CN103622911B - 一种难溶性药物脂质体制备方法 - Google Patents

Abstract

本方法属于药物制备领域，特别涉及一种难溶性药物脂质体的制备方法。本发明采用分开制备不带药物的空白脂质体，与药物悬浮液或药物溶液，随后在一定温度、一定转速条件下混合空白脂质体与药物，经此方法制得难溶性药物脂质体，其包封率≥90%，平均粒径≤150nm。本发明采用常规工艺设备，产品质量稳定，方法工艺简单、成本低，解决了难溶性药物脂质体难于工业化的技术难题。

Description

一种难溶性药物脂质体制备方法

技术领域

本方法属于药物制剂工艺领域，特别涉及一种难溶性药物脂质体制剂的制备方法。

背景技术

脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部生物学定义:当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。

脂质体是一种含磷脂组分的微粒，可作为难溶性药物的载体，是一种新型药物制剂。含药脂质体经静脉给药后，主要被网状内皮系统吞噬，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，改变被包封药物的体内分布，从而提高药物的治疗指数，可减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。

脂质体按结构和粒径可分为：单室脂质体、多室脂质体；脂质体按性能可分为：一般脂质体（包括上述单室脂质体、多室脂质体和多相脂质体等）、特殊性能脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等；脂质体按荷电性可分为：中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。

到本专利申请为止，国内外研究（专利CN101385715B、CN101507708B、CN1092044C、CN1236771C、CN100356919C）难溶性药物制成脂质体的方法基本所谓的被动载药方式，即都是将难溶性药物与磷脂混合在一起，然后成膜，挤压最终制成脂质体。为了使最终产品的粒径符合质量标准，需要多次挤压，在此过程中容易导致药物的降解、杂质超标。一般来说这种工艺所得到的产品包封率都不是太高；而且成膜工艺难以控制，使得工业化成为困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有技术中，采用被动载药方式，制备难溶性药物脂质体时，包封率低，工艺复杂且难以控制。

为解决这一技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明首次采用主动载药的方式对难溶性药物进行包封，本发明预先制备不含活性物的空白脂质体，然后再制备难溶性药物的悬浮液或溶液，在一定温度和搅拌速率下将两者混合，混合体系由浑浊状转变成透明或半透明状即成。

这里所说的难溶性药物为，在100g水中溶解度低于0.1g的药物，包括阿德福韦酯、多西他赛、喜树碱、甲基多巴、双香豆素、安鲁米特、紫杉醇、安妥明、硝苯地平、甲苯磺丁脲、降糖灵、利福霉素、硫唑嘌啉、依托泊甙、灰黄霉素、法莫替丁，环胞素、甲氨喋呤、伊曲康唑、潘生丁、6-巯基嘌呤、胺碘酮、两性霉素B等。

上述方法包括以下步骤：

A、制备空白脂质体，并将空白脂质体的平均粒径控制在纳米尺寸；

B、制备难溶性药物溶液，或制备难溶性药物的悬浮液；

C、将步骤A中得到的空白脂质体，与步骤B中得到的难溶性药物悬浮液或溶液混合，制得含药脂质体。

步骤A中，空白脂质体的制备方法，包括薄膜超声法、注入法、逆向蒸发法、熔融法、冷冻干燥法、超声分散法、多相制备法等，

具体地说：步骤A中，磷脂和附加剂，在热熔条件或加有机溶剂条件下制备空白脂质体，经缓冲液水化，通过机械方法将空白脂质体平均粒径控制在纳米尺寸（优选平均粒径在150nm以下），其中磷脂按重量百分比占体系的0.1～50%，

其中，附加剂包括，胆固醇、维生素E、十八胺、磷酸二鲸蜡脂、大豆油、苋生油或橄榄油等；磷脂包括天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂或其混合物，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、二月桂磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酸、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、天然或合成的脑磷脂、心磷脂等。

步骤B中，将难溶性药物分散于有机溶剂或缓冲液中，通过机械方法控制药物颗粒为细粉末状态（优选平均粒径在5μm以下）。

上述内容中，步骤A或步骤B中，空白脂质体、难溶性药物悬浮液或溶液制备中，所述的机械方法，包括球磨法、气流粉碎法、高速剪切法、高压均质法、高压挤出法；

步骤A或步骤B中，缓冲液可用单糖、双糖、多糖或其混合物配制来保护脂质体，同时还可以添加其他缓冲离子对、抗氧剂、表面活性剂来增强难溶性药物分散性和脂质体的稳定性，如含有组氨酸、缬氨酸、苏氨酸、甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯胶、木糖醇、山梨醇、果糖中一种或几种的缓冲溶液；表面活性剂为聚氧乙烯类非离子表面活性剂、泊洛沙类非离子型表面活性剂、芳泽类聚氧乙烯型非离子表面活性剂或其混合物，

步骤A或步骤B中，机溶剂选自，乙醇、甲醇、乙醚、丙酮、异丙醇、叔丁醇、氯仿、二氯甲烷、二甲亚砜、甲酰胺中一种或几种的混合物。

本发明步骤C中反应温度范围是0～100℃，搅拌转速为0～50000rpm，步骤C所得载药脂质体中可能存在部分有机溶剂，本发明采用交叉切向流技术置换原载药脂质体溶液。成品中有机溶剂的残留量控制在5%（重量分数）以下。

本发明最后制得的成品脂质体制剂，经0.22μm滤膜过滤除菌，包装或冷冻保存。

大概的制备工艺流程图如附图1所示，本发明依据上图事宜，优选采用乙醇注入制备空白脂质体后，通过高压微射流将脂质体粒径降低至150nm以下，便于工业化除菌，备用。将难溶性药物通过有机溶剂溶解或将难溶性药物分散于含有表面活性剂的缓冲液中，形成平均粒径低于5μm的混悬液。将上述两种溶液按比例混合，搅拌，待体系由浑浊变成半透明或透明液时，停止搅拌，无菌过滤、灌装保存或冻干保存。

本发明优选注入法制备空白脂质体因为有下列原因：可工业化，乙醇有机溶剂对环境、对人体毒性较低；乙醇注入法制得脂质体后乙醇去除工艺可靠。

本发明的有益效果在于：

难溶性药物制成悬浮液或溶液后，物理性质有较大的改变，一旦加入空白脂质体内后，难溶性药物颗粒，更容易进入脂质体，同时脂质体磷脂膜的流动性，使得难溶颗粒能够更好进入脂质体膜层或内部，从而达到高于90%的包封率。形成难溶性药物也用“主动载药”方式进行全封。

本发明首次采用主动载药的方式对难溶性药物进行包封，在脂质体与药物混合后，无需再次通过高压剪切技术即可形成可以通过无菌过滤的脂质体制剂。将解决脂质体生产过程中的关键问题：多次挤压导致药物降解、杂质超标等问题；可实现脂质体制剂大规模的工业化生产，同时避免使用更多的有机溶剂。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图。

图2是实施例1中，空白脂质体的粒径图。

图3是实施例1中，包裹有紫杉醇的脂质体的粒径图。

图4是实施例1中，冻干复融后，紫杉醇脂质体粒径图。

图5是对比实施例1中，冻干复融后，紫杉醇脂质体粒径图。

图6是对比实施例2中，冻干复融后，两性霉素B脂质体粒径图。

具体实施方式

以下实施例中所涉及到的，脂质体中药物含量采用HPLC法测定；粒径采用激光仪测定；包封率测试方法如下：

柱活化：取凝胶柱G50轻敲让填料至管底，去红色帽盖并放入2ml离心管中，加入500μl水，30min后以8000转/分钟离心5min，弃滤液后，再加入500μl水，15min后以8000转/分钟离心5min，弃滤液后加0.9%氯化钠溶液500μl以8000转/分钟离心5min，弃滤液，再离心5min，更换离心管备用。

取样品适量，加水制成每1ml溶液中含紫杉醇为2mg的悬浮液。

精密量取悬浮液200μl至活化好的凝胶柱上，等10分钟后，以8000转/分钟离心5分钟，再加入500μl水于凝胶柱上以8000转/分钟离心5分钟，合并滤液至10ml容量瓶中，用醋酸：甲醇（1：200）洗涤离心管3次并转移至容量瓶中，加用醋酸：甲醇（1：200）溶解后转移溶解并定容至刻度，摇匀，采用HPLC法测定，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积记为A_包封。

上述凝胶柱再依次以25%乙醇2ml、50%乙醇2ml、无水乙醇4ml分次离心洗脱，洗脱液全部转移至另一10ml容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，摇匀，采用HPLC法测定，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积记为A_游离。

精密量取悬浮液200μl至10ml容量瓶中，加醋酸：甲醇（1：200）稀释至刻度，摇匀，照含量测定项下的色谱方法，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积记为A_{总 药物}。

按照公式计算包封率和柱回收率：

简化计算公式：

A_包封：为柱分离包封样品经醋酸：甲醇（1：200）稀释后样品溶液峰面积

A_游离：为柱分离游离样品经无水乙醇稀释后样品溶液峰面积

A_总药物：为未分离悬浮液经用醋酸：甲醇（1：200）稀释后样品溶液峰面积

实施例1

制备步骤A

空白脂质体处方：

将磷脂、大豆油用氯仿溶解，置于旋转蒸发仪上，除去氯仿，形成磷脂膜。将甘露醇溶于水中，加到磷脂膜中，将磷脂膜洗脱，经高压均质仪，将平均粒径控制在150nm以下备用。

空白脂质体的粒径图如附图2所示。

制备步骤B

紫杉醇溶液处方：

紫杉醇0.4g

乙醇2g

将紫杉醇溶解于乙醇中。

制备步骤C

在步骤B中加入步骤A制得的空白脂质体溶液（步骤B中，紫杉醇能够溶于乙醇，当乙醇溶液与水相混合时，紫杉醇不溶于水而析出，其颗粒很小，达到微米尺寸），在室温下，200rpm下搅拌，体系由浑浊变透明状液体。采用交叉切向流技术，除去乙醇使其残留量在5%以下。经0.22μm滤膜过滤除菌，分装、冻干。

加速稳定性数据

实施例2

制备步骤A

空白脂质体处方：

将磷脂、聚乙二醇磷脂酰乙醇胺、胆固醇加乙醇60℃加热溶解，将海藻糖，组氨酸溶于水中，用盐酸调ph为6.5，加热至65℃，将上述乙醇溶液注入，搅拌30min后，经高压均质仪，将平均粒径控制在180nm以下备用。

制备步骤B

多西他塞溶液处方：

多西他塞0.6g

乙醇2g

将多西他塞溶解于乙醇中。

制备步骤C

在步骤B中加入步骤A中制得的空白脂质体溶液（难溶性药物悬浮液或溶液的制备原理如实施例1中所示），在4℃下，100rpm下搅拌，体系由浑浊变透明状液体，经交叉切向流设备进行缓冲液置换后（乙醇的残留量控制在5%以下），经0.22μm滤膜过滤除菌，分装、冻干。

加速稳定性数据

实施例3

制备步骤A

空白脂质体处方：

将磷脂、磷脂酰甘油、胆固醇加甲醇、二氯甲烷溶解，得有机溶液；将蔗糖，丁二酸钠溶于水中，用盐酸调ph为5.5，加热至35℃。将上述有机溶液缓缓注入，搅拌30min后，真空回收有机溶剂，再经高压均质仪，将平均粒径控制在100nm以下备用。

制备步骤B

两性霉素B悬浮液处方：

两性霉素B1g

去氧胆酸钠0.1g

水10g

将去氧胆酸钠溶解于水中，加入两性霉素B，经胶体磨研磨，使得两性霉素B颗粒平均粒径在5μm以下。

制备步骤C

在步骤B中加入步骤A中制得的空白脂质体溶液，在70℃下，20000rpm下搅拌，体系由黄色浑浊变成黄色半透明状液体，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装、冻干。得到两性霉素B脂质体，平均粒径120nm，包封率＞90%。

加速稳定性数据

对比实施例1：（没有控制空白脂质体的粒径）

制备步骤A

空白脂质体处方：

将磷脂、大豆油用氯仿溶解，置于旋转蒸发仪上，除去氯仿，形成磷脂膜。将甘露醇溶于水中，加到磷脂膜中，获得空白脂质体溶液。

制备步骤B

紫杉醇溶液处方：

紫杉醇0.4g

乙醇2g

将紫杉醇溶解于乙醇中。

制备步骤C

在步骤B中加入步骤A制得的空白脂质体溶液中，混合均匀，200rpm下搅拌60分钟。采用交叉切向流技术，除去乙醇使其残留量在5%以下。经0.22μm滤膜过滤除菌，分装、冻干。

上述制备方法得到的脂质体药物，包封率为62.4%，平均粒径为457nm。

本对比实施例中，冻干复融后，紫杉醇脂质体粒径图如图5所示。

对比实施例2：（没有控制空白脂质体的粒径，且没有控制难溶性药物的粒径）

制备步骤A

空白脂质体处方：

将磷脂、磷脂酰甘油、胆固醇加甲醇、二氯甲烷溶解，得有机溶液；将蔗糖，丁二酸钠溶于水中，用盐酸调ph为5.5，加热至35℃。将上述有机溶液缓缓注入，搅拌30min后，真空回收有机溶剂，获得空白脂质体溶液。

制备步骤B

两性霉素B悬浮液处方：

两性霉素B1g

去氧胆酸钠0.1g

水10g

将去氧胆酸钠溶解于水中，加入两性霉素B，搅拌均匀。

制备步骤C

在步骤B中加入步骤A中制得的空白脂质体溶液，在70℃下，20000rpm下搅拌60分钟，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装、冻干。

上述制备方法得到的脂质体药物，包封率为58.6%，平均粒径为421nm。

本对比实施例中，冻干复融后，两性霉素B脂质体粒径图如图6所示。

Claims (1)

1.一种难溶性药物脂质体制备方法，其特征在于：所述的方法为，

步骤A

空白脂质体处方为

将磷脂、聚乙二醇磷脂酰乙醇胺、胆固醇加乙醇60℃加热溶解；将海藻糖，组氨酸溶于水中，用盐酸调ph为6.5，加热至65℃，将上述乙醇溶液注入，搅拌30min后，经高压均质仪，将平均粒径控制在180nm以下，得到空白脂质体溶液；

步骤B

多西他塞溶液处方为

多西他塞0.6g

乙醇2g

将多西他塞溶解于乙醇中；

步骤C

在步骤B中加入步骤A中制得的空白脂质体溶液，在4℃下，100rpm下搅拌，体系由浑浊变透明状液体，经交叉切向流设备进行缓冲液置换后，乙醇的残留量控制在5％以下，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装、冻干，制得含药脂质体。