CN103645318A - 金黄色葡萄球菌SpA5突变体抗原特异性IgG抗体检测方法和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌（SA）SpA5突变体抗原特异性IgG抗体的检测方法及检测试剂盒。本发明方法提高了方法的特异性，操作简捷、可重复性好。

Description

金黄色葡萄球菌SpA5突变体抗原特异性IgG抗体检测方法和检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌（SA）SpA5突变体，更具体地，涉及该突变体的抗原特异性IgG抗体的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)，以下简称金葡菌，有“嗜肉菌”的别称。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性炎症为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感染具有重要的战略及现实意义。

随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）自1961年被首次发现至今，目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的医院內感染病原菌之一。同时，因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行，且呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，被称为“第一超级细菌”。

绝大多数SA临床分离株都能表达SpA。SpA分子量为55kDa，定位于细胞壁上。SpA前体包含一N端信号肽及一C端筛选信号以使其共价结合于细胞壁上。成熟肽的N端部分包含5个56-61个氨基酸残基的Ig结合结构域，卷曲成三个α螺旋束。这些结构域能与哺乳动物IgG的Fc段结合，破坏抗体的调理吞噬作用；亦能与VH3型的B细胞受体结合，使B细胞死亡，破坏获得性及天然免疫反应。因而，诱导机体产生针对SpA的抗体，阻断MRSA的免疫逃逸机制是SA疫苗的一个重要选择。但由于SpA具备抗体结合能力，以天然SpA作为抗原无法实现预期目标，需要对其进行突变尽可能去除其抗体结合活性，同时保留其免疫原性。

本申请发明人经过长期研究，对MRSA252菌株的SpA蛋白的EDABC五个IgG结构域进行突变，研发出一种生物活性高于现有技术的SpA5突变体（如SEQ ID NO.1所示），具有很强的免疫原性，可作为金黄色葡萄球菌疫苗的候选抗原。但该SpA5突变体仍能部分地结合哺乳动物IgG抗体的Fc段，从而给SpA5特异性IgG的检测造成了困难。发明人前期在对用SpA5免疫动物后所得血清的检测中发现，SpA5突变体包被酶标板与未免疫阴性对照组血清反应，仍呈弱阳性结果，这就是由于SpA5非特异性结合血清中IgG抗体Fc段所致。

发明内容

本发明旨在提供一种检测方法以去除非特异性干扰从而测得SpA5抗原特异性抗体，该方法能够解决SpA5与IgG的Fc段非特异性结合问题，可对疫苗免疫后不同物种中的SpA5抗原特异性IgG抗体进行检测，为研究SpA5的抗原性和免疫原性奠定基础。

在第一个方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌SpA5突变体抗原特异性IgG抗体检测方法，包括：1）获得SpA5蛋白免疫后的动物血清，用胃蛋白酶酶切血清中的抗体获得抗体的F(ab’)₂片段；2）ELISA检测SpA5特异性的F(ab’)₂片段化IgG抗体。

在另一方面，本发明提供一种检测SpA5特异性IgG抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：酶切缓冲液、胃蛋白酶、ELISA反应试剂。

本发明中所提及的SpA5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明利用胃蛋白酶酶切以及酶联免疫吸附试验对用SpA5疫苗免疫的动物血清中的SpA5特异性IgG抗体进行检测，得到血清中抗体的效价。该检测方法排除了SpA（SpA5）非特异性结合抗体Fc段造成的干扰，提高了方法的特异性。同时，该方法操作简捷、可重复性好，在不同物种（BALB/C小鼠、SD大鼠、新西兰大耳白兔等）的血清抗体检测中都得到了验证，可用于重组金黄色葡萄球菌疫苗的免疫原性及抗原性研究。

附图说明

图1：各组动物血清抗体几何平均滴度图。

具体实施方式

在第一个方面，本发明的SpA5特异性IgG抗体的检测方法包括：1）获得SpA5蛋白免疫后的动物血清，用胃蛋白酶酶切血清中的抗体获得抗体的F(ab’)₂片段；2）ELISA检测SpA5特异性的F(ab’)₂片段化IgG抗体。

本发明方法的具体步骤如下：

1）抗体制备：将SpA5蛋白免疫动物后所采集的血液样本于4℃放置2h，4℃8000rpm/min离心10min，吸取上层血清，-20℃放置备用；

2）配制酶切溶液：向0.1-0.2M的醋酸钠溶液中加入胃蛋白酶，使胃蛋白酶的最终活性单位为30-150IU/mL，优选为60IU/mL，调节pH至4.0～4.6；

3）使用2）配制的酶切溶液将步骤1）获得的血清稀释10倍，混匀后37℃水浴酶切6h，每隔1h震荡混匀5～10min；通过该步骤采用胃蛋白酶切割抗体获得一个F(ab’)₂片段和一些小片段pFc’，避免Fc片段的干扰；

4）采用纯化的SpA5蛋白通过ELISA检测SpA5特异性的F(ab’)₂片段化IgG抗体滴度；优选地，以2μg/ml浓度的SpA5蛋白包被ELISA板，将步骤3）酶切后的样品用抗体稀释液稀释至1：2000后，通过倍比稀释的方法测定其中SpA5特异性的F(ab’)₂片段化IgG抗体滴度。

在另一方面，本发明提供一种检测SpA5抗原特异性IgG抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：酶切缓冲液、胃蛋白酶、ELISA反应试剂。优选地，所述酶切缓冲液为0.1-0.2M的醋酸钠溶液；优选地，所述ELISA反应试剂包括：包被液、抗体稀释液、洗涤液、封闭液和终止液。本领域技术人员根据本领域常规技术可以毫无疑义地知道需要哪些试剂来进行ELISA实验。

本发明所使用的实验材料及主要试剂如下所示：

1、实验动物

BALB/C小鼠（北京华阜康）、SD大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）、新西兰大耳白兔（第三军医大学实验动物中心）。

2、实验材料

SpA5（30μg/600μl）疫苗制剂，由本申请发明人自己配制。

3、主要试剂

甘氨酸、胃蛋白酶购自上海生工生物工程有限公司；普通以及F(ab’)₂片段化山羊抗小鼠、大鼠和兔IgG二抗购自上海亨代劳商贸有限公司；可溶性单组分底物溶液购自北京天根重庆代理；氯化钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、聚山梨酯20均购自国药集团化学试剂有限公司；氯化钾购自成都科龙化工试剂厂；PBS磷酸盐缓冲液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

4、试剂配制

1)酶切溶液：0.2M的醋酸钠溶液，加入胃蛋白酶使其最终活性单位为60IU/mL，调节pH至4.0-4.6。

2）ELISA试剂配制

①包被液：在电子天平上称取Na₂CO₃1.6g，NaHCO₃2.9g，调节pH至9.6，蒸馏水定容至1000mL；

②抗体稀释液：在电子天平上称取NaCl8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，吐温200.5mL，调节pH至7.4，加蒸馏水定容至1000mL；

③洗涤液：0.05%吐温20-PBS（pH7.4）；

取规格为1000mL/袋PBS1袋溶于1000mL纯水中，加入0.5mL吐温20；

④封闭液（现配现用）：

20ml的抗体稀释液，按1%的比例加入BSA，4℃放置备用；

⑤终止液（2mol/L硫酸）：

将22.2mL浓硫酸加入177.8mL ddH₂O中。

实施例1：动物的免疫及免疫血清的获得

1）动物分组：按照随机的原则将动物分为疫苗免疫组和对照组，分组情况如表1所示。

表1：免疫原性研究实验动物分组

2）实验动物的免疫：疫苗组采用SpA5蛋白肌肉注射，每只动物注射一支（600μL）；对照组采用相同体积的生理盐水免疫，免疫程序为0天、14天、21天三次免疫。

3）采血：末次免疫结束后14天取血，小鼠通过摘除眼球取血，大鼠采用尾静脉取血，兔子采用耳缘静脉取血。血液置于4℃孵育2小时后，8000rpm离心10min，分离血清并保存于-20℃，备用。

实施例2：胃蛋白酶酶切血清中的抗体

取实施例1获得的血清20μl，加入180μl的酶切溶液，混匀后于37℃水浴酶切6h，每隔1h震荡混匀5min。

实施例3：抗SpA5特异性抗体的检测

实验方法：

1)包被：用包被液稀释纯化的SpA5蛋白至2μg/mL。100μL/孔包被酶联板，充分震荡铺匀，4℃冰箱放置过夜或者37℃2h。

2)封闭：洗涤液洗板4次，每次加液300μL，震动30s，吸液2.5s。用封闭液200μL/孔封闭酶联条，4℃冰箱放置过夜或者37℃2h。

3)加入一抗：洗涤液洗板4次，每次加液300μL，震动30s，吸液2.5s。将上述酶切后的血清再稀释200倍至1:2000，然后用抗体稀释液2倍倍比稀释7个梯度，振荡摇匀。将稀释后的样品以100μL/孔加入酶联板，37℃温箱孵育40min。

4)加入二抗：洗涤液洗板4次，每次加液300μL，震动30s，吸液2.5s。将HRP标记的F(ab’)₂片段化山羊抗小鼠、大鼠和兔IgG二抗用抗体稀释液1:10000，按100μL/孔加入，振荡摇匀，37℃温箱孵育40min。同时采用普通的山羊抗小鼠、大鼠和兔IgG二抗做对照。

5)显色：用洗涤液洗板4次，每次加液300μL，震动30s，吸液2.5s。再按100μL/孔加入显色液，于暗处显色5-10min。

6)终止反应：显色结束时50μL/孔加入2mol/L H₂SO₄终止反应。采用酶标仪测定492nm下各孔OD值。

7)统计方法：采用A_样品/A_阴性值>2.1为阳性标准，获得各个血清中特异性抗体的最高稀释度。采用几何平均滴度作柱状图。

实验结果：

如表2所示，ELISA检测结果表明：如果在检测中采用普通的IgG二抗，由于SpA5蛋白含有IgG结合结构域，能非特异性地结合哺乳动物IgG抗体的Fc段，疫苗免疫组和对照组检测结果相似，不存在明显差异。但是当采用F(ab’)₂片段化山羊抗小鼠、大鼠和兔IgG二抗后，对照组结果均为阴性，排除了非特异性的干扰，能够更准确的反映血清中SpA5蛋白特异性IgG抗体的真实水平，特异性更高。图1为通过将不同物种各个实验组小鼠血清检测的抗体效价求几何平均滴度（GMT），作柱状图分析结果。

表2：SpA免疫不同动物后血清特异性抗体效价检测

通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域相关知识可以显而易见地应用本发明中所提供的检测方法来制备相关检测试剂盒，用于诊断SpA5突变体蛋白疫苗免疫后的抗原特异性抗体水平及免疫保护效果评价。

Claims (10)

1.一种检测SpA5蛋白特异性IgG的方法，包括步骤：1）获得SpA5蛋白免疫后的动物血清，用胃蛋白酶酶切血清中的抗体获得抗体的F(ab’)₂片段；2）ELISA检测SpA5特异性的F(ab’)₂片段化IgG抗体；所述SpA5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1）中使用酶切溶液酶切抗体，所述酶切溶液包括0.1-0.2M的醋酸钠、最终活性单位为30-150IU/mL的胃蛋白酶，pH4.0～4.6。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述胃蛋白酶的最终活性单位为60IU/mL。

4.一种用于如权利要求1～3任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：酶切缓冲液、胃蛋白酶、ELISA反应试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述酶切缓冲液为0.1-0.2M的醋酸钠溶液。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其中，所述ELISA反应试剂包括：包被液、抗体稀释液、洗涤液、封闭液和终止液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，1000mL所述包被液包括：Na₂CO₃1.6g，NaHCO₃2.9g，pH值为9.6。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，1000mL所述抗体稀释液包括：NaCl8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，吐温200.5mL，pH值为7.4。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述洗涤液为0.05%吐温20-PBS溶液，pH值为7.4。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述封闭液为：按1%的比例向20ml抗体稀释液加入BSA。