CN103627725B - 一种植物叶绿体多基因转化载体、构建方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物叶绿体多基因转化载体、构建方法及用途，所述植物叶绿体多基因转化载体的外源多顺反子的插入位点位于叶绿体psbC-trnG高频同源重组区。本发明的优势在于，能够保证多顺反子在转录为mRNA之后断裂为各自独立的稳定的单顺反子mRNA，有效克服了大量多顺反子mRNA不能进行翻译的问题；本发明能够运用一个强启动子将多个基因一次性转化进目标植物，有效避免了寻找启动子困难、转化后基因沉默的问题；能够保证每个基因都高效地转录和翻译，有效避免了多基因转化基因表达之间存在差异的问题；本发明在植物基因工程及农作物转基因等方面具有广泛的应用前景。

Description

一种植物叶绿体多基因转化载体、构建方法及用途

技术领域

本发明涉及一种植物叶绿体多基因转化载体，同时还涉及该多基因转化载体的构建方法及用途，属于基因工程领域。

背景技术

高等植物绝大多数重要农艺性状和代谢途径都由多基因控制，为了增进这些重要农艺性状的表现，研究人员多通过向目标农作物转化基因来实现。这些基因要么是作物本身已有的基因，通过转化使其在作物中过量表达；要么是农作物本身没有的基因，这些基因源于其它生物或者由人工合成而来。但是因为绝大多数重要的性状都由多基因编码，转化单一基因很难达到预期的效果。向目标农作物转化多个基因或者控制整个代谢途径的多个关键基因就变得特别重要。

目前已知的植物多基因转化技术有下面几个：1)首先通过转化单一基因得到转单基因的植株，然后通过有性杂交得到转化多个基因的转基因植株，该方法所需时间长，工作量大，不能够体现出植物基因工程的优势；2)再转化策略，首先向目标农作物转化单一基因，得到转基因植株后再继续转化第二个基因，以此类推，得到多基因转化个体，该方法的缺点与第一种类似，育种周期长，后代筛选工作量大，多次转化需要应用多个抗生素筛选标记，而且多次转化容易诱发基因沉默，很难达到预期目的；3)共转化策略，将多个不同的表达载体同时转化农杆菌，然后进行侵染，从转化后代中进行筛选，该方法偶然性大，成功几率非常低；4)转录单位策略，将多个基因串联起来，每个基因都含有自己的启动子、终止子，构建各自的基因表达盒，然后进行转化，该方法的缺陷在于所转化的每个基因都必须连接有自己的启动子，如果每个基因都使用不同的启动子，少数几个基因的转化还可以，如果涉及到多个基因，寻找各自独立、效果良好的启动子将变得非常困难；如果使用相同的启动子，则会造成基因沉默，所转化基因不能表达；5)融合蛋白策略，将前边基因的终止密码子去掉，用一段病毒基因序列与下一个基因相连接，融合基因翻译以后，中间病毒基因编码的氨基酸序列被水解掉，从而使各个基因得以表达，该方法的优势在于能够一次转化即可成功，缺点在于，各个基因的表达效率不一致，顺序排列前边的基因表达的几率高，排在后边的基因表达效率低。

相对于上述几种多基因转化的缺点，近几年发展起来的叶绿体转化具有明显的优势。其优势主要有以下几点：1)外源基因表达水平高；2)外源基因定点整合，没有基因沉默现象；3)叶绿体随母体遗传，外源基因不会随花粉外溢；4)叶绿体是原核表达方式，只需要一个启动子和一个终止子。理论上，外源基因通过叶绿体转化，能够实现多基因转化的目的。但是，研究发现，将多个外源基因按照细菌操纵子的形式连接起来以后进行转化，虽然在转基因植株中确实得到了预期的多顺反子转录片段，但是占相当比例的多顺反子mRNA不能够被翻译成氨基酸序列，而且在得到多顺反子mRNA的同时，也得到了许多比预期小的mRNA片段，表明部分多顺反子的转录体发生了剪切或降解。对转基因植株的表型性状进行检测后发现，目的性状的表现也比预期低很多。据此推测，细菌中操纵子的表达与叶绿体中操纵子的表达可能存在着相当程度的差异；尽管叶绿体基因的表达方式保留着其祖先蓝细菌的特点——叶绿体绝大多数操纵子转录起始位点(通过叶绿体基因组自身编码的RNA聚合酶识别)上游具有一个可以识别的-35盒与一个-10TATA盒)和翻译起始信号(包括核糖体结合位点等)，通过叶绿体转化新的生物合成途径的操纵子似乎是理所当然能够进行的，但是细菌中操纵子的表达模式与叶绿体中操纵子的表达模式之间的差异依然相当大。细菌中多顺反子转录体直接进行翻译，而在叶绿体中经常不是这样。叶绿体中绝大多数多顺反子转录体需要进行转录后处理，剪切为单顺反子或寡顺反子单元。多顺反子转录体前体剪切为单顺反子mRNA对于下游顺反子的翻译可能是必需的。例如，在烟草体外转录系统中，双顺反子psaC-ndhD转录子前体中的ndhD不能进行翻译。原因可能是形成了RNA二级结构，在这个二级结构中，psaC编码区中一个8nt序列与下游的ndhD的5’UTR形成互补结构，遮盖了翻译起始区域(HiroseandSuguira,BothRNAeditingandRNAcleavagearerequiredfortranslationoftobaccochloroplastndhDmRNA:apossibleregulatorymechanismfortheexpressionofachloroplastoperonconsistingoffunctionallyunrelatedgenes.EMBOJ,1997,16:6804-6811)。许多细胞核突变体呈现叶绿体转录体前体顺反子间处理功能缺陷，也表明顺反子间RNA处理对于操纵子中所有顺反子的有效翻译是非常重要的。例如，玉米crp1突变体不能够在顺反子petB和petD之间进行剪切，造成petD翻译的缺失(Barkanetal.AnuclearmutationinmaizeblockstheprocessingandtranslationofseveralchloroplastmRNAsandprovidesevidenceforthedifferentialtranslationofalternativemRNAforms.EMBOJ,1994,13:3170-3181)。拟南芥突变体hcf107由于顺反子psbH不能够从一个含有5个基因的操纵子psbB的转录体上剪切下来，造成了顺反子psbH翻译的缺失(Felderetal.Thenucleus-encodedHCF107geneofArabidopsisprovidesalinkbetweenintercistronicRNAprocessingandtheaccumulationoftranslation-competentpsbHtranscriptsinchloroplasts.PlantCell,2001,13:2127-2141)。另一个拟南芥突变体crr2，由于在顺反子rps7和ndhB之间的剪切功能受到损害，造成了NDH复合体的缺失，很可能是由于ndhB不能够被未处理的双顺反子转录体翻译造成的(Hashimotoetal.Anucleus-encodedfactor,CRR2,isessentialfortheexpressionofchloroplastndhBinArabidopsis.PlantJ,2003,36:541-549)。在对一个人工合成的多顺反子RNA翻译起始进行研究的过程中，发现在叶绿体转化植物的Shine-Dalgarno序列应用中，存在一个明显的从5’到3’的极性，而用相同的转化载体在大肠杆菌中进行分析时却没有发现该现象(DrechselandBock.SelectionofShine-Dalgarnosequencesinplastids.NucleicAcidsRes.,2010,39:1427-1438)。暗示翻译起始速度沿5’到3’的方向逐步降低。这些实验结果和现象都表明细菌操纵子表达模式和叶绿体操纵子表达模式之间存在相当程度的差异，生搬硬套细菌操纵子表达模式来进行植物叶绿体多基因转化可能达不到预期效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物叶绿体多基因转化载体，能够一次性将多个基因转化进目标植物；能够保证多顺反子在单一启动子的启动下进行转录；能够保证转录后多顺反子mRNA降解为各自独立的稳定的单顺反子mRNA；能够保证每个基因都得到高效地转录和翻译；在植物基因工程及农作物转基因等方面具有广泛的应用前景。

本发明的目的还在于提供一种植物叶绿体多基因转化载体的构建方法。

本发明的目的还在于提供一种植物叶绿体多基因转化载体在制备多基因转化植物中的用途。

本发明的目的还在于提供一种植物叶绿体多基因转化载体在制备用于清除土壤重金属汞污染的转基因烟草中的用途。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种植物叶绿体多基因转化载体，所述植物叶绿体多基因转化载体的外源多顺反子的插入位点位于叶绿体psbC-trnG高频同源重组区。

所述植物叶绿体多基因转化载体包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

所述外源多顺反子只有一个启动子，为烟草叶绿体rrn16基因启动子，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述外源多顺反子中每两个相邻基因之间都由一段如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列连接。

所述外源多顺反子中的每个基因起始密码子的前面都连有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。该核苷酸序列与起始密码子之间还有4个碱基，这4个碱基可以随周边序列不同而变化。

所述外源多顺反子中的每个基因终止密码子后边都连接有各自不同的终止子，能够保证多顺反子mRNA断裂后得到的单顺反子mRNA的稳定性。

本发明的技术方案还在于提供一种植物叶绿体多基因转化载体的构建方法，所述植物叶绿体多基因转化载体是将外源多顺反子插入叶绿体psbC-trnG高频同源重组区构建而成。

所述外源多顺反子中每两个相邻基因之间都由一段如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列连接。

本发明的技术方案还在于提供一种植物叶绿体多基因转化载体在制备多基因转化植物中的用途。

本发明的技术方案还在于提供一种植物叶绿体多基因转化载体在制备用于清除土壤重金属汞污染的转基因烟草中的用途。

所述转基因烟草为在烟草中导入含有假单胞菌(Pseudonmonas)K-62菌株基因merT、merB1和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)基因ppk的植物叶绿体多基因转化载体。

本发明的外源多顺反子由一个叶绿体特异表达的强启动子和多个基因构成，每个基因终止密码子后边都连接有不同的终止子，每个基因起始密码子前边都连接有核糖体结合位点(SEQIDNO.4所示核苷酸序列)；通过对烟草叶绿体多个操纵子单顺反子间序列进行比对和功能筛选，设计合成了在前一个基因的终止子与下一个基因核糖体结合位点之间连接的一小段DNA序列，该序列的mRNA能够被叶绿体中的水解酶水解掉，从而将多顺反子转录体水解为单顺反子mRNA(图1)，增强外源基因转录体的稳定性和翻译能力，最后将构建的多顺反子序列插入叶绿体高频同源重组区域psbC-trnG，获得植物多基因转化载体。

本发明的优势在于，能够保证多顺反子在转录为mRNA之后被水解断裂为各自独立的稳定的单顺反子mRNA，有效克服了大量多顺反子mRNA不能进行翻译的问题；本发明能够运用一个强启动子将多个基因一次性转化进目标植物，有效避免了寻找启动子困难、转化后基因沉默的问题；能够保证每个基因都高效地转录和翻译，有效避免了多基因转化基因表达之间存在差异的问题；本发明在植物基因工程及农作物转基因等方面具有广泛的应用前景。

本发明通过土壤农杆菌侵染将该载体转化进植物叶绿体，获得多基因转化植物。运用本发明获得的转多基因除汞烟草，能够通过所转化的假单胞菌K-62菌株基因merT将有机汞和无机汞转运进烟草细胞内，通过所转化的merB1将甲基汞转化为二价汞，通过所转化的产气肠杆菌基因ppk对二价汞进行螯合来清除土壤中的汞污染。实验证明，本发明的转基因烟草能够高效清除土壤中的有机汞和无机汞，在重金属汞污染的土壤中适应能力强，对土壤中的有机汞和无机汞的清除能力强，在土壤重金属汞污染的修复方面具有很高的应用价值。

附图说明

图1为Northernblot印迹杂交检测，所用探针为标记过的ppk和merT混合片段；其中，

1表示多顺反子中单顺反子之间仅用自制片段EL(SEQIDNO.3)连接起来，基因终止密码子后边没有连接终止子；

2表示多顺反子中仅仅只是将三个基因串联起来，基因之间无终止子和自制连接片段；

3表示多顺反子中前一个基因终止密码子后边连接有终止子，在终止子和下一个基因起始密码子前边连接有自制连接片段EL(SEQIDNO.3)；

图2为实施例11中的质粒ptb1k用SalI和SacI进行双酶切后的琼脂糖电泳图，其中，大片段(10.4kb)表示初始载体pRI101-AN，小片段(8.4kb)显示的是烟草叶绿体DNA高频同源重组区域psbC-trnG和人工构建的多顺反子Prrn-merT-T1-EL-merB1-T2-EL-ppk-T3；

图3为农杆菌侵染转化后的烟草叶片在抗性筛选平板上长出分化芽；

图4为转基因阳性烟草分化芽在生根培养基上的生长情况；

图5为实施例12的转基因烟草的琼脂糖凝胶检测图，其中，

1-7和11、12为转基因阳性植株，8-10为阴性植株；

图6为转基因烟草苗移栽到土壤中；

图7为氯化汞处理前、后转基因烟草与非转基因烟草的鲜重比值，1、2、3、4分别代表处理所用的氯化汞浓度，其值分别为0μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l；

图8为氯化甲基汞处理前、后转基因烟草与非转基因烟草的鲜重比值，1、2、3、4分别代表处理所用的氯化甲基汞浓度，其值分别为0nmol/l、25nmol/l、50nmol/l、100nmol/l；

图9为在含不同浓度氯化汞的培养液中生长两周后转基因烟草与非转基因烟草的汞含量，1、2、3、4分别代表处理所用的氯化汞浓度，其值分别为1.25μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l；

图10为在含不同浓度氯化甲基汞的培养液中生长两周后转基因烟草与非转基因烟草的汞含量，1、2、3、4分别代表处理所用的氯化甲基汞浓度，其值分别为12.5nmol/l、25nmol/l、50nmol/l、100nmol/l；

图11为在含有不同浓度氯化汞的土壤中生长一周后转基因烟草与非转基因烟草的汞含量，1、2、3、4分别代表处理所用的氯化汞浓度，其值分别为1.25nmol/g土壤、2.5nmol/g土壤、5nmol/g土壤、10nmol/g土壤；

图12为在含有不同浓度氯化甲基汞的土壤中生长一周后转基因烟草与非转基因烟草的汞含量，1、2、3、4分别代表处理所用的氯化甲基汞浓度，其值分别为12.5pmol/g土壤、25pmol/g土壤、50pmol/g土壤、100pmol/g土壤。

具体实施方式

通过以下实例进一步举例描述本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

质粒pRI101-AN购自大连TAKARA公司；pGEM-Teasy购自promega公司；大肠杆菌DH10B、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)和土壤农杆菌GV3101购自上海北诺生物科技有限公司；各种限制性内切酶及连接酶均购自NewEnglandBiolabs公司；测序工作均由大连TAKARA公司完成；引物均由北京诺赛基因公司合成。

实施例1

培养烟草NC89至三叶一心，提取烟草叶绿体DNA，具体方法参照孙晓荣等发表的文献进行(孙晓荣等，三倍体枇杷叶绿体DNA提取方法的优化，西南师范大学学报(自然科学版)。根据烟草叶绿体基因组(Genbank登录号：Z00044.2)中基因psbC-trnG的核苷酸序列，设计引物，以烟草叶绿体DNA为模板，PCR扩增psbC-trnG高频同源重组区，引物序列如下：

PIF：5’-ACGCGTCGACTTCTTTAAATTCCGTGGGTGGTGTAGCTAC-3’(下划线为SalI位点)

PIR：5’-CACGGAGCTCGCACAGTATGAAAGACCTTTTAGATGCACA-3’(下划线为SacI位点)

PCR反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物PIF1pmol，引物PIR1pmol，H₂O22μl，DNA2.5ng。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3.5min，共40个循环；72℃10min。

用SalI和SacI对PCR扩增片段和植物表达载体pRI101-AN进行酶切，纯化回收后，将二者用T4DNA连接酶在16℃条件下连接24小时，将连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆进行测序，将序列完全正确的质粒命名为pancg。

实施例2

根据烟草叶绿体基因组DNA序列(GenBank登录号：Z00044.2)中的rrn16基因启动子序列，委托TAKARA公司合成引物，引物序列如下：

P1F：5’-AATACGGCCCCTAAGCCCAATGTGAGTTTTTCTAGTTGGATTTGCTCCCCCGCCGTCGTTCAATGAGAATGGATAAGAGGCTCGTGGGATTGACGTGAGGGGGCAGGGATGGCTATATTTCTGGGAGCGAACTCCGGGCGAATA-3’(下划线为ApaI位点)

P1R：5’-CCAATGCATACATGCATGCTATTCGCCCGGAGTTCGCTCCCAGAAATATAGCCATCCCTGCCCCCTCACGTCAATCCCACGAGCCTCTTATCCATTCTCATTGAACGACGGCGGGGGAGCAAATCCAACTAGAAAAACTCACATTGGGCTTAG-3’(下划线为NsiI位点和SphI位点)

在PCR仪上进行退火，退火反应体系和反应程序如下：

退火反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物P1F1pmol，引物P1R1pmol，H₂O23μl。

退火反应程序：94℃7min，2℃/min降温至25℃。

退火获得的片段即为烟草叶绿体rrn16基因启动子(Prrn)(SEQIDNO.2)，将该片段用ApaI和NsiI进行酶切，将载体pGEM-Teasy用ApaI和NsiI进行酶切，将酶切后的片段与载体在TDNA连接酶条件下16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆进行测序，序列完全正确的质粒命名为p1。

实施例3

根据假单胞菌K-62菌株质粒pmr26DNA序列(GenBank登录号：D83080.2)，委托TAKARA公司合成引物P2F、P2R和汞转运蛋白基因merT。合成汞转运蛋白基因merT时在merT的5’端加上SphI位点和核糖体结合位点，3’端加上SphI位点和BstZI位点。引物P2F和P2R序列如下：

P2F：5’-ACATGCATGC ACGTATGTCTGAACCACAAAACGGGCGCGGTGCGC-3’(下划线为SphI位点，方框所标为核糖体结合位点)

P2R：5’-ACATGCATGCTGCAGCGGCCGTTAATAGAAAAATGGAACGACATAGGGAAATC-3’(下划线为SphI位点和BstZI位点)

将合成的merT基因用SphI进行酶切，对p1也用SphI进行酶切，在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆用P2F和P2R进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下：

PCR反应体系：ExTaq(TAKARA，货号：DRR01BM)0.25μl，10×ExTaqBuffer5μl，MgCl₂(25mmol/l)4μl，dNTPMixture(各2.5mmol/l)4μl，引物P2F1pmol，引物P2R1pmol，H₂O33μl，DNA2.5ng。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃0.5min，共40个循环；72℃10min。

对能够扩增出大小约为350bp片段的克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为p2。

实施例4

培养烟草NC89至三叶一心，提取烟草叶绿体DNA，具体方法参照孙晓荣等发表的文献进行(孙晓荣等，三倍体枇杷叶绿体DNA提取方法的优化，西南师范大学学报(自然科学版)，2012，37(2)：93-96)。根据烟草叶绿体基因组(Genbank登录号：Z00044.2)中RbcL基因的核苷酸序列，设计引物，以烟草叶绿体DNA为模板，PCR扩增RbcL基因的3’端(命名为T1)，引物序列如下：

P3F：5’-TGCAGCGGCCGCAACAAAGATTCTATTGCATATATTTTGACTAAGTA-3’(下划线为BstZI位点)

P3R：5’-TGCAGCGGCCGATAAGAATGCGGCCGCTTCGCTATAAAATTATTTAT-3’(下划线为BstZI位点和NotI位点)

PCR反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物P3F1pmol，引物P3R1pmol，H₂O23μl。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃0.5min，共40个循环；72℃10min。

将扩增出来的片段和质粒p2同时用BstZI进行酶切，酶切产物进行纯化回收后，用T4DNA连接酶在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆用P3F和P3R进行扩增，对能够扩增出大约600bp片段的克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为p3。

实施例5

委托TAKARA公司合成引物P4F和P4R，引物序列如下：

P4F：5’-ATAAGAATGCGGCCGCAGGATCGTTTATTTACAACGGAATGGTATACAAAGTCAACAGATCTCAAGAGAAGGAGATATACA-3’(下划线为NotI位点)

P4R：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCCCCGCGGTGTATATCTCCTTCtcTTGAGATCTGTTGACTTTGTATACCATTCCGTTGTAAATAAACGATCCT-3’(下划线为NotI位点和SacII位点)

在PCR仪上退火，合成自制片段(命名为EL)。退火反应体系和反应程序如下：

退火反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物P4F1pmol，引物P4R1pmol，H₂O23μl。

退火反应程序：94℃7min，2℃/min降温至25℃。

对退火获得的片段用NotI进行酶切，对p3也用NotI进行酶切，酶切产物进行纯化回收后，用T4DNA连接酶在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为p4。

实施例6

根据假单胞菌K-62菌株质粒pmr26DNA序列(GenBank登录号：D83080.2)，委托TAKARA公司合成引物P5F、P5R和汞转运蛋白基因merB1。合成汞转运蛋白基因merB1时在merB1的5’端加上SacII位点和核糖体结合位点，3’端加上SacII位点和SpeI位点。引物序列如下：

P5F：5’-TCCCCGCGG GAAAATGGACAAGACTATTTATTCCAAAAAGATTG-3’(下划线为SacII位点，方框所标为核糖体结合位点)

P5R：5’-TCCCCGCGGCTAGACTAGTTCATACTGGGCTTTCCTCGCAGTCCTCTAGCA-3’(下划线为SacII位点和SpeI位点)

将合成的merB1基因用SacII进行酶切，对p4也用SacII进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶纯化回收后，用T4DNA连接酶在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆用P5F和P5R进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下：

PCR反应体系：ExTaq(TAKARA，货号：DRR01BM)0.25μl，10×ExTaqBuffer5μl，MgCl₂(25mmol/l)4μl，dNTPMixture(各2.5mmol/l)4μl，引物P5F1pmol，引物P5R1pmol，H₂O33μl，DNA2.5ng。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃0.5min，共40个循环；72℃10min。

对能够扩增出大约600bp片段的克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为p5。

实施例7

培养烟草NC89至三叶一心，提取烟草叶绿体DNA，具体方法参照孙晓荣等发表的文献进行(孙晓荣等，三倍体枇杷叶绿体DNA提取方法的优化，西南师范大学学报(自然科学版)，2012，37(2)：93-96)。根据烟草叶绿体基因组(Genbank登录号：Z00044.2)中PsaI基因的核苷酸序列，设计引物，以烟草叶绿体DNA为模板，PCR扩增PsaI基因的3’端(命名为T2)，引物序列如下：

P6F：5’-CTAGACTAGTGATCCGCTGGGACCCAATCTCATCCATTTT-3’(下划线为SpeI位点)

P6R：5’-CTAGACTAGTAAAACTGCAGTACTTTACCCGATTGCATTT-3’(下划线为SpeI位点和PstI位点)

PCR反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物P6F1pmol，引物P6R1pmol，H₂O23μl。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃0.5min，共40个循环；72℃10min。

将扩增出来的片段用SpeI进行酶切，对p5也用SpeI进行酶切，酶切产物进行纯化回收后，用T4DNA连接酶在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆用P6F和P6R进行扩增，对能够扩增出大小约450bp片段的克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为p6。

实施例8

委托TAKARA公司合成引物P7F和P7R，，引物序列如下：

P7F：5’-AAAACTGCAGAGGATCGTTTATTTACAACGGAATGGTATACAAAGTCAACAGATCTCAAGAGAAGGAGATATAC-3’(下划线为PstI位点)

P7R：5’-AAAACTGCAGACTCCAACGCGTTGGTGTATATCTCCTTCTCTTGAGATCTGTTGACTTTGTATACCATTCCGTTGTAAATAAACGATCCT-3’(下划线为PstI位点和BstXI位点)

在PCR仪上退火，合成自制片段。该自制片段与实施例5中所述自制片段除了两端酶切位点不同外，其余完全相同。退火反应体系和反应程序如下：

退火反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物P7F1pmol，引物P7R1pmol，H₂O23μl。

退火反应程序：94℃7min，2℃/min降温至25℃。

将退火获得的自制片段用PstI进行酶切，将质粒p6也用PstI进行酶切，然后将两者在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为p7。

实施例9

利用普通LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，溶解在950ml的蒸馏水中，用氢氧化钠调整pH为7.0，添加蒸馏水至总体积为1升)，培养产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)(购自上海北诺生物科技有限公司)，培养条件为37℃，180rpm振荡培养72h。

根据产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)ppk基因序列(GenBank登录号：D14445.1)，设计引物，提取产气肠杆菌基因组DNA，具体可参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒说明书(货号：DP302-02)。以产气肠杆菌基因组DNA为模板，扩增ppk基因。引物如下：

P8F:5’-ACTCCAACGCGTTGG TGTAATGGGTCAGGAAAAGTTATATATCGAGAAAGAGCTAAGCTGG-3’(下划线为BstXI位点，方框所标为RBS位点)

P8R:5’-ACTCCAACGCGTTGGAACTTTTTATGCATATTAATCGGGTTGCTCGAGTGATTTGATATAGTCGTAAAT-3’(下划线为BstXI位点和NsiI位点)

PCR反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物P8F1pmol，引物P8R1pmol，H₂O22μl，DNA2.5ng。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，共40个循环；72℃10min。

将扩增出来的片段用BstXI进行酶切，对p7也用BstXI进行酶切，酶切产物进行纯化回收后，用T4DNA连接酶在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆用P8F和P8R进行扩增，对能够扩增出大约2kb片段的克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为p8。

实施例10

培养烟草NC89至三叶一心，提取烟草叶绿体DNA，具体方法参照孙晓荣等发表的文献进行(孙晓荣等，三倍体枇杷叶绿体DNA提取方法的优化，西南师范大学学报(自然科学版)，2012，37(2)：93-96)。根据烟草叶绿体基因组(Genbank登录号：Z00044.2)中psbA基因的核苷酸序列，设计引物，以烟草叶绿体DNA为模板，PCR扩增psbA基因的3’端(命名为T3)，引物序列如下：

P9F：5’-AACTTTTTATGCATACCTTTCTTTTTTTCTTTTTAT-3’(下划线为NsiI位点)

P9R：5’-AACTTTTTATGCATACCCTCGCCTACTTACATTCC-3’(下划线为NsiI位点)

PCR反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物P9F1pmol，引物P9R1pmol，H₂O22μl，DNA2.5ng。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃0.5min，共40个循环；72℃10min。

将扩增出来的片段用NsiI进行酶切，对p8也用NsiI进行酶切，酶切产物进行纯化回收后，用T4DNA连接酶在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆用P9F和P9R进行扩增，对能够扩增出约400bp片段的克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为p9。

实施例11

以p9为模板，设计引物，扩增多基因序列Prrn-merT-T1-EL-merB1-T2-EL-ppk-T3，引物序列如下：

P10F：5’-AGCTCTAACGTTCTAAGCCCAATGTGAGTTTTTCTAGTT-3’(下划线为AclI位点)

P10R：5’-AGCTCTAACGTTCCCTCGCCTACTTACATTCCGTTTTTA-3’(下划线为AclI位点)

PCR反应体系：2×PfuMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0686A)25μl，引物P10F1pmol，引物P10R1pmol，H₂O22μl，DNA2.5ng。

PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃5min，共40个循环；72℃10min。

将扩增出来的片段用AclI进行酶切，对质粒pancg也用AclI进行酶切，酶切产物进行纯化回收后，用T4DNA连接酶在16℃条件下连接24小时，用连接产物对大肠杆菌DH10B进行转化，挑选阳性克隆提取质粒，用AclI进行酶切，对能够切出大约5kb片段的克隆进行测序，将插入方向为正向插入且序列无碱基突变的质粒命名为ptb1k，即为人工构建的植物叶绿体多基因转化载体。该载体含有最初的商业化载体pRI101-AN的序列(去掉SalI和SacI之间的序列)和人工插入序列两部分，人工插入序列如SEQIDNO.1所示。

实施例12

配制MS培养基，具体配制方法参见Murashige和Skoog发表的文献(MurashigeandSkoog.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant,1962,15:473-497)。烟草NC89种子表面消毒后播种在MS培养基表面，16h光照/8h黑暗，25℃培养一个月，获得无菌苗。

取1μgptb1k质粒DNA用热激法对农杆菌GV3101细胞进行转化，在含有50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基(牛肉膏5g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨5g/l，蔗糖5g/l，MgSO₄0.5g/l，琼脂15g/l，pH＝7.0)上28℃暗培养3天，挑5个单克隆进行培养，提取质粒，用AclI进行酶切鉴定。选取含有能够酶切出约5kb片段的质粒的克隆，在YEB培养液(牛肉膏5g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨5g/l，蔗糖5g/l，MgSO₄0.5g/l，pH＝7.0)中28℃，180rpm培养2-3天，将培养得到的农杆菌菌液按照1:100的比例接种在50ml新鲜的YEB液体培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8。取烟草无菌苗叶片，用无菌手术刀切成约1cm²的碎片，放入无菌瓶中，加入上述农杆菌菌液侵染10min。侵染后的外植体接种在分化培养基(MS+2mg/l6-BA+0.5mg/lIAA)上暗培养4天。然后转移到含有300mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的分化培养基上，16h光照/8h黑暗，25℃条件下进行培养，每4周继代一次。待抗性芽长到1-1.5cm时(图3)，从基部将芽切下，转入含有300mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的生根培养基(MS+0.5mg/lIAA)上，诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的植株(图4)。对具有卡那霉素抗性的植株提取基因组DNA，提取方法参照孙晓荣等发表的文献进行(孙晓荣等，三倍体枇杷叶绿体DNA提取方法的优化，西南师范大学学报(自然科学版)，2012，37(2)：93-96)，用引物P11F：5’-TATGTCTGAACCACAAAACGGGCGCGGTGCGCTCTT-3’和P11R：5’-AAACAAAAGATTCAAGTTCGAATATAGCTCTTCTTTC-3’进行PCR扩增，选取能够扩增出大约4.6kb片段的阳性植株(图5)移栽到土壤中(图6)，培养至成熟期收获种子，获得转基因烟草。

实验例1、本发明转基因烟草对汞的耐受性分析

1、对无机汞的耐受性分析

将种子表面消毒后播种在MS固体培养基上，25℃条件下生长3周，然后把植株移栽到MS液体培养基中，25℃条件下继续培养，一周后称量烟株鲜重，然后把植株转移到含有不同浓度氯化汞的MS培养液中继续生长，一周后，再次称量烟株的鲜重，求出在含汞培养液中生长一周后烟株鲜重与在含汞培养液中培养前烟株鲜重的比值，根据鲜重的变化情况评价转基因植株对汞离子的耐受性。结果显示，在不含氯化汞的培养液中生长的植株，转基因烟草与非转基因烟草并没有明显的差别。在含有2.5μmol/l氯化汞的MS培养液中培养一周后，非转基因烟草培养后鲜重与培养前的比值为1.1左右，而转基因烟草则达到了1.3，说明转基因烟草对无机汞的耐性明显高于非转基因烟草。即使在含有10μmol/l氯化汞的MS培养液中培养，转基因植株相应比值也达到了1.2以上，而此时的非转基因植株只有1.05左右，非转基因植株在含有10μmol/l氯化汞的MS培养液中培养一周后，基本上没有生长(图7)。

2、对有机汞的耐受性分析

将种子表面消毒后播种在MS培养基上，25℃条件下生长3周，然后把植株移栽到MS液体培养基中，25℃条件下继续培养，培养一周后称量烟株鲜重，然后将植株转移到含有不同浓度氯化甲基汞的MS培养液中继续生长，一周后，再次称量烟株的鲜重，求出在含汞培养液中生长一周后烟株鲜重与在含汞培养液中培养前烟株鲜重的比值，根据鲜重的变化情况评价转基因植株对甲基汞的耐受性。结果显示，转基因植株在含有氯化甲基汞的培养液中相应比值基本都在1.3左右，而非转基因植株则随着处理浓度的加大，比值逐渐降低，在氯化甲基汞处理浓度为100nmol/l时，处理前后非转基因植株的鲜重基本没有变化(图8)。

3、转基因烟草对无机汞的吸收

将表面消毒后的种子种植在MS固体培养基上25℃条件下培养3周，转移到含有不同浓度氯化汞的新鲜MS培养液中25℃再培养2周，将幼苗用蒸馏水冲洗干净后放置在55℃条件下干燥处理。将干燥处理后的幼苗用硝酸进行处理，然后用无烟冷凝原子吸收光谱分析仪RA-2A(NipponInstruments,Tokyo,Japan)测量幼苗中的汞含量。结果表明，转基因植株汞含量明显高于非转基因对照，在1-10μmol/l的处理范围内，转基因植株汞含量随着氯化汞处理浓度的提高而增加。非转基因植株汞含量在汞处理浓度为5μmol/l时达到最高值，在氯化汞处理浓度为10μmol/l时，非转基因植株汞含量反而下降，这是由于高浓度的氯化汞对植物造成伤害，造成其吸收能力下降而造成的(图9)。

4、转基因烟草对有机汞的吸收

将表面消毒后的种子种植在MS固体培养基上25℃条件下培养3周，转移到含有不同浓度氯化甲基汞的新鲜MS培养液中25℃再培养2周，将幼苗用蒸馏水冲洗干净后放置在55℃条件下干燥处理以备用。将干燥处理后的幼苗用硝酸进行处理，然后用无烟冷凝原子吸收光谱分析仪RA-2A(NipponInstruments,Tokyo,Japan)测量幼苗中的汞含量。结果显示，转基因植株对氯化甲基汞的吸收能力显著高于非转基因植株。转基因植株对氯化甲基汞的积累能力在氯化甲基汞处理浓度为100nmol/l时达到最高值，在含有100nmol/l氯化甲基汞的MS培养液中生长两周后，转基因植株的汞含量为2432pmol/g幼苗，而非转基因植株此时的汞含量只有212pmol/g幼苗，相差十倍左右(图10)。

实验例2

1、转基因烟草对土壤中无机汞的吸收

将表面消毒后的种子种植在MS固体培养基上25℃条件下培养4周，将幼苗移栽到营养钵内，营养钵内的土壤含有不同浓度的氯化汞，25℃条件下培养1周后，将幼苗用蒸馏水冲洗干净后放置在55℃条件下干燥处理以备用。将干燥处理后的幼苗用硝酸进行处理，用无烟冷凝原子吸收光谱分析仪RA-2A(NipponInstruments,Tokyo,Japan)测量幼苗中的汞含量。结果显示，在含有不同浓度氯化汞的土壤中生长一周后，转基因植株迅速积累大量的汞，并且随着氯化汞处理浓度的提高，转基因植株汞含量迅速增加；而非转基因植株虽然也吸收有一定量的汞，但是与非转基因植株相差巨大，例如在处理浓度为10nmol/g土壤时，转基因植株的汞含量几乎比非转基因植株高30倍，而且随着氯化汞处理浓度的提高，非转基因植株汞含量变化不大(图11)。

2、转基因烟草对土壤中有机汞的吸收

将表面消毒后的种子种植在MS固体培养基上25℃条件下培养4周，将幼苗移栽到营养钵内，营养钵内的土壤含有不同浓度的氯化甲基汞，25℃条件下培养1周后，将幼苗用蒸馏水冲洗干净后放置在55℃条件下干燥处理以备用。将干燥处理后的幼苗用硝酸进行处理，然后用无烟冷凝原子吸收光谱分析仪RA-2A(NipponInstruments,Tokyo,Japan)测量幼苗的汞含量。结果显示，转基因植株与非转基因植株汞含量与氯化汞处理后所展示的情况相似。转基因植株在含有高浓度氯化甲基汞处理的土壤中迅速吸收大量的甲基汞，非转基因植株汞含量则非常低，转基因植株对甲基汞的吸收处理能力显著高于非转基因植株(图12)。

应用实验例

将转基因烟草幼苗移栽到河南省某县郊区的一块菜地进行种植。该菜地由于进行污水灌溉而被汞污染。该地块土壤容重为2.3×10³kg/m³，含水量为18％，pH值为7.4。对烟草进行正常的施肥浇水。观察记录烟草的生长状况。定期采样测量烟草中汞的积累量。同时采集土样，精确称取2g均匀土壤样品于150ml锥形瓶中，加硝酸硫酸混合液(硝酸硫酸体积比为1:1)10ml，水l0ml，5％的高锰酸钾溶液l0ml(若紫色褪去需补加高锰酸钾)，置于电热板上加热近沸60min，取下冷却，滴加20％盐酸羟胺使高锰酸钾全部褪色，定容至l00m1，取10ml样品，加入10％的氯化亚锡1ml，用F732一V智能型测汞仪测量其吸光度，计算土壤样品中的汞含量。经过测算，处理前该地块土壤汞含量为2.1mg/kg。栽种本发明所述的转基因烟草至成熟期，再次对该地块土壤汞含量进行测算，发现该地块土壤汞含量已经降为1.4mg/kg。对成熟期烟草叶片汞含量用无烟冷凝原子吸收光谱分析仪RA-2A(NipponInstruments,Tokyo,Japan)进行测量后发现，此时转基因烟草叶片汞含量最高值可达21nmol/g，转基因烟草根的汞含量最高可达117nmol/g。

Claims (9)

1.一种植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述植物叶绿体多基因转化载体的外源多顺反子的插入位点位于叶绿体psbC-trnG高频同源重组区；

所述植物叶绿体多基因转化载体由商业化载体pRI101-AN和插入基因构成，所述插入基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述外源多顺反子只有一个启动子，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述外源多顺反子中每两个相邻基因之间都由一段如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列连接。

4.根据权利要求3所述的植物叶绿体多基因转化载体，其特征在于，所述外源多顺反子中的每个基因起始密码子的前面都连有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

5.一种如权利要求1所述的植物叶绿体多基因转化载体的构建方法，其特征在于，所述植物叶绿体多基因转化载体是将外源多顺反子插入叶绿体psbC-trnG高频同源重组区构建而成。

6.根据权利要求5所述的植物叶绿体多基因转化载体的构建方法，其特征在于，所述外源多顺反子中每两个相邻基因之间都由一段如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列连接。

7.一种如权利要求1所述的植物叶绿体多基因转化载体在制备多基因转化植物中的用途。

8.一种如权利要求1所述的植物叶绿体多基因转化载体在制备用于清除土壤重金属汞污染的转基因烟草中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述转基因烟草为在烟草中导入含有假单胞菌（Pseudonmonas）K-62菌株基因merT、merB1和产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）基因ppk的植物叶绿体多基因转化载体。