CN103589647A

CN103589647A - 紫红曲霉yh-6菌株及其用途和由该菌株制备的酯化红曲

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Publication number: CN103589647A
Application number: CN201310402204.3A
Authority: CN
Inventors: 胡沂淮
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明公开了一种紫红曲霉 YH-6 菌株及其用途和由该菌株制备的酯化红曲，用该菌株制备的酯化红曲能促进曲酒中以己酸乙酯为主的四种酯的合成，缩短曲酒的发酵周期，提高曲酒的优质品率。本发明的紫红曲霉（ Monascus purpureus ） YH-6 菌株是从洋河酒厂股份有限公司自制的大曲中分离得到的，该菌株于 2013 年 7 月 17 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏 ，保藏号： CGMCC No.7959 。

Description

紫红曲霉YH-6菌株及其用途和由该菌株制备的酯化红曲

技术领域：

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及酿酒领域中的紫红曲霉菌YH-6菌株及其用途和由该菌株制备的酯化红曲。

背景技术：

红曲霉在生长过程中能产生多种酶类，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、酯化酶等。自上世纪80年代以来，酿酒界对红曲霉进行了广泛的探索和应用研究，取得了突破性的进展和良好的经济效益。红曲霉种类较多，其中酯化红曲主要由烟灰色红曲霉和紫红曲霉制成，红曲霉胞外脂酶具有较强的催化己酸乙酯合成的能力，被称为红曲酶胞外己酸乙酯合成酶。酯化红曲（红曲霉的生物制剂）作为一种生物催化剂，在浓香型白酒发酵过程中具有重要的作用。

酯化红曲作为强化大曲菌种在产酯生香方面具有明显的优势，为提高白酒中己酸乙酯、乙酸乙酯等酯类物质的形成起到了不可替代的作用。因此，酯化红曲的使用对提高己酸乙酯的含量，提高基酒优质品率效果明显，经济效益显著。此外，酯化红曲应用于黄水处理，可降低污水处理成本，可以实现对酿酒副产物资源的再利用，使黄水中的COD、BOD含量在原有基础上下降80％，并获得一定经济效益。再者，酯化红曲对提升二级酒的档次提供重要的技术支持。二级酒中含有大量的有机酸和醇类，酯化红曲可以催化二级酒中的有机酸与醇类的酯化合成反应，促进酒中酯类化合物的形成，从而改善二级酒的口味和品质，增加优级酒的产量。

虽然距酯化红曲的发现已经有相当长的时间，不同的研究机构和酿酒企业都开展了酯化红曲的研究，但实际大规模的生产应用在国内还很少，同时，现有的酯化红曲存在着酯化率低的问题也没有到很好解决，本发明将促进酯化红曲的大规模推广和应用。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是提供一种紫红曲霉YH-6菌株及其用途和由该菌株制备的酯化红曲，用该菌株制备的酯化红曲能促进曲酒中以己酸乙酯为主的四种酯的合成，缩短曲酒的发酵周期，提高曲酒的优质品率。

本发明的紫红曲霉（Monascus purpureus）YH-6菌株是从洋河酒厂股份有限公司自制的大曲中分离得到的，该菌株于2013年 7 月 17 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号：CGMCC No.7959。

本发明通过以下技术方案实现：

一种紫红曲霉菌（Monascus purpureus）YH-6，保藏号为：CGMCC No.7959 。

用上述的紫红曲霉菌（Monascus purpureus）YH-6制备的酯化红曲。

上述的紫红曲霉菌或酯化红曲在曲酒发酵中的用途。

所述酯化红曲制备包括以下步骤：

（1）将1 g大曲粉加入装有 50 mL 富集培养基的250 mL 三角瓶中，在32 ℃下, 100 r/ m 富集培养96 h，移取 5 mL 培养液至另一盛有富集培养基的三角瓶中连续2次富集。富集 3 次后，稀释涂布选择性筛选平板，选取菌落颜色为红色，同时，透明圈透明清晰，透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落划线分离，纯化得到纯菌株；将纯化后的菌株储存于麦芽汁固体培养基斜面上，4 ℃冰箱保存；

（2）将步骤（1）低温保存的菌种，用接种针挑取少许接种于100 mL 液态发酵培养基中100 r/m培养96 h，使菌丝球个数达到饱和；

（3）将步骤（2）的菌液以5 %的接种量接入固态培养基，32 ℃静置培养20天，制成酯化红曲。

所述富集培养基、液体发酵培养基分别为：麦芽汁培养基，自然pH，115 ℃灭菌20 min，然后再加乙醇5 %和灭过菌的乳酸 4 ‰。

选择性平板培养基：在100 mL麦芽汁培养基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯1.5%，琼脂2 %，自然pH，115 ℃灭菌20 min。

所述固态培养基为麸皮培养基：麸皮100 g，乳酸0.4 mL，葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.5 g，KH₂PO₄ 0.1 g，MgSO₄.7H₂O 0.1 g，水70 mL，115 ℃灭菌20 min后加乙醇5 mL。

菌种筛选步骤：

通过上述步骤（1）得到纯菌株10株。将纯化后的菌株储存于麦芽汁固体培养基斜面上，4 ℃冰箱保存。

对得到的10株纯菌株分别按上述步骤（2）和步骤（3）制备酯化红曲，筛选的酯化力最高的紫红曲霉菌株，由生工生物工程（上海）有限公司进行26s RNA分子测序鉴定。分类命名为紫红曲霉菌（Monascus purpureus）YH-6。

菌落形态为：菌丝较紧密，菌丝蔓延性不强，形成圆形的菌落。菌落表面呈绒毛状，中间有一突起，有向外呈放射状的皱褶，边缘较整齐。菌落干燥，无光泽，菌落颜色最初是白色，随着培养时间的延长，菌落最后变为红褐色。打开平板，菌落具有淡雅的香气。

以紫红曲霉菌YH-6 为出发菌株，生产得到酯化红曲粗酶制剂催化己酸合成己酸乙酯具有很强的专一性和选择性，其最适催化温度为35 ℃，最适催化pH 为3.5，最适催化酒精浓度为28 %，最适己酸浓度为1 %，其适合应用于浓香型白酒和黄水酯化液的生产中。

附图说明

图1为筛选出的10株紫红曲霉菌YH-6菌株酯化能力比较示意图。

图2为紫红曲霉菌YH-6菌落形态示意图（左为菌落正面，右为菌落反面）。

图3为紫红曲霉菌YH-6的26S rRNA系统发育示意图。

图4为以紫红曲霉菌YH-6为出发菌株制备的酯化红曲，酯化力与时间曲线示意图。

图5为以紫红曲霉菌YH-6为出发菌株制备的酯化红曲，酯化力与温度曲线示意图。

图6为以紫红曲霉菌YH-6为出发菌株制备的酯化红曲，酯化力与 pH值曲线示意图。

图7为以紫红曲霉菌YH-6为出发菌株制备的酯化红曲，酯化力与酒精浓度曲线示意图。

图8为以紫红曲霉菌YH-6为出发菌株制备的酯化红曲，酯化力与己酸浓度曲线示意图。

具体实施方式：

实施例1

三丁酸甘油酯、己酸、乙酸、乳酸、丁酸、乙醇等化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。麸皮由农贸市场上购买。大曲粉为洋河酒厂股份有限公司自制。

准备以下培养基备用

富集培养基、液体发酵培养基分别为：麦芽汁培养基，自然pH，115 ℃灭菌20 min，然后再加乙醇5 %和灭过菌的乳酸 4 ‰。均为体积百分比。

选择性平板培养基：在100 mL麦芽汁培养基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯1.5%，琼脂2 %，自然pH，115 ℃灭菌20 min。均为体积百分比。

麸皮培养基：麸皮100 g，乳酸0.4 mL，葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.5 g，KH₂PO₄ 0.1 g，MgSO₄.7H₂O 0.1 g，水70 mL，115 ℃灭菌20 min后加乙醇2.5 mL。

菌种筛选步骤：

（1）将1 g大曲粉加入装有 50 mL 富集培养基的250 mL 三角瓶中，在32 ℃下, 100 r/ m 富集培养96 h，移取 5 mL 培养液至另一盛有富集培养基的三角瓶中连续2次富集。富集 3 次后，稀释涂布选择性筛选平板，选取菌落颜色为红色，同时，透明圈透明清晰，透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落划线分离，纯化直至得到纯菌株（共得到10株）。将纯化后的菌株储存于麦芽汁固体培养基斜面上，4 ℃冰箱保存。

对得到的10株纯菌株分别制备酯化红曲，制备步骤如下：

（2）将低温保存菌种用接种针挑取少许接种于100 mL 液态发酵培养基中100 r/m培养96 h，使菌丝球个数达到饱和。

（3）将步骤（2）的菌液以5 %的接种量接入麸皮培养基，32 ℃静置培养20天，制成酯化红曲麸曲。

得到10种酯化红曲麸曲，对其酯化力进行筛选，步骤如下：

（4）称取相当于5 g干曲量的步骤（3）酯化红曲麸曲，加入100 mL含1 %己酸，20 %乙醇的酯化体系中（其余为水），32 ℃酯化100 h，加水50 mL蒸馏，接馏出液100 mL，最后用气相色谱检测反应体系中形成的己酸乙酯含量。酯化力定义为每100 mL馏出液中含己酸乙酯多少毫克。筛选酯化力最高的紫红曲霉菌株。其中6号菌株制成的酯化红曲麸曲，酯化力最高（180㎎∕100 mL），如图1所示。该菌株经生工生物工程（上海）有限公司鉴定，将其命名为紫红曲霉菌YH-6。该菌株于2013年 7 月 17 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号：CGMCC No.7959。

紫红曲霉菌YH-6菌落形态：菌丝较紧密，菌丝蔓延性不强，形成圆形的菌落。菌落表面呈绒毛状，中间有一突起，有向外呈放射状的皱褶，边缘较整齐如图2所示（左为菌落正面，右为菌落反面）。菌落干燥，无光泽，菌落颜色最初是白色，随着培养时间的延长，菌落最后变为红褐色。打开平板，菌落具有淡雅的香气。

紫红曲霉菌YH-6，由生工生物工程（上海）有限公司进行26s RNA分子测序鉴定。

利用PCR测序技术，得到待鉴定紫红曲霉菌YH-6菌株的587 bp 26S rRNA基因D1/D2保守序列，结果如下：

GAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCCCCTCCGGGGTCCGCGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGCTCAGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCGGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGGACGGGGTGCCTGGGTCCATGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGATCAGACTCGCCTGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTCGGGTGGCCGGTCAAAGGCCCCGGGAATGTGTCGCCCTCCGGGGCGTCTTATAGCCCGGGGTGCCATGCGGCCTACCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCGTAATGGTCGTAAGCGACCCGTCTT

根据26S rRNA基因序列保守性进行系统发育分析。通过NCBI的 BLAST比对，获得同源性较高的已知分类单元，然后用phylip软件将这些序列构建系统发育树见附图3。

从系统发育树图3中，可知筛选到的紫红曲霉YH-6菌株的26S rRNA序列与紫红曲霉（Monascus purpureus）的进化距离最近。

紫红曲霉YH-6菌株对酸和酒精的耐受能力：

将YH-6菌株分别挑取到含有2 ‰、4 ‰、6 ‰、8 ‰、10 ‰和12 ‰乳酸的麦芽汁培养基上培养，结果显示当乳酸浓度超过8 ‰时，无菌丝生长。将YH-6菌株分别挑取到含有2 %、4 %、6 %、8 %、10 %和12 %酒精的麦芽汁培养基上培养，结果显示当酒精浓度超过10 %时，无菌丝生长。因此，当乳酸和酒精单独使用时，YH-6能忍受8 ‰的乳酸和10 %的酒精。

酯化红曲麸曲酯化力与时间曲线如图4所示。

从图4可知，当酯化红曲YH-6在麸皮培养基中培养到第7天时，麸曲的酯化力相对最高。超过7天时，麸曲的酯化力能够保持相对稳定。确定酯化红曲的培养时间为7天。酯化体系以及培养条件同上述步骤（4）。

酯化红曲YH-6麸曲对几种酸的酯化力分别测定：

根据酯化力测定方法（上述步骤（4）），催化体系中反应底物分别为己酸、乙酸、丁酸或乳酸，其它条件保持不变，分别测定酯化红曲YH-6在体系中催化己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的生成含量。其结果见表1。

表1 酯化红曲麸曲 YH-6对几种酸的酯化力

有机酸乙酯	己酸乙酯	乙酸乙酯	丁酸乙酯	乳酸乙酯
					含量（mg/100 mL）	180.13	19.86	80.94	44.07

酯化红曲麸曲对混合酸的酯化力测定：

用己酸、乙酸、丁酸和乳酸各1 mL的混合酸作为底物（其它条件同上述步骤（4）），测定酯化红曲YH-6麸曲在体系中催化己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的生成含量。其结果见表2。

表2 酯化红曲YH-6麸曲对混合酸的催化力

有机酸乙酯	己酸乙酯	乙酸乙酯	丁酸乙酯	乳酸乙酯
					含量（mg/100 mL）	78.85	14.02	48.98	11.16

从表2中可以看出，在混酸中，酯化红曲YH-6麸曲对己酸的催化选择性是最好的，己酸乙酯的生成量最高，其他的三种酯都比较少。这说明该酯化红曲麸曲应用于浓香型大曲酒和黄水酯化液的生产中时，在各种酸混合存在的底物中，对己酸的选择性相当好，能大量提高代表浓香型白酒主要香味成分己酸乙酯的含量，有相当大的利用价值。

酯化红曲YH-6麸曲最佳酯化温度的测定：

根据酯化力测定方法（上述步骤4），催化体系中其它条件保持不变，而只考察在不同的温度下，酯化红曲YH-6酯化酶在体系中催化己酸乙酯的生成含量。结果见附图5。

由图5可知，酯化红曲YH-6麸曲酯化酶的最适催化温度为35 ℃，在25 ℃～35 ℃范围内，酯化红曲的酯化能力随温度的升高而增强。其主要原因是在此温度范围内，酶没有变性失活，随着温度的提高，酶的活性不断的提高。当温度超过35℃以上时，酯化酶会发生蛋白变性，酯化红曲的酯化能力随温度的升高而逐渐减弱。

酯化红曲YH-6麸曲最佳酯化pH的测定：

根据酯化力测定方法（上述步骤4），温度选择35 ℃，催化体系中其它条件保持不变，考察在不同的pH下，酯化红曲YH-6酯化酶在体系中催化己酸乙酯的生成含量。结果见附图6。由图6可知，酯化红曲YH-6适宜的pH为 3.5。

酯化红曲YH-6麸曲最佳酒精浓度的测定：

根据酯化力测定方法（上述步骤4），温度选择35 ℃，pH选择3.5，催化体系中其它条件保持不变，考察在不同的酒精浓度下，酯化红曲YH-6酯化酶在体系中催化己酸乙酯的生成含量。结果见附图7。从图7可知，酯化红曲YH-6酯化酶的最适催化酒精浓度为28 %，酒精浓度在低于28 %时酯化红曲的酯化能力随酒精浓度的升高而增强；而在28 % 以上时，酯化红曲的酯化能力随酒精浓度的升高而减弱。

酯化红曲YH-6麸曲最佳己酸浓度的测定：

根据酯化力测定方法，温度选择35 ℃，pH选择3.5，酒精浓度选择28 %，催化体系中其它条件保持不变，考察在不同的己酸浓度下，酯化红曲YH-6酯化酶在体系中催化己酸乙酯的生成含量。结果见附图8。从图8中可以看出，酯化红曲YH-6酯化酶的最适催化己酸浓度为1 %，己酸浓度在低于1 %时酯化红曲的酯化能力随己酸浓度的升高而增强；而在1 % 以上时，酯化红曲的酯化能力随酒精浓度的升高而减弱。在实际生产中，要注意控制酒醅的酸度，酸度过大或过小，都会影响酯化的效率。

实施例2

红曲霉属于腐生性真菌，它对生物质具有较强的分解能力。这主要归功于在自然生长过程中，红曲霉就能产生多种分解酶类，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、酯化酶等。如果能与传统大曲配合使用，可以大幅度提高大曲的糖化力、发酵力、液化力和酯化力。用实施例1得到的酯化红曲YH-6麸曲，与洋河酒厂股份有限公司自制的包包曲，以及与外购的武汉佳成生产的红曲进行生产性能比较。结果见表3。

表3 酯化红曲YH-6麸曲与包包曲、与佳成红曲生产性能比较

	YH-6	包包曲	佳成红曲
				水分（%）	48.4	13.06	7.96
酸度（mmoL/10g曲）	1.21	1.01	0.81
				发酵力（g CO₂/10g曲.48 hr）	0.72	0.25	2.14
糖化力（mg C₆H₁₂O₆/g 曲.hr）	635	520	580
				液化力（g 淀粉/g 曲.hr）	1.45	1.84	1.57
酸性蛋白酶（U/g 曲）	58.104	58.65	57.26
				酯化力（mg/100 mL）	183.16	16.66	137.23
酯分解力（mg/100 mL）	22.32	11.94	15.25

由表可知，酯化红曲YH-6与包包曲相比，除了液化力而外，所有的指标都优于包包曲。说明酯化红曲完全可以与包包曲相配合使用，提高包包曲的使用效率。

酯化红曲YH-6麸曲与武汉佳成生产的红曲相比，酯化力远远高于佳成红曲。另外，酯化红曲YH-6麸曲的酯分解力也比佳成生产的红曲要弱。本发明筛选出的YH-6菌株制备的酯化红曲，比佳成红曲更好，更适合于酿酒生产。佳成红曲的发酵力相对较高，主要原因是佳成红曲中添加了大量的酵母。

实施例3

实施例1得到的酯化红曲YH-6麸曲，与外购的武汉佳成生产的红曲应用于酿酒副产物的处理。将洋河酒厂股份有限公司生产的二级酒、黄水和酒尾按2：1：1的比例混合后，再加入己酸2.5 %，然后分别加入酯化红曲YH-6麸曲 5 %（重量与体积百分比），武汉佳成生产的红曲5 %（重量与体积百分比），35 ℃条件下酯化30天。结果见表4。

表4 酯化红曲YH-6麸曲与佳成红曲对酿酒副产物酯化性能比较

	酯化红曲YH-6麸曲	佳成红曲
			酯化力（mg/100 mL）	1569.53	1287.73

由表可知，酯化红曲YH-6对酿酒副产物的酯化能力效果明显，远高于武汉佳成红曲。

Claims

1.一种紫红曲霉菌（Monascus purpureus）YH-6，保藏号为：CGMCC No.7959。

2.用权利要求1所述的紫红曲霉菌YH-6制备的酯化红曲。

3.权利要求1所述的紫红曲霉菌或权利要求2所述的酯化红曲在曲酒发酵中的用途。

4.如权利要求2所述的酯化红曲，其特征在于所述酯化红曲制备包括以下步骤：

（1）将1 g大曲粉加入装有 50 mL 富集培养基的250 mL 三角瓶中，在32 ℃下, 100 r/ m 富集培养96 h，移取 5 mL 培养液至另一盛有富集培养基的三角瓶中连续2次富集，富集 3 次后，稀释涂布选择性筛选平板，选取菌落颜色为红色，同时，透明圈透明清晰，透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落划线分离，纯化得到纯菌株；将纯化后的菌株储存于麦芽汁固体培养基斜面上，4 ℃冰箱保存；

5.如权利要求4所述的酯化红曲，其特征在于：所述富集培养基、液体发酵培养基分别为麦芽汁培养基，115 ℃灭菌20 min，然后再加乙醇5 %和灭过菌的乳酸 4 ‰。

6.如权利要求4所述的酯化红曲，其特征在于：选择性平板培养基为在100 mL麦芽汁培养基中，加溴甲酚紫0.004 g，三丁酸甘油酯1.5%，琼脂2 %，115 ℃灭菌20 min。

7.如权利要求4所述的酯化红曲，其特征在于：所述固态培养基为麸皮培养基，由以下组分组成，麸皮100 g，乳酸0.4 mL，葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.5 g，KH₂PO₄ 0.1 g，MgSO₄.7H₂O 0.1 g，水70 mL，115 ℃灭菌20 min后加乙醇2.5 mL。