CN103614324B

CN103614324B - 一株短链脂肪酸降解菌及其应用

Info

Publication number: CN103614324B
Application number: CN201310608087.6A
Authority: CN
Inventors: 肖梓军; 方力; 于洋; 刘海澄; 黄鹤; 相养冬; 朱贤琨; 郗丽君; 徐海; 吕建仁
Original assignee: LIAOHE PETROCHEMICAL BRANCH CHINA NATIONAL PETROLEUM Corp; China University of Petroleum East China
Current assignee: LIAOHE PETROCHEMICAL BRANCH CHINA NATIONAL PETROLEUM Corp; China University of Petroleum East China
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2033-11-25
Also published as: CN103614324A

Abstract

本发明提供了一株短链脂肪酸降解菌ZB35（Myroides sp.ZB35），保藏于中国武汉典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏日期2013年1月17日，保藏号为CCTCC NO:M2013024。本发明短链脂肪酸降解菌ZB35可快速、高效地降解水体中的多种短链脂肪酸类有机污染物。该菌株的菌剂制备工艺简单且成本低，将在污水治理中展示良好的应用前景。

Description

一株短链脂肪酸降解菌及其应用

技术领域

本发明属于环保技术领域，具体涉及一株降解多种短链脂肪酸的细菌菌株ZB35及其在降解水体中短链脂肪酸类有机污染物中的应用。

背景技术

原油劣质化、重质化已成为世界范围内的趋势。全球剩余石油资源中的70%是重油，重油必将成为我国未来主要的接替资源。重油大规模集中加工，需要研发污水高效处理技术。稠油（劣质重油种类之一）规模化集中化处理，其加工污水的水量及比例也将不断增长，污水中难生物降解有机物量、种类也将不断变化，将会直接影响生化处理段微生物代谢的稳定运行。生化处理法作为污水净化处理最为高效率、低能耗的工艺技术仍然值得我们深入研究，在原技术基础上，开发出更加技术可靠、经济合理的升级处理工艺，应对重油加工变化带来的新问题。因此，开发高效、稳定、抗冲击能力强的稠油加工污水处理工艺和技术，特别是生化处理工艺和技术，对于应对我国稠油加工量迅速增加、污染物排放标准不断提高的趋势，解决产量增加与排放量减少等矛盾具有重大意义。

稠油加工污水的处理，是世界范围内的难题，国内外尚非常缺乏专门针对稠油污水生化处理的工业化技术，在此方面的基础理论研究也非常匮乏。由于稠油加工污水含有大量的乳化油和悬浮物，一般采取两段处理工艺。前一段工艺是以脱油和悬浮物为主的物理化学工序，后一段是生物降解工序。中国石油辽河石化公司是目前全国最大的稠油加工企业，作为中国石油稠油加工基地，辽河石化在稠油加工污水的处理方面已经开展了大量研究和技术开发工作。在生化处理阶段，辽河石化目前采用水解酸化+CAST（循环式活性污泥法）等工艺，可使处理后的污水达标排放。但在CAST池出水中，采用GC-MS（气相色谱-质谱联用）技术仍检测到多种短链脂肪酸类有机污染物，如表1所示。

表1CAST池出水GC-MS分析主要检出短链脂肪酸类有机污染物

短链脂肪酸类有机污染物虽然毒性不高，但它们在水体中的溶解度较大，会造成COD（化学需氧量）升高；在水体中降解较慢，特别是对于带有分支的脂肪酸，例如表1中的2-甲基丁酸。若对上述这些残余有机污染物进一步降解，有可能使辽河石化已经达标排放的出水水质进一步提高。但是目前国内外对短链脂肪酸类有机污染物降解菌的选育和研究报道非常少，尤其是用同一株细菌同时降解多种短链脂肪酸类有机污染物的情况本发明尚属国内外首例。

发明内容

针对上述目前存在的问题，本发明提供了一株高效降解多种短链脂肪酸的细菌菌株ZB35及其在降解水体中短链脂肪酸类有机污染物中的应用方法。

本发明提供的短链脂肪酸降解菌ZB35（Myroides sp.ZB35），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：武汉市武昌珞珈山；保藏号：CCTCC NO:M2013024；保藏日期：2013年1月17日。

为了得到目的菌株，本发明采取了以下措施：配制以2-甲基丁酸为唯一碳源的无机盐培养基，从辽河石化取得活性污泥样品，进行菌株的富集筛选与分离纯化，最终得到能够快速彻底降解2-甲基丁酸的本发明菌株ZB35。该菌株菌体呈杆状，革兰氏染色反应呈阴性。通过细菌16S rDNA测序，并用美国国立生物技术信息中心（简称NCBI）的BLAST程序对该菌株的16S rDNA序列和GenBank数据库中已收录的序列进行核苷酸同源性比对，发现与之序列同源性大于99%的已知菌株是Myroides属，因此本发明菌株鉴定为Myroides属，并命名为Myroidessp.ZB35。本发明菌株Myroides sp.ZB35已于2013年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC NO:M2013024。

本发明的菌株Myroides sp.ZB35除了能以2-甲基丁酸为唯一碳源和能源进行生长繁殖外，还能降解很多种其他短链脂肪酸类化合物，如戊酸、己酸、庚酸、辛酸等。这些有机污染物经降解主要转化为简单的无机物（二氧化碳和水），少量用于合成无害的菌体细胞，因此本方法不存在二次污染。

本发明的短链脂肪酸降解菌Myroides sp.ZB35可快速、高效地降解水体中的多种短链脂肪酸类有机污染物。该菌株的菌剂制备工艺简单且成本低，将在污水治理中展示良好的应用前景。

附图说明

附图1是菌株Myroides sp.ZB35扫描电镜照片。

附图2是菌株Myroides sp.ZB35降解2-甲基丁酸过程曲线。

附图3是菌株Myroides sp.ZB35降解戊酸过程曲线。

附图4是菌株Myroides sp.ZB35降解己酸过程曲线。

附图5是菌株Myroides sp.ZB35降解庚酸过程曲线。

附图6是菌株Myroides sp.ZB35降解辛酸过程曲线。

附图7是菌株Myroides sp.ZB35降解含有2-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸5种混合酸的过程曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明技术进一步说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：菌株富集筛选与分离纯化

1.1配制富集培养基

按如下配方配制富集培养基，每升去离子水中含：200毫克2-甲基丁酸，2.28克K₂HPO₄·3H₂O，0.47克NaH₂PO₄·2H₂O，1.32克(NH₄)₂SO₄，0.12克MgSO₄，2.63毫克CaCl₂，0.72毫克FeSO₄·7H₂O，0.46毫克ZnSO₄·7H₂O，0.22毫克MnSO₄·H₂O。调pH至7.0，121℃条件下灭菌20分钟。

1.2菌株富集

称取2克活性污泥样品，接种到装有100毫升上述富集培养基的摇瓶中，置于转速为150转/分钟的摇床中，控温30℃。约3天后，取其中1毫升培养液，接种到新的100毫升富集培养基中，继续富集，如此反复操作，共富集4次。

1.3菌株分离纯化

首先配制LB（Luria-Bertani）固体培养基，每升去离子水中含：10克蛋白胨，5克酵母提取物，10克NaCl，17克琼脂粉。121℃条件下灭菌20分钟。准备用于梯度稀释的试管和生理盐水等物品，灭菌后备用。

将上述1.2实验第4次富集得到的培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布到上述固体培养基上，置于30℃的恒温箱中培养1至3天，肉眼观察长出的菌落大小，待大小合适时即可停止培养。用接种环挑取单菌落，采取划线法分离纯化，得到目的菌株。

实施例2：菌株鉴定与保藏

2.1形态特征

菌落呈黄色，表面光滑，边缘整齐。菌体呈杆状，革兰氏染色呈阴性。

2.2菌株16S rDNA鉴定与保藏

用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R为扩增引物，采取PCR方法扩增上述1.3实验得到的目的菌株的16S rDNA片段，电泳检测后，送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得测序结果，并用美国国立生物技术信息中心（简称NCBI）的BLAST程序对该菌的16S rDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比对，发现与之序列同源性大于99%的已知菌株是Myroides属，因此本发明菌株鉴定为Myroides属，并命名为Myroidessp.ZB35。本发明菌株Myroides sp.ZB35已于2013年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC NO:M2013024。该菌株的16S rDNA序列已提交到GenBank数据库中，登录号为KF874659。

2.3菌株生理生化特征

对菌株Myroides sp.ZB35进行了生理生化特征鉴定，结果如表2所示。

表2Myroides sp.ZB35的生理生化特征

实施例3：制备Myroides sp.ZB35菌剂

将实施例2所述Myroides sp.ZB35接种于摇瓶中，装液量为50毫升，于恒温摇床中培养。所用培养基为LB液体培养基；培养条件为：温度30℃，摇床转速150转/分钟。当细胞生长达到对数生长末期，即一般培养12小时左右，停止培养，收获菌种。将此菌种以2%的接种量接种到含有混合短链脂肪酸的无机盐培养基中，在温度30℃、摇床转速150转/分钟的条件下培养约60小时，即得ZB35液体菌剂。该菌剂可直接应用，或置于4℃冰箱中待用。所述LB液体培养基配方为：每升去离子水中含：10克蛋白胨，5克酵母提取物，10克NaCl。121℃条件下灭菌20分钟。所述含有混合短链脂肪酸的无机盐培养基配方为：每升去离子水中含：200毫克2-甲基丁酸，200毫克戊酸，200毫克己酸，200毫克庚酸，200毫克辛酸，2.28克K₂HPO₄·3H₂O，0.47克NaH₂PO₄·2H₂O，1.32克(NH₄)₂SO₄，0.12克MgSO₄，2.63毫克CaCl₂，0.72毫克FeSO₄·7H₂O，0.46毫克ZnSO₄·7H₂O，0.22毫克MnSO₄·H₂O。调pH至7.0，121℃条件下灭菌20分钟。

实施例4：Myroides sp.ZB35菌剂的具体应用

在含有1000毫克/升2-甲基丁酸的去离子水中，按每升反应液添加如下无机盐成分：2.28克K₂HPO₄·3H₂O，0.47克NaH₂PO₄·2H₂O，1.32克(NH₄)₂SO₄，0.12克MgSO₄，2.63毫克CaCl₂，0.72毫克FeSO₄·7H₂O，0.46毫克ZnSO₄·7H₂O，0.22毫克MnSO₄·H₂O。取3个250毫升大小的摇瓶，每瓶中装入50毫升反应液，向每瓶接种3毫升经实施例3得到的ZB35液体菌剂，控件降解时的反应温度为30±2℃，反应初始pH值为7.0±0.2，摇床转速为150转/分钟。降解反应进行过程中取样检测反应水体中残余短链脂肪酸浓度，得到附图2菌株Myroides sp.ZB35降解2-甲基丁酸过程曲线。由图中可以看出，当反应进行到约200小时时，降解率达到100%。

实施例5：Myroides sp.ZB35菌剂的具体应用

同实施例4，但用戊酸替换2-甲基丁酸。降解反应进行过程中取样检测反应水体中残余短链脂肪酸浓度，得到附图3菌株Myroides sp.ZB35降解戊酸过程曲线。由图中可以看出，当反应进行到约70小时时，降解率达到100%。

实施例6：Myroides sp.ZB35菌剂的具体应用

同实施例4，但用己酸替换2-甲基丁酸。降解反应进行过程中取样检测反应水体中残余短链脂肪酸浓度，得到附图4菌株Myroides sp.ZB35降解己酸过程曲线。由图中可以看出，当反应进行到约100小时时，降解率达到100%。

实施例7：Myroides sp.ZB35菌剂的具体应用

同实施例4，但用庚酸替换2-甲基丁酸。降解反应进行过程中取样检测反应水体中残余短链脂肪酸浓度，得到附图5菌株Myroides sp.ZB35降解庚酸过程曲线。由图中可以看出，当反应进行到约125小时时，降解率达到100%。

实施例8：Myroides sp.ZB35菌剂的具体应用

同实施例4，但用辛酸替换2-甲基丁酸。降解反应进行过程中取样检测反应水体中残余短链脂肪酸浓度，得到附图6菌株Myroides sp.ZB35降解辛酸过程曲线。由图中可以看出，当反应进行到约140小时时，降解率达到100%。

实施例9：Myroides sp.ZB35菌剂的具体应用

同实施例4，但用混合酸替换2-甲基丁酸，所述混合酸为2-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸5种短链脂肪酸的等比例混合物，即每种酸的浓度均为200毫克/升。降解反应进行过程中取样检测反应水体中残余短链脂肪酸浓度，得到附图7菌株Myroides sp.ZB35降解混合酸过程曲线。由图中可以看出，当反应进行到约90小时时，降解率达到100%。

Claims

1.一株短链脂肪酸降解菌Myroides sp.ZB35，其特征在于：该菌株已于2013年1月17日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2013024。

2.如权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO:M 2013024的菌株Myroides sp.ZB35在降解水体中短链脂肪酸有机污染物中的应用。