CN103589808A - 细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制方法和系统，该系统包括培养室，还包括中央控制单元、物质交换器和氮气、氧气、二氧化碳气源，所述培养室与物质交换器之间设有循环培养液管道，所述培养室的上游端与物质交换器的循环培养液出口之间的上游循环培养液管道上设有生化传感器，所述培养室的下游端与物质交换器的循环培养液入口之间的下游循环培养液管道上设有第一液流驱动装置，所述氮气、氧气、二氧化碳气源分别经电磁阀与物质交换器的气体入口通过气体管道连接，所述生化传感器、第一液流驱动装置、电磁阀分别与中央控制单元电连接。本发明的方法和系统在全封闭的情况下实现了组织的长期培养。

Description

细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制方法和系统

技术领域

本发明涉及生物医学工程细胞和组织培育领域，特别涉及一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制方法和系统。

背景技术

体外培养环境中，细胞和组织在生长过程中不断消耗O₂，产生CO₂并积聚在培养液中，使培养液pH不断下降。

维持pH稳定的常规方法是丢弃旧培养液然后添加新培养液，称为换液。换液这一方式是在pH值下降到相当低时进行，导致生化环境的较大波动，同时频繁换液将大大增加污染的风险。

维持培养液的氧分压/二氧化碳分压需要充分的气体交换，即氧气的供给和二氧化碳的排出。常规方法主要有：一、在二氧化碳孵箱中，借助培养液容器上的通气孔以开放的方式实现被动的气体交换，其交换效率低下，并不能按需要实施调控；二、在培养液中插入氧气管，管口安装微孔气体注入器，直接向培养液中注入氧气产生气泡与培养液接触充氧，此法易滋生细菌，产生的气泡也容易破坏培养的细胞。

此外，一些细胞和组织则需要特殊的培养条件，例如在低氧的条件下软骨组织的生长更好，成纤维细胞需要偏碱性的环境，连续培养的细胞株则多需要偏酸性的环境。低氧孵箱虽然能实现某一恒定的低氧分压环境，但不能任意控制pH处于某一预设范围，也不能保持稳定。

组织工程组织的体外培养是一个长期的过程，需要数周甚至数月。这一培养过程中，组织生长到不同阶段，对生化环境的需要也是不同的。最常用于改变生化环境的方法是换液并转移至不同的孵箱。这一方法除了增加污染的风险，也会中断组织的连续生长过程。因此，本领域急需一种全封闭并自动改变生化环境的培养方法和系统，能够实现组织的长期连续培养。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制方法，本方法可实现在全封闭的培养条件下灵敏迅速地将培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压控制在指定的范围，减少生化环境出现显著波动，避免换液产生的污染风险。同时，本方法能在不中断培养过程的情况下，通过改变预设控制值范围，将pH、氧分压和二氧化碳分压控制在不同的水平，以满足组织生长不同时期对不同生化环境的需要。

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制系统，该系统具有新鲜培养液与循环培养液两个各自相对独立的循环系统，形成气/液和液/液一体化交换，能够实现不开仓就能更新培养液，能够实现组织的长期连续培养，可实现在全封闭的培养条件下灵敏迅速地将培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压控制在指定的范围，减少生化环境出现显著波动，避免换液产生的污染风险。同时，本系统能在不中断培养过程的情况下，通过改变预设控制值范围，将pH、氧分压和二氧化碳分压控制在不同的水平，以满足组织生长不同时期对不同生化环境的需要。

本发明的目的是这样实现的：一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制方法，包括如下步骤：

1）预先设定培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压的控制值范围；

2）在培养液的循环使用过程中实时检测培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压；

3）将步骤2）中的实时检测获取的pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值与步骤1）中预设的控制值范围进行比较，判断测定值是否在预设控制值范围内；

4）若测定值不在预设控制值范围内，根据培养液的pH或氧分压或二氧化碳分压的情况，向培养液补充氮气、氧气、二氧化碳中的一种或几种，进行气体交换；

5）待培养液进行气体交换，pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值达到预设控制值范围后，停止向培养液补充气体。

步骤4）所述若测定值不在预设控制值范围内，根据培养液的pH或氧分压或二氧化碳分压的情况，当其中一项指标不在预设控制值范围内，则调节该项指标，使该项指标恢复到预设控制值范围；当其中两项或三项指标不在预设控制值范围内，则按先后次序依次调节培养液的二氧化碳分压、氧分压、pH指标，使各项指标恢复到预设控制值范围。

若测定值不在预设控制值范围内，当pH的测定值低于pH预设控制值范围的下限时，向培养液补充氮气和氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，pH的测定值达到pH预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当pH的测定值高于pH预设控制值范围的上限时，向培养液补充二氧化碳，进行气体交换，待培养液进行气体交换，pH的测定值达到pH预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。

所述pH预设控制值范围内的判定点是pH预设控制值范围的中间值。

若测定值不在预设控制值范围内，当氧分压的测定值低于氧分压预设控制值范围的下限时，向培养液补充氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，氧分压的测定值达到氧分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当氧分压的测定值高于氧分压预设控制值范围的上限时，向培养液补充氮气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，氧分压的测定值达到氧分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。

所述氧分压预设控制值范围内的判定点是氧分压预设控制值范围的中间值。

若测定值不在预设控制值范围内，当二氧化碳分压的测定值低于二氧化碳分压预设控制值范围的下限时，向培养液补充二氧化碳，进行气体交换，待培养液进行气体交换，二氧化碳分压的测定值达到二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当二氧化碳分压的测定值高于二氧化碳分压预设控制值范围的上限时，向培养液补充氮气和氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，二氧化碳分压的测定值达到二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。

所述二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点是二氧化碳分压预设控制值范围的中间值。

一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制系统，包括培养室，还包括中央控制单元、物质交换器和氮气、氧气、二氧化碳气源，所述培养室与物质交换器之间设有循环培养液管道，所述培养室的上游端与物质交换器的循环培养液出口之间的上游循环培养液管道上设有生化传感器，所述培养室的下游端与物质交换器的循环培养液入口之间的下游循环培养液管道上设有第一液流驱动装置，所述氮气、氧气、二氧化碳气源分别经电磁阀与物质交换器的气体入口通过气体管道连接，所述生化传感器、第一液流驱动装置、电磁阀分别与中央控制单元电连接。

所述物质交换器与一新鲜培养液储存器之间设有新鲜培养液循环管道，所述新鲜培养液储存器的上游端与物质交换器的新鲜培养液出口通过上游新鲜培养液管道连接，所述新鲜培养液储存器的下游端与物质交换器的新鲜培养液入口通过下游新鲜培养液管道连接，该下游新鲜培养液管道上设有第二液流驱动装置，所述第二液流驱动装置与中央控制单元电连接。

所述物质交换器的气体入口与电磁阀的下游端之间设有第一过滤器，所述物质交换器的气体出口设有单向阀，所述单向阀的上游端与物质交换器的气体出口之间设有第二过滤器。

由于采用了上述方案，所述培养室与物质交换器之间设有循环培养液管道，所述培养室的下游端与物质交换器的循环培养液入口之间的下游循环培养液管道上设有第一液流驱动装置，使物质交换器能够与培养室形成循环通道，让循环培养液在第一液流驱动装置的驱动下能够在物质交换器与培养室之间循环，为培养室内的培育组织提供营养。所述培养室的上游端与物质交换器的循环培养液出口之间的上游循环培养液管道上设有生化传感器。所述氮气、氧气、二氧化碳气源分别经电磁阀与物质交换器的气体入口通过气体管道连接。所述生化传感器、第一液流驱动装置、电磁阀分别与中央控制单元电连接。所述生化传感器能够实时检测循环培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压，并将实时检测获取的pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值传递给中央控制单元。所述中央控制单元将生化传感器实时检测获取的pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值与中央控制单元中预设的控制值范围进行比较，判断测定值是否在预设控制值范围内，若测定值不在预设控制值范围内，根据培养液的pH或氧分压或二氧化碳分压的情况，向培养液补充氮气、氧气、二氧化碳中的一种或几种，进行气体交换。所述氮气、氧气、二氧化碳气源分别经电磁阀与物质交换器的气体入口通过气体管道连接，使氮气、氧气、二氧化碳中的一种或几种能够在中央控制单元的控制下通入物质交换器与循环培养液进行气体交换，因而改变培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压。由于用于气体经过且与循环培养液进行气/液交换的疏水性中空纤维生物半透膜集束形成一个相对独立的气体通道，而液体不能从该通道流走，故使壳体的腔室形成一个密闭空间，且使用第一、第二过滤器能够阻止细菌、真菌进入物质交换器，不易滋生细菌。且氮气、氧气、二氧化碳中的一种或几种能够在中央控制单元的控制下通入物质交换器与循环培养液进行气体交换，其交换效率高，能够按需要实施调控。待培养液进行气体交换，pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值达到预设控制值范围后，通过中央控制单元控制电磁阀停止向培养液补充气体。本发明的自动控制系统配合本发明的自动控制方法可实现在全封闭的培养条件下灵敏迅速地将培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压控制在指定的范围，减少生化环境出现显著波动，避免换液产生的污染风险。同时，本发明的自动控制系统配合本发明的自动控制方法能在不中断培养过程的情况下，通过改变中央控制单元中的预设控制值范围，能够将pH、氧分压和二氧化碳分压任意控制在某一预设范围内，且保持稳定，以满足组织生长不同时期对不同生化环境的需要，有利组织的长期连续培养。本发明的自动控制系统配合本发明的自动控制方法能使组织工程组织的制备实现标准化和商业化。

所述物质交换器与一新鲜培养液储存器之间设有新鲜培养液循环管道。由于新鲜培养液与循环培养液具有各自相对独立的循环系统，并且还能够相互进行交换，因此培养液的循环驱动能够采用脉动泵模拟人体心脏跳动的脉冲方式，使培养液进行循环为培育的组织提供营养。本发明的自动控制系统形成气/液和液/液一体化交换，能够实现不开仓就能更新培养液，并且使氧和二氧化碳、新鲜培养液、循环培养液在交换器中完成气/液和液/液交换更新，而且培养液在密闭空间内循环和交换更新，培养液的液面也不会产生泡沫，避免通入气体产生的气泡破坏培养的细胞，完全杜绝培养液被污染，又能实现培养液脉冲式循环更新，从而实现真正意义的人体血液循环的脉冲式仿生培育。由于培养液在密闭空间内循环和交换更新，在组织培育过程中不会排放培养液，培养液总量不会减少，因此用较少量的新鲜培养液就能够完成较长时间的组织工程组织培育过程，既减少新鲜培养液的用量，降低成本，又使组织工程组织培育具备了产业化生产的条件。本自动控制系统作为组织工程组织制备系统中的重要设备，能够使组织工程组织的制备形成产业化生产。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明的系统示意图；

图2为本发明的方法流程图。

附图中，1为培养室，2为中央控制单元，3为物质交换器，31为循环培养液入口，32为循环培养液出口，33为新鲜培养液入口，34为新鲜培养液出口，35为气体入口，36为气体出口，37为亲水性中空纤维生物半透膜集束，38为疏水性中空纤维生物半透膜集束，4为上游循环培养液管道，5为下游循环培养液管道，6为生化传感器，7为第一液流驱动装置，8为新鲜培养液储存器，9为上游新鲜培养液管道，10为下游新鲜培养液管道，11为第二液流驱动装置，12为氮气、氧气、二氧化碳气源，13为电磁阀，14为第一过滤器，15为第二过滤器，16为单向阀，17为气体管道。

具体实施方式

参见图1，一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制系统，包括培养室1，还包括中央控制单元2、物质交换器3和氮气、氧气、二氧化碳气源12。所述物质交换器3包括采用聚碳酸酯材料制作的带腔室的壳体, 壳体的腔室设有用于与培养室相连的循环培养液入口和出口31、32，壳体上设置用于与新鲜培养液储存器相连的新鲜培养液入口和出口33、34，腔室内设置用于新鲜培养液经过且与循环培养液进行液/液交换的亲水性中空纤维生物半透膜集束37连通新鲜培养液的入口、出口33、34，壳体上设置气体出口36和用于与氮气、氧气、二氧化碳气源相连的气体入口35，腔室内设置用于气体经过且与循环培养液进行气/液交换的疏水性中空纤维生物半透膜集束38连通气体的入口、出口35、36，使壳体的腔室形成密闭空间。气/液和液/液交换均采用中空纤维生物半透膜集束，若干中空纤维生物半透膜组成的集束能够使交换面积增加，提高交换效率。所述亲水性中空纤维生物半透膜、疏水性中空纤维生物半透膜均采用聚醚砜膜效果为佳。所述培养室与物质交换器之间设有循环培养液管道。所述培养室的上游端与物质交换器的循环培养液出口32之间通过上游循环培养液管道4连接，所述培养室的下游端与物质交换器的循环培养液入口31之间通过下游循环培养液管道5连接。所述培养室的上游端与物质交换器的循环培养液出口之间的上游循环培养液管道4上设有生化传感器6，所述培养室的下游端与物质交换器的循环培养液入口之间的下游循环培养液管道5上设有第一液流驱动装置7，所述氮气、氧气、二氧化碳气源12分别经电磁阀13与物质交换器的气体入口35通过气体管道17连接。各电磁阀的上游端通过四通分别与氮气、氧气、二氧化碳气源通过气体管道连接，各电磁阀的下游端均通过气体管道与物质交换器的气体入口连接。本实施例的所述氮气、氧气、二氧化碳气源分别为氮气、氧气、二氧化碳储气瓶。所述氮气、氧气、二氧化碳气源还可以采用本领域已知的其他方法实现，如集中供气终端等。所述物质交换器的气体入口与电磁阀的下游端之间设有第一过滤器14，所述物质交换器的气体出口设有单向阀16，所述单向阀的上游端与物质交换器的气体出口之间设有第二过滤器15。使用第一、第二过滤器的目的是阻止细菌、真菌进入物质交换器，优选方案中第一、第二过滤器的过滤膜孔径为0.22微米。所述生化传感器、第一液流驱动装置、电磁阀分别与中央控制单元电连接。所述物质交换器与一新鲜培养液储存器8之间设有新鲜培养液循环管道，所述新鲜培养液储存器的上游端与物质交换器的新鲜培养液出口通过上游新鲜培养液管道9连接，所述新鲜培养液储存器的下游端与物质交换器的新鲜培养液入口通过下游新鲜培养液管道10连接，该下游新鲜培养液管道上设有第二液流驱动装置11，所述第二液流驱动装置与中央控制单元电连接。本实施例中，所述循环培养液管道、新鲜培养液循环管道、气体管道均采用医用硅胶管，且通过标准鲁尔接口连接。所述第一液流驱动装置和第二液流驱动装置采用脉动泵效果为佳。当然，第一液流驱动装置和第二液流驱动装置也可采用本领域已知的其他技术方法驱动循环培养液和新鲜培养液循环流动。对循环培养液的pH/ PO2/ PCO2化学指标的测量，优选采用银/氯化银电极传感器测量pH、荧光淬灭法光学氧传感器测量氧分压，电位severinghous法传感器测量二氧化碳分压。技术人员也可采用本领域已知的其他技术方法测量上述指标。所述电磁阀为气流电磁阀。电磁阀选用常闭型分步直动式电磁阀效果为佳，电磁阀出口气体流速设定为10mL/S。技术人员可以根据实际需要，如循环培养液的总量、细胞和组织生长所需的条件来设置气体流速，同时可以选用本领域已知的气流控制阀实现气体流速控制。所述中央控制单元集成控制脉动泵、电磁阀和收集生化传感器信号的功能。所述中央控制单元与一触摸屏连接。所述触摸屏显示实时数据，并将操作者的操作信息传递给中央控制单元。所述触摸屏采用液晶触摸屏效果为佳。在液晶触摸屏上可以输入预设值、各控制参数，并查看实时数据。所述中央控制单元采用型号为C8501F的单片机效果为佳。所述单片机使用梯形图编程。所述中央控制单元的硬件和软件也可采用本领域已知的其他方法实现。

本自动控制系统的工作流程为：新鲜培养液从新鲜培养液储存器由第二液流驱动装置泵出，进入物质交换器，经新鲜培养液入口、亲水性生物半透膜纤维集束内部、新鲜培养液出口，流回新鲜培养液储存器，形成新鲜培养液循环，附图1中以实线半箭头标示。氮气、氧气、二氧化碳储气瓶处于开放状态，氮气、氧气、二氧化碳在电磁阀的控制下，以单一成分气体或混合气体经第一过滤器、气体入口进入疏水性生物半透膜纤维集束内部，再经气体出口、第二过滤器、单向阀排到大气中，形成气体通路，附图1中以虚线箭头标示。循环培养液在第一液流驱动装置的驱动下，经循环培养液入口进入物质交换器的密闭腔室，再经循环培养液出口、生化传感器回到培养室，形成循环培养液循环，附图1中以实线箭头标示。新鲜培养液和循环培养液都在液流驱动装置的驱动下持续循环流动。气体从气体入口进入用于气体经过且与循环培养液进行气/液交换的疏水性中空纤维生物半透膜集束内部，与疏水性中空纤维生物半透膜膜外的腔室中的循环培养液进行气体交换，从而改变循环培养液的PH值、PO₂、PCO₂，使培养条件更稳定，利于培育组织细胞的培养。新鲜培养液在流经亲水性中空纤维生物半透膜集束时，部分新鲜培养液从亲水性中空纤维生物半透膜渗透到膜外的腔室中，向循环培养液摄入营养物质，同时循环培养液也渗透进亲水性中空纤维生物半透膜内，使循环培养液中的代谢产物随在亲水性中空纤维生物半透膜集束内循环的新鲜培养液被带走，由此形成新鲜培养液与循环培养液的液/液交换。

环境温度和压力恒定时，培养液中的各气体分压之和的最大值恒定。充入某一气体，如氧气，可使培养液中的氧分压上升直至氧气达到最大溶解度。如氧气未达最大溶解度之前，各气体分压之和已达最大值，继续充入氧气则会使氮气、二氧化碳等成分从培养液中排出。以此方式，可以向培养液中充入氧气、二氧化碳、氮气中的某一成分或混合气体来调节氧分压和二氧化碳分压。由于二氧化碳溶于培养液生成碳酸，可在一定范围内调节pH，因此改变二氧化碳分压可以调节pH。

参见图1和图2，一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制方法，包括如下步骤：

1）在中央控制单元中预先设定培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压的控制值范围。启动本系统之前，根据培养对象的生化环境需要条件，在中央控制单元设定pH、氧分压、二氧化碳分压的预设控制值范围。本实例根据最常见的细胞或组织培养的生化环境，预设pH为 7.2-7.4，氧分压为160-180mmHg，二氧化碳分压为30-45mmHg。技术人员可以根据实际需要调整pH、氧分压和二氧化碳分压的预设值。在常采用的DMEM培养液中，其可设定的最大调节范围分别是pH 6.5-8.1，氧分压30-320mmHg，二氧化碳分压5-160mmHg。如改变培养液的种类，由于缓冲盐成分改变，以上最大可调节范围可能扩大或缩小。

2）在培养液的循环使用过程中循环培养液流经生化传感器时，生化传感器实时检测循环培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压的值，并将实时检测获取的pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值通过串口数据线传递给中央控制单元。

3）中央控制单元将步骤2）中的生化传感器实时检测获取的pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值与步骤1）中预设的控制值范围进行比较，根据如下所述的基本控制原则判断pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值是否在预设控制值范围内，即是否偏离预设控制值范围。

4）若pH、氧分压和二氧化碳分压中的三个指标的测定值都在其预设控制值范围内，则返回步骤3）。

若pH、氧分压和二氧化碳分压中有一个或几个的测定值不在其预设控制值范围内，根据培养液的pH或氧分压或二氧化碳分压的情况，中央控制单元则继续判定需要何种气体进入物质交换器，中央控制单元向电磁阀发出开启信号，控制电磁阀开放相应的气体管道，使所需气体（氮气、氧气、二氧化碳中的一种或几种）进入物质交换器的疏水性生物半透膜纤维集束内部腔室中与疏水性生物半透膜膜外的腔室中的循环培养液进行气体交换，因而改变培养液的pH或氧分压或二氧化碳分压。在气体交换的同时，生化传感器继续测量pH、氧分压和二氧化碳分压三个指标。进入物质交换器的气体流速由电磁阀控制，为避免循环培养液的指标变化过快，电磁阀出口气体流速应控制在较低水平。优选方案的电磁阀出口气体流速设定为10mL/S。技术人员可以根据实际需要，如循环培养液的总量、细胞和组织生长所需的条件来设置电磁阀出口气体流速。经过一段时间，待培养液进行气体交换，中央控制单元从生化传感器获取的pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值达到预设控制值范围，且达到预设控制值范围内的判定点后，中央控制单元向电磁阀发出关闭信号，控制电磁阀关闭相应的气体管道，停止向物质交换器中通入气体。

通入物质交换器中的气体的种类取决于偏离预设控制值范围的化学指标种类，通入气体的量取决于偏离预设控制值范围的程度。基本控制原则如下：

（a）pH预设控制值范围的上限和下限均需设定在最大调节范围以内，当生化传感器测得的循环培养液的pH的测定值低于pH预设控制值范围的下限时，向培养液补充比例为1:1的氮气和氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，pH的测定值达到pH预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当pH的测定值高于pH预设控制值范围的上限时，向培养液补充二氧化碳，进行气体交换，待培养液进行气体交换，pH的测定值达到pH预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。所述pH预设控制值范围内的判定点是pH预设控制值范围的中间值效果为佳。技术人员可以根据实际需要，如循环培养液的总量、细胞和组织生长所需的条件来设置pH预设控制值范围内的判定点，只要该判定点的数值在pH预设控制值范围内即可。

（b）氧分压预设控制值范围的上限和下限均需设定在最大调节范围以内，当生化传感器测得的循环培养液的氧分压的测定值低于氧分压预设控制值范围的下限时，向培养液补充氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，氧分压的测定值达到氧分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当氧分压的测定值高于氧分压预设控制值范围的上限时，向培养液补充氮气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，氧分压的测定值达到氧分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。所述氧分压预设控制值范围内的判定点是氧分压预设控制值范围的中间值效果为佳。技术人员可以根据实际需要，如循环培养液的总量、细胞和组织生长所需的条件来设置氧分压预设控制值范围内的判定点，只要该判定点的数值在氧分压预设控制值范围内即可。

（c）二氧化碳分压预设控制值范围的上限和下限均需设定在最大调节范围以内，当生化传感器测得的循环培养液的二氧化碳分压的测定值低于二氧化碳分压预设控制值范围的下限时，向培养液补充二氧化碳，进行气体交换，待培养液进行气体交换，二氧化碳分压的测定值达到二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当二氧化碳分压的测定值高于二氧化碳分压预设控制值范围的上限时，向培养液补充比例为1:1的氮气和氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，二氧化碳分压的测定值达到二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。所述二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点是二氧化碳分压预设控制值范围的中间值效果为佳。技术人员可以根据实际需要，如循环培养液的总量、细胞和组织生长所需的条件来设置二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点，只要该判定点的数值在二氧化碳分压预设控制值范围内即可。

（d）当生化传感器测得的循环培养液有其中一项指标不在预设控制值范围内，则根据上述方法调节该项指标，使该项指标恢复到预设控制值范围；当生化传感器测得的循环培养液同时有两项指标或三项指标超出预设控制值范围，常见的情况包括但不限于：pH过高，二氧化碳分压过低；pH过低，二氧化碳分压过高；pH过低，氧分压过低；二氧化碳分压过低，氧分压过高；二氧化碳分压过高，氧分压过低；pH过低，二氧化碳分压过高，氧分压过低。此时的控制原则是，按照二氧化碳分压、氧分压、pH指标的先后次序根据上述方法调节各项指标，使各项指标恢复到预设控制值范围。

本实施例中，pH、氧分压和二氧化碳分压超出预设控制值范围后的调控具体如下。

（a）pH的调控：pH＜7.2，通入氮气和氧气混合气体（1:1），当pH≥7.3时停止通气； pH＞7.4，通入二氧化碳，pH≤7.3时停止通气。

（b）氧分压的调控：氧分压＜160mmHg，通入氧气，当氧分压≥170mmHg时停止通气；氧分压＞180mmHg，通入氮气，氧分压≤170mmHg时停止通气。

（c）二氧化碳分压的调控：二氧化碳分压＜30mmHg，通入二氧化碳，当二氧化碳分压≥40mmHg时停止通气；二氧化碳分压＞45mmHg，通入氮气和氧气混合气体（1:1），二氧化碳分压≤40mmHg时停止通气。

（d）如循环培养液同时有两项指标或三项指标超出预设范围，此时按照二氧化碳分压、氧分压、pH的次序调节各指标回复到各自预设范围，各指标调节方法如前所述。

通过使用本发明的自动控制系统配合本发明的自动控制方法在培养室中培养细胞和组织，本实施例的培养室中的组织连续培养42天，中途没有换液，没有污染。整个循环培养液的三个指标实际保持范围是：pH 7.20-7.32，氧分压160-173mmHg，二氧化碳分压35-45mmHg。可见这三个指标很好地维持在预设范围内。培养的组织经检测，生长效果明显优于常规方法（二氧化碳孵箱+换液）培养的组织。该方法在全封闭的情况下实现了组织的长期培养，不需开舱排放旧的循环培养液并添加新的培养液，显著减少了手工操作及其产生的干扰，实现了真正意义上的自动化组织工程组织培养。

Claims (10)

1.一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）预先设定培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压的控制值范围；

2）在培养液的循环使用过程中实时检测培养液的pH、氧分压和二氧化碳分压；

3）将步骤2）中的实时检测获取的pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值与步骤1）中预设的控制值范围进行比较，判断测定值是否在预设控制值范围内；

4）若测定值不在预设控制值范围内，根据培养液的pH或氧分压或二氧化碳分压的情况，向培养液补充氮气、氧气、二氧化碳中的一种或几种，进行气体交换；

5）待培养液进行气体交换，pH、氧分压和二氧化碳分压的测定值达到预设控制值范围后，停止向培养液补充气体。

2.根据权利要求1所述的自动控制方法，其特征在于：步骤4）所述若测定值不在预设控制值范围内，根据培养液的pH或氧分压或二氧化碳分压的情况，当其中一项指标不在预设控制值范围内，则调节该项指标，使该项指标恢复到预设控制值范围；当其中两项或三项指标不在预设控制值范围内，则按先后次序依次调节培养液的二氧化碳分压、氧分压、pH指标，使各项指标恢复到预设控制值范围。

3.根据权利要求1或2所述的自动控制方法，其特征在于：若测定值不在预设控制值范围内，当pH的测定值低于pH预设控制值范围的下限时，向培养液补充氮气和氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，pH的测定值达到pH预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当pH的测定值高于pH预设控制值范围的上限时，向培养液补充二氧化碳，进行气体交换，待培养液进行气体交换，pH的测定值达到pH预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。

4.根据权利要求3所述的自动控制方法，其特征在于：所述pH预设控制值范围内的判定点是pH预设控制值范围的中间值。

5.根据权利要求1或2所述的自动控制方法，其特征在于：若测定值不在预设控制值范围内，当氧分压的测定值低于氧分压预设控制值范围的下限时，向培养液补充氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，氧分压的测定值达到氧分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当氧分压的测定值高于氧分压预设控制值范围的上限时，向培养液补充氮气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，氧分压的测定值达到氧分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。

6.根据权利要求5所述的自动控制方法，其特征在于：所述氧分压预设控制值范围内的判定点是氧分压预设控制值范围的中间值。

7.根据权利要求1或2所述的自动控制方法，其特征在于：若测定值不在预设控制值范围内，当二氧化碳分压的测定值低于二氧化碳分压预设控制值范围的下限时，向培养液补充二氧化碳，进行气体交换，待培养液进行气体交换，二氧化碳分压的测定值达到二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体；当二氧化碳分压的测定值高于二氧化碳分压预设控制值范围的上限时，向培养液补充氮气和氧气，进行气体交换，待培养液进行气体交换，二氧化碳分压的测定值达到二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点时，停止向培养液补充气体。

8.根据权利要求7所述的自动控制方法，其特征在于：所述二氧化碳分压预设控制值范围内的判定点是二氧化碳分压预设控制值范围的中间值。

9.一种细胞和组织培养液的pH/氧分压/二氧化碳分压的自动控制系统，包括培养室，其特征在于：还包括中央控制单元、物质交换器和氮气、氧气、二氧化碳气源，所述培养室与物质交换器之间设有循环培养液管道，所述培养室的上游端与物质交换器的循环培养液出口之间的上游循环培养液管道上设有生化传感器，所述培养室的下游端与物质交换器的循环培养液入口之间的下游循环培养液管道上设有第一液流驱动装置，所述氮气、氧气、二氧化碳气源分别经电磁阀与物质交换器的气体入口通过气体管道连接，所述生化传感器、第一液流驱动装置、电磁阀分别与中央控制单元电连接。

10.根据权利要求9所述的自动控制系统，其特征在于：所述物质交换器与一新鲜培养液储存器之间设有新鲜培养液循环管道，所述新鲜培养液储存器的上游端与物质交换器的新鲜培养液出口通过上游新鲜培养液管道连接，所述新鲜培养液储存器的下游端与物质交换器的新鲜培养液入口通过下游新鲜培养液管道连接，该下游新鲜培养液管道上设有第二液流驱动装置，所述第二液流驱动装置与中央控制单元电连接。

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