CN103626837B - 含生物可裂解二肽的糖原磷酸化酶抑制剂胆酸类衍生物、其制备方法及医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类含生物可裂解二肽的糖原磷酸化酶抑制剂胆酸类衍生物，还涉及他们的制备方法以及含有它们的药物组合。该类衍生物是糖原磷酸化酶的肝靶向前体药物，生物可裂解二肽可在体内酶的作用下裂解释放糖原磷酸化酶抑制剂。该类化合物可用于预防和治疗糖尿病及其并发症、高血脂症、肥胖、高胰高血糖素症、胰岛素抵抗、禁食高血糖症、高血压及其并发症、动脉粥样硬化症、代谢综合征或肿瘤。

Description

含生物可裂解二肽的糖原磷酸化酶抑制剂胆酸类衍生物、其 制备方法及医药用途

技术领域

本发明涉及一类含生物可裂解二肽的糖原磷酸化酶抑制剂胆酸类衍生物，还涉及他们的制备方法以及含有它们的药物组合。糖原磷酸化酶抑制剂胆酸类衍生物是糖原磷酸化酶的肝靶向前体药物，与糖原磷酸化酶抑制剂相比口服后能够提高糖原磷酸化酶抑制剂在肝中的浓度，可作为降血糖特别是空腹高血糖治疗的优选药物。该类化合物可用于预防和治疗糖尿病及其并发症、高血脂症、肥胖、高胰高血糖素症、胰岛素抵抗、禁食高血糖症、高血压及其并发症、动脉粥样硬化症、代谢综合征或肿瘤。

背景技术

2型糖尿病是一组由遗传缺陷和后天环境因素共同导致的以空腹和餐后高血糖为主要特征的代谢异常综合征。持续的高血糖会导致血管、肾脏、神经系统及视网膜等并发症的产生，因此，保持血糖水平正常十分重要。临床研究表明，糖尿病患者肝脏所输出葡萄糖的显著增加是导致空腹高血糖的重要原因之一。用³H标记葡萄糖的研究显示，健康个体在基础状态下，肝脏所输出葡萄糖的速率为1.8-2.0mg·kg^-1·min^-1；而伴有中度空腹高血糖的2型糖尿病患者，其肝脏输出葡萄糖的速率约增加0.5mg·kg^-1·min^-1，显著高于正常人。

肝脏葡萄糖的生成主要来源于两方面：1)糖异生作用；2)糖原的酶催化降解。研究表明，糖异生和糖原降解对糖尿病患者的肝脏糖生成具有同等的贡献。值得注意的是，二甲双胍作为临床上首选的降糖药之一，其作用机制被认为主要是通过抑制肝脏糖异生作用来降低血糖。而另一方面，目前在临床上尚无有效的抑制肝脏糖原过度降解的药物。

空腹情况下，肝糖原经糖原磷酸化酶的作用生成葡萄糖-1-磷酸，再经磷酸葡萄糖变位酶催化下转变为葡萄糖-6-磷酸，最后在葡萄糖-6-磷酸酯酶的作用下去磷酸化而输出肝糖。或是直接进入无氧代谢和有氧代谢途径以参与能量供应。由于糖原磷酸化酶是糖原代谢中的一个关键因子，因此，对它的药理性抑制有可能用于治疗与糖原过度降解相关的疾病，如糖尿病、缺血性心肌损伤和肿瘤等(Curr.Protein.Pept.Sci.，2002，3，561；Am.J.Physiol.Heart.Girc.Physiol.，2004，286，H1177)。此外，高血压及其相关的病理改变例如动脉粥样硬化、高脂血症以及高胆固醇血症等都与升高的胰岛素水平有关。糖原磷酸化酶抑制剂可有效降低胰岛素水平，因此可用于治疗高胆固醇血症、高胰岛素血症、高血脂症、动脉粥样硬化及心肌缺血。

近年来，研发新型糖原磷酸化酶抑制剂这一领域已受到广泛关注。例如，美国专利申请No.6,297,269和欧洲专利申请No.EP0832066记载了作为糖原磷酸化酶抑制剂的取代的N-(吲哚-2-羰基)酰胺及其衍生物，美国专利申请No.6,107,329记载了作为糖原磷酸化酶抑制剂的取代的N-(吲哚-2-羰基)甘氨酰胺及其衍生物，欧洲专利申请No.WO2006059163记载了作为糖原磷酸化酶抑制剂的吡咯并吡啶-2-甲酸酰胺衍生物。但是，人体组织中存在三种糖原磷酸化酶同功酶，依据其优势表达的组织分别被命名为肌型糖原磷酸化酶、脑型糖原磷酸化酶、肝型糖原磷酸化酶，三者具有高度的同源性。肌型糖原磷酸化酶主要存在于肌肉组织，其功能是为肌肉收缩供应能量，脑型糖原磷酸化酶主要在成年人的脑和心脏表达，可在缺氧或严重低血糖时提供葡萄糖的紧急供应，而肝型糖原磷酸化酶则通过调节肝脏糖原贮存的葡萄糖来影响全身血糖。由于该酶三种同工酶同源性高，导致目前报道的该靶点抑制剂普遍缺乏对肝脏糖原磷酸化酶的选择性，从而导致对肌肉组织产生肌毒性反应，临床应用受到限制。为了降低糖原磷酸化酶抑制剂的肌毒性反应，提高其降血糖活性，增加生物利用度，对已经报道的糖原磷酸化酶抑制剂进行修饰研究，寻找可选择性作用于肝脏糖原磷酸化酶的新衍生物。

胆酸是目前唯一的口服肝靶向药物载体，它在体内有特殊的转运系统。胆酸可被肝脏特异性的吸收，这种吸收是通过肝细胞膜上的Na⁺依赖性转运系统(NTCP)及Na⁺非依赖性转运系统(OTAP)实现的。胆酸是内源性的肝细胞特异性的天然配基，具有高度的器官特异性。胆酸在肝细胞中由胆固醇生物合成而来，然后与甘氨酸或牛磺酸结合，随胆汁排入小肠，再吸收入肝脏，不断的进行肝肠循环成人体内肝肠循环。每天重复6-15次，参与循环的胆酸总量达到17-40克。因此具有较高的转运能力。作为内源性的天然配基胆酸具有良好的生物兼容性，适合于作为靶向药物的载体，以胆酸为靶向载体，不但能够实现药物的肝靶向性，减少毒副作用，而且能够提高药物在体内的生物利用度。

在靶向载体与小分子药物中间的间隔基团发挥着不可忽视的作用。间隔基团使低分子药物与靶向载体形成稳定的或暂时的结合，可在血液循环中保持一定的稳定性，在体液和酶的作用下通过水解、离子交换或酶促反应使药物基团重新断裂下来，即具有一定的稳定性和可水解及酶解性。适宜的间隔基团，可以控制药物从聚合物中释放的速度和药物释放部位。肽类间隔基团是近年来研究较为广泛的一种间隔基团。由于氨基酸序列形成的寡肽可以被溶酶体中的酶催化水解，因此可以由特别设计的寡肽作为间隔基团把药物和靶向载体连接起来。由于不同的酶对不同的肽类发生作用的位置有所差异，因此肽类间隔基团的长度和组成可以影响药物的释放速度。De Marre等对以寡肽连接的丝裂霉素C-聚[N-(2-羟乙基)-L-谷酰胺]前药进行研究，在pH5.5条件下，用tritosomes水解3h后，以Ala-Leu-Ala-Leu为间隔基团的前药，丝裂霉素C的释放可达到81.0％，而以Gly-Phe-Leu为间隔基团的前药，丝裂霉素C的释放仅达到2.4％，说明间隔基团的寡肽结构及组成对药物的释放有很大影响(J. Control Release，1994，31，89-97)。

发明内容

本发明首次公开了式(I)所示的具有药用价值的含生物可裂解二肽的糖原磷酸化酶抑制剂胆酸类衍生物、其制备方法及医药用途，包括在制备抗糖尿病及其并发症药物、降血脂药物、减肥药物、抗动脉粥样硬化药物、治疗代谢综合症药物和抗肿瘤药物方面的用途。尤其是式(I)所示的化合物是糖原磷酸化酶抑制剂的肝靶向前体药物，因此可以用于治疗肝脏中与糖原代谢异常相关的疾病，这些疾病包括：糖尿病及其并发症、高血脂症、肥胖、高胰高血糖素症、胰岛素抵抗、禁食高血糖症、高血压及其并发症、动脉粥样硬化症、代谢综合征或肿瘤。此外，本发明还提供一种含有式(I)所示化合物的药物制剂。

本发明涉及式(I)所示的化合物及其药学上可接受的盐或酯：

其中：

X₁、X₂、X₃和X₄全为C或者X₁、X₂、X₃和X₄之一为N而其他的必须为C；

R₁和R₁’各自独立代表H、卤素、羟基、氰基、C_0-4烷基、C_1-4烷氧基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、乙烯基、乙炔基；

R₂代表CH₃-、(CH₃)₂CHCH₂-、CH₃CH₂(CH₃)CH-、H₂NCH₂CH₂CH₂CH₂-；

R₃代表(CH₃)₂CH-、C₆H₅CH₂-、p-HO-C₆H₄CH₂-；

R₄、R₅、R₆和R₇各自独立代表H、羟基、R₈COO；

R₈代表1～20个碳的非取代的或X取代的直链或支链烷基、烯烃基、炔烃基、芳基和杂芳基；

X代表H、F、Cl、Br、I、CN、NO₂、NH₂、CF₃、SH、OH、OCH₃、OC₂H₅、COOH、1～10个碳的直链或支链烷基、烯烃基、炔烃基、芳基、杂芳基。

上述化合物中优选的化合物为：

X₁、X₂、X₃和X₄全为C或者X₁、X₂、X₃和X₄之一为N而其他的必须为C；

R₁和R₁’各自独立为H、卤素、氰基；

R₂代表CH₃-、H₂NCH₂CH₂CH₂CH₂-；

R₃代表(CH₃)₂CH-、C₆H₅CH₂-；

R₄、R₅、R₆和R₇各自独立为H、羟基；

X代表H、F、Cl、Br、I、CN、NO₂、NH₂、CF₃、SH、OH、OCH₃、OC₂H₅、COOH、1～10个碳的直链或支链烷基、烯烃基、炔烃基、芳基、杂芳基。

更为优选的化合物是：

本发明所述的化合物可采用已报道的工艺方法制备，也可以采用下述方法制备得到：

a)将制备好的含裸露羟基的糖原磷酸化酶抑制剂，与氨基端用叔丁氧羰基(Boc)或芴甲氧羰基(Fmoc)保护的二肽溶解在有机溶剂中，加入偶联试剂进行成酯反应，反应1-72小时，温度为0℃至45℃。偶联试剂可以采用常规的缩合试剂，如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-丙基磷酸三环酸酐(T₃P)。可视反应进行情况适当选择催化剂，如4-二甲氨基吡啶；

b)将a产物溶解在有机溶剂中，加入脱保护试剂脱去氨基端的保护，温度为0℃至回流。其中，氨基端用叔丁氧羰基(Boc)保护的a产物用三氟乙酸脱去保护，氨基端用芴甲氧羰基(Fmoc)保护的a产物用哌啶脱去保护。所采用的溶剂可以是乙腈、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、甲苯、正己烷、环己烷、叔丁基甲基醚或上述溶剂的混合溶剂，优先采用乙腈或二氯甲烷作为溶剂；

c)将羧基端游离的胆酸及其衍生物，与b产物溶解在有机溶剂中，加入偶联试剂与有机胺或无机碱，反应1-72小时，温度为0℃至45℃。溶剂一般选择惰性溶剂，特别是非质子性溶剂，包括乙腈、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、正己烷、环己烷、四氢呋喃、叔丁基甲基醚或上述溶剂的混合溶剂，优先采用二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或N，N-二甲基甲酰胺。偶联试剂可以采用常规的缩合试剂，如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯和1-羟基苯并三氮唑(HATU)、1-丙基磷酸三环酸酐(T₃P)。所采用的无机碱为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾，所采用的有机碱为N，N-二异丙基乙胺或三乙胺。

本发明还包括药物制剂，该制剂包含作为活性剂的通式(I)化合物或其药用盐、酯或药学上可接受的载体。

上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，是指一种或几种惰性的、非毒性的固体或液体填充物、稀释剂，助剂等，它们不逆向与活性化合物或病人发生作用。

本发明组合物的剂型可以是片剂、胶囊、丸剂、栓剂、软胶囊、口服液、混悬剂、注射液等药剂学上常用的剂型。

口服用药片和胶囊含有传统的赋形剂如填充物、稀释剂、润滑剂、分散剂以及粘合剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。

以上活性剂的剂量将因配方而异。

一般地，已证明有利的量，为达到所需结果，每千克每24小时给药的式(1)化合物的总量为约0.01-800mg，优选的总量为0.1-100mg/kg。如果必要，以几次单剂量的形式给药。然而，如果必要，也可以偏离上述用量，即这取决于待治疗的受试者的类型和体重、个体对药物的行为、疾病的性质和严重性、制剂和给药的类型、以及给药时间和间隔。

附图说明

图1是表示本发明部分衍生物的制备过程。

在图1中，X₁、X₂、X₃、X₄、R₁、R₁’、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和X的定义如上述式(I)中所定义，R₉代表各种氨基酸的N端保护基，如叔丁氧羰基(Boc)或芴甲氧羰基(Fmoc)。

具体实施方式：

下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实例是为了更好的阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

以下通过实施例进一步说明本发明的实施

实施例1

(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-(4-氟苯基)-1-(4-羟基哌啶-1-基)丙酮

将BOC-4-氟-L-苯丙氨酸(15.6g，55.1mmol)溶于无水二氯甲烷(160mL)中，冰浴下加入HATU(25g，66.1mmol)和DIPEA(8.54g，66.1mmol)，室温搅拌10分钟，再加入4-羟基哌啶(6.7g，66.1mmol)，室温搅拌过夜。反应液以饱和食盐水洗，无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，残渣经反相HPLC分离，得白色固体(50mg，29.8％)。快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯l/l，V/V)，得白色固体(19.7g，98％)。

ESI-MS m/z：367.2[M+H]⁺.

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：7.14-7.18(m，2H)，6.95-7.00(m，2H)，5.47(dd，J＝8.8，14.8Hz，1H)，4.83(dd，J＝6.0，13.6Hz，1H)，3.81-4.01(m，2H)，3.46-3.62(m，1H)，3.15-3.33(m，1H)，2.89-3.00(m，2H)，1.73-1.83(m，2H)，1.42-1.52(m，2H)，1.40(s，9H).

(S)-2-氨基-3-(4-氟苯基)-1-(4-羟基哌啶-1-基)丙酮

将(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-(4-氟苯基)-1-(4-羟基哌啶-1-基)丙酮(19g，52mmol)溶于二氯甲烷(50mL)，冰浴下，缓慢滴加新鲜制备的氯化氢的二氯甲烷溶液(2N，50mL)，室温搅拌过夜。次日，反应液减压浓缩得白色固体(14g，89％)。

ESI-MS m/z：267.2[M+H]⁺.

¹H NMR(MeOD，400MHz)：8.52(brs，1H)，7.29(dd，J＝7.2，13.6Hz，2H)，7.09-7.14(m，2H)，4.63(br s，1H)，3.86-4.06(m，1H)，3.73-3.83(m，1H)，3.35-3.62(m，1H)，2.78-3.21(m，4H)，0.92-1.85(m，4H).

(S)-1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-4-羟基哌啶

按制备(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-(4-氟苯基)-1-(4-羟基哌啶-1-基)丙酮的类似方法，将(S)-2-氨基-3-(4-氟苯基)-1-(4-羟基哌啶-1-基)丙酮(14g，46.4mmol)和5-氯-1-氢-吡咯[2，3-c]并吡啶-2-羧酸(9.08g，46.4mmol)反应，得白色固体(14.2g，99％)。

ESI-MS m/z：444.9[M+H]⁺.

¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)：12.27(s，1H)，9.22(t，J＝8.8Hz，1H)，8.57(s，1H)，7.77(s，1H)，7.36(d，J＝9.6，3H)，7.06(d，J＝3.6，1H)，5.16(d，J＝6.4，1H)，4.75(s，1H)，3.67-4.04(m，3H)，2.91-3.30(m，4H)，1.57-1.67(m，2H)，1.13-1.24(m，2H).

(S)-2-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基正丁酰胺基)丙酸甲酯

将N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸(4g，18.4mmol)和丙氨酸甲酯盐酸盐(2.58g，18.5mmol)溶于干燥的DMF(80mL)中，冰浴下加入EDCI(5.3g，27.7mmol)，HOBt(3.73g，27.65mmol)和DIPEA(5.93g，46mmol)，氮气保护下室温搅拌过夜。反应液依次以1N盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压蒸干得白色固体(4.5g，80％)。

ESI-MS m/z：325.2[M+Na]⁺.

¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：6.38(brs，1H)，5.07(brs，1H)，4.58-4.65(m，1H)，3.93-3.97(m，1H)，3.78(s，3H)，2.11-2.20(m，1H)，1.47(s，9H)，1.43(d，J＝7.2Hz，3H)，0.99(d，J＝6.8Hz，3H)，0.94(d，J＝6.8Hz，3H)；

(S)-2-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基正丁酰胺基)丙酸

将(S)-2-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基正丁酰胺基)丙酸甲酯(2.5g，8.3mmol)溶于甲醇/水的混合溶液中(20mL，V/V＝l/l)，加入氢氧化钠(0.5g，12.5mmol)，室温搅拌3h。减压蒸除甲醇，剩余反应液用1N盐酸水溶液中和pH至2-3，过滤，滤饼以二氯甲烷洗涤，真空干燥得白色固体(1.6g，46％)。

ESI-MS m/z：287.0[M-H]-.

¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：6.86(brs，1H)，5.26-5.34(m，1H)，4.59-4.63(m，1H)，3.99-4.02(m，1H)，2.04-2.25(m，1H)，1.47-1.49(m，12H)，0.98(d，J＝6.4，3H)，0.95(d，J＝6.8，3H).

(S)-N-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基正丁酰基)丙氨酸-{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯

将(S)-2-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基正丁酰胺基)丙酸(1g，3.5mmol)和(S)-1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-4-羟基哌啶(1.54g，3.5mmol)溶于DMF(30mL)中，冰浴下加入DCC(1.1g，5.2mmol)，室温搅拌过夜。反应混合物过滤，滤液蒸去溶剂，残余物用乙酸乙酯溶解，置冰箱中过夜，过滤，滤液蒸去溶剂，残渣经反相HPLC分离，得白色固体(1.3g，57％)。

ESI-MS m/z：715.0[M+H]⁺.

¹H-NMR(MeOD，400MHz)：8.53(s，1H)，7.64(s，1H)，7.30-7.35(m，2H)，7.14(s，1H)，7.00-7.06(m，2H)，5.31-5.36(m，1H)，4.89-4.96(m，1H)，4.36-4.42(m，1H)，3.40-3.95(m，5H)，3.17-3.30(m，1H)，3.08-3.13(m，1H)，2.00-2.07(m，1H)，1.78-1.89(m，1H)，1.54-1.67(m，1H)，1.29-1.45(m，14H)，0.89-1.00(m，6H).

(S)-N-(2-氨基-3-甲基正丁酰基)丙氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯

将(S)-N-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基正丁酰基)丙氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯(1g，1.4mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，冰浴下滴加三氟醋酸(1mL，14mmol)，滴毕维持此温度搅拌2小时。减压蒸除反应液，残渣溶于乙酸乙酯，依次以饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥。过滤除去干燥剂，浓缩，得到白色固体粗品，此粗品无需纯化可直接用于下一步反应。

(S)-N-{2-[N-(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷酰胺基)]-3-甲基正丁酰基}丙氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯

将胆酸(330mg，0.80mmol)溶于DMF(5mL)中，冰浴下加入HATU(456mg，1.2mmol)和三乙胺(121mg，1.2mmol)，室温搅拌10分钟，再加入(S)-N-(2-氨基-3-甲基正丁酰基)丙氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯(450mg，crude)，室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残渣溶于乙酸乙酯，有机相以饱和食盐水洗，无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，残渣经反相HPLC分离，得淡黄色固体(150mg，24％)。

ESI-MS m/z：1005.0[M+H]⁺.

¹H-NMR(MeOD，400MHz)：8.58(s，1H)，7.71(s，1H)，7.31-7.36(m，2H)，7.17-7.20(m，1H)，7.01-7.07(m，2H)，4.95-5.00(m，1H)，4.35(td，J＝7.2，14.4Hz，1H)，4.15-4.27(m，1H)，3.90-3.96(m，1H)，3.78-3.81(m，2H)，3.69(s，1H)，3.55-3.62(m，2H)，3.36-3.48(m，2H)，3.08-3.24(m，2H)，2.23-2.25(m，4H)，1.13-1.84(envelope，31H)，1.40(s，3H)，1.38(s，3H)，0.85-1.08(envelope，16H)，0.69-0.71(m，1H)，0.68(d，J＝26.0Hz，3H).

实施例2

(S)-2-[(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-苯丙酰胺基]-6-(苄氧酰胺基)己酸甲酯

按制备(S)-2-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基正丁酰胺基)丙酸甲酯的类似方法，将赖氨酸甲酯盐酸盐(2.49g，7.6mmlo)和N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(2g，7.6mmol)反应，得白色固体(3g，73％)。

ESI-MS m/z：542.3[M+H]⁺.

¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：7.38(d，J＝4.4Hz，4H)，7.29-7.35(m，5H)，7.20-7.27(m，3H)，6.49(d，J＝7.2Hz，1H)，5.11(dd，J＝12.4，16.4Hz，2H)，4.54-4.59(m，1H)，4.35-4.40(m，1H)，3.72(s，3H)，3.16(dd，J＝6.0，12.0Hz，2H)，3.07(t，J＝6.0Hz，2H)，1.77-1.88(m，1H)，1.64-1.71(m，1H)，1.49-1.56(m，2H)，1.40(s，9H)，1.27-1.36(m，2H).

(S)-2-[(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-苯丙酰胺基]-6-(苄氧酰胺基)己酸

按制备(S)-2-(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基正丁酰胺基)丙酸的类似方法，将(S)-2-[(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-苯丙酰胺基]-6-(苄氧酰胺基)己酸甲酯水解，得白色固体(2.5g，91％)。

ESI-MS m/z：526.0[M-H]^-.

¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：7.35(brs，4H)，7.17-7.29(m，6H)，704(brs，1H)，5.32(d，J＝44.4Hz，1H)，5.09(dd，J＝12.4，18.8Hz，2H)，4.51(dd，J＝14.8，41.2Hz，1H)，2.98-3.18(m，4H)，1.88(brs，1H)，1.73(brs，1H)，1.43-1.51(m，2H)，1.38(s，9H)，1.24-1.29(m，2H).

(S)-2-[(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-苯丙酰胺基]-6-(芴甲氧羰酰胺基)己酸

将(S)-2-[(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-苯丙酰胺基]-6-(苄氧酰胺基)己酸(1g，1.9mmol)溶于甲醇(10mL)中，加入催化量的10％Pd/C(20mg)，室温常压氢化24小时。常压过滤除去Pd/C，滤液蒸干。残渣溶于二氧六环(10mL)中，冰浴下，缓慢加入NaHCO₃(404mg，4.75mmol)和芴甲氧羰酰氯(518mg，2.0mmol)，冰浴下搅拌5小时。减压蒸干溶剂，残渣以乙酸乙酯稀释，依次以1N盐酸水溶液、饱和NaHCO₃水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后蒸去溶剂得白色固体(1g，86％)。

ESI-MS m/z：614.0[M-H]^-.

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.68(d，J＝7.6Hz，2H)，7.53(d，J＝6.4Hz，1H)，7.41(t，J＝7.6Hz，2H)，7.33(t，J＝7.2Hz，2H)，7.24-7.29(m，4H)，7.15-7.19(m，2H)，4.26(d，J＝6.8Hz，2H)，4.19(t，J＝6.4Hz，1H)，4.05-4.11(m，1H)，3.83(dd，J＝5.6，11.6Hz，1H)，3.05-3.09(m，1H)，2.93(dd，J＝6.4，13.2Hz，2H)，2.70-2.76(m，1H)，1.68-1.76(m，1H)，1.52-1.61(m，1H)，1.34-1.14(m，2H)，1.29(s，9H)，1.20-1.23(m，2H).

(S)-N-[(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-苯丙酰基)]-N’-芴甲氧羰酰基赖氨酸-{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯

将(S)-2-[(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-苯丙酰胺基]-6-(芴甲氧羰酰胺基)己酸(380mg，0.6mmol)和(S)-1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-4-羟基哌啶(550mg，0.6mmol)溶解于干燥的二氯甲烷(30.0mL)中，缓慢加入1-丙基磷酸三环酸酐的乙酸乙酯溶液(T₃P，50wt.％，0.95mL，3.1mmol)。加毕，氮气保护下室温搅拌过夜。反应结束后，反应液中依次以1N盐酸水溶液，饱和NaHCO₃水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残渣经反相HPLC分离(流动相：ACN---H₂O(0.05％TFA)，梯度：10％-30％)，得白色固体(380mg，60％)。

ESI-MS m/z：1042.0[M+H]⁺.

¹H-NMR(MeOD，400MHz)：8.55(d，J＝7.6Hz，1H)，7.71-7.79(m，2H)，7.60-7.66(m，3H)，7.36(dd，J＝7.2，14.4Hz，2H)，7.22-7.31(m，9H)，7.13(d，J＝10.0Hz，1H)，7.00(dd，J＝8.0，16.0Hz，2H)，5.26-5.33(m，1H)，4.31-4.38(m，4H)，4.14-4.20(m，1H)，3.39-3.77(m，4H)，3.08-3.16(m，5H)，2.67-2.87(m，2H)，1.05-1.85(envelope，20H)，1.32(s，9H).

(S)-N-[(S)-2-氨基-3-苯丙酰基)]-N’-芴甲氧羰酰基赖氨酸-{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯

按制备(S)-N-(2-氨基-3-甲基正丁酰基)丙氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯的类似方法，将(S)-N-[(S)-2-叔丁氧羰基氨基-3-苯丙酰基)]-N’-芴甲氧羰酰基赖氨酸-{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯脱保护，得白色固体粗品，此粗品无需纯化可直接用于下一步反应。

(S)-N-{2-[N-(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷酰胺基)]-3-苯丙酰胺基}-N’-芴甲氧羰酰基赖氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯

按制备(S)-N-{2-[N-(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷酰胺基)]-3-甲基正丁酰基}丙氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯的类似方法，将胆酸(155mg，0.38mmol)和(S)-N-[(S)-2-氨基-3-苯丙酰基)]-N’-芴甲氧羰酰基赖氨酸-{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯350mg粗品反应，得白色固体(300mg，61％)。

ESI-MS m/z：666.6[M/2+H]⁺.

¹H-NMR(MeOD，400MHz)：8.70(d，J＝7.6Hz，1H)，7.73-7.81(m，3H)，7.61-7.68(m，2H)，7.39(t，J＝7.2Hz，2H)，7.25-7.33(m，6H)，7.14-7.20(m，1H)，7.23(d，J＝4.4Hz，2H)，7.00-7.05(m，2H)，5.26-5.37(m，1H)，4.94-4.98(m，1H)，4.61-4.72(m，1H)，4.29-4.39(m，2H)，4.17-4.24(m，1H)，3.86-3.93(m，1H)，3.71-3.76(m，2H)，3.47-3.56(m，2H)，3.04-3.22(m，4H)，2.70-2.95(m，3H)，2.14-2.33(m，3H)，1.91-2.11(m，3H)，1.30-1.82(envelope，23H)，1.30(s，3H)，1.12-1.21(m，3H)，0.89-1.03(envelope，8H)，0.91(d，J＝4.4Hz，3H)，0.63-0.68(m，1H)，0.62(d，J＝18.8Hz，3H).

(S)-N-{2-[N-(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷酰胺基)]-3-苯丙酰胺基}-赖氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯

将(S)-N-{2-[N-(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷酰胺基)]-3-苯丙酰胺基}-N’-芴甲氧羰酰基赖氨酸{1-[2-(5-氯-1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-2-甲酰胺)-3-(4-氟苯基)丙酰基]-哌啶-4-基}酯(260mg，0.20mmol)溶于乙腈(3mL)中，冰浴下，缓慢滴加哌啶溶液(0.6mL)，滴毕室温搅拌1h。减压蒸除溶剂，残渣经反相HPLC分离(流动相：ACN---H₂O(0.05％TFA)，梯度：10％-30％)，得淡棕色固体(100mg，45％)。

ESI-MS m/z：1110.0[M+H]⁺.

¹H-NMR(MeOD，400MHz)：7.70(d，J＝3.6Hz，1H)，7.33(t，J＝5.2Hz，3H)，7.27(dd，J＝4.4，24.4Hz，4H)，7.18(d，J＝2.8Hz，1H)，7.02-7.06(m，2H)，5.32(dd，J＝7.2，14.0Hz，1H)，4.56-4.63(m，1H)，4.37(ddd，J＝5.2，12.2，23.0Hz，1H)，3.92(d，J＝23.6Hz，1H)，3.71-3.82(m，2H)，3.39-3.60(m，3H)，3.08-3.23(m，5H)，2.88-2.95(m，3H)，2.16-2.35(m，4H)，1.31-1.90(m，30H)，0.95-1.17(m，3H)，0.93(d，J＝5.2Hz，3H)，0.67(d，J＝21.2Hz，3H).

体外糖原磷酸化酶抑制活性试验：

试剂的配制：1)显色液的配制：称量钼酸铵5g，溶解于500ml1M HCl中，用搅拌器搅拌，至全部溶解后在加入孔雀绿190mg，继续搅拌至全部溶解，并用锡箔纸避光；2)缓冲液的配制：①精密称量Hepes0.5958g，溶于5ml H₂O中，用10M NaOH调PH至7.2，配制成终浓度为0.5M的Hepes；②精密称量KCl0.3728g，溶于5ml H₂O中，配制成终浓度为1M的KCl；③精密称量MgCl₂0.0255g，溶于1ml H₂O中，配制成终浓度为125mM的MgCl₂；④精密称量EGTA0.0476g，溶于5ml H₂O中，用10M NaOH调PH至7.0，配制成终浓度为25mM的EGTA；⑤精密称量G-1-P0.0152g，溶于10ml H₂O中，配制成终浓度为5mM的G-1-P；⑥精密称量glycogen10mg，溶于1ml H₂O中，配制成终浓度为10mg/ml的glycogen；3)阳性药caffeine溶液的配制：将caffeine溶于10ml H₂O配制0.5、5、50和500μM的溶液；4)配制GPa溶液：取1μl的GPa加入到100μl反应体系中，终浓度为250ng/100μl；5)待测试化合物溶液的配制：将待测试化合物溶于DMSO配制成浓度为10mM溶液，取适量化合物溶液加入到反应体系中至不同终浓度。

测定rabbit肌糖原磷酸化酶活性的量效曲线：通过读取不同浓度的GPa加入显色液后的在655nm下的OD值，来测定其量效曲线。由量效曲线可选择GPa的量为250ng。

实验步骤：1)设计PC(阳性对照)、Blank(空白对照)、阳性药(咖啡因)；2)加反应buffer52μl；3)加测试化合物至终浓度；4)加酶1μl，终浓度为250ng/100μl；5)加显色液150μl；6)30摄氏度条件下反应20分钟；7)在波长655nm条件下比色；8)数据的读取及抑制率的计算：抑制率＝[阳性对照-待测样品]/[阳性对照-空白对照]。

测试结果：表中列出了糖原磷酸化酶肝靶向前药分子对rabbit肌糖原磷酸化酶的抑制活性数据，结果显示，该类糖原磷酸化酶肝靶向前药分子对糖原磷酸化酶具有不同程度的抑制活性。

糖原磷酸化酶肝靶向前药分子对rabbit肌糖原磷酸化酶的抑制活性

^aIC₅₀值均为三次实验的平均值；

^bNI表示在100M浓度下没有活性。

以上药理学数据显示，本发明通式(I)化合物具有糖原磷酸化酶的抑制作用，因此可用于预防和治疗糖尿病及其并发症、高血脂症、肥胖、高胰高血糖素症、胰岛素抵抗、禁食高血糖症、高血压及其并发症、动脉粥样硬化症、代谢综合征或肿瘤。

Claims (11)

1.如下式所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

X₁、X₂、X₃和X₄全为C或者X₁、X₂、X₃和X₄之一为N而其他的必须为C；

R₁和R₁’各自独立代表H、卤素、羟基、氰基、C₄烷基、C_1-4烷氧基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、乙烯基或乙炔基；

R₂代表CH₃-、(CH₃)₂CHCH₂-、CH₃CH₂(CH₃)CH-或H₂NCH₂CH₂CH₂CH₂-；

R₃代表(CH₃)₂CH-、C₆H₅CH₂-或p-HO-C₆H₄CH₂-；

R₄、R₅、R₆和R₇各自独立代表H、羟基或R₈COO-；

R₈代表1～20个碳的非取代的或X取代的直链或支链烷基、烯烃基、炔烃基、芳基或杂芳基；

X代表H、F、Cl、Br、I、CN、NO₂、NH₂、CF₃、SH、OH、OCH₃、OC₂H₅、COOH、1～10个碳的直链或支链烷基、烯烃基、炔烃基、芳基或杂芳基。

2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：

X₁、X₂、X₃和X₄全为C或者X₁、X₂、X₃和X₄之一为N而其他的必须为C；

R₁和R₁’各自独立为H、卤素、羟基或氰基；

R₂代表CH₃-或H₂NCH₂CH₂CH₂CH₂-；

R₃代表(CH₃)₂CH-或C₆H₅CH₂-；

R₄、R₅、R₆和R₇各自独立为H或羟基。

3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，化合物是下列任一化合物或其药学上可接受的盐：

4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：

a)将制备好的含裸露羟基的糖原磷酸化酶抑制剂，与氨基端用叔丁氧羰基或芴甲氧羰基保护的二肽溶解在有机溶剂中，加入偶联试剂进行成酯反应，反应1-72小时，温度为0℃至45℃；偶联试剂采用1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐、N，N′-二环己基碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯或1-丙基磷酸三环酸酐；

b)将步骤a)的产物溶解在有机溶剂中，加入脱保护试剂脱去氨基端的保护，温度为0℃至回流；其中，氨基端用叔丁氧羰基保护的a)产物用三氟乙酸脱去保护，氨基端用芴甲氧羰基保护的a)产物用哌啶脱去保护；所采用的溶剂是乙腈、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、甲苯、正己烷、环己烷、叔丁基甲基醚或上述溶剂的混合溶剂；

c)将羧基端游离的胆酸或其衍生物，与步骤b)的产物溶解在有机溶剂中，加入偶联试剂与有机胺或无机碱，反应1-72小时，温度为0℃至45℃；溶剂是乙腈、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、正己烷、环己烷、四氢呋喃、叔丁基甲基醚或上述溶剂的混合溶剂；偶联试剂采用1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐、N，N′-二环己基碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯或1-丙基磷酸三环酸酐；所采用的无机碱为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾，所采用的有机胺为N，N-二异丙基乙胺或三乙胺。

5.如权利要求4所述的方法，其中，步骤a)中加入催化剂4-二甲氨基吡啶。

6.如权利要求4所述的方法，其中，步骤b)中所采用的溶剂是乙腈或二氯甲烷。

7.如权利要求4所述的方法，其中，步骤c)中的溶剂是二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或N，N-二甲基甲酰胺。

8.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

9.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗高血压或其并发症、动脉粥样硬化症、代谢综合征或肿瘤的药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：所述代谢综合征是糖尿病或其并发症、高血脂症、肥胖、高胰高血糖素症、胰岛素抵抗或禁食高血糖症。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于：所述糖尿病是2型糖尿病，其并发症包括：糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病神经病变或糖尿病并发的心脑血管疾病。