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CN103611171B - 以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂及其制备方法 - Google Patents

以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂及其制备方法 Download PDF

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CN103611171B CN201310606272.1A CN201310606272A CN103611171B CN 103611171 B CN103611171 B CN 103611171B CN 201310606272 A CN201310606272 A CN 201310606272A CN 103611171 B CN103611171 B CN 103611171B
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张雯雯
徐经纬
赵桂燕
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Jiangxi Rare Earth Research Institute Chinese Academy Of Sciences
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Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
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Abstract

本发明提供一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂及其制备方法，属于磁共振成像造影剂。该造影剂是在刚性连接基团四苯酰基甲烷上共价连接四个DO3A基团，再与顺磁性金属离子Gd3+配合而得到的，除了DO3A中的四个氮原子和环上的三个羧酸基参与顺磁离子的配位以外，四苯酰基甲烷中的乙酰羰基也参与配位，这个配位键的形成，既增强了顺磁离子与化合物配合的稳定性，又减少了DO3A螯合基团与连接中心之间的连接体柔性，使DO3A和顺磁离子的旋转与整个分子的旋转更加一致，在客观上延长了顺磁离子的旋转相关时间，使造影剂的弛豫效率提高。本发明的造影剂总的弛豫效率达到27.2mM-1s-1。

Description

以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂及其制备方法
技术领域
本发明属于磁共振成像造影剂，具体涉及一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂及其制备方法。
背景技术
近年来，磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）已经成为临床上常用的诊断手段之一。与常规CT相比，磁共振成像具有无辐射、非侵入性、高空间分辨率等优点。目前，临床上有大于35%的磁共振成像需要使用磁共振成像造影剂（MRI contrast agent）。随着新型磁成像技术，例如功能磁共振成像（Functional MRI）、灌注磁共振成像（Perfusion MRI）等的开发和临床应用，磁共振成像造影剂的研究和开发已经成为一个日益重要的领域。磁共振成像造影剂是一类能够缩短成像时间，增加被检测部位与周围组织的磁信号差异，从而提高成像对比度和清晰度，显示组织器官功能状态的诊断用药。
目前，临床上使用的造影剂大多为含钆离子的小分子配合物，按照其结构可分为链状类（DTPA类似物）和大环类（DOTA类似物）。例如Gd-DOTA（Dotarem，多它灵）和Gd-HP-DO3A（ProHance，普络显思），然而此类造影剂的缺点是在人体中代谢缓慢，滞留时间长，可能造成慢性中毒等副作用，因而限制了此类造影剂的应用；最近赵桂燕小组构造了(Gd-DO3A)3-TAB的三核造影剂（Two multinuclear GdIII macrocyclic complexes as contrast agents with highrelaxivity and stability using rigid linkers,Inorg.Chim.Acta,2013,146–152）使得弛豫效率比临床造影剂要高。但通过构造更多核的造影剂，其弛豫效率可以更大地提高，从而进一步减少注射的剂量得到更清晰的对比图像。
发明内容
本发明的目的是提供一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂及其制备方法，该造影剂具有更高的弛豫效率和更好的稳定性。
本发明首先提供一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂，该造影剂具有如下结构：
本发明还提供一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂的制备方法，该方法由以下步骤实现：
步骤一：将2-溴乙酰溴和四苯基甲烷反应，得到四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷；
步骤二：将三-叔丁基2,2',2''-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐（tBu-DO3A·HBr）和NaHCO3混合，得到混合溶液，然后将步骤一得到的四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷加入上述混合溶液中反应，得到四（4-（2-三-（4,7,10-三乙酸叔丁基酯基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基）苯基）甲烷；
步骤三：将步骤二得到的四（4-（（2-三-（4,4',7-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷除去叔丁基保护基团，得到反应产物(DO3A)4-TPM；
步骤四：将步骤三得到的(DO3A)4-TPM与GdCl3溶液反应，得到以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂。
优选的是，所述的2-溴乙酰溴和四苯基甲烷的摩尔比为（4～5）:1
优选的是，所述的NaHCO3与tBu-DO3A·HBr的摩尔比为（8～10）：1。
优选的是，所述的tBu-DO3A·HBr与四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷的摩尔比为（4～5）：1。
优选的是，所述的四（4-（（2-三-（4,4',7-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷除去叔丁基保护基团的具体步骤为：将四（4-（（2-三-（4,4',7-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷溶解于三氟乙酸中，在冰水浴中反应，再继续在室温下反应，然后除去三氟乙酸，得到油状物，将油状物溶解于甲醇中，冷却，向体系中滴加乙醚，得到反应产物(DO3A)4-TPM。
优选的是，所述的冰水浴的反应温度为0℃～5℃，反应时间为30～60分钟。
优选的是，所述的在室温下的反应时间为24～48小时。
优选的是，所述的(DO3A)4-TPM与GdCl3溶液的反应温度为70℃～80℃，反应时间为24～48小时。
优选的是，所述的(DO3A)4-TPM与GdCl3摩尔比为1：（4～4.2）。
发明原理：
本发明以四苯酰基甲烷为连接体的多核非离子型磁共振成像造剂，是在刚性连接基团-四苯酰基甲烷上共价连接四个DO3A基团，再与顺磁性金属离子Gd3+配合而得到的；除了DO3A中的四个氮原子和环上的三个羧酸基参与顺磁离子的配位以外，四苯酰基甲烷中的乙酰羰基也参与配位，这个配位键的形成，既增强了顺磁离子与化合物配合的稳定性，又减少了DO3A螯合基团与连接中心之间的连接体柔性，使DO3A和顺磁离子的旋转与整个分子的旋转更加一致，在客观上延长了顺磁离子的旋转相关时间，使造影剂的弛豫效率提高。
本发明的造影剂在水溶液中稳定存在，且有极好的水溶性，可以按照常规方法使用，方便使用，并且利于贮存，可作为注射液使用，将其静脉注射到诊断对象包括人体或其它哺乳动物体内，然后直接进行磁共振成像检测，即可得到效果增强的磁共振成像图；本发明中的造影剂的给药量因外界条件的不同而有所不同，例如，诊断仪器型号（磁场强弱）、诊断对象用药部位等，临床常用造影剂Gd-DTPA的弛豫效率为3.6±0.2s-1mM-1，与其相比(Gd-DO3A)4-TPM按照单个钆计算的弛豫效率提高88%，因此用药量要比临床小分子偏低。一般来说，作为具有潜在临床应用的造影剂，诊断对象主要为人类或其他哺乳类动物，故用药量可以为每千克体重0.1～0.5毫摩尔。
本发明的有益效果：
1、本发明采用刚性连接体构建多核造影剂，其顺磁离子的旋转与整个分子的旋转较之使用柔性链更加同步，本发明的造影剂与现在临床应用的大环类造影剂Gd-DOTA、Gd-HP-DO3A相比，以单个钆计算提高了88%以上，(Gd-DO3A)4-TPM总的弛豫效率达到27.2mM-1s-1，与三核造影剂(Gd-DO3A)3-TAB相比，提高了50%。
2、本发明的造影剂采用可以提供顺磁离子配位的基团为连接体，通过酮羰基的氧的配位进一步提高了造影剂的稳定性；
3、本发明的造影剂采用大环类DO3A作为螯合钆离子的单体，提高了造影剂的热力学和动力学稳定性并且保证整个造影剂分子呈现电中性，即非离子型造影剂；
4、本发明的造影剂毒性较低，毒性实验结果表明：造影剂(Gd-DO3A)4-TPM用半数抑制浓度(IC50)来表征其毒性大小为15.5毫摩尔/升。
附图说明
图1本发明实施例1制备的造影剂(Gd-DO3A)4-TPM的纵向弛豫速率1/T1随Gd3+浓度变化的线性关系图；
图2为本发明实施例2制备的造影剂(Eu-DO3A)4-TPM的静态磷光谱图；
图3为本发明实施例2制备的造影剂(Eu-DO3A)4-TPM在普通水溶液和氘代水溶液中的磷光衰减曲线图；
图4为本发明实施例2制备的造影剂(Gd-DO3A)4-TPM的紫外-可见吸收谱图；
图5为本发明实施例1制备的造影剂(GdDO3A)4-TPM的质谱图；
图6为本发明实施例3制备的造影剂(GdDO3A)4-TPM的细胞存活率随Gd3+浓度变化的细胞毒性图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明首先提供一种以四苯酰基甲烷为连接体的四核非离子型磁共振成像造影剂，该造影剂是在四苯酰基甲烷上同时共价连接四个DO3A(2,2',2''-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)；每个DO3A再分别与一个顺磁离子Gd3+形成配合物，具有如下结构：
本发明还提供一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂的制备方法，该方法由以下步骤实现：
步骤一：将2-溴乙酰溴和四苯基甲烷反应，得到四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷；
步骤二：将三-叔丁基2,2',2''-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐（tBu-DO3A·HBr）和NaHCO3混合，得到混合溶液，然后将步骤一得到的四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷加入上述混合溶液中反应，得到四（4-（2-三-（4,7,10-三乙酸叔丁基酯基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基）苯基）甲烷；
步骤三：将步骤二得到的四（4-（（2-三-（4,4',7-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷除去叔丁基保护基团，得到反应产物(DO3A)4-TPM；
步骤四：将步骤三得到的(DO3A)4-TPM与GdCl3溶液反应，得到以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂。
按照本发明，步骤一所述的2-溴乙酰溴和四苯基甲烷反应，优选在氮气保护下，先将四苯基甲烷溶解在CS2溶液中，再加入2-溴乙酰溴，然后再加入AlCl3，回流反应，所述的温度优选为50℃～55℃，反应时间优选为24～28小时，反应完成后，除去CS2，加入冰水、浓盐酸、二氯甲烷搅拌直至黑色固体完全溶解；分层萃取，用水，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥；硅胶柱分离得到白色泡沫状固体四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷。所述的2-溴乙酰溴和四苯基甲烷的摩尔比为（4～5）:1，所述的冰水、浓盐酸和二氯甲烷的体积比为（50～70）：（10～15）：（40～60）。
按照本发明，步骤二所述的混合溶液，是将三-叔丁基2,2',2''-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐（tBu-DO3A·HBr）和NaHCO3加入反应管中，加入干燥的乙腈搅拌溶解，得到混合溶液，所述的搅拌时间优选为0.5～1小时，将上述四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷加入到混合溶液中反应，得到反应产物，所述的反应温度优选为80～90℃，反应时间优选为4～8小时，产物用硅胶柱分离，得橙色固体粉末。所述的NaHCO3与tBu-DO3A·HBr的摩尔比优选为（8～10）：1，所述的tBu-DO3A·HBr与四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷的摩尔比优选为（4～5）：1。
按照本发明，所述的四（4-（（2-三-（4,4',7-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷除去叔丁基保护基团的具体步骤为：将四（4-（（2-三-（4,4',7-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷溶解于三氟乙酸中，优选在0℃～5℃冰水浴中反应30～60min，再继续在室温下反应24～48小时，然后除去三氟乙酸，得到油状物，将油状物溶解于甲醇中，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次；接着加入二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，之后逐滴在油状物中滴加甲醇，直至得到的油状物全部溶解，冷却至0℃～5℃，向体系中滴加乙醚，直至沉淀完全，过滤，真空干燥得褐色粉末状固体(DO3A)4-TPM。
按照本发明，所述的(DO3A)4-TPM与GdCl3溶液反应，优选先将(DO3A)4-TPM加入二次水溶解，滴加碱溶液至(DO3A)4-TPM水溶液PH值为6.5-7.5，将GdCl3溶液加入(DO3A)4-TPM水溶液中反应，以保证钆离子螯合完全，二甲基酚橙检测无游离钆离子。所述的(DO3A)4-TPM与GdCl3摩尔比为1：（4～4.2），所述碱溶液为NaOH溶液。所述反应温度优选为70℃～80℃，反应时间优选为24～48小时。
所述的以四苯酰基甲烷为连接体的四核非离子型磁共振成像造影剂合成路线如下：
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
第一步：四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷的合成
氮气保护下，将0.8g四苯基甲烷溶解于30mLCS2中，再加入2.5g2-溴乙酰溴，然后加入1.7gAlCl3，回流，在50℃下反应28h，倒掉CS2，加入25g冰水、7mL浓盐酸、25mL二氯甲烷搅拌直至黑色固体完全溶解；分层萃取，加水及饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过硅胶柱，流动相为二氯甲烷：正己烷=20:1，最后得到白色泡沫状固体四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷1.4g。
第二步：四（4-（2-三-（4,7,10-三乙酸叔丁基酯基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基）苯基）甲烷的合成
在20mL反应管中加入1.6g三-叔丁基2,2',2''-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐（tBu-DO3A·HBr）和1.8gNaHCO3，然后加入5mL乙腈，搅拌30min；在此混合溶液中加入0.54g四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷，加热回流在90℃下反应4h，滤掉无机盐，硅胶柱分离，使用二氯甲烷：甲醇10:1淋洗剂冲洗，得到橙色固体0.8g。
第三步：四（4-（（2-三-（4,7,10-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷
氮气保护下，将0.8g四（4-（2-三-（4,7,10-三乙酸叔丁基酯基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基）苯基）甲烷溶解于20mL三氟乙酸中，于0℃下搅拌1小时，撤去冰水浴，在室温下继续反应48小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸得到油状物，加入30mL甲醇溶解，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次；接着加入30mL二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，之后逐滴在油状物中滴加甲醇，直至得到的油状物全部溶解，冷却至0℃，向体系中缓慢滴加乙醚，直至沉淀完全，过滤，真空干燥得0.6g褐色粉末状固体(DO3A)4-TPM（含少量三氟乙酸）。
步骤四：与钆离子螯合
称取0.029g步骤三得到的(DO3A)4-TPM加入5mL二次水溶解，滴加NaOH碱溶液调PH值为6.5-7.5，加入120uL0.3313mol/LGdCl3水溶液，于80℃下反应24小时，二甲基酚橙检测无游离钆离子，最后得到橙黄色溶液以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂。
图1为本发明实施例1制备的造影剂(GdDO3A)4-TPM的纵向弛豫速率1/T1随Gd3+浓度变化的线性关系图，从图中可知，(GdDO3A)4-TPM在20MHz，37℃条件下整个分子的弛豫效率计算为27.2mM-1s-1，与现在临床应用的大环类造影剂Gd-DOTA（Dotarem，多它灵），Gd-HP-DO3A（3.8mM-1s-1）（ProHance，普络显思）相比，单个钆的弛豫效率提高了88%。
图5为本发明实施例1制备的造影剂(GdDO3A)4-TPM的质谱图，从图可以看出，本发明成功的合成了以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂。
实施例2
第一步：四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷的合成
氮气保护下，将1.6g四苯基甲烷溶解于60mLCS2中，再加入5g2-溴乙酰溴，最后加入3.4gAlCl3，回流，在50℃下反应25h，倒掉CS2，加入50g冰水、13mL浓盐酸、50mL二氯甲烷搅拌直至黑色固体完全溶解；分层萃取，加水及饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过硅胶柱，流动相为二氯甲烷：正己烷=20:1，最后得到白色泡沫状固体四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷2.6g。
第二步：四（4-（2-三-（4,7,10-三乙酸叔丁基酯基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基）苯基）甲烷的合成
在50mL圆底烧瓶中加入3.2g三-叔丁基2,2',2''-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐（tBu-DO3A·HBr）和4gNaHCO3，然后加入10mL乙腈，搅拌40min；在此混合溶液中加入1.1g四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷，加热回流，在85℃下反应6h，滤掉无机盐，硅胶柱分离，使用二氯甲烷：甲醇10:1淋洗剂冲洗，得到橙色固体1.5g。
第三步：四（4-（（2-三-（4,7,10-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷
氮气保护下，将1.5g四（4-（2-三-（4,7,10-三乙酸叔丁基酯基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基）苯基）甲烷溶解于37mL三氟乙酸中，于0℃下搅拌1小时，撤去冰水浴，在室温下继续反应36小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸得到油状物，加入30mL甲醇溶解,再减压蒸馏除去甲醇，重复三次；接着加入30mL二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，之后逐滴在油状物中滴加甲醇，直至得到的油状物全部溶解，冷却至0℃，向体系中缓慢滴加乙醚，直至沉淀完全，过滤，真空干燥得1.1g褐色粉末状固体(DO3A)4-TPM（含少量三氟乙酸）。
步骤四：与钆离子螯合
称取0.0726g步骤三得到的(DO3A)4-TPM加入5mL二次水溶解，滴加NaOH碱溶液调PH值为6.5-7.5，加入301uL0.3313mol/LGdCl3水溶液，于70℃下反应42小时，二甲基酚橙检测无游离钆离子，最后得到橙黄色溶液以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂。
实施例2制备的造影剂的总弛豫效率在20MHz，pH7，温度为37℃的条件下以钆离子浓度计算为27.5mM-1s-1。
图2本发明实施例2制备的造影剂(EuDO3A)4-TPM的静态磷光谱图。通过铕离子（Eu3+）取代的化合物(EuDO3A)4-TPM来代替研究(GdDO3A)4-TPM的静态磷光性质。虚线部分为采用Eu的特征光谱694nm作为发射波长时扫出的最佳吸收谱图，实线部分代表以290nm作为激发波长时扫出的配合物的发射光谱，从而选出最佳的激发波长为290nm。
图3本发明实施例2制备的造影剂(EuDO3A)4-TPM在普通水溶液和氘代水溶液中的磷光衰减曲线图。通过铕离子（Eu3+）取代的配合物来代替研究(GdDO3A)4-TPM的动态磷光性质。通过配合物在不同溶液中的衰减计算配合物在不同溶液中的荧光寿命，可见表1。由计算得到的荧光寿命结合下面（1）公式计算可以得到内配层水分子数目q为1。
qEu=1.2*(1/τlum;H2O-1/τlum;D2O-0.25)   （1）
表1(EuDO3A)4-TPM在普通水溶液和氘代水溶液中的磷光寿命及配位水分子数
图4为本发明实施例2制备的造影剂(GdDO3A)4-TPM的紫外-可见吸收谱图。由图可知，与配体的谱图（DO3A)4-TPM（■）相比，造影剂(GdDO3A)4-TPM（●）的吸收谱向长波长移动。以4：1的DTPA与(GdDO3A)4-TPM混合后，在室温下共存超过45天，其吸收谱（▲）仍旧与钆离子存在的(GdDO3A)4-TPM吻合，表明DTPA不能夺取(GdDO3A)4-TPM中的钆离子，从而说明(GdDO3A)4-TPM与Gd-DTPA相比具有更高的稳定性。
将(GdDO3A)4-TPM分别与Zn2+,Ca2+和Cu2+混合，连续观察混合物的紫外-可见吸收光谱超过6个星期，混合物的光谱仍然分别与(GdDO3A)4-TPM的特征谱重叠，显示没有钆离子从造影剂中解离，说明(GdDO3A)4-TPM其动力学稳定性足以满足人体内应用的需要。
实施例3
第一步：四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷的合成
氮气保护下，将2g四苯基甲烷溶解于75mLCS2中，再加入6.3g2-溴乙酰溴，最后加入4.3gAlCl3，回流，在55℃下反应24h，倒掉CS2，加入65g冰水、16mL浓盐酸、65mL二氯甲烷搅拌直至黑色固体完全溶解；分层萃取，加水及饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过硅胶柱，流动相为二氯甲烷：正己烷=20:1，最后得到白色泡沫状固体四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷3.4g。
第二步：四（4-（2-三-（4,7,10-三乙酸叔丁基酯基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基）苯基）甲烷的合成
在50mL圆底烧瓶中加入3.4g三-叔丁基2,2',2''-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐（tBu-DO3A·HBr）和4.3gNaHCO3，然后加入12mL乙腈，搅拌0.5h；在此混合溶液中加入1.2g四-（4-（溴乙酰基）苯基）甲烷，加热回流在80℃下反应8h，滤掉无机盐，硅胶柱分离，使用二氯甲烷：甲醇10:1淋洗剂冲洗，得到橙色固体1.6g。
第三步：四（4-（（2-三-（4,7,10-三乙酸基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基）乙酰基）苯基）甲烷
氮气保护下，将2g四（4-（2-三-（4,7,10-三乙酸叔丁基酯基）1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基）苯基）甲烷溶解于50mL三氟乙酸中，于5℃下搅拌30mim，撤去冰水浴，在室温下继续反应24小时，停止反应后，减压蒸馏除掉溶剂三氟乙酸得到油状物，加入30mL甲醇溶解，再减压蒸馏除去甲醇，重复三次；接着加入30mL二氯甲烷，减压蒸馏除去二氯甲烷，重复三次，之后逐滴在油状物中滴加甲醇，直至得到的油状物全部溶解，冷却至5℃，向体系中缓慢滴加乙醚，直至沉淀完全，过滤，真空干燥得1.56g褐色粉末状固体(DO3A)4-TPM（含少量三氟乙酸）。
步骤四：与钆离子螯合
称取0.1469g步骤三得到的(DO3A)4-TPM加入5mL二次水溶解，滴加NaOH碱溶液调PH值为6.5-7.5，加入602uL0.3313mol/LGdCl3水溶液，于75℃下反应48小时，二甲基酚橙检测无游离钆离子，最后得到橙黄色溶液橙黄色溶液以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂。
实施例3制备的造影剂的总弛豫效率在20MHz，pH7，温度为37℃的条件下以钆离子浓度计算为26.9mM-1s-1。
实施例4造影剂(GdDO3A)4-TPM对人子宫颈癌细胞株(HeLa)细胞的毒性实验
1.收集对数期HeLa细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200uL，铺板使待测细胞调密度至3000个/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）；
2.于5%CO2，37℃孵育，直至细胞单层铺满96孔平底板孔底，贴壁，加入实施例3制备的造影剂(GdDO3A)4-TPM，所述的造影剂浓度梯度范围为0.08毫摩尔每升至20毫摩尔每升的药物，每孔100uL，设5个复孔，用10%胎牛血清的培养液培养；
3.继续于5%CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察；
4.弃去培养液，用PBS冲洗3遍，再加入含0.5%MTT的培养液100uL，继续培养4h；
5.终止培养，小心吸去孔内培养液；
6.每孔加入150uL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值；
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
图6为本发明实施例3制备得到(GdDO3A)4-TPM的细胞存活率随Gd3+浓度变化的细胞毒性图。由此实验得出，造影剂(GdDO3A)4-TPM24小时半数细胞致死浓度（IC50，衡量药物诱导凋亡的参数,即诱导能力越强,该数值越低,也可以反向说明靶细胞对药物的耐受程度越低)为15.5毫摩尔/升。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂，其特征在于，该造影剂具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，该方法由以下步骤实现：
步骤一：将2-溴乙酰溴和四苯基甲烷反应，得到四-(4-(溴乙酰基)苯基)甲烷；所述的2-溴乙酰溴和四苯基甲烷的摩尔比为(4～5):1；
步骤二：将三-叔丁基2,2',2″-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐和NaHCO3混合，得到混合溶液，然后将步骤一得到的四-(4-(溴乙酰基)苯基)甲烷加入上述混合溶液中反应，得到四(4-(2-三-(4,7,10-三乙酸叔丁基酯基)1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基)苯基)甲烷；所述的NaHCO3与三-叔丁基2,2',2″-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐的摩尔比为(8～10)：1；所述的三-叔丁基2,2',2″-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯·溴化氢盐酸盐与四-(4-(溴乙酰基)苯基)甲烷的摩尔比为(4～5)：1；
步骤三：将步骤二得到的四(4-(2-三-(4,7,10-三乙酸叔丁基酯基)1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基)苯基)甲烷除去叔丁基保护基团，得到反应产物(DO3A)4-TPM；
步骤四：将步骤三得到的(DO3A)4-TPM与GdCl3溶液反应，得到以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂；所述的(DO3A)4-TPM与GdCl3摩尔比为1：(4～4.2)。
3.根据权利要求2所述的一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，所述的四(4-(2-三-(4,7,10-三乙酸叔丁基酯基)1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基)苯基)甲烷除去叔丁基保护基团的具体步骤为：将四(4-(2-三-(4,7,10-三乙酸叔丁基酯基)1,4,7,10-四氮杂环十二烷基乙酰基)苯基)甲烷溶解于三氟乙酸中，在冰水浴中反应，再继续在室温下反应，然后除去三氟乙酸，得到油状物，将油状物溶解于甲醇中，冷却，向体系中滴加乙醚，得到反应产物(DO3A)4-TPM。
4.根据权利要求3所述的一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，所述的冰水浴的反应温度为0℃～5℃，反应时间为30～60分钟。
5.根据权利要求3所述的一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，所述的在室温下的反应时间为24～48小时。
6.根据权利要求2所述的一种以四苯酰基甲烷为连接体的非离子型多核磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于，所述的(DO3A)4-TPM与GdCl3溶液的反应温度为70℃～80℃，反应时间为24～48小时。
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