来表示。

表2

辅助试剂组成

	人凝血因子	人凝血因子IX	人凝血因了VIII
				辅助试剂1	200μggmL	2U/mL	-
辅助试剂2	200μg/mL	2U/m	2U/mL

上述表2中，人凝血因子（Human Factor II）的200μg/mL相当于2U/mL。

＜被检血浆＞

·被检血浆A、B、C是从接受华法林给药的患者采集的血浆。根据临床症状等，否定LA的存在。

·被检血浆1-2是缺乏血液凝固第VIII因子和血液凝固第IX因子的血浆。未接受抗凝血剂的给药。

·被检血浆3-10是从接受作为抗凝血剂的肝素的给药的患者采集的血浆。根据临床症状等，否定LA的存在。

·被检血浆11-37是从根据基础疾病、临床症状而怀疑存在抗磷脂抗体的患者采集的血浆。其中，11-24是从接受华法林给药的患者采集的血浆。

＜结果＞

如表3所示，在华法林给药·非LA组中，APTT筛选试验中全部为cutoff值以上，难以进行与LA阳性的鉴别。另外，对于dRVVT试验，3个例子中的2个例子为假阳性（表中用“阳性＊”表示）。另一方面，混合试验和本发明1、2中全部为阴性。

表3

如表4所示，在否定LA的凝血因子缺乏（FVIII和FIX）患者血浆中，APTT筛选试验中全部为cutoff值以上，难以进行与LA阳性的鉴别。另一方面，在dRVVT试验、混合试验以及本发明1、2中，全部为阴性。本发明的方法是向被检血浆中补充凝血因子的体系，但通过包括比较稀释前后的工序，从而单纯缺乏凝血因子的状态和为抑制因子阳性时的结果不会不明确。能够与dRVVT试验、混合试验同样明确地鉴别。

表4

如表5所示，在肝素给药·非LA组中，APTT筛选试验中8个例子中的7个例子为cutoff值以上，难以与LA阳性进行鉴别。另外，对于dRVVT试验，8个例子中的2个例子为假阳性（表中用“阳性＊”表示）。另一方面，本发明1、2中全部为阴性。

表5

表6中示出了疑似LA的样品组的结果。在华法林给药组中，APTT筛选试验中14个例子中的13个例子为cutoff值以上，但如果考虑表3的结果，则难以进行与LA阳性的鉴别。对于dRVVT试验，也是14个例子中的13个例子为阳性，由表3的结果暗示了因华法林给药而可能产生假阳性，难以进行由华法林引起的假阳性与LA阳性的鉴别。此外，APTT筛选试验中的阴性样品（样品16）与dRVVT试验中的阴性样品（样品19）不一致。另一方面，混合试验的14个例子中的3个例子为阳性，3个阳性例子在本发明1、2中均为阳性。因此dRVVT试验的结果中，认为至少14个例子中的7个例子为假阳性（表中用“阳性＊”表示）的可能性高。混合试验为阴性，对本发明1、2为阳性的样品3个例子（样品11、21、23）测定被认为是LA的责任抗体的抗β2GPI抗体（以下aβ2GPI）、抗磷脂酰丝氨酸·凝血酶原复合体抗体（以下aPS/PT），其结果是样品11、21两者为阳性，样品23的aPS/PT为阳性。根据以上可认为，这3个例子的混合试验的结果为假阴性，实际上为LA阳性的可能性非常高。

在华法林非给药组中，13个例子中的6个例子的所有项目为阳性，2个例子为阴性，因此，可以对这8个例子进行阳性·阴性的鉴别。剩余5个例子中，对仅本发明1、2为阳性的样品30测定aβ2GPI和aPS/PT，其结果是aβ2GPI为阳性，所以认为为dRVVT和混合试验的假阳性，实际上为LA阳性的可能性非常高。

表6

在APTT筛选试验和dRVVT试验中，受到肝素、华法林等抗凝血剂的影响，产生假阳性。另外，关于混合试验，受到华法林的影响等，有时产生假阴性。本发明方法不像APTT筛选试验和dRVVT试验那样受到肝素、华法林等抗凝血剂的影响，与凝血因子缺乏的鉴别也明确，与混合试验相比感受性高、假阴性少。

Claims (5)

1.一种含有血液凝固因子的缓冲液组合物在制备狼疮抗凝物的检测试剂中的应用，其特征在于，所述狼疮抗凝物的检测试剂被用于狼疮抗凝物的检测方法，所述检测方法包括下述工序(A)、(B)以及(C)：

(A)在血液凝固时间的测定前或者测定时，分别向血液试样和该试样的稀释试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物的工序，

(B)对工序(A)的各试样测定血液凝固时间的工序，

(C)对在工序(B)中得到的各试样的血液凝固时间进行对比的工序。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，血液凝固因子是选自FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI以及FXII中的1种或2种以上。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，血液试样为全血或者血浆。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，在血液凝固时间的测定前，向血液试样中添加含有血液凝固因子的缓冲液组合物。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其中，血液凝固时间的测定手段是活化凝血活酶时间或者稀释拉塞尔蛇毒时间。