CN103608048A - 医疗材料 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供医疗材料，其表面稳固地固定有保持抗凝血活性状态下的化合物，该化合物能够阻碍血小板参与的一次止血阶段和凝血因子参与的凝血血栓形成阶段这两个阶段的凝血反应。本发明提供医疗材料，其表面固定有亲水性高分子化合物，所述亲水性高分子化合物是下述通式（I）所示的化合物与选自乙二醇、醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、丙二醇、乙烯醇和硅氧烷中的单体的共聚物键合而成的。

Description

医疗材料

技术领域

本发明涉及医疗材料。

背景技术

用于将血液凝固所需的凝血反应是多种凝血因子参与的极其复杂的反应，可以认为血小板参与的一次止血阶段和凝血酶之类的凝血因子进行参与而将纤维蛋白稳定强化的凝血血栓形成阶段是特别重要的。

凝血反应对于止住由受伤等引起的出血而言是不可或缺的，另一方面，在人工透析或使用了导管、支架以及人工血管等医疗材料的手术中，通过血液与医疗材料等的接触而使凝血反应推进时，还存在因所形成的血块、凝血血栓而产生循环压力的上升、血流阻碍或血管闭塞的危险性。

作为减轻这些危险性的方法，已知有对要接受人工透析的患者预先施予作为抗凝血剂的肝素从而防止凝血的方法，但存在过量施予肝素时有副作用、给药量的管理繁杂、对于具有出血倾向的患者无法适用等多个问题。另外，在使用了导管等医疗材料的手术中，根据需要使用肝素、尿激酶等血栓溶解剂，但有时使用这些会增加患者的出血倾向。

最近，为了规避这些问题，报告有如下尝试：将包括肝素在内的具有抗凝血作用的化合物固定在血液回路等医疗材料的表面，用以防止治疗中的凝血（专利文献1~9）。

现有技术文献 

专利文献 

专利文献1：日本特表2003-507082号公报

专利文献2：日本特开2001-213984号公报

专利文献3：日本特表2004-525888号公报

专利文献4：日本特开2006-291193号公报

专利文献5：国际公开第08/032758号公报

专利文献6：日本特开2009-225824号公报

专利文献7：日本特开2010-082067号公报

专利文献8：日本特开2007-181691号公报

专利文献9：日本特开2007-181692号公报。

发明内容

发明要解决的问题

然而，现状是尚未开发出在表面固定能够阻碍血小板参与的一次止血阶段和凝血因子参与的凝血血栓形成阶段这两个阶段的凝血反应的化合物而成的医疗材料。另外，以往的表面固定具有抗凝血作用的化合物而成的医疗材料存在如下问题：化合物在保持充分的抗凝血活性的状态下不会被固定，在治疗中被固定的化合物离开医疗材料而向血液中溶出。进而，为了阻碍血小板参与的一次止血阶段和凝血因子参与的凝血血栓形成阶段这两个阶段的凝血反应而使用多个化合物时，需要控制化合物间的竞争吸附、固定化比率，用于获得表面固定这些化合物而成的医疗材料的操作极其繁杂。

因而，本发明的目的在于提供医疗材料，其表面稳固地固定有保持了抗凝血活性状态的化合物，该化合物能够阻碍血小板参与的一次止血阶段和凝血因子参与的凝血血栓形成阶段这两个阶段的凝血反应。

用于解决问题的手段

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：表面固定亲水性高分子化合物而成的医疗材料显示出显著的抗凝血作用，且亲水性高分子化合物相对于医疗材料的表面稳固地固定，所述亲水性高分子化合物是由具有抗凝血酶活性的特定化合物与阻碍血小板附着的共聚物键合而成的。

即，本发明提供医疗材料，其表面固定有亲水性高分子化合物，所述亲水性高分子化合物由下述通式（I）所示的化合物、与选自乙二醇、醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、丙二醇、乙烯醇和硅氧烷中的单体的共聚物键合而成，

[化1]

[式中，R¹表示（2R,4R）-4-烷基-2-羧基哌啶基，R²表示苯基或稠合多环式化合物残基，该稠合多环式化合物残基可以被低级烷基或低级烷氧基或氨基取代，所述氨基被低级烷基取代。]。

上述共聚物优选为聚醚改性有机硅。

上述通式（I）所示的化合物优选为（2R,4R）-4-甲基-1-（（2S）-2-｛[（3RS）-3-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-8-基]磺酰基｝氨基-5-胍基戊酰基）哌啶-2-羧酸。

作为上述医疗材料的原材料，例如可列举出纤维素、纤维素醋酸酯、聚碳酸酯、聚砜（以下记为“PSf”）、聚醚砜、聚甲基丙烯酸甲酯（以下记为“PMMA”）等聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚酰亚胺或聚四氟乙烯等，优选为聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、PMMA、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、PSf。

作为上述医疗材料，例如可列举出嵌入型人工器官、人工血管、导管、支架、血袋、血液回路、人工肺、人工心肺、器官抗粘连膜（organ adhesion preventive film）、隐形眼镜、人工晶体或手术用辅助器具或者在生物体成分分离用组件或血液净化用组件等中内置的中空纤维膜等分离膜或吸附剂，优选为中空纤维膜。

另外，本发明提供血液净化用组件，其填充有表面固定有上述亲水性高分子化合物的中空纤维膜。

发明的效果

根据本发明，能够提供医疗材料，其表面稳固地固定有保持抗凝血活性状态下的亲水性高分子化合物，该亲水性高分子化合物显著地阻碍血小板参与的一次止血阶段和凝血因子参与的凝血血栓形成阶段这两个阶段的凝血反应。

附图说明

图1是表示实施例中制作的微型组件的简图。

图2是体外血液循环试验的封闭体系回路的简图。

图3是亲水性高分子化合物的溶出量的测定中的、人血浆循环回路的简图。

图4是表示使用了PSf和PMMA中空纤维膜微型组件的、未添加抗凝血剂条件下的体外血液循环试验结果的图。

具体实施方式

本说明书中使用的用语在没有特别说明的情况下如下定义。

本发明的医疗材料所固定的“亲水性高分子化合物”的“亲水性”是指化合物为水溶性的、或者即使为非水溶性也会因静电相互作用或氢键而与水分子相互作用。

作为“选自乙二醇、醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、丙二醇、乙烯醇和硅氧烷中的单体的共聚物”（以下记为“抗血小板附着共聚物”），例如可列举出由聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙二醇、聚醚和聚硅氧烷组成的高分子化合物、或这些高分子化合物的单体与其它单体的共聚物或接枝体，优选为由亲水性高的聚醚与聚硅氧烷组成的高分子化合物、部分皂化聚乙烯醇或乙烯基吡咯烷酮与醋酸乙烯酯的共聚物。

作为“由聚醚与聚硅氧烷组成的高分子化合物”，例如可列举出聚醚与聚硅氧烷的共聚物、聚合物复合物（polymer complexes）或聚合物共混物。聚醚与聚硅氧烷的共聚物由聚醚单元和聚硅氧烷单元组成，这些共聚形态可以是无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物中的任意种，其中，优选为亲水性高的聚醚改性有机硅。

“聚醚”是指例如可列举出源自聚环氧乙烷或聚环氧丙烷的结构。此处，“聚醚”是指通式（II）所示的结构（R³表示碳原子数为6以下的烷基），聚醚的一例即“源自聚丙二醇的结构”是指通式（III）所示的结构。

[化2]

[化3]

。

“聚醚改性有机硅”是指有机硅链的侧链键合有聚醚单元的有机硅，也可以是进一步进行了氨基改性、羧基改性的聚醚改性有机硅。

抗血小板附着共聚物为部分皂化聚乙烯醇时，从使处理容易性或亲水性变得适合的观点出发，其皂化度优选为50~不足100mol%，更优选为74~99.9mol%，进一步优选为78~95mol%。此处，“皂化度”是指通过式1算出的数值。  

皂化度 = m/（n＋m）×100 ??????式1

m：聚乙烯醇中的、通式（IV）所示的结构的数量

n：聚乙烯醇中的、通式（V）所示的结构的数量。

[化4]

[化5]

。

抗血小板附着共聚物为乙烯基吡咯烷酮与醋酸乙烯酯的共聚物时，从使处理容易性或亲水性变得适合的观点出发，乙烯基吡咯烷酮单元优选为50单元摩尔%以上，更优选为60单元摩尔%以上。另一方面，从使相对于医疗材料的固定化量变得适合的观点出发，乙烯基吡咯烷酮单元优选不足100单元摩尔%。需要说明的是，在乙烯基吡咯烷酮与醋酸乙烯酯的共聚物中，乙烯基吡咯烷酮单元所占的比例（单元摩尔%）可以通过对共聚物进行¹H-NMR测定（溶剂：CDCl₃）来算出。

医疗材料的表面的抗血小板附着共聚物的吸附量优选为0.1pg/mm²以上、更优选为1pg/mm²以上、进一步优选为10pg/mm²以上。

上述吸附量通过以下方法进行测定。首先，将未处理的传感器芯片（Sensor Chip Au；GE Healthcare）用表面等离子共振装置（以下记为“SPR”）（BIACORE3000；GE Healthcare）进行前处理（25℃的蒸馏水、流速20μl/min、10分钟），测定其信号值（RU：共振单元）。

将医疗材料的原材料、即被固定化原材料溶解在溶剂中，制备0.5重量%的被固定化原材料溶液。将1滴该被固定化原材料溶液滴加至安装于旋涂机的进行了前处理的传感器芯片的金膜部分的中心，使其在室温下立即以3000rpm旋转1分钟，使被固定化原材料被覆传感器芯片。

确认在传感器芯片上没有液滴后，用SPR对传感器芯片进行蒸馏水洗涤（25℃、流速20μl/min、10分钟），进而用0.025重量%Triton-X100溶液洗涤3次（25℃、流速20μl/min、1分钟），测定洗涤结束10分钟后的信号值。

从进行上述操作而得到的传感器芯片之中，选择旋涂前后的信号值之差在3000~8000的范围内的芯片，用蒸馏水进行洗涤（25℃、流速20μl/min、10分钟），进而用0.025重量%Triton-X100溶液洗涤3次（25℃、流速20μl/min、1分钟）。

在洗涤结束10分钟后，注入要吸附于医疗材料的亲水性高分子化合物水溶液（浓度：100μg/ml）（25℃、流速20μl/min、1分钟），用蒸馏水进行洗涤（25℃、流速20μl/min、3分钟）。求出刚开始注入前的信号值（以下记为“信号值A”）和注入结束3分钟后的信号值（以下记为“信号值B”）之差，以1RU=1pg/mm²的形式进行换算。

接着，用蒸馏水进行洗涤（25℃、流速20μl/min、2分钟），进而用0.025重量%Triton-X100溶液洗涤3次（25℃、流速20μl/min、1分钟），再次注入要吸附的亲水性高分子化合物水溶液（浓度：100μg/ml）（25℃、流速20μl/min、1分钟）。以后，重复同样的操作，求出共计5次的信号差（信号值A与信号值B之差），将其平均值作为抗血小板附着共聚物相对于医疗材料的吸附量。

作为含有具有胍基结构的化合物的化合物即“通式（I）所示的化合物”，例如优选为（2R,4R）-4-甲基-1-（（2S）-2-｛[（3RS）-3-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-8-基]磺酰基｝氨基-5-胍基戊酰基）哌啶-2-羧酸（以下记为“阿加曲班”）。阿加曲班是1978年合成的具有精氨酸衍生物的选择性抗凝血酶活性的医药化合物。此处，“具有抗凝血酶活性”是指与凝血酶的键合亲和性高，作为评价化合物的抗凝血酶活性的指标，例如可列举出基于被检溶液的吸光度值由米氏方程与双倒数作图（Lineweaver-Burk plot）算出的阻碍常数（以下记为“Ki”）。Ki越小则表示与凝血酶的键合亲和性高、抗凝血酶活性越高。Ki优选为10μM以下、进一步优选为1μM以下、更进一步优选为500nM以下。具有抗凝血酶活性的化合物可以单独使用，也可以组合2种以上使用。

作为将上述的亲水性高分子化合物固定于医疗材料的表面的方法，例如可列举出预先使医疗材料与以上述亲水性化合物作为有效成分的表面处理剂接触，并向其照射放射线的方法。需要说明的是，作为要照射的放射线的种类，优选为电子束或γ射线。在难以进行照射放射线的方法的情况下，例如可以采用将溶解或分散于乙醇、甲醇等有机溶剂中的上述亲水性化合物喷雾或涂布在医疗材料的表面并使其干燥的方法。

实施例

以下，列举出实施例来详细说明本发明，但本发明不受它们的限定。

（实施例1）

1.氨基·聚醚改性有机硅与阿加曲班的键合：

取阿加曲班5mmol置于茄形烧瓶中，添加10mL脱水二甲基甲酰胺（以下记为“脱水DMF”）并溶解后，边将茄形烧瓶进行冰冷边滴加10mL 4N盐酸/1,4-二噁烷（东洋化成株式会社），搅拌1小时。接着，用旋转蒸发仪蒸馏去除溶剂，进而在真空干燥机中干燥一晚，向该干燥物中添加脱水DMF 25mL，制成阿加曲班盐酸盐/脱水DMF溶液。

以表1所示的量向两口烧瓶中采取阿加曲班盐酸盐/脱水DMF溶液，边在冰冷下搅拌边分别添加二环己基碳二亚胺（以下记为“DCC”）/脱水DMF溶液和4-羟基苯并三唑（以下记为“HOBt”）/脱水DMF溶液，进而添加聚醚改性有机硅（X-22-3939A；信越化学株式会社），在室温下反应3天。接着，将反应液投入透析管（Spectra/Por RC Pore 6 MWCO=1000）中，在超过反应液的10倍体积量的蒸馏水中边适当交换蒸馏水边进行3天透析。将透析后的反应液过滤，用旋转蒸发仪蒸馏去除滤液的溶剂后，在真空干燥机中干燥一晚，从而得到亲水性高分子化合物（以下记为“实施例1化合物”）。

2.实施例1化合物的抗凝血酶活性的测定：

测定使用ECA-T试剂盒（HaemoSys公司）。向实施例1化合物100μL中添加蒸馏水900μL，从而制备实施例1化合物水溶液。采取实施例1化合物水溶液30μL，与ECA 凝血酶原缓冲液（ECA prothrombin buffer） 100μL和ECA-T底物 25μL混合，在37℃下孵育60秒钟，然后置于装置（COATRON M1（编号 80 800 000）；Production公司）中，进一步添加ECA ecarin 试剂 50μL并进行测定。

用使用乙醇/盐酸（体积比率4/1）混合溶剂制备成任意浓度的阿加曲班溶液20μL与人血浆80μL混合而成的液体、或者将空白的蒸馏水20μL与人血浆80μL混合而成的液体来代替上述实施例1化合物水溶液，使用ECA-T试剂盒分别进行测定，由它们的结果制作标准曲线。将基于标准曲线算出的实施例1化合物水溶液的以阿加曲班计浓度1494.3重量ppm作为实施例1化合物水溶液的显示抗凝血酶活性的值。

3.实施例1化合物的凝血酶阻碍常数的测定：

将牛凝血酶液（Ito Life Science Inc.）10000U溶于生理盐水1mL中，制备牛凝血酶水溶液。

将S-2238原液（Sekisui Medical Co., Ltd.）25mg溶于蒸馏水40mL中，制备S-2238原液水溶液。

使用稀释缓冲液（0.05M Tris、0.1M NaCl、1mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、pH 7.4），分别稀释牛凝血酶水溶液、S-2238原液水溶液以及上述实施例1化合物水溶液。

向96孔板中分配S-2238原液水溶液的稀释液100μL和实施例1化合物水溶液的稀释液50μL，进行密封并用设定为37℃的恒温干燥机加热30分钟。接着，进一步分配以37℃加热30分钟的牛凝血酶水溶液的稀释液50μL，立即用酶标仪（测定波长405nm、参照波长595nm）测定其吸光度。

第一次吸光度测定结束后，立即进行第二次吸光度测定。第三次及以后的吸光度测定分别在注入牛凝血酶水溶液的稀释液开始4、6、8、10、12、14、16、18、20分钟后进行。由所得各吸光度的值利用米氏方程与双倒数作图算出Ki。实施例1化合物的Ki为11nM。

需要说明的是，针对聚醚改性有机硅（X-22-3939A）也同样地算出Ki，但不具有抗凝血酶活性的聚醚改性有机硅的Ki果然与空白呈现同样的值。

进而，针对阿加曲班也同样地算出Ki，结果Ki为39nM，与实施例1化合物的Ki相比时，呈现3倍以上的数值。

由这些结果可以明确：上述亲水性高分子化合物与凝血酶的键合亲和性极高，能够对以中空纤维膜为首的医疗材料赋予明显超过已知具有抗凝血酶活性的阿加曲班的显著的抗凝血酶活性。

（实施例2~13）

除了变更DCC、HOBt以及聚醚改性有机硅（X-22-3939A）相对于阿加曲班盐酸盐的摩尔比、以及脱水DMF相对于聚醚改性有机硅的体积比率之外，用与实施例1同样的方法分别得到实施例2~13化合物，测定它们的抗凝血酶活性。DCC、HOBt以及聚醚改性有机硅（X-22-3939A）相对于阿加曲班盐酸盐的摩尔比以及实施例2~13化合物各自的抗凝血酶活性的测定结果示于表1。

[表1]

需要说明的是，针对聚醚改性有机硅（X-22-3939A）也同样地测定抗凝血酶活性，其值与空白的蒸馏水没有区别，可以确认聚醚改性有机硅自身不具有抗凝血酶活性。

（PMMA中空纤维的制作）

将等规-PMMA 5重量份和间规-PMMA 20重量份添加至二甲基亚砜75重量份中，以110℃搅拌8小时而得到制膜原液。将该制膜原液从口型双层圆筒型管头喷出，在空气中通过300mm后，导入水100%的凝固浴中，得到内径0.2mm、膜厚0.03mm的PMMA中空纤维。需要说明的是，作为内部注入气体使用干燥氮气。

（PSf中空纤维的制作）

将PSf（Solvay S.A.制造的Udel（注册商标）P-3500）18重量份和PVP（BASF公司制造的K30）9重量份加入至DMAc 72重量份与水1重量份的混合溶剂中，以90℃加热14小时并溶解，得到制膜原液。另外，准备由DMAc58重量份和水42重量份的芯液。使用环状狭缝部分的外径为0.3mm、内径为0.2mm的口型双层圆筒型管头，分别从外侧的管喷出制膜原液、从内侧的管喷出芯液，导入处于距离管头为350mm的位置的水100%的凝固浴中，得到PSf中空纤维。

（PMMA中空纤维膜微型组件的制作）

准备内径10mm、长度120mm的组件盒，其与通常的中空纤维型透析器同样地分别具有通向中空纤维的内侧的端口（血液端口）和通向外侧的端口（透析液端口）各2个。

将50根上述PMMA中空纤维成束而制成PMMA中空纤维膜，边留意不使PMMA中空纤维膜的中空部闭塞边将其两末端用环氧系灌封剂固定于上述的组件盒，然后将PMMA中空纤维膜和组件盒内部用蒸馏水洗涤，得到图1所示的微型组件6。

用超纯水溶解，以使Bis-Tris（同仁化学株式会社）和氯化钠的最终浓度分别达到0.25M和0.5M，向其中滴加6N盐酸，调整至pH5，制备5倍浓度的Bis-Tris缓冲液。

利用压缩空气去除所制作的微型组件6的血液接触侧（PMMA中空纤维膜内侧）与非血液接触侧（PMMA中空纤维膜外侧）残留的蒸馏水。接着，将以阿加曲班计浓度为10000重量ppm的实施例1化合物水溶液、丙二醇、5倍浓度的Bis-Tris缓冲液以及蒸馏水以体积比率4/3/2/1进行混合，得到填充液。

将上述填充液400μL使用注射器仅填充于微型组件6的血液接触侧。其后，利用压缩空气去除填充液，然后对将血液端口1a、1b和透析液端口2a、2b全部密封了的微型组件6照射约3小时的吸收剂量为25kGy的γ射线。

使用蠕动泵8，向PMMA中空纤维膜4和微型组件6的内部以10mL/min的流速通液8小时的0.025重量%聚氧乙烯辛基苯基醚水溶液，洗涤PMMA中空纤维膜4和微型组件6的内部。其后，将蒸馏水和生理盐水均以10mL/min的流速各通液30分钟，进一步进行洗涤，制作固定有实施例1化合物的微型组件（以下记为“PMMA中空纤维膜微型组件1”）。

将以阿加曲班计浓度为10000重量ppm的实施例1化合物水溶液、丙二醇、5倍浓度的Bis-Tris缓冲液以及蒸馏水以表2所示的体积比率进行混合，分别制备填充液。除了使用所制备的各填充液以外，与上述进行同样的操作，分别制作固定有实施例1化合物的微型组件（“PMMA中空纤维膜微型组件2”~“PMMA中空纤维膜微型组件4”）。

[表2]

（PSf中空纤维膜微型组件的制作）

除了将PMMA中空纤维替换为PSf中空纤维以外，与上述进行同样的操作，得到固定有实施例1化合物的微型组件（以下记为“PSf中空纤维膜微型组件”）。

利用压缩空气去除另行制作的微型组件6的血液接触侧（PSf中空纤维膜内侧）与非血液接触侧（PSf中空纤维膜外侧）残留的蒸馏水。接着，将以阿加曲班计浓度为10000重量ppm的实施例1化合物水溶液、丙二醇、5倍浓度的Bis-Tris缓冲液以及蒸馏水以体积比率4/3/2/1进行混合，得到填充液。

将上述填充液400μL使用注射器仅填充于微型组件6的血液接触侧。其后，利用压缩空气去除填充液，然后对将血液端口1a、1b和透析液端口2a、2b全部密封的微型组件6照射约3小时的吸收剂量为25kGy的γ射线。

使用蠕动泵8，向PSf中空纤维膜4和微型组件6的内部以10mL/min的流速通液8小时的0.025重量% 聚氧乙烯辛基苯基醚水溶液，洗涤PSf中空纤维膜4和微型组件6的内部。其后，将蒸馏水和生理盐水均以10mL/min的流速各通液30分钟，进一步进行洗涤，制作固定有实施例1化合物的微型组件（以下记为“PSf中空纤维膜微型组件1”）。

将以阿加曲班计浓度为10000重量ppm的实施例1化合物水溶液、丙二醇以及5倍浓度的Bis-Tris缓冲液以表3所示的体积比率进行混合，分别制备填充液。除了使用所制备的各填充液以外，与上述进行同样的操作，分别制作固定有实施例1化合物的微型组件（“PSf中空纤维膜微型组件2”~“PSf中空纤维膜微型组件5”）。

[表3]

另一方面，除了使用聚醚改性有机硅（X-22-3939A）来代替以阿加曲班计浓度为10000重量ppm的实施例1化合物水溶液以外，与上述进行同样的操作，得到固定有聚醚改性有机硅的微型组件（以下记为“比较例1微型组件”）。

（体外血液循环试验）

将志愿者提供的血液与柠檬酸以体积比率9/1进行混合，得到柠檬酸加血。将相对于柠檬酸加血1mL添加了作为促凝剂的葡萄糖酸钙（calcicol） 43.6μL而成的液体作为被检血液。

将硅管7a、7b连接于PMMA中空纤维膜微型组件1，在硅管7b的途中设置蠕动泵8。从与血液端口1a连接的硅管7a以0.9mL/min的流量通液5秒钟的被检血液，将从血液端口1b流出的被检血液从硅管7b废弃，去除PMMA中空纤维膜内部的气泡。接着，将硅管7a与7b用包接部9连接，制作图2所示的封闭体系回路。

以0.9mL/min的流量开始被检血液的循环，由于回路内生成的凝血血栓，回路内压上升，测定截止至硅管7a或7b离开包接部9为止的循环持续时间。使用PMMA中空纤维膜微型组件1时的循环持续时间为35分钟。另外，使用PSf中空纤维膜微型组件1进行相同条件的评价时的循环持续时间为41分钟。

分别使用PMMA中空纤维膜微型组件2~4和PSf中空纤维膜微型组件2~5来代替PMMA中空纤维膜微型组件1，进行与上述同样的体外血液循环试验，结果示于图4。PMMA中空纤维膜微型组件中，填充液中的实施例1化合物溶液的体积比率超过一定值时，循环持续时间达到极限，与此相对，PSf中空纤维膜微型组件未观察到这样的倾向，能够持续适当地延长循环持续时间。

准备PMMA中空纤维膜中未固定任何化合物的微型组件6（以下记为“比较例2微型组件”），进行与上述同样的血液循环试验。此时的循环持续时间为20分钟，为使用PMMA中空纤维膜微型组件或PSf中空纤维膜微型组件时的一半以下的值。由这些结果可以明确：其对于固定有上述亲水性高分子化合物的医疗材料显示优异的抗凝血作用。

需要说明的是，使用比较例1微型组件进行与上述同样的血液循环试验时的循环持续时间为20分钟，与使用PMMA中空纤维膜中未固定任何化合物的比较例2微型组件时没有区别。

（实施例1化合物的溶出量的测定）

将另行制作的实施例1微型组件的血液端口1b与内径0.8mm、长度520mm的硅管7b连接，其途中设置蠕动泵8。血液端口1a与内径0.8mm、长度160mm的硅管7a连接。其后，将硅管7a和7b各自的另一端插入放有5mL人血浆的聚苯乙烯圆管（编号：352054；BECTON, DICKINSON公司）10中，制作图3所示的循环回路。

使用蠕动泵8，将人血浆以0.5mL/min的流速循环4小时，然后使用ECA-T试剂盒测定聚苯乙烯圆管10内的人血浆中的实施例1化合物浓度。然而，循环后人血浆中的实施例1化合物浓度在ECA-T试剂盒的检测限以下，未从PMMA中空纤维膜微型组件中确认到实施例1化合物的溶出。该结果表示：上述亲水性高分子化合物能够对以中空纤维膜为首的医疗材料进行稳固的固定。

（抗血小板附着共聚物的吸附量评价）

作为构成上述亲水性高分子化合物的、抗血小板附着共聚物之一即乙烯基吡咯烷酮与醋酸乙烯酯的共聚物（以下记为“VA系共聚物”），准备了PVP（K-90）、VA73、VA64、VA55、VA37（均为BASF公司）。同样地，作为抗血小板附着共聚物之一即部分皂化聚乙烯醇，准备了PVA217、PVA417、PVA205c（均为KURARAY CO.,LTD）。进而，作为聚醚改性有机硅，准备了F114、F244、F303、F3031、F348、F350s、F502、F506、X-22-3939A（均为Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.）。需要说明的是，所准备的VA系共聚物、部分皂化聚乙烯醇以及聚醚改性有机硅均用蒸馏水进行稀释而制备成10000重量ppm的水溶液。

另一方面，作为比较对象，作为构成上述亲水性高分子化合物的、抗血小板附着共聚物中未包含的高分子化合物，准备了PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG20000（均为Nacalai Tesque, Inc）以及PEG甲基醚（PEG-em）、PEG二甲基醚（PEG-dm）（均为Sigma-Aldrich Corporation.）。需要说明的是，所准备的高分子化合物均用蒸馏水进行稀释而制备成10000重量ppm的水溶液。

作为用于固定抗血小板附着共聚物的被固定化原材料的0.5重量%溶液，分别制备了PMMA（重均分子量93000；Sigma-Aldrich Corporation.）/甲苯溶液、聚氨酯/二甲基乙酰胺溶液、PSf（Solvay S.A.制造的Udel（注册商标）P-3500）/二甲基乙酰胺溶液、聚氯乙烯（重均分子量80000；Sigma-Aldrich Corporation.）/四氢呋喃溶液、聚苯乙烯（Wako）/氯仿溶液和聚碳酸酯（重均分子量20000；Teijin Limited）/氯仿溶液。

测定各种抗血小板附着共聚物对各个被固定化原材料的吸附量。结果示于表4。

[表4]

由表4的结果可以明确：构成上述亲水性高分子化合物的抗血小板附着共聚物不限定于聚醚改性有机硅（X-22-3939A），其能够对以中空纤维膜为首的医疗材料进行稳固的固定。

（抗血小板附着能力的评价）

将另行制作的PMMA中空纤维膜微型组件的组件盒用超声波切割机切断，取出固定有实施例1化合物的PMMA中空纤维膜（以下记为“实施例1中空纤维膜”）。

在直径18mm的聚对苯二甲酸乙二醇酯制的圆形膜的单面粘贴双面胶，向其中固定实施例1中空纤维膜，然后将已固定的PMMA中空纤维膜横切（そぎ切り）成半圆筒状，使其露出内表面。在切成筒状的Falcon（注册商标）圆筒管（18mmφ、No.2051）的内部放入固定于圆形膜的实施例中空纤维膜，将圆筒管与圆形膜的间隙用封口膜密封。其后，将该圆筒管内用生理盐水充满。

向预先采取了肝素的采血管中倒入刚采取完成的志愿者的静脉血，倒置混合，制备肝素加血。需要说明的是，肝素加血的肝素浓度达到50U/mL。

废弃上述圆筒管内的生理盐水，然后加入肝素加血1.0mL，以37℃振荡1小时。接着，将上述圆筒管内的实施例1中空纤维膜用10mL生理盐水洗涤，然后添加含有2.5体积%的戊二醛的生理盐水进行血液成分的固定，进而用蒸馏水进行洗涤。其后，从上述圆筒管中取出固定有实施例1中空纤维膜的圆形膜，将固定有实施例中空纤维膜的圆形膜以常温、0.5Torr绝对压进行12小时减压干燥。

将减压干燥后的固定有实施例1中空纤维膜的圆形膜用双面胶粘贴在扫描型电子显微镜的试样台上，通过溅射在实施例中空纤维膜表面形成铂/钯薄膜。使用场发射型扫描型电子显微镜（S800；日立制作所）以1500倍的倍率观察表面形成有铂/钯薄膜的实施例中空纤维膜的长度方向的中央附近的内表面，数出1个视野中（4.3×10³μm²）的附着血小板数。

将不同的5个视野中的附着血小板数的平均值的整数值记作血小板附着数（个/4.3×10³μm²）时，附着于实施例1中空纤维膜的血小板数为1个。

另一方面，将另行制作的比较例2微型组件的组件盒用超声波切割机切断，取出未固定任何化合物的中空纤维膜（以下记为“比较例2中空纤维膜”），对其也同样地确认血小板附着数时，比较例2中空纤维膜的附着血小板数为100个以上。

由这些结果可以明确：上述亲水性高分子化合物能够对以中空纤维膜为首的医疗材料赋予显著的抗血小板附着能力。

（全血凝固时间的测定）

将采取的自志愿者的血液和柠檬酸以体积比率9/1进行混合，制备了柠檬酸加血。

向比色皿（cuvette）（NON-ACTIVATED CLOTTING TEST KIT）中采取生理盐水18μL，向其中添加葡萄糖酸钙14.8μL，进而加入柠檬酸加血342μL，然后用Sonoclot凝血/血小板机能分析装置（IMI Co., Ltd）进行测定，将所得ACT ONSET值作为全血凝固时间。采取的自志愿者的血液的全血凝固时间为545秒。

分别使用2、10、20μM的阿加曲班溶液（溶剂为甲醇/盐酸（体积比率4/1））代替生理盐水并进行同样的测定时，全血凝固时间分别为531、746、849秒。

分别使用0.3、1.3、2.5μM的实施例1化合物水溶液代替生理盐水并进行同样的测定时，全血凝固时间分别为527、693、730秒。

（实施例14）

1.醋酸乙烯酯-乙烯基吡咯烷酮共聚物与阿加曲班的键合：

向螺纹小瓶（screw vial）中采取四氢呋喃14.9g、醋酸乙烯酯11.5g、N-乙烯基吡咯烷酮10.8g、2-氨基乙硫醇0.028g以及偶氮二异丁腈0.016g，密闭后照射10分钟的超声波。先将螺纹小瓶开封一次，用氩气鼓泡10分钟，再次密闭后，边搅拌边将螺纹小瓶在60℃的热水浴中浸渍1小时、进而在70℃的热水浴中浸渍6小时，使醋酸乙烯酯与乙烯基吡咯烷酮发生共聚反应。将向该反应液中添加甲醇80mL而得到的产物添加至约5倍量的醚中，去除上清液。将重新添加醚并去除上清液这一洗涤操作重复3次，进行减压干燥，得到醋酸乙烯酯-乙烯基吡咯烷酮共聚物。对所得醋酸乙烯酯-乙烯基吡咯烷酮共聚物进行¹H-NMR测定（溶剂：CDCl₃）时，乙烯基吡咯烷酮单元为60.6单元摩尔%。

将所得醋酸乙烯酯-乙烯基吡咯烷酮共聚物3.58g溶于脱水DMF 20mL中，制备醋酸乙烯酯-乙烯基吡咯烷酮共聚物/脱水DMF溶液。向两口烧瓶中采取所制备的醋酸乙烯酯-乙烯基吡咯烷酮共聚物/脱水DMF溶液的总量以及阿加曲班盐酸盐/脱水DMF溶液（0.49M）0.5mL，边在冰冷下搅拌，边分别添加DCC/脱水DMF溶液（1.04M）0.5mL和HOBt/脱水DMF溶液（1.02M）0.5mL，在氮气气氛下以室温反应3天。接着，将反应液投入透析管（Spectra/Por RC Pore 6 MWCO=1000）中，边在超过反应液的10倍体积量的蒸馏水中适当交换蒸馏水边进行3天透析。将透析后的反应液过滤，用旋转蒸发仪蒸馏去除滤液的溶剂后，在真空干燥机中干燥一晚，得到亲水性高分子化合物（以下记为“实施例14化合物”）。

2.实施例14化合物的抗凝血酶活性的测定：

利用与实施例1化合物的抗凝血酶活性的测定同样的方法，测定实施例14化合物/甲醇溶液（浓度20重量%），将算出的实施例14化合物/甲醇溶液的以阿加曲班计浓度104.1ppm记为实施例14化合物/甲醇溶液的显示抗凝血酶活性的值。

（实施例15）

取阿加曲班44.8mmol置于茄形烧瓶中，在Ar气流下添加脱水二甲基甲酰胺（以下记为“脱水DMF”）50mL并溶解后，将茄形烧瓶进行冰冷。滴加50mL 4N盐酸/1,4-二噁烷（东洋化成株式会社），在室温下搅拌1小时。接着，用旋转蒸发仪蒸馏去除溶剂，用脱水甲苯（Wako）进行共沸处理。进而在真空干燥机中干燥一晚，向所得化合物中添加脱水DMF，制成阿加曲班盐酸盐/脱水DMF溶液（1.0M）。

向三口烧瓶中添加阿加曲班盐酸盐/脱水DMF溶液46ml，边在冰冷下进行搅拌，边添加HOBt 57.8mmol、脱水DMF 20ml。溶解后，添加DCC 51.0mmol。预先向以40℃减压干燥5小时的氨基-聚醚改性有机硅（X-22-3939A；Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.）190g中添加脱水DMF 760g，并进行搅拌。在冰冷下将溶解有阿加曲班盐酸盐、DCC、HOBt的脱水DMF溶液添加至氨基-聚醚改性有机硅/脱水DMF溶液中。将脱气、Ar置换重复5次后，以室温搅拌3天使其反应。将反应液加入至透析管（Spectra/Por RC Pore 6 MWCO=15,000）中，边在超过反应液的100倍体积量的蒸馏水中适当交换蒸馏水边进行7天透析。将透析后的反应液过滤，用旋转蒸发仪蒸馏去除滤液的溶剂后，在真空干燥机中干燥一晚，得到键合物（以下记为“实施例15键合物”）。

（实施例15键合物的抗凝血酶活性的测定）

测定使用ECA-T试剂盒（HaemoSys公司）。向实施例15键合物10mg中添加蒸馏水1ml，制备了实施例15键合物水溶液。采取实施例15键合物水溶液 30μL，与ECA 凝血酶原缓冲液（ECA prothrombin buffer） 100μL和ECA-T底物 25μL混合，以37℃孵育60秒钟，然后放置于装置（COATRON M1（编号 80 800 000）；Production公司）中，进而添加ECA ecarin 试剂 50μL后，进行抗凝血酶活性的测定。

用使用乙醇/盐酸（体积比率4/1）混合溶剂制备成任意浓度的阿加曲班溶液20μL与人血浆80μL混合而成的液体、或者将空白的蒸馏水20μL与人血浆80μL混合而成的液体来代替上述实施例15键合物水溶液，使用ECA-T试剂盒分别进行测定，由它们的结果制作标准曲线。将基于标准曲线算出的实施例15键合物水溶液的以阿加曲班计浓度2.6重量ppm作为实施例15键合物水溶液的显示抗凝血酶活性的值。

由这些结果可以明确：上述亲水性高分子化合物与已知具有抗凝血酶活性的阿加曲班相比即使为极低的浓度也能够延长全血凝固时间，能够对以填充于血液净化用组件的中空纤维膜为首的医疗材料赋予优异的抗凝血作用。

产业上的可利用性 

本发明在医疗领域中能够作为具有优异抗凝血作用的医疗材料使用。

附图标记说明

1a,1b???血液端口、2a,2b???透析液端口、3???组件盒、4???中空纤维膜、5???灌封剂、6???微型组件、7a,7b???硅管、8???蠕动泵、9???包接部、10???聚苯乙烯圆管

Claims (6)

1.医疗材料，其表面固定有亲水性高分子化合物，所述亲水性高分子化合物由下述通式（I）所示的化合物与选自乙二醇、醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、丙二醇、乙烯醇和硅氧烷中的单体的共聚物键合而成，

[化1]

式中，R¹表示（2R,4R）-4-烷基-2-羧基哌啶基，R²表示苯基或稠合多环式化合物残基，该稠合多环式化合物残基可以被低级烷基或低级烷氧基或者氨基取代，所述氨基被低级烷基取代。

2.根据权利要求1所述的医疗材料，其中，所述共聚物是聚醚改性有机硅。

3.根据权利要求1或2所述的医疗材料，其中，通式（I）的化合物为（2R,4R）-4-甲基-1-（（2S）-2-｛[（3RS）-3-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-8-基]磺酰基｝氨基-5-胍基戊酰基）哌啶-2-羧酸。

4.根据权利要求1~3中任一项所述的医疗材料，其将选自聚酯、聚氨酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯以及聚砜中的任一种作为原材料。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的医疗材料，其为中空纤维膜。

6.血液净化用组件，其填充有权利要求5所述的医疗材料。

Images