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CN103619342B - 用于治疗肥胖症和/或代谢综合征的方法 - Google Patents

用于治疗肥胖症和/或代谢综合征的方法 Download PDF

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CN103619342B CN201280031426.2A CN201280031426A CN103619342B CN 103619342 B CN103619342 B CN 103619342B CN 201280031426 A CN201280031426 A CN 201280031426A CN 103619342 B CN103619342 B CN 103619342B
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Mesoblast Inc
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Abstract

本发明提供了治疗或预防肥胖症或引起体重减轻或治疗或预防代谢综合征的方法，其包括对受试者施用富含STRO‑1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。

Description

用于治疗肥胖症和/或代谢综合征的方法
相关申请信息
本申请要求于2011年5月19日提交的名称为“用于治疗肥胖症和/或代谢综合征的方法”的美国临时专利申请号61/488,037的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文。
领域
本发明涉及用于治疗或预防肥胖症和/或代谢综合征的方法。
背景
代谢综合征
代谢综合征(同义词综合征X)是一种复杂的高社会经济成本的病症，其被认为是世界范围的流行病。美国约32%的人被认为患有代谢综合征，并且风险随着年龄而增长(例如，年龄在40和60岁之间的人中40%被认为患有这种综合征)。代谢综合征与许多疾病的风险增加有关，例如，冠心病、动脉粥样硬化性疾病、高血压、中风以及2型糖尿病。目前，代谢综合征基于以下标准中的三种或更多种进行诊断：
o腰围升高：升高的定义取决于种族、国家以及性别；
o甘油三酯升高：≥150mg/dL血液(1.7mmol/L血液)或用于甘油三酯升高的药物治疗；
o高密度脂蛋白(HDL)胆固醇降低：男性＜40mg/dL血液(1.0mmol/L血液)、女性＜50mg/dL血液(1.3mmol/L血液)或用于低高密度脂蛋白胆固醇的药物治疗；
o血压升高：收缩压≥130mm Hg和/或舒张压≥85mm Hg或用于高血压(hypertension)的药物治疗(或用于高血压(high blood pressure)的药物治疗)；以及
o空腹血糖升高：＞100mg/dL血液(或用于高血糖症的药物治疗)
目前用于代谢综合征的非药物疗法包括运动和节食。药物治疗一般以代谢综合征的症状之一为目标。例如，已提出改善甘油三酯和HDL水平的化合物适用于治疗代谢综合征。然而，这些药物治疗遭受各种不良的副作用。例如：
●氯贝丁酯(一种纤维酸衍生物)增加发病率和死亡率。此外，已在啮齿动物中证明致瘤性。临床试验显示某些贝特类药物还导致血清肌酐水平的可逆性增加。
●烟酸具有多种不良作用，其中最严重的是化学性肝炎。其它副作用包括潮红、瘙痒以及皮疹。
●他汀类药物与肌肉疼痛和横纹肌溶解症(其可导致肾功能衰竭和死亡)、肌无力、神经病变以及记忆力减退相关。此外，他汀类药物具有相对短的半衰期以及需要定期服药以提供治疗效益。例如，阿托伐他汀具有的有效半衰期为约20-30小时并且被认为是长效他汀。
从前面来看，本领域中将明显地需要用于代谢综合征的治疗/预防方法。示例性的治疗/预防方法将治疗或预防代谢综合征的若干症状。
肥胖症
肥胖症的发生率在全世界显著增加，在过去的30年中最显著。到2000年，总计3千8百80万美国成年人或30%的美国人口被归类为肥胖(即，身体质量指数分数对于高加索人为至少30kg/m2、对于日本人为25kg/m2以及对于中国人为28kg/m2)。肥胖症与多种疾病或病症相关，或被认为导致了多种疾病或病症，并且在美国每年估计约有280,000例死亡可归因于肥胖症相关性病症。
肥胖症是发展许多与肥胖症相关性并发症的风险因素，从非致命衰弱性病状(例如，骨关节炎和呼吸病症)到危及生命的慢性病症(例如，高血压、2型糖尿病、动脉粥样硬化、心血管疾病、一些形式的癌症和中风)。
由于肥胖受试者的数量不断增加(仅在美国，肥胖症的发生率在过去十年中就增加了三分之一)，因此对于开发用于控制肥胖症和肥胖症相关性并发症的新的有效策略的需要变得越来越重要。
尽管肥胖症具有高患病率并且我们对于肥胖症是如何发展的理解有了许多进展，但是目前的治疗策略始终未能获得长期成功。此外，大约有百分之90至95的体重减轻的受试者后来再次恢复了他们减去的体重。
目前有几种治疗药物被FDA批准用于长期治疗肥胖症。这些化合物中的一种，奥利司他，是一种胰脂肪酶抑制剂，其通过阻断身体吸收脂肪来起作用。然而，使用这种药物还伴随着未消化脂肪通过身体时令人不快的副作用。
另一种常用于治疗肥胖症的药物是西布曲明，一种食欲抑制剂。西布曲明是一种β-苯乙胺，其选择性地抑制脑中去甲肾上腺素和血清素的再吸收。不幸的是，使用西布曲明还与血压升高和心率增加有关。由于这些副作用，因此西布曲明的剂量被限制在低于最有效剂量的水平。
用于短期治疗肥胖症的化合物包括食欲抑制剂，如安非他命衍生物。然而，这些化合物具有高度成瘾性。此外，受试者对于这些体重减轻药物的反应是不同的，其中某些人比其它人减去更多的体重以及某些人无论如何也无法减去任何体重。
基于前面的原因，对于本领域的技术人员来说将显而易见，在本领域中对于治疗或预防肥胖症或减轻体重的方法存在需要。
概要
本发明人已发现，他们能够使用STRO-1+细胞制剂在非人类灵长类动物模型中减轻体重和/或治疗肥胖症和/或治疗代谢综合征。例如，发明人发现通过施用STRO-1+细胞制剂，他们降低了甘油三酯和极低密度脂蛋白(VLDL)的水平，增加了HDL的水平，提高了糖耐量、降低了空腹胰岛素和葡萄糖水平并且减轻了体重。因此，发明人能够治疗诊断代谢综合征所需的众多症状。发明人还展示了单次施用细胞制剂提供了至少三个月的治疗效益，并且多次施用可以延长这种效益的时间并且增加效益的水平。
本发明提供了降低受试者体重的方法，所述方法包括对受试者施用富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
在一个实例中，所述受试者是超重的。在一个实例中，受试者是肥胖的。
在一个实例中，受试者患有2型糖尿病。在另一个实例中，受试者未患2型糖尿病。
本发明另外提供了治疗或预防受试者的肥胖症的方法，所述方法包括对受试者施用富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
在一个实例中，施用群和/或子代和/或可溶性因子使得体重在施用之后约4周减轻了至少约3%或3.5%。
在一个实例中，施用群和/或子代和/或可溶性因子使得体重施用之后约8周减轻了至少约4%或4.5%。
在一个实例中，施用群和/或子代和/或可溶性因子使得体重在施用之后约12周减轻了至少约4%或4.5%。
例如，体重的减轻是在初次施用所述细胞之后。
在一个实例中，方法包括至少两次施用群和/或子代和/或可溶性因子。例如，每次施用隔开约12周的时期。在一个实例中，施用使得体重在初次施用后16周内减轻了至少约5%。
在一个实例中，方法包括至少两次施用群和/或子代和/或可溶性因子，其中每次施用隔开约12周的时期，并且施用使得体重在初次施用的20周内减轻了至少约6%。
在一个实例中，施用群和/或子代和/或可溶性因子不导致受试者消耗明显更少的食物和/或不明显地减少受试者对于消耗食物的欲望。这不是说方法不另外包括消耗更少的食物(例如，与治疗之前或受试者的治疗早期的消耗量相比)，只是施用本身不影响受试者的食物消耗。
本发明还提供了治疗或预防受试者的代谢综合征或其症状的方法，所述方法包括对受试者施用富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
在一个实例中，代谢综合征的症状是选自由以下组成的组：甘油三酯升高、低密度脂蛋白升高、高密度脂蛋白降低、脂蛋白指数降低、空腹血糖水平升高、空腹胰岛素水平升高、进食后的葡萄糖清除率降低、胰岛素抵抗、糖耐量异常、肥胖症以及它们的组合。
在一个实例中，方法减轻或预防两种或三种或四种或五种或所有的前述症状。
在一个实例中，施用群和/或子代和/或可溶性因子产生以下一种或多种：
(i)甘油三酯降低；
(ii)低密度脂蛋白降低；
(iii)高密度脂蛋白升高
(iv)脂蛋白指数升高；
(v)空腹血糖水平降低；
(vi)空腹胰岛素水平降低；
(vii)进食后的葡萄糖清除率增加；
(viii)胰岛素抵抗减少；以及
(ix)体重减轻。
在一个实例中，施用群和/或子代和/或可溶性因子产生前述的两种或三种或四种或五种或全部。
在一个实例中，方法防止代谢综合征和/或其症状的进展或恶化。
在一个实例中，本文描述的方法在任何实例中包括施用富含STRO-1亮细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
在一个实例中，本文描述的方法在任何实例中包括施用富含STRO-1+和组织非特异性碱性磷酸酶+(TNAP)+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
在一个实例中，富含STRO-1+细胞的群和/或子代和/或由其得到的可溶性因子是全身性地施用。例如，群和/或子代和/或可溶性因子是静脉内施用。
在一个实例中，群和/或子代和/或可溶性因子施用多次。
例如，群和/或子代和/或可溶性因子是每两周或更多周施用一次。
例如，群和/或子代和/或可溶性因子是每三周或更多周施用一次。
例如，群和/或子代和/或可溶性因子是每四周或更多周施用一次。
在一个实例中，方法包括监测受试者并且当以下一种或多种发生时施用另一剂量的群和/或子代和/或可溶性因子：
(i)甘油三酯升高至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平；
(ii)低密度脂蛋白水平升高至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平；
(iii)高密度脂蛋白水平降低至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平；
(iv)脂蛋白指数降低至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平；
(v)空腹血糖水平升高至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平；
(vi)空腹胰岛素水平降低至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平；
(vii)进食后的葡萄糖清除率降低至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平；
(viii)胰岛素抵抗升高至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平；
(ix)体重升高至高于在施用群和/或子代和/或可溶性因子之后的一个月或两个月检测到的水平的水平，或与在初次施用群和/或子代和/或可溶性因子之前检测到的水平类似的水平。
在一个实例中，本文根据任何实例描述的方法包括施用足以达成以下一种或多种的剂量的群和/或子代和/或可溶性因子：
(i)甘油三酯降低；
(ii)低密度脂蛋白降低；
(iii)高密度脂蛋白升高；
(iv)脂蛋白指数升高；
(v)空腹血糖水平降低；
(vi)空腹胰岛素水平降低；
(vii)进食后的葡萄糖清除率增加；
(viii)胰岛素抵抗减少；以及
(ix)体重减轻。
在一个实例中，剂量足以达成前述的至少两种或三种或四种或五种或全部。
在一个实例中，本文中根据任何实例描述的方法包括施用每公斤0.1×106至5×106之间个STRO-1+细胞和/或其子代。
在一个实例中，本文中根据任何实例描述的方法包括施用每公斤0.3×106至2×106之间个STRO-1+细胞和/或其子代。例如，方法包括施用每公斤约1×106或2×106个STRO-1+细胞和/或其子代。
在一个实例中，本文中根据任何实例描述的方法包括施用低剂量的STRO-1+细胞和/或其子代。例如，低剂量的STRO-1+细胞和/或其子代包括每公斤0.1×105至0.5×106之间个STRO-1+细胞和/或其子代。例如，低剂量的STRO-1+细胞和/或其子代包括每公斤0.3×10δ个STRO-1+细胞和/或其子代。
在一个实例中，群和/或子代细胞是自体的或异体的和/或可溶性因子可以从自体或异体细胞得到。在一个实例中，群和/或子代和/或可溶性因子是异体的和/或可溶性因子是来自异体细胞。
根据上述实例，方法可以另外包括获得群和/或子代细胞和/或可溶性因子或可以另外包括分离群和/或子代细胞和/或可溶性因子。在一个实例中，群和/或子代细胞是基于STRO-1和/或TNAP的表达。
在一个实例中，群和/或子代细胞和/或可溶性因子是从受治疗的受试者中获得的。在另一实例中，群和/或子代细胞和/或可溶性因子是从同一物种的不同受试者中获得的。
在一个实例中，富含STRO-1+细胞的群和/或子代细胞在施用之前和/或在获得可溶性因子之前已培养扩增。
根据上述实例，本文中根据任何实例描述的方法可以另外包括培养群和/或子代细胞。
在一个实例中，STRO-1+细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子以包含所述STRO-1+细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子和载体和/或赋形剂的组合物的形式来施用。
根据上述实例，本文中根据任何实例描述的方法可以另外包括将群和/或子代和/或可溶性因子配制为组合物。
在一个实例中，受试者患有肥胖症和/或患有代谢综合征。例如，受试者需要治疗。
在一个实例中，受试者具有罹患肥胖症和/或罹患代谢综合征的风险。
本发明还提供了富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子，用于治疗或预防肥胖症和/或代谢综合征和/或代谢综合征的症状。
本发明还提供了富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的用途，其用于制造用于治疗或预防受试者的肥胖症和/或代谢综合征和/或代谢综合征的症状的药物。
本发明还提供了包含富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子的试剂盒，其与本文中根据任何实例描述的方法的使用说明书一同包装。
例如，本发明提供了包含含有群和/或子代和/或可溶性因子的组合物的试剂盒，其与指示在本文根据任何实例描述的方法中使用组合物的产品信息一同包装。
附图简要说明
图1.TNAP(STRO-3)和间充质前体细胞标志物STRO-1亮在成人骨髓单核细胞(BMMNC)中的共表达。通过孵育MACS选择的BMMNC并用与FITC偶合的山羊抗鼠类IgM抗体间接标记的STRO-1(x轴)和用与PE偶合的山羊抗鼠类IgG间接标记的STRO-3mAb(鼠类IgG1)(y轴)进行双色免疫荧光和流式细胞术。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×104个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的1.0%的反应性水平。结果表明STRO-1亮细胞的较小群体共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO-1+细胞未能与STRO-3mAb反应。
图2.图形表示示出了使用利用山羊抗鼠类IgM或IgG缀合的FITC二次抗体检测时相对于同种型(IgM、IgG2a以及IgG1)阴性对照(虚线)具有间充质干细胞标志物STRO-1、STRO-4以及CD146(实线)阳性细胞表面表达的培养扩增骨髓来源食蟹猕猴MPC的单细胞悬浮液所产生的代表性流式细胞直方图。代表性直方图还示出了食蟹猕猴MPC缺乏单核细胞/巨噬细胞(CD14)、造血干/祖细胞(CD34)以及成熟白细胞(CD45)的细胞表面标志物表达。与同种型对照相比荧光水平大于1%表示为阳性。
图3.图形表示示出了经过一个月的重复评估时期，在静脉内葡萄糖耐量测试(IVGTT)之后的早期(5-20分钟；左手侧)和晚期(30-60分钟；右手侧)胰岛素反应的平均曲线下面积(AUC)。测试在糖尿病和非糖尿病动物中进行(如所示)。
图4.图形表示示出了在静脉内输注葡萄糖之后晚期胰岛素反应的月平均曲线下面积(AUC3o-60min)。描绘了每个非糖尿病和糖尿病动物(如所示)在MPC处理一个月前和6个月后的个别数据。箭头指示输注MPC的时间。
图5.图形表示示出了连续剂量的MPC诱导对糖负荷的晚期胰岛素反应的逐渐增加。图(a)中的表达示出了对非糖尿病和糖尿病动物(如所示)的组静脉内输注葡萄糖后晚期胰岛素反应的月平均曲线下面积。描绘了非糖尿病和糖尿病动物(如所示)的组在MPC处理一个月前和6个月后的数据。箭头指示输注MPC的时间。图3(b)中的表达阐明了相对于未处理的基线值，每个组的晚期胰岛素反应的月平均变化百分比。
图6.图形表示示出了静脉内输注葡萄糖后的晚期胰岛素反应(30-60min)期间的月平均血糖清除速率。描绘了每个非糖尿病和糖尿病动物(如所示)在MPC处理一个月前和6个月后的个别数据。箭头指示输注MPC的时间。
图7.图形表示示出了MPC在高葡萄糖负荷后诱导葡萄糖清除率的逐渐增加。图(a)示出了静脉内输注葡萄糖后的晚期胰岛素反应(30-60min)期间的月平均血糖清除速率。描绘了非糖尿病和糖尿病动物(如所示)组在MPC处理一个月前和6个月后的个别数据。箭头指示输注MPC的时间。图5(b)描绘了相对于预处理基线，每个组非葡萄糖处理速率的月平均变化百分比。
图8.图形表示示出了使用MPC处理的猴的月平均空腹血糖水平(上图)和月平均空腹胰岛素水平(下图)。描绘了非糖尿病(基线时空腹BGL＞110mg/dL)和糖尿病(基线时空腹BGL＜110mg/dL)动物在MPC处理一个月前和6个月后的个别数据。箭头指示输注MPC的时间。指示了每只动物的MPC剂量。
图9.图形表示示出了施用MPC的动物月平均空腹血糖水平(上图)和月平均空腹胰岛素水平(下图)。描绘了非糖尿病(基线时空腹BGL＞110mg/dL)和糖尿病(基线时空腹BGL＜110mg/dL)动物组在MPC处理一个月前和6个月后的数据。箭头指示输注MPC的时间。
图10.图形表示示出了MPC处理诱导持续体重减少，尽管饮食摄入持续较高。图(a)示出了非糖尿病和糖尿病动物的月平均体重变化。描绘了非糖尿病和糖尿病动物在MPC处理一个月前和6个月后的个别数据。箭头指示输注MPC的时间。每只动物的MPC剂量在每个图的顶部示出。图(b)示出了每只个别动物在整个测量体重期间的食物消耗量(每周消耗的颗粒平均数)。图(c)示出了在MPC疗法之后相对于未处理基线，合并的动物组的月平均体重减轻百分比。在MPC处理的过程中，体重减轻的范围为4%至6%。
图11.图形表示示出了非糖尿病和糖尿病动物的每月空腹血脂谱(如所示)。描绘了非糖尿病和糖尿病动物在MPC处理一个月前和6个月后的个别数据。箭头指示输注MPC的时间。每只动物的MPC剂量在每个图的顶部示出。
图12.图形表示示出了非糖尿病和糖尿病动物的月平均空腹血脂谱(如所示)。描绘了非糖尿病和糖尿病动物组在MPC处理一个月前和6个月后的数据。箭头指示输注MPC的时间。
详细描述
通用技术和选定的定义
在本说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质组合物的组应视为包括那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个或多个(即，一个或多个)。
除非特别声明，否则本文描述的每个实例在作必要的修改的情况下适用于本发明各个和每个其它实例。
本领域的技术人员应了解，本发明和其个别实例容许具体描述的内容以外的变化和修改。应理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括在本说明书中个别地或共同地提及或指示的所有的步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或其任何两者或多者。
本发明的范围不受本文中包括的本发明的具体实例限制，所述实例意欲只是用于示例的目的。功能上等同的产物、组合物以及方法显然在如本文描述的本发明和其实例的范围内。
除非另有指示，否则在不进行过度实验的情况下使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液相肽合成、固相肽合成以及免疫学的常规技术来执行本发明。所述程序描述于以下文献中，例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第二版(1989)，卷I、II以及III全部；DNA Cloning:A Practical Approach，卷I和II(D.N.Glover编著,1985),IRL Press，Oxford，全文；Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(M.J.Gait编著,1984)IRL Press，Oxford，全文，以及尤其是其中Gait的论文，第1-22页；Atkinson等，第35-81页；Sproat等，第83-115页；以及Wu等，第135-151页；4.Nucleic AcidHybridization:A Practical Approach(B.D.Hames和S.J.Higgins编著,1985)IRL Press，Oxford，全文；Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach(1986)IRLPress，Oxford，全文；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编著,Academic Press,Inc.)，全系列；J.F.RamalhoOrtigao,"The Chemistry of Peptide Synthesis"见：Knowledge database of Accessto Virtual Laboratory website(Interactiva,Germany)；Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.Land Fenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154；Barany,G.和Merrifield,R.B.(1979)见The Peptides(Gross,E.和Meienhofer,J.编著),卷.2,第1-284页,AcademicPress,New York12.Wunsch,E.编著(1974)Synthese von Peptiden in Houben-WeylsMetoden der Organischen Chemie(Muler,E.编著),卷15,第4版,第1和2部分,Thieme,Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.和Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25,449-474；Handbook of Experimental Immunology,卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著,1986,Blackwell Scientific Publications)；以及Animal Cell Culture:PracticalApproach,第3版(John R.W.Masters编著,2000),ISBN0199637970,全文。
在本说明书中，除非全文另有要求，否则词语“包括(comprise)，或变化形式如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，将被理解为意指包括所述步骤或要素或整数或者步骤或要素或整体的组，但是不排除任何其它的步骤或要素或整数或者要素或整数的组。
如本文中所用的，术语“来源于”应意味指示指定的整数可从特定的来源来获得，即使不一定直接来自该来源。在由STRO-1+细胞和/或其子代细胞得到的可溶性因子的上下文中，这个术语应意味一种或多种因子，例如蛋白质、肽、碳水化合物等等是在体外培养STRO-1+细胞和/或其子代细胞期间产生。
如本文所用的，术语“甘油三酯升高”应被理解为意指每dL血液约150mg甘油三酯或更多(1.7mmol/L血液)。用于评价受试者的脂类和/或脂蛋白水平的方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且包括超速离心法、免疫测定。
如本文所用的，术语“低密度脂蛋白(LDL)升高”将被理解为意指每dL血液100mgLDL或更多，或对于患有心脏病或动脉粥样硬化的患者来说每dL血液70mg LDL或更多。用于评价受试者的脂类和/或脂蛋白水平的方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且包括超速离心法、免疫测定。
如本文所用的，术语“高密度脂蛋白(HDL)胆固醇减少”将被理解为男性每dL血液40mg HDL或更少(1.0mmol/L血液)或更少或女性每dL血液50mg HDL或更少(1.3mmol/L)。用于评价受试者的脂类和/或脂蛋白水平的方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且包括超速离心法、免疫测定。
如本文所用的，术语“脂蛋白指数”将被理解为意指HDL比非HDL胆固醇的比率。因此，HDL水平越高和/或非HDL胆固醇水平越低，比率越高。
如本文所用的，术语“空腹血糖水平升高”将被理解为意指空腹血浆葡萄糖水平为每L血浆5.6mmol葡萄糖(或每dL血浆1OOmg葡萄糖)至每L血浆6.9mmol葡萄糖(或每dL血浆125mg葡萄糖)。
如本文所用的，术语“空腹胰岛素水平升高”将被理解为意指空腹胰岛素水平大于约60pmol/L。这也表明胰岛素抵抗。
如本文所用的，术语“糖耐量异常”将被理解为意指摄取75克口服剂量的葡萄糖两小时后，血浆葡萄糖浓度为7.8mmol/dL(140mg/dL)或更大(例如，7.8mmol/dL至11mmol/dL(140mg/dL-197mg/dL)。这个定义也涵盖公认的定义，例如使用静脉内葡萄糖耐量试验所评估。
如本文所用的，术语“胰岛素抵抗”涵盖以糖耐量异常和/或空腹胰岛素水平升高为特点的病状。
如本文所用的，术语“超重”或“过重”将被理解为平均身体质量指数为25或更多。在某些实例中，这个术语包含肥胖症。在某些实例中，这个术语包含前肥胖症，即，BMI为25-30。这个术语还涵盖其它临床上公认的“超重”的定义。超重的受试者也被认为具有发展肥胖症的风险。
本文提及“具有发展代谢综合征的风险”的受试者包括五十几岁和/或西班牙裔和/或亚裔和/或大于或等于25的受试者和/或具有2型糖尿病家族史和/或孕期糖尿病(妊娠糖尿病)家族史和/或肥胖症家族史和/或诊断出高血压、心血管疾病或多囊卵巢综合征中的一种或多种的受试者。
如本文所用的，术语“有效量”应被理解为意指足以达成以下一种或多种的STRO-1+细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的量：
(i)甘油三酯降低；
(ii)低密度脂蛋白降低；
(iii)高密度脂蛋白升高；
(iv)脂蛋白指数升高；
(v)空腹血糖水平降低；
(vi)胰腺的胰岛素分泌增加；
(vii)进食后的葡萄糖清除率增加；
(viii)胰岛素抵抗减少；以及
(ix)体重减轻。
如本文所用的，术语“治疗有效量”应理解为意指足以治疗代谢综合征和/或肥胖症的STRO-1+细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的量，即，使得受试者不再满足代谢综合征和/或肥胖症的临床标准。例如，使肥胖受试者的体重降低至一个点，在这个点肥胖者不再肥胖(例如，他们可能是超重或正常)。
如本文所用的，术语“预防有效量”应理解为意指足以预防或抑制或延迟代谢综合征和/或肥胖症的发病的STRO-1+细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子的量，即，使受试者免于发展关于诊断代谢综合征和/或肥胖症的临床标准。例如，超重的受试者被治疗得使得他们的体重不再继续增加至他们肥胖的那个点。
如文本所用的，术语“低剂量”应被理解为意指STRO-1+细胞和/或其子代的量少于1×1O6个，但仍然足以是如本文定义的“有效量”和/或“治疗有效量”和/或如本文定义的“预防有效量”。例如，低剂量包含0.5×106个或更少的细胞，或0.4×106个或更少的细胞或0.3×1O6个或更少的细胞或0.1×106或更少的细胞。
如本文所用的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”应被理解为意指施用治疗有效量的可溶性因子和/细胞并且减少或抑制代谢综合征的症状，使得受试者不再在临床上诊断出症状和/或减少受试者的体重使得他们不再肥胖。
如本文所用的，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”或“预防(prevention)”应被理解为意指施用预防有效量的可溶性因子和/或细胞并且停止或阻止或延迟代谢综合征的发展或进展和/或停止或阻止或延迟肥胖症的发展。
如本文所用，术语“可溶性因子”应理解为指可溶于水的由STRO-1+细胞和/或其子代产生的任何分子，例如蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、碳水化合物等。所述可溶性因子可以在细胞内和/或由细胞分泌。所述可溶性因子可以是复杂混合物(例如上清液)和/或其组分和/或可以是纯化的因子。在一个实例中，可溶性因子是上清液或含于上清液内。因此，本文涉及施用一种或多种可溶性因子的任何实例应理解为在作了必要的修改的情况下适用于施用上清液。
如本文所用的，术语“上清液”指的是在合适的培养基(例如，液体培养基)中体外培养STRO-1+细胞和/或其子代后产生的非细胞物质。通常，上清液由在适宜的条件和时间下在培养基中培养细胞，随后通过如离心等过程移除细胞物质后所产生。在施用之前，上清液可能会或可能不会经受进一步的纯化步骤。在一个实例中，上清液包含少于105个，更多，如，少于104个，例如，少于103个，例如，无活细胞。
如本文所用的，术语“正常或健康个体”应被理解为意指如通过本领域已知的和/或本文描述的任何方法所评价后，未患代谢综合征或肥胖症的受试者。在一个实例中，“正常或健康的个体”未患代谢综合征的任何症状和/或BMI小于35。
STRO-1+细胞或子代细胞，和由其得到的上清液或者一种或多种可溶性因子
STRO-r细胞为在骨髓、血液、乳牙(例如脱落的乳牙)、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞。
在一个实例中，STRO-1+细胞能够分化成一种或多种或两种或多种和/或三种生殖系，如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。
在一个实例中，STRO-1+细胞是多能细胞，其能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维结缔组织。这些细胞所进入的特定谱系决定和分化路径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(如生长因子、细胞因子)和/或由宿主组织建立的局部微环境条件的各种影响。STRO-1+多能细胞因此为非造血祖细胞，其分裂产生子细胞，所述子细胞为干细胞或适时不可逆分化产生表型细胞的前体细胞。
在一个实例中，STRO-1+细胞是从由受试者(例如欲治疗的受试者或相关受试者或不相关受试者(无论是相同物种抑或不同物种))获得的样本富集而来。术语“富含”或其变形在本文中用于描述一种细胞群体，其中当与细胞的未处理群体(例如处于天然环境中的细胞)相比较时，一种特定细胞类型的比例或者多种特定细胞类型的比例增加。在一个实例中，富含STRO-1+细胞的群包含至少约0.1%或0.5%或1%或2%或5%或10%或15%或20%或25%或30%或50%或75%的STRO-1+_细胞。在这方面，术语“富含STRO-1+细胞的细胞群”将被理解为为术语“包含X%STR01+细胞的细胞群”提供明确的支持，其中X%是本文列举的百分比。在某些实例中，STRO-1+细胞可以形成无性系的集落，例如，CFU-F(成纤维细胞)或其亚群(例如50%或60%或70%或70%或90%或95%)可以具有这种活性。
在一个实例中，细胞群是富含包含处于可选择的形式的STRO-r细胞的细胞制剂。在这方面，术语“可选择的形式”将被理解为意指细胞表达允许选择STRO-1+细胞的标志物(例如，一种细胞表面标志物)。标志物可以是STRO-1，但不一定是。例如，如本文描述的和/或例证的，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如MPC)也表达STRO-1(并且可以是STRO-1亮)。因此，表明细胞是STRO-1+并不意指细胞由STRO-1表达来选择。在一个实例中，细胞是基于至少表达STRO-3来选择，例如，它们是STRO-3+(TNAP+)。
提及选择细胞或其群不需要从特定的组织来源进行选择。如本文描述的，STRO-1+细胞可以是从种类繁多的来源中进行选择或分离或富集的。也就是说，在某些实例中，这些术语为从任何包含STRO-1+细胞(例如，MPC)的组织或血管化组织或包含周细胞(例如STRO-1+周细胞)的组织或本文描述的组织中的任何一种或多种中进行选择提供支持。
在一个实例中，在本发明的方法中所用的细胞表达一种或多种个别地或全体选自由以下组成的组的标志物：TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+或其任何组合。
“个别地”指本发明独立地涵盖所述标志物或标志物组，以及虽然个别标志物或标志物组可能未独立地在本文中列出，但随附权利要求书仍可彼此独立地和分开地定义所述标志物或标志物组。
“全体”指本发明涵盖任何数量的所述标志物或肽组或其组合，以及虽然所述数量的标志物或标志物组或其组合可能未在本文中具体列出，但随附权利要求书仍可将所述组合或子组合与标志物或标志物组的任何其它组合独立地和分开地定义。
例如，STRO-1+细胞是STRO-1亮(同义词STRO-1亮)。在一个实例中，相对于STRO-1暗或STRO-1中间细胞，Stro-1亮细胞优先富集。
在一个实例中，STRO-1亮细胞另外是TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90P)和/或CD146+中的一种或多种。例如，细胞是为一种或多种的前述标志物而选择和/或显示表达一种或多种前述标志物。在这方面，显示表达标志物的细胞不需要被特别地测试，而是可以测试预先富集或分离的细胞并且随后使用，可以合理地假设分离的或富集的细胞也表达同样的标志物。
在一个实例中，间充质前体细胞是WO2004/85630中所定义的血管周围间充质前体细胞。
对于指定标志物称为“阳性”的细胞，其可能根据标志物存在于细胞表面上的程度而表达低(lo或暗)或高(亮、亮)水平的所述标志物，其中所述术语涉及细胞分选过程中所用的荧光或其它标志物的强度。lo(或暗或深)和亮的区别应放在所分选特定细胞群体上所用的标志物的情形中加以理解。对于指定标志物称为“阴性”的细胞不一定完全不存在于所述细胞。所述术语指细胞表达所述标志物的水平相对极低，并且当在可检测标记时产生极低信号或者在背景水平以上不可检测，例如使用同种型对照抗体检测到的水平。
当在本文中使用时，术语“亮”是指细胞表面上的标志物在可检测标记时产生相对较高的信号。虽然不希望受理论限制，但提出“亮”细胞所表达的靶标志物蛋白(例如由STRO-1识别的抗原)比样本中的其它细胞多。例如，当用缀合FITC的STRO-1抗体标记时，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析所测定的STRO-1亮细胞产生比非亮细胞((STRO-1深/暗)高的荧光信号。在一个实例中，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1%。在其它实例中，“亮”细胞构成起始样本中所含的最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1%、至少约0.5%、至少约1%、至少约1.5%或至少约2%。在一个实例中，STRO-1亮细胞的STRO-1表面表达相对于“背景”(即STRO-1-细胞)具有2个对数量级以上的表达。相比之下，STRO-1暗和/或STR0-1中间细胞的STRO-1表面表达与“背景”相比具有小于2个对数量级的表达，通常与“背景”相比约1个对数以下。
如本文所用，术语“TNAP”意欲涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有亚型。例如，所述术语涵盖肝亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾亚型(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中，如本文所用的TNAP是指可以结合由2005年12月19日根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)的规定以保藏编号PTA-7282保藏于ATCC的杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子。
此外，在一个优选实例中，STRO-1+细胞能够产生克隆CFU-F。
大比例的STRO-1+多能细胞优选能够分化成至少两种不同生殖系。多能细胞可以发展成的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其具有胆道上皮细胞和肝细胞的多潜能；神经限制细胞，其可以产生会发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；神经元前体，其会发展出神经元；心肌和心肌细胞、葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系的前体。其它谱系包括但不限于成牙质细胞、牙质产生细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(诸如角化细胞)、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
在另一个实例中，STRO-1+细胞在培养时不能产生造血细胞。
在一个实例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞。在本发明的另一适用实例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，而来自于另一物种)。
本发明还涵盖使用由自体外培养物产生的STRO-1+细胞和/或其子代细胞(后者也称为扩增细胞)获得或得到的上清液或可溶性因子。本发明的扩增细胞根据培养条件(包括培养基中刺激因子的数量和/或类型)、传代次数等可以具有多种表型。在某些实例中，子代细胞是在从亲本群体传代约2次、约3次、约4次、约5次、约6次、约7次、约8次、约9次或约10次后获得。然而，子代细胞可以在从亲本群体传代任何次后获得。
子代细胞可以通过在任何适合培养基中培养而获得。如本文在提及细胞培养时使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气态或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不供养细胞生长的液体培养基。培养基也包括胶状培养基，诸如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包括在皮氏培养皿(petri dish)或其它固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。术语“培养基”也指意欲用于细胞培养中的材料，即使其尚未与细胞接触。换句话说，制备用于细菌培养的富营养液体是培养基。当与水或其它液体混合时变得适于细胞培养的粉末混合物可称为“粉状培养基”。
在一个实例中，适用于本发明方法的子代细胞是通过使用经过STRO-3抗体标记的磁性珠粒从骨髓分离TNAP+STRO-1+细胞，并接着培养扩增所分离的细胞来获得(关于适合培养条件的实例，请参见Gronthos等Blood85:929-940,1995)。
在一个实例中，所述扩增细胞(子代)(例如至少在5次传代后)可以是TNAP-、CC9+、I类HLA+、II类HLA-、CD14-、CD19-、CD3-、CD11a-c-、CD31-、CD86-、CD34-和/或CD80-。然而，在与本文所述不同的培养条件下，不同标志物的表达有可能会变化。此外，虽然具有这些表型的细胞可在扩增细胞群体中占优势，但这并不指较小比例的细胞不具有此表型(例如，小百分比的扩增细胞可以是CC9-)。在一个实例中，扩增细胞仍具有分化成不同细胞类型的能力。
在一个实例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群体包含其中至少25%(诸如至少50%的细胞)的细胞是CC9+。
在另一实例中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩增细胞群体包含其中至少40%(诸如至少45%的细胞)的细胞是STRO-1+。
在另一实例中，扩增细胞可表达一种或多种全体或个别地选自由以下组成的组的标志物：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白β6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2=瘦素-R)、RANKL、STRO-4(HSP-90P)、STRO-1亮和CD146或这些标志物的任何组合。
在一个实例中，子代细胞是如WO2006/032092中所定义和/或所述的多能扩增STRO-1+多能细胞子代(MEMP)。制备可用于得到子代的STRO-1+多能细胞的富集群体的方法描述于WO01/04268和WO2004/085630中。在体外情形中，STRO-1+多能细胞极少以绝对纯制备物形式存在，而是一般与作为组织特异性定向细胞(TSCC)的其它细胞一起存在。WO01/04268提出以约0.1%至90%的纯度水平从骨髓采集所述细胞。包含可得到子代的MPC的群体可直接从组织来源采集，或者其可为已在离体扩增的群体。
例如，子代可获自大致上纯化的STRO-1+多能细胞的已采集且未扩增的群体，其构成其所存在的群体总细胞的至少约0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或95%。此水平可以通过例如选择对至少一种个别地或全体选自由TNAP、STRO-4(HSP-90P)、STRO-1亮、3G5+、VCAM-1、THY-1、CD146和STRO-2组成的组的标志物呈阳性的细胞来实现。
MEMPS与新鲜采集的STRO-1+多能细胞的区别之处可在于其对于标志物STRO-1亮呈阳性且对于标志物碱性磷酸酶(ALP)呈阴性。相比之下，新鲜分离的STRO-1+多能细胞对于STRO-1亮和ALP两者都呈阳性。在本发明的一个实例中，至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所施用细胞具有表型STRO-1亮、ALP-。在另一实例中，MEMPS对于标志物Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1中的一种或多种呈阳性。在另一实例中，MEMP不显示TERT活性和/或对于标志物CD18呈阴性。
STRO-1+细胞起始群体可源自WO01/04268或WO2004/085630中所述的任一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或许更广泛来说来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。
应理解，在进行本发明中所述的方法时，带有任何指定细胞表面标志物的细胞的分离可以通过多种不同方法来实现，然而，示例性方法依赖于结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)与所关注标志物的结合，随后分离显示结合(为高水平结合或低水平结合)或不结合的那些细胞。最适宜结合剂为抗体或基于抗体的分子，例如单克隆抗体或基于单克隆抗体的分子(例如包含其抗原结合片段的蛋白质)，因为后面所说的这些结合剂具有特异性。抗体在两个步骤中都可使用，然而也可以使用其它试剂，因此这些标志物的配体也可以用于富集带有所述标志物或缺乏所述标志物的细胞。
抗体或配体可连接至固体支持物以允许粗分离。例如，分离技术最大程度地保持欲收集的部分的活力。具有不同功效的各种技术可用于获得相对较粗的分离。所用特定技术将取决于分离效率、相关细胞毒性、执行的容易性和速度，以及复杂设备和/或技术技能的必要性。分离程序可包括但不限于使用涂有抗体的磁性珠粒的磁性分离、亲和色谱和利用连接至固体基质的抗体的“淘选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。执行FACS的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
针对本文所述的各标志物的抗体可商购获得(例如抗STRO-1的单克隆抗体可从R&D Systems,USA商购获得)、从ATCC或其它保藏组织获得和/或可使用业内公认的技术产生。
在一个实例中，分离STRO-1+细胞的方法例如包括第一步骤，其为利用例如识别STRO-1的高水平表达的磁性活化细胞分选(MACS)的固相分选步骤。接着必要时可进行第二分选步骤以得到更高水平的前体细胞表达，如专利说明书WO01/14268中所述。此第二分选步骤可能涉及使用两种或更多种标志物。
获得STRO-1+细胞的方法还可能包括使用已知技术进行第一富集步骤之前采集细胞来源。因此，组织将以手术方式移除。接着将构成来源组织的细胞分离为所谓单细胞悬浮液。此分离可以通过物理和或酶学方式达成。
一旦获得了适合的STRO-1+细胞群体，就可以通过任何适合方式对其进行培养或扩增以获得MEMP。
在一个实例中，细胞是取自欲治疗的受试者，使用标准技术在体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩增细胞以自体或同种异体组合物形式施用至受试者。在可选实例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞来获得上清液或可溶性因子。在本发明的另一适用实例中，使用非人动物的细胞(或者如果患者不是人，则来自另一物种)来获得上清液或可溶性因子。
本发明可以使用来自任何非人动物物种的细胞加以实施，包括但不限于非人灵长类动物细胞、有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、兔类动物、啮齿动物、鸟类动物和鱼类动物细胞。可用于实施本发明的灵长类动物细胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猕猴和任何其它新世界或旧世界猴类的细胞。可用于实施本发明的有蹄类动物细胞包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。可用于实施本发明的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠和沙鼠细胞。可用于实施本发明的兔类动物物种的实例包括家兔、长腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪地兔和鼠兔。鸡(原鸡(Gallus gallus))为可用于实施本发明的方法的鸟类物种的一个实例。
在一个实例中，细胞是人细胞。
适用于本发明方法的细胞在使用前或获得上清液或可溶性因子前可储存。保藏和储存真核细胞和尤其哺乳动物细胞的方法和方案在本领域中是已知的(参见例如Pollard,J.W.和Walker,J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols,第二版,Humana Press,Totowa,N.J.；Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells,第四版,Wiley-Liss,Hoboken,N.J.)。维持所分离的干细胞(诸如间充质干细胞/祖细胞)或其子代的生物活性的任何方法都可以结合本发明来使用。在一个实例中，通过使用低温保藏来维持和储存细胞。
遗传修饰细胞
在一个实例中，对STRO-1+细胞和/或其子代细胞进行遗传修饰，例如，以表达和/或分泌相关蛋白质。例如，细胞被工程改造来表达在治疗代谢综合征或肥胖症有用的蛋白质，例如，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或肽YY(PYY)或其活性片段(例如，PYY[3-36])、唾液素-4或艾塞那肽。
遗传修饰细胞的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。例如，使欲在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表达的启动子。例如，将核酸连接至可在受试者的多种细胞中可操作的启动子，诸如病毒启动子，例如CMV启动子(例如CMV-IE启动子)或SV-40启动子。其它适合启动子在本领域中是已知的并且应理解为在作了必要修改的情况下适用于本发明的实例。
在一个实例中，核酸以表达构建体的形式提供。如本文所用，术语“表达构建体”是指具有在细胞中将表达赋予到可操作地连接的核酸(例如报道基因和/或可反选择的报道基因)的能力的核酸。在本发明的上下文中，应了解，表达构建体可包含或为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达格式维持和/或复制异源DNA的其它核酸。
构建适用于实施本发明的表达构建体的方法对于本领域的技术人员来说将是显而易见的并且描述于以下文献中：例如Ausubel等(见：Current Protocols in MolecularBiology.Wiley Interscience,ISBN047150338,1987)或Sambrook等(见：MolecularCloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratories,New York,第三版2001)。例如，使用例如PCR从适合模板核酸扩增表达构建体的各组分并随后克隆至适合的表达构建体(诸如质粒或噬菌粒)中。
适于所述表达构建体的载体在本领域中是已知的和/或在本文中描述。例如，适于哺乳动物细胞中的本发明方法的表达载体为例如由Invitrogen供应的pcDNA载体套装的载体、pCI载体套装的载体(Promega)、pCMV载体套装的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP16载体(Clontech)或pcDNA载体套装的载体(Invitrogen)。
本领域的技术人员将认识到其它载体和所述载体的来源，诸如Invitrogen公司、Clontech或Promega。
用于将分离的核酸分子或包含所述核酸的基因构建体引入细胞中用于表达的方式对于本领域的技术人员来说是已知的。用于指定生物体的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入细胞中的方式包括显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体(诸如使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))介导的转染、PEG介导的DNA吸收、电穿孔和微粒轰击(诸如使用涂有DNA的钨粒子或金粒子(Agracetus Inc.,WI,USA))以及其它方式。
或者，本发明的表达构建体是病毒载体。适合病毒在本领域中是已知的并且可商购获得。用于递送核酸和使所述核酸整合至宿主细胞基因组中的常规基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体适用于将保持游离形式的核酸引入宿主细胞中。病毒载体为靶细胞和组织中基因转移的有效且通用的方法。另外，已在多种不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
例如，逆转录病毒通常包含包装能力高达6-10kb外来序列的顺式作用长末端重复(LTR)。最小顺式作用LTR就足以用于载体的复制和包装，其接着用于将表达构建体整合至靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于以下病毒的载体：鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合(参见例如Buchscher等,J Virol.56:2731-2739(1992)；Johann等,J.Virol.65:1635-1640(1992)；Sommerfelt等,Virol.76:58-59(1990)；Wilson等,J.Virol.63:274-2318(1989)；Miller等,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700；Miller和Rosman BioTechniques7:980-990,1989；Miller,A.D.Human Gene Therapy7:5-14,1990；Scarpa等Virology75:849-852,1991；Burns 等Proc.Natl.Acad.Sci USA90:8033-8037,1993)。
已开发各种腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。AAV载体可以使用本领域中已知的技术容易地构建。参见例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO92/01070和WO93/03769；Lebkowski等Molec.Cell.Biol.5:3988-3996,1988；Vincent等(1990)Vaccines90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter Current Opinion inBiotechnology5:533-539,1992；Muzyczka.Current Topics in Microbiol,andImmunol.755:97-129,1992；Kotin,Human Gene Therapy5:793-801,1994；Shelling和Smith Gene Therapy7:165-169,1994；和Zhou等J Exp.Med.779:1867-1875,1994。
适用于递送本发明的表达构建体的其它病毒载体包括例如来源于痘病毒家族的载体，诸如牛痘病毒和禽痘病毒或α病毒或缀合病毒载体(例如Fisher-Hoch等,Proc.NatlAcad.Sci.USA56:317-321,1989中所述的载体)。
细胞和可溶性因子的治疗/预防潜能的测定
用于确定细胞或可溶性因子治疗或预防或延迟代谢综合征或肥胖症的发病或进展的的能力方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
例如，将细胞或可溶性因子(例如，因子或单个因子或因子片段(通过亲和纯化或色谱得到)的混合物)施用至代谢综合征和/或肥胖症的模型，并且对一种或多种症状的效果进行评估。
代谢综合征的示例性模型包括高脂肪饲养的KK/Ta小鼠(Akagiri等,J ClinBiochem Nutr.42:150-157,2008)、C57Bl/6NCrl-Leprdb-lb/Crl小鼠(Charles RiverLaboratories)、高果糖饲养的啮齿动物(Le和Tappy,Current Opinion in ClinicalNutrition and Metabolic Care,9:469^175,2006)、高蔗糖饲养的大鼠(Coelho等Regulatory Peptides,162:61-67,2010)、高脂肪饲养的啮齿动物，以及高脂肪和高碳水化合物饲养的啮齿动物(例如，如Panchal和Brown所综述，Journal of Biomedicine andBiotechnology(2011))
肥胖症的示例性遗传模型包括dbldb小鼠、obiob小鼠、Zucker糖尿病肥胖大鼠以及Otsuka Long-Evans Tokushima肥胖大鼠。
肥胖症的示例性诱导模型包括高脂肪饲养的啮齿动物和/或高脂肪以及高碳水化合物饲养的啮齿动物。
在一个实例中，代谢综合征和/或肥胖症的模型是高脂肪饲养的非人灵长类动物，例如，食蟹猴)。
对于本领域的技术人员来说从前述内容显而易见，本发明还提供用于鉴别或分离用于治疗、预防或延迟代谢综合征或肥胖症的细胞或可溶性因子的方法，所述方法包括：
(i)对患有代谢综合征和/或肥胖症的测试受试者施用细胞或可溶性因子并且对受试者的代谢综合征的症状和/或体重进行评估；
(ii)对受试者的代谢综合征的症状和/或体重水平进行比较，(i)比较患有代谢综合征和/或肥胖症而没有施用细胞或可溶性因子的受试者的代谢综合征的症状和/或体重，
其中与对照组受试者相比较，测试受试者的症状改善和/或体重减轻表明细胞或可溶性因子治疗代谢综合征和/或其肥胖症。
所述细胞可以是本文根据任何实例描述的任何细胞。
本文描述了示例性症状。
细胞组合物
在本发明的一个实例中，STRO-1+细胞和/或其子代细胞是以组合物形式施用。在一个实例中，所述组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
术语“载体”和“赋形剂”是指在本领域中常规用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质的组合物(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Mac Publishing Company(1980)。载体还可减少活性化合物的任何不当副作用。适合载体例如是稳定的，例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下在接受者体内不产生明显的局部或全身性不良作用。
适用于本发明的载体包括那些常规使用的载体，例如水、盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer's solution)、缓冲溶液、透明质酸和二醇是示例性液体载体，特别是(当等渗时)对于溶液来说。适合药用载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
在另一实例中，载体是介质组合物，例如细胞在其中生长或悬浮的介质组合物。例如，所述介质组合物不在其所施用的受试者中诱发任何不良作用。
示例性介质和赋形剂不会不利地影响细胞活力和/或细胞减少、预防或延迟代谢综合征和/或肥胖症的能力。
在一个实例中，载体或赋形剂提供缓冲活性以使细胞和/或可溶性因子维持在适合pH下，由此发挥生物活性，例如载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表一种有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子相互作用的程度最低并且允许快速释放细胞和因子，在这种情况下，可将本发明的组合物制造为用于例如通过注射直接施加至血流或组织或围绕组织或与组织相邻的区域中的液体。
STPvO-1+细胞和/或其子代细胞也可以并入或包埋于与接受者相容并且降解为对接受者无害的产物的支架中。所述支架提供对欲移植到接受受试者体内的细胞的支持和保护。天然和/或合成生物可降解性支架为所述支架的实例。
多种不同的支架可成功用于实施本发明的方法。示例性支架包括但不限于生物可降解的支架。天然生物可降解支架包括胶原蛋白、纤连蛋白和层连蛋白支架。适用于细胞移植支架的合成材料应能够支持广泛细胞生长和细胞功能。所述支架也可被吸收。适合支架包括聚乙醇酸支架，例如如Vacanti等,J.Ped.Surg.23:3-91988；Cima等,Biotechnol.Bioeng.35:1451991；Vacanti等,Plast.Reconstr.Surg.88:753-91991所述，或合成聚合物，诸如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。
在另一实例中，细胞可在凝胶支架(诸如来自Upjohn公司的Gelfoam)中施用。
适用于本文所述方法的细胞组合物可以单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。可结合本发明组合物施用的细胞包括但不限于其它多效或多能细胞或干细胞，或骨髓细胞。不同类型的细胞可在临施用前或施用前不久与本发明组合物混合，或者其可以在施用前一起共培养一段时间。
在一个实例中，组合物包含有效量或治疗或预防有效量的细胞。例如，组合物包含约1×1O5个STRO-1+细胞/kg至约1×1O7个STRO-1+细胞/kg或约1×1O6个STRO-1+细胞/kg至约5×106个STRO-1+细胞/kg。欲施用的细胞的确切量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重和性别以及代谢综合征和/或肥胖症的范围和严重程度。
在一个实例中，将低剂量细胞施用至受试者。示例性剂量包括每公斤约0.1×104和0.5×106之间个细胞，例如每公斤约0.1×105和0.5×106之间个细胞，诸如每公斤约0.5×105和0.5×106之间个细胞，例如每公斤约0.1×106和0.5×106之间个细胞，例如每公斤约0.2×106或0.3×106或0.4×106个细胞。
在一些实例中，细胞是含于不允许细胞离开进入受试者循环中，然而允许由细胞分泌的因子进入循环中的腔室中。以此方式，可通过允许细胞分泌因子进入受试者循环中来向受试者施用可溶性因子。所述腔室同样可植入受试者的某一部位以增加可溶性因子的局部水平，例如在胰腺中或其附近植入
在本发明的一些实例中，可不必或不需要在起始细胞组合物疗法前对患者进行免疫抑制。因此，移植同种异体或者甚至异种的STRO-1+细胞或其子代在一些情况下可能是耐受的。
然而，在其它情况下，在起始细胞疗法前以药理学方式对患者进行免疫抑制和/或针对细胞组合物减少受试者的免疫反应可能是需要或适当的。这可以通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现，或者这可以通过在囊封装置中递送细胞来实现。细胞可以囊封在细胞所需要的营养物和氧以及治疗因子可透过，而细胞不可透过的胶囊中来免疫体液因子和细胞。例如，囊封剂具有低变应原性，容易地且稳定地位于靶组织中，并且对所植入的结构提供附加保护。降低或消除对移植细胞的免疫反应的这些和其它方式在本领域中是已知的。作为替代，可对细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。
可溶性因子的组合物
在一个实例中，由STRO-1+细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子是以例如包含适合载体和/或赋形剂的组合物形式施用。在一个实例中，载体或赋形剂不会不利地影响可溶性因子或上清液的生物学作用。
在一个实例中，组合物包含稳定可溶性因子或上清液组分(例如蛋白酶抑制剂)的物质的组合物。在一个实例中，所包括的蛋白酶抑制剂的量不足以对受试者产生不良影响。
包含由STRO-1+细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的组合物可制备为适当液体悬浮液，例如于培养基或于稳定载体或缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)中的悬浮液。适合载体在上文中描述。在另一实例中，包含由STRO-1+细胞得到和/或由子代细胞得到的上清液或可溶性因子的悬浮液是用于注射的油性悬浮液。适合亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。欲用于注射的悬浮液也可含有增加悬浮液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或聚葡萄糖。任选地，悬浮液也可含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。
可以通过在具有上述成分之一或其组合的适当溶剂中并入所需量的上清液或可溶性因子，需要时随后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。
一般来说，通过将上清液或可溶性因子并入含有基本分散介质或来自以上列出成分的其它所需成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，示例性制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。根据本发明的替代实例，上清液或可溶性因子可以与一种或多种增强它的溶解度的其它化合物一起配制。
其它示例性载体或赋形剂描述于以下文献中：例如Hardman等,(2001)Goodman和Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams以及Wilkins,New York,N.Y.；Avis等,(编著)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等,(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等,(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.。
治疗组合物通常应无菌且在制造和储存条件下稳定。组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它有序结构。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在一些情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬酯酸盐和明胶)来达成。此外，可溶性因子可以于时间释放制剂中施用，例如于包括缓慢释放聚合物的组合物中施用。活性化合物可用保护化合物免于快速释放的载体制备，诸如控制释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。多种用于制备所述制剂的方法已获得专利或通常为本领域的技术人员所已知。
上清液或可溶性因子可与例如提供可溶性因子的缓慢释放的适当基质组合施用。
组合物的附加组分
STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性细胞因子、STRO-1+细胞或其子代可以与其它有益的药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起施用。当与其它药剂一起施用时，它们可以在单一药物组合物中、或在分开的药物组合物中、与其它药剂同时或按序(在施用其它药剂之前或之后)一起施用。可以共施用的生物活性因子包括抗细胞凋亡剂(例如EPO、EPO模拟体、TOP、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂)；消炎药(例如，p38MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLAST、TRANLAST、REMICADE、SIROLIMUS，以及NSAID(非类固醇消炎药，例如TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPROFEN)；免疫抑制/免疫调节剂(例如钙调神经磷酸酶抑制剂，例如环孢素、他克莫司；mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS、EVEROLIMUS)；抗增生剂(例如，咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯)；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、氢化可的松)；抗体例如单克隆抗-IL-2α受体抗体(例如，巴利昔单抗、达克珠单抗)、多克隆抗T细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体OKT3))；抗血栓形成剂(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯基丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂和血小板抑制剂)；和抗氧化剂(例如普罗布考、维生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)，以及局部麻醉剂。
在一个实例中，如本文根据任何实例描述的组合物包括用于治疗或预防代谢综合征和/或肥胖症的另一因子，例如，如本文描述，如他汀类药物。
替代地，或此外，如本文根据任何实例描述的细胞、分泌因子和/或组合物与代谢综合征和/或肥胖症的已知治疗组合。
在一个实例中，如本文根据任何实例描述的药物组合物包含用于治疗代谢综合征和/或肥胖症的化合物。或者，如本文根据本发明的任何实例描述的治疗/预防的方法另外包括施用用于治疗代谢综合征和/或肥胖症的化合物。示例性化合物在本文描述并且应理解为在作了必要的修改的情况下适用于本发明的这些实例。
在另一个实例中，如本文根据任何实例描述的组合物另外包含诱导或增强祖细胞分化为血管内皮细胞的因子。示例性因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF，例如PDGF-BB)以及FGF。
在另一个实例中，如本文根据任何实例描述的组合物另外包含组织特异性定向细胞(TSCC)。在这方面，国际专利申请号PCT/AU2005/001445示范了施用TSCC和STRO-1+细胞可以使得TSCC的增殖增强。在一个实例中，TSCC是血管细胞。对受试者施用所述组合物可以导致血管的产生增加，例如导致被递送至受影响的组织的营养成分增加。
医疗装置
本发明还提供了用于使用或当在如本文根据任何实例描述的方法中使用时的医疗装置。例如，本发明提供包含如本文根据任何实例描述的STRO-1+细胞和/或其子代和/或其可溶性因子和/或组合物的注射器或导管或其它合适的递送装置。任选地，注射器或导管与如本文根据任何实例描述的方法的说明书一起包装。
在另一个实例中，本发明提供包含如本文根据任何实例描述的STRO-1+细胞和/或其子代和/或其可溶性因子和/或组合物的植入物。任选地，植入物与如本文根据任何实例描述的方法的说明书一起包装。合适的植入物可以形成为具有支架，例如如上文所述，和STRO-1+细胞和/或其子代细胞和/或其可溶性因子。
施用模式
由STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+细胞或其子代可手术植入、注射、递送(例如借助于导管或注射器)或以其它方式直接或间接施用至需要修复或增强的部位(例如器官)或施用至脂肪垫中。
在一个实例中，由STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+细胞或其子代是递送至受试者的血流中。例如，由STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+细胞或其子代是以肠胃外方式递送。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于腹腔、脑室、脑室内、鞘内或静脉内。在一个实例中，由STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+细胞或其子代是动脉内递送至主动脉中、心脏的心房或心室中或血管中，例如静脉内。
在细胞递送至心脏的心房或心室的情况下，可以将细胞施用至左心房或左心室以避免可能由细胞快速递送至肺而引起的并发症。
在一个实例中，由STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+细胞或其子代是静脉内递送。
在一个实例中，使用注射器或通过导管或中心管线将由STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+细胞或其子代注射至递送部位中。
用于治疗性制剂的施用方案的选择取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平和实体的免疫原性。在一个实例中，施用方案使与可接受水平的副作用相一致的递送至患者的治疗性化合物的量达到最大。因此，所递送制剂的量部分取决于特定实体和所治疗病状的严重性。
在一个实例中，由STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+细胞或其子代是以单次推注剂量来递送。或者通过连续输注、或通过间隔为例如一天、一周或每周1-7次的剂量来施用由STRO-1+细胞得到的上清液或可溶性因子、STRO-1+细胞或其子代。示例性剂量方案是涉及最大剂量或避免明显不当副作用的剂量频率的方案。总每周剂量取决于所使用化合物/细胞的类型和活性。适当剂量由临床医师例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来确定。一般来说，剂量始于稍小于最佳剂量的量并在此后以较小增量增加直至相对于任何负面副作用达成所需或最佳的效果。
本发明展示了在受试者中观察至少四周由STRO-1+细胞和/或其子代和/或其得到的可溶性因子提供的治疗效益。因此，在某些实例中，细胞是每周、隔周、每三周一次或每四周一次地施用。
根据本发明涉及治疗或延迟代谢综合征和/或肥胖症的发展的实例一致，STRO-1+细胞和/或其子代细胞和/或其得到的可溶性因子是在例如使用本领域已知的和/或本文描述的标准方法诊断出病症之后施用。
对于涉及预防或延迟代谢综合征和/或肥胖症的发病的那些实例，STRO-1+细胞和/或其子代细胞和/或其得到的可溶性因子可以在临床上诊断出病症之前施用。
本发明包括以下非限制性实施例。
实施例
实施例1通过选择STRO-3+细胞对MPC进行免疫选择
骨髓(BM)是从健康正常的成人志愿者(20-35岁)中采集。简单地说，从髂后嵴抽吸40ml BM至含肝素锂抗凝剂的试管中。
如先前所述(Zannettino,A.C.等(1998)Blood92:2613-2628)使用LymphoprepTM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)通过密度梯度分离制备BMMNC。在4℃下以400×g离心30分钟后，用转移吸管移除白细胞层并在由含有5%胎牛血清(FCS；CSL Limited,Victoria,Australia)的汉克氏平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)构成的“HHF”中洗涤三次。
随后如先前所述(Gronthos等(2003)Journal of Cell Science116:1827-1835；Gronthos,S.和Simmons,P.J.(1995)Blood85:929-940)通过磁性活化细胞分选法分离STRO-3+(或TNAP+)细胞。简单地说，在冰上将约1-3×108个BMMNC在由10%(v/v)正常兔血清于HHF中组成的阻断缓冲液中孵育20分钟。在冰上将细胞与200μl的STRO-3mAb于阻断缓冲液中的10μg/ml溶液一起孵育1小时。随后通过在400×g下离心将细胞在HHF中洗涤两次。加入山羊抗小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,UK)于HHF缓冲液中的1/50稀释液且在冰上将细胞孵育1小时。如上将细胞在MACS缓冲液(补充有1%BSA、5mM EDTA和0.01%叠氮化钠的无Ca2+且无Mn2+的PBS)中洗涤两次并重悬于最终体积为0.9ml的MACS缓冲液中。
将100μl抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec;Bergisch Gladbach,Germany)加入细胞悬浮液中且在冰上孵育15分钟。将细胞悬浮液洗涤两次并重悬于0.5ml MACS缓冲液中且随后上样至微型MACS管柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，并用0.5ml MACS缓冲液洗涤三次以回收未结合STRO-3mAb的细胞(于2005年12月19日保藏于美国典型培养物中心(American Type Culture Collection；ATCC)，保藏编号PTA-7282-参见国际公布号WO2006/108229)。再加入1ml MACS缓冲液后，由磁体移除管柱并通过正压力分离TNAP+细胞。将来自各部分的细胞等分试样用抗生蛋白链菌素-FITC染色并通过流式细胞术评估纯度。
实施例2:通过STRO-3mAb选择的细胞是STRO-1亮细胞
设计实验以证实使用STRO-3mAb作为用于分离细胞STRO-1亮细胞的单一试剂的可能性。
鉴于STRO-3(IgG1)的同种型与STRO-1(IgM)的同种型不同，因此通过双色FACS分析基于与使用MACS程序分离的STRO-1-细胞的共表达评估STRO-3鉴定克隆CFU-F的能力(图1)。点阵直方图表示以列表模式数据形式收集的5×104个事件。垂直线和水平线设定为小于用在相同条件下处理的同种型匹配对照抗体1B5(IgG)和1A6.12(IgM)获得的平均荧光的1.0%的反应性水平。结果表明STRO-1亮细胞的较小群体共表达TNAP(右上象限)，而其余STRO-1+细胞未能与STRO-3mAb反应。随后测定所有四个象限的通过FACS分离的细胞的CFU-F发生率(表1)。
表1：通过双色FACS分析基于细胞表面标志物STRO-1和TNAP的共表达富集人骨髓细胞(参考图1)。将FACS分选的细胞在标准克隆条件下在补充有20%FCS的αMEM中培养。数据表示铺板的每105个细胞中第14天群落形成细胞(CFU-F)的平均数±SE(n=3个不同骨髓抽吸物)。这些数据表明人MPC仅局限于BM(其明显共表达STRO-1抗原)的TNAP阳性部分。
骨髓部分 每105个细胞中CFU-F的频率 富集(增加倍数)
未分级分离的BMMNC 11.0±2.2 1.0
TNAP+/STRO-1亮 4,511±185 410
TNAPVSTRO-1深 0.0 0.0
实施例3:食蟹猕猴STRO-3+MPC的表征
将猿猴骨髓祖细胞(来自食蟹猕猴；cyno-MPC)从自雌性食蟹猕猴(macacafascicularis)收集的约15ml的骨髓抽吸液中分离。使用聚蔗糖梯度(Ficoll gradient)将骨髓抽吸物悬浮液分离并且洗涤以移除无核细胞(红血球)。将有核细胞计数然后通过连接CA12抗体(抗STRO-3)和Dynalbeads进行分离。将连接有抗体和珠粒的细胞通过MPC-1磁体的磁场进行阳性选择。将阳性选择的细胞计数，并且接种至T形瓶中的生长培养基中作为传代(p.)0。在集落形成测定(CFU-F)中使用预选、阳性和阴性细胞。
使用生长培养基喂养cyno-MPC细胞。每2至4天喂养所有培养物(p.O–p.5)直到它们达到所需的汇合度。接着使用HBSS洗涤，以及随后相继使用胶原酶和胰蛋白酶/维尔烯(Versene)来对细胞进行传代或收获细胞。将p.1细胞计数并且接种至T形瓶中。当p.1cyno-MPC细胞达到所需汇合度时，收获细胞并且使用速率受控的冷冻机进行低温保存。
将传代1低温保存cyno-MPC解冻并且接种至T形瓶中(p.2)。将p.2细胞在细胞工厂中传代至p.3。收获p.3细胞并在细胞工厂内传代至p.4。将额外的p.3细胞低温保存。将p.4细胞在6×细胞工厂传代至p.5。当p.5cyno-MPC细胞达到所需的汇合度时，收获细胞并且使用速率受控的冷冻机低温保存。将细胞在50%的αMEM、42.5%的Profreeze，以及7.5%的DMSO中低温保存。样品是针对CFU-F测定、FACS、无菌性、支原体以及内毒素进行测试。
培养的cyno-MPC的免疫表型的代表性流式细胞仪分析结果在图2中示出。如所示出的，这些细胞是STRO-1+、STRO-4+以及CD146+。
将p5的Cyno MPC解冻，并且如实施例4所描述用于静脉内注射糖尿病和非糖尿病食蟹猕猴。
实施例4:STRO-3MPC即使在低剂量下对于治疗代谢综合征和肥胖症也有效
选择了五(5)只食蟹猕猴用于治疗。这些猴子具有糖尿病性代谢综合征(身体质量指数＞35、甘油三酯＞75mg/dL，以及低HDL水平)。历时一个月的时期，基于空腹血糖水平、空腹胰岛素水平，以及在静脉内葡萄糖耐量测试(IVGTT)之后的胰岛素/血糖反应评估猴子的糖尿病的明显特征。五只猴子中的三只被鉴定为患有糖尿病(月平均空腹血糖＞110)。猴子的基线特征在表2中示出。
表2：糖尿病和非糖尿病动物的特征
特征 非糖尿病(n=2) 糖尿病(n=3)
体重(kg) 7.8 9.0
空腹血糖(mg/dL) 92 140
空腹胰岛素(mU/L) 45 28
甘油三酯(mg/dL) 25 18
脂蛋白指数 0.6 0.3
猴子被分配为组1、2或3。动物接受如下剂量的单次缓慢静脉内(IV)输注异体MPC(如实施例2所描述分离)至头静脉或合适的外周静脉(剂量根据最近记录的体重进行调整)：
表3：治疗组概述
三个月后，猴子以同样的剂量接受第二次MPC输注。
在第一次输注后六个月，每两周对猴子的体重、脂质特征、空腹血糖水平、空腹血液胰岛素水平以及对IVGTT的血糖和胰岛素反应进行评估。
结果
图3展示了糖尿病动物在输注MPC之前对葡萄糖负荷的晚期胰岛素反应表现出缺陷。
如图4示出的结果表明在非糖尿病动物中，MPC的第一次剂量诱导了胰岛素反应的适度改变并且第二次剂量诱导了持续3个月(即，从第4至第6个月)的完全的胰岛素反应。在糖尿病组中，第一次和第二次MPC剂量都连续表明持续6个月的增加的胰岛素反应。这些数据支持了，如在糖尿病和中度糖尿病动物的葡萄糖负荷后的胰岛素反应诱导所描绘的，MPC能够改善胰腺β-细胞的功能。
与在图5中示出的个别动物数据一致，图5(图a)中的非糖尿病动物的分组数据表明第二次MPC输注诱导了持续3个月(即，从第4至第6个月)的完全的胰岛素反应。这在图5(图b)中被证实，其示出在第二次MPC输注之后诱导了50%-100%的晚期胰岛素反应。
然而，在图5(图a)中，汇集的糖尿病组数据表明第一次和第二次MPC剂量都连续增加了持续6个月的晚期胰岛素反应。在第一次和第二次MPC输注之后分别观察到晚期胰岛素反应的40%-75%和75%-175%的增加。这些数据支持了在葡萄糖负荷之后连续剂量的MPC诱导晚期胰岛素反应。
MPC治疗还产生了在非糖尿病动物的第一次和第二次MPC治疗之后葡萄糖清除速率的增加(图6)。例如，第二次剂量诱导了持续3个月(即，从第4至第6个月)的反应。此外，在糖尿病动物组中，第一次和第二次MPC剂量都连续表明持续6个月的葡萄糖清除速率的增加。这些数据表明，如在图4和5中所阐明的在葡萄糖负荷后的晚期胰岛素反应的诱导是与图6所述的基线预处理值相比，MPC治疗后葡萄糖清除率增加的原因
在第一次和第二次MPC治疗之后(图7图a)后，在非糖尿病组中还观察到葡萄糖清除速率的增加。增加在图7(图b)中示出为葡萄糖清除率(第1-3个月的5%-10%对比第4-6个月的15%-25%)的平均变化百分比。
如图7(图b)所示，在糖尿病组中，第一次和第二次MPC剂量都连续表明葡萄糖清除速率持续6个月相对于基线稳定增加10%-20%。这些数据暗示连续MPC治疗诱导了在静脉内葡萄糖负荷之后葡萄糖清除速率的逐渐增加。
还示出施用MPC诱导了月平均血糖水平的持续降低和空腹胰岛素水平的改善(图8)。在非糖尿病动物#1880(80mg/dL的平均基线)中，MPC的第一次剂量产生了空腹胰岛素水平的降低。动物#1880还显示了在第一次剂量后空腹胰岛素水平的降低。
动物#3351显示了在第二次MPC剂量的第二个月后，空腹BGL的降低。这个动物(在MPC治疗前处于基线的高胰岛素血症)显示了在输注MPC后6个月的胰岛素水平的正常化。
所有的糖尿病动物显示与预处理基线相比，在MPC治疗后空腹BGL值完全降低(低于基线持续6个月)。这些数据显示MPC治疗诱导了月平均血糖水平的持续降低。
图9示出了在非糖尿病组，与MPC治疗前的基线值相比，第一次和第二次MPC剂量都产生了空腹血糖水平的降低。在输注MPC之后，存在持续6个月的胰岛素水平的正常化。在糖尿病组中，与预处理基线值相比，在MPC治疗后有持续六个月的低于基线的空腹BGL的完全降低。此外，在糖尿病组中，与预处理基线值相比，第一次MPC降低了空腹胰岛素水平。这些数据表明MPC治疗诱导了月平均空腹血糖水平的持续降低。在患有代谢综合征的非糖尿病动物中，空腹胰岛素水平持续降低了6个月，并且这种效果在糖尿病组中短暂持续了3个月。
图9(a)示出了非糖尿病和糖尿病动物的月平均体重变化。描绘了非糖尿病和糖尿病动物在MPC治疗一个月前和6个月后的个别数据。箭头指示输注MPC的时间。每只动物的MPC剂量在每个图的顶部示出。
如图10图(a)所示的，与预处理体重相比，在非糖尿病动物#1880中第一次MPC剂量对于体重减轻具有短暂的效果并且第二次MPC剂量对于体重减轻具有进一步效果。非糖尿病动物#3351在MPC的两种剂量下显示出体重逐渐减轻的型态。令人惊奇的是，如图10图(b)所示，对于每个个别动物来说，发生了体重的减轻，而无论在体重测量期间的稳定食物消耗。
在糖尿病动物#1624和#7581中，在MPC的第一次和第二次剂量之后有持续的体重减轻。动物#2875的体重在MPC治疗期间低于未治疗基线。
图10图(c)示出了在MPC治疗之后相对于未处理的基线的汇集的动物组的月平均体重减轻百分比。在MPC治疗的过程中，体重减轻的范围为4%至6%。
这些数据表明了MPC治疗诱导了非糖尿病和糖尿病动物的体重减轻，其与在MPC治疗后空腹血糖水平降低、葡萄糖清除速率增加以及诱导的葡萄糖刺激胰岛素产生有关。
图11示出了在非糖尿病动物中，与预处理值相比，在MPC治疗后有甘油三酯和VLDL的持续降低和HDL水平的增加。在动物#1880中，还有MPC第二次剂量的效果的证据，其显示了与第一次MPC剂量相比，在第二次MPC剂量之后脂蛋白指数的增加。非糖尿病动物表明持续6个月的脂蛋白指数的增加。图11呈现的数据表明MPC治疗改善了非糖尿病动物的长期脂质特征和糖尿病动物的短期脂质特征。
在非糖尿病组中，与预处理的值相比，在持续6个月的MPC治疗之后甘油三酯和VLDL有持续降低并且HDL水平有增加(图12)。与脂质特征一致，非糖尿病组显示6个月的脂蛋白指数的持续增加。在MPC第一次剂量随后，糖尿病动物显示了脂蛋白指数的短期效果，其持续了2个月时期。这些数据表明MPC治疗改善了非糖尿病动物的长期脂质特征和糖尿病动物的短期脂质特征。
本文呈现的数据表明所研究的毛里求斯食蟹猴具有的饮食诱导的代谢综合征和2型糖尿病的进展与降低的胰岛素水平和对葡萄糖负荷的晚期胰岛素反应的缺陷有关。连续3个月的MPC剂量分别导致对葡萄糖负荷的晚期胰岛素反应逐步增强以及超过6个月的葡萄糖清除率的改善。此外，静脉内MPC输注使空腹血糖水平持续6个月的正常化，而没有任何低血糖。MPC治疗还产生了持续6个月的体重之间减轻并且使与代谢综合征相关的异常的脂质特征正常化。在没有糖尿病的受试者中，脂质降低效果持续6个月。

Claims (18)

1.富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子在制造用于降低患有体重过重的受试者的体重过重的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中施用所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子使得体重在所述施用之后4周减轻至少3％。
3.富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子在制造用于治疗受试者的体重过重和/或肥胖症的药物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其中施用所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子产生以下一种或多种：
(i)甘油三酯降低；
(ii)低密度脂蛋白降低；
(iii)高密度脂蛋白升高；
(iv)脂蛋白指数升高；
(v)空腹血糖水平降低；
(vi)胰腺的胰岛素分泌增加；
(vii)进食后的葡萄糖清除率增加；
(viii)胰岛素抵抗减少；以及
(ix)体重减轻。
5.如权利要求1或3所述的用途，其包括施用富含STRO-1亮细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子。
6.如权利要求1或3所述的用途，其中所述富含STRO-1+细胞的细胞群和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子是全身性地施用。
7.如权利要求1或3所述的用途，其中所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子施用多次。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子是每四周或更多周施用一次。
9.如权利要求1或3所述的用途，其包括施用足以达成以下一种或多种的剂量的所述群和/或所述子代和/或所述可溶性因子：
(i)甘油三酯降低；
(ii)低密度脂蛋白降低；
(iii)高密度脂蛋白升高；
(iv)脂蛋白指数升高；
(v)空腹血糖水平降低；
(vi)胰腺的胰岛素分泌增加；
(vii)进食后的葡萄糖清除率增加；
(viii)胰岛素抵抗减少；以及
(ix)体重减轻。
10.如权利要求1或3所述的用途，其包括施用每公斤0.1×106至5×106之间个STRO-1+细胞和/或其子代。
11.如权利要求1或3所述的用途，其包括施用每公斤0.3×106至2×106之间个STRO-1+细胞和/或其子代。
12.如权利要求1或3所述的用途，其包括施用低剂量的STRO-1+细胞和/或其子代。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述低剂量的STRO-1+细胞和/或其子代包含每公斤0.1×105至0.5×106之间个STRO-1+细胞和/或其子代。
14.如权利要求12所述的用途，其中所述低剂量的STRO-1+细胞和/或其子代包含每公斤0.3×106个STRO-1+细胞和/或其子代。
15.如权利要求1或3所述的用途，其中所述富含STRO-1+细胞的群和/或子代细胞是自体的或异体的，和/或所述可溶性因子可以获自自体或异体细胞。
16.如权利要求1或3所述的用途，其中所述富含STRO-1+细胞的群和/或子代细胞已在施用之前和/或在获得所述可溶性因子之前经过培养扩增。
17.如权利要求1或3所述的用途，其中所述富含STRO-1+细胞的群是STRO-1亮，和/或表达组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)，和/或所述子代细胞和/或可溶性因子是获自作为STRO-1亮的和/或表达TNAP的STRO-1+细胞。
18.如权利要求1或3所述的用途，其中所述STRO-1+细胞和/或其子代细胞和/或由其得到的可溶性因子以组合物的形式来施用，所述组合物包含所述STRO-1+细胞和/或其子代和/或由其得到的可溶性因子以及载体和/或赋形剂。
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