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CN103562406B - 用于预测对艾日布林的反应的方法和组合物 - Google Patents

用于预测对艾日布林的反应的方法和组合物 Download PDF

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CN103562406B CN201280013701.8A CN201280013701A CN103562406B CN 103562406 B CN103562406 B CN 103562406B CN 201280013701 A CN201280013701 A CN 201280013701A CN 103562406 B CN103562406 B CN 103562406B
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Abstract

本发明提供了通过确定源自于患乳腺癌受试者的样品中特定生物标志物的水平来预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)在所述受试者的治疗中的效能的方法。

Description

用于预测对艾日布林的反应的方法和组合物
相关申请
本申请要求2011年3月18日提交的美国临时申请号61／454426的优先权，其全部内容在此引为参考。
发明背景
癌症是用于描述广泛的各种不同疾病的术语，这些疾病各自以特定类型细胞的不受控制的生长为特征。它始于含有这样的细胞的组织，且如果在诊断时癌尚未扩散到任何其他组织，可以通过例如手术、辐射或其他类型的局部疗法来治疗。然而，当有证据表明癌已从其起源组织转移时，通常使用不同的方法来治疗。事实上，由于不能确定转移范围，因此在检测到任何扩散证据时通常采取系统治疗方法。这些方法包括施用干扰快速分裂细胞例如癌细胞的生长的化疗药物。
软海绵素B(halichondrin B)是一种结构复杂的大环化合物，其最初从海生海绵冈田软海绵(Halichondria okadai)分离，随后在Axinella sp.、Phakellia carteri和Lissodendoryx sp.中发现。软海绵素B的全合成在1992年发表(Aicher等，J.Am.Chem.Soc.114：3162-3164，1992)。已显示软海绵素B在体外抑制微管蛋白聚合、微管装配、β-微管蛋白交联、GTP和长春新碱与微管蛋白的结合以及微管蛋白依赖性GTP水解。还显示，这种分子在体外和体内具有抗癌性质。具有抗癌活性的软海绵素B类似物描述在美国专利号6,214,865B1中。
特别是，已开发艾日布林甲磺酸盐(一种软海绵素B类似物)作为抗癌药物。最近，艾日布林甲磺酸盐被批准用于治疗以前接受过至少两种用于治疗转移性疾病的化疗治疗方案的患有转移乳腺癌的患者，其中先前的疗法可能包括辅助或转移设置的蒽环类抗生素和／或紫杉烷。在治疗前预测癌症患者是否可能对抗癌药剂具有反应性的能力，能够指导选择适合的治疗，并且对患者有益。因此，对于可用于在患有癌症、特别是乳腺癌的患者中评估或预测对艾日布林的反应性的方法和组合物存在着需求。
发明概述
本发明至少部分是基于下述发现，即在本文中鉴定的生物标志物的低表达水平、例如不表达，指示了对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的反应性。具体来说，在受试者中这些生物标志物、包括例如在表1中示出的一种或多种生物标志物的不表达或低表达水平指示了所述受试者将对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗有反应。
因此，一个方面，本发明提供了一种用于确定艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，其通过分析源自于所述受试者的样品以确定所述样品中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的表达水平来进行，其中所述生物标志物的低表达水平表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)在治疗所述患乳腺癌的受试者中有效。另一个方面，本发明提供了一种用于确定艾艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，其通过确定源自于所述受试者的样品中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的表达水平来进行，其中所述生物标志物的低表达水平表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)在治疗所述患乳腺癌的受试者中有效。在进一步的方面，本发明提供了一种用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，其通过确定源自于所述受试者的样品中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的表达水平来进行，并且当样品中存在所述生物标志物的低表达水平时，预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)在治疗所述患乳腺癌的受试者中有效。在本发明的上述方面的一种实施方式中，所述方法还可以包括从受试者获得样品。
再另一个方面，本发明提供了一种用于确定例如源自于患乳腺癌的受试者的乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗的敏感性的方法，其通过确定所述肿瘤中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的表达水平来进行，其中所述肿瘤中所述生物标志物的低表达水平表明所述肿瘤对使用艾日布林或其类似物的治疗敏感。再另一个方面，本发明提供了一种用于确定例如源自于患乳腺癌的受试者的乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗的敏感性的方法，其通过确定所述肿瘤中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的表达水平来进行，并且当所述生物标志物在所述肿瘤中以低水平表达时，将所述肿瘤鉴定为对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗敏感。
在本发明的进一步的方面中，提供了用于治疗患乳腺癌的受试者的方法。所述方法包括鉴定其中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物以低水平表达的患乳腺癌的受试者，并向所述受试者施用治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)。再进一步的方面，本发明提供了治疗患乳腺癌受试者的方法，其通过分析源自于所述受试者的样品以确定所述样品中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的表达水平，并且当在所述样品中检测到所述生物标志物的低表达水平时，向所述受试者给药治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)来进行。在本发明的上述方面的一种实施方式中，所述方法还可以包括从受试者获得样品。
在本发明的进一步的方面中，提供了用于治疗患有对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐敏感的乳腺癌的受试者的方法。所述方法包括鉴定患有对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐敏感的乳腺癌(例如其中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物以低水平表达的乳腺癌)的受试者，并且向所述受试者施用治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)。再进一步的方面，本发明提供了治疗患有对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐敏感的乳腺癌的受试者的方法，其通过分析源自于所述受试者的样品以确定所述样品中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的表达水平，并且当在所述样品中检测到所述生物标志物的低表达水平时，向所述受试者施用治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)来进行。在本发明的上述方面的一种实施方式中，所述方法还可以包括从受试者获得样品。
在各种实施方式中，所述受试者以前没有用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)治疗过。或者，所述受试者以前已用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐治疗过。在某些实施方式中，所述乳腺癌是雌激素受体(ER)阴性乳腺癌和／或孕酮受体(PR)阴性乳腺癌和／或Her-2阴性乳腺癌。
在各种实施方式中，测定选自表1中列出的生物标志物中的至少2种、至少3种、至少4种或至少5种生物标志物的表达水平。
在特定实施方式中，使用包含选自表1中列出的生物标志物中的2种或更多生物标志物的子组合的预测性基因印记。在各种实施方式中，测定选自表1中列出的生物标志物中的至少2种、至少3种、至少4种或至少5种生物标志物的表达水平。例如，所述预测性基因印记可以包括至少2种生物标志物，例如DYSF和EDIL3，GNAT1和ERGIC3，KRT24和PAPLN，MANSC1和PDGFB，PCDHl和PDGFB或PHOSPHO2和PSENEN。在另一种实施方式中，所述预测性基因印记可以包括至少3种生物标志物，例如COL7A1、YTHDF1和ZIC5，CKLF、IL10和TUBB6，CDC20、CFL1和TMEM79，HYAL2、NCBP1和SNX11，或CEP152、NCBP1和SATB1。在另一种实施方式中，所述预测性基因印记可以包括至少4种生物标志物，例如APBB2、CCL26、PSENEN和SATB1，ANG、JAM3、KLHL17和PAPLN，ITFG3、MAD2L1BP、NMU和PDGFB，SPTA1、TYROBP、SNX11和PSENEN，GRAMD4、GNAT1、TMIGD2和YTHDF1，或GRAMD4、HYAL2、PHOSPHO2和TUBB6。在另一种实施方式中，所述预测性基因印记可以包括至少5种生物标志物，例如CCL26、CDC20、ERGIC3、EDIL3和PCDH1，DYSF、NMU、PHOSPHO2、PSENEN和SNX11，APBB2、CKLF、CYP4F3、TUBB6和YTHDF1，或CEP152、MAD2L1BP、SPTA1、TMEM79和ZIC5。
在特定实施方式中，所述预测性基因印记可以包括ABI3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、KRT24、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PCDH1、PHOSPHO2、SPTA1、TMIGD2、TYROBP、ZIC5、ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1中的2种或更多种生物标志物，例如ABI3和ANG，APBB2和CCL26，GNAT1和GRAMD4，IL10和ITFG3，MACSC1和MOBKL1 B，NMU和PCDH1，或TYROBP和ZIC5。在其他实施方式中，所述预测性基因印记包括至少3种上面所述的生物标志物，例如ABI3、ANG和APBB2，CCL26、CKLF和COL7A1，DYSF、GNAT1和HYAL2，JAM3、KLHL17和KRT24，NCBP1、NMU和PCDH1，SPTA1、TMIGD2和TYROBP，或ZIC5、MAD2L1BP和CDC20。在其他实施方式中，所述预测性基因印记包括至少4种上面所述的生物标志物，例如ABI3、ANG、APBB2和CCL26，CEP152、CFL1、CKLF和COL7A1，KRT24、MANSC1、MOBKL1 B和SPTA1，TYROBP、TMIGD2、PHOSPHO2和NMU，ABI3、GNATI、KLHL17和SPTA1，或CEP152、HYAL2、PCDH1和TMIGD2。在再进一步的实施方式中，所述预测性基因印记包括至少5种上面所述的生物标志物，例如CKLF、COL7A1、GRAMD4、JAM3和PCDH1，APBB2、CEP152、DYSF、IL10和TYROBP，CYP4F3、HYAL2、ITFG3、KLHL17和KRT24，NCBP1、SPTA1、TMIGD2、IL10和JAM3，或CCL26、PHOSPHO2、SPTA1、TMIGD2和ZIC5。
在其他实施方式中，所述预测性基因印记可以包括ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79或YTHDF1中的2种或更多种生物标志物或其任何子组合，例如ERGIC3和PDGFB，ERGIC3和PSENEN，ERGIC3和SATB1，ERGIC3和SNX11，ERGIC3和TMEM79，ERGIC3和YTHDF1，PDGFB和PSENEN，PDGFB和SATB1，PDGFB和SNX11，PDGFB和TMEM79，PDGFB和YTHDF1，PSENEN和SATB1，PSENEN和SNX11，PSENEN和TMEM79，PSENEN和YTHDF1，SATB1和SNX11，SATB1和TMEM79，SATB1和YTHDF1，SNX11和TMEM79，SNX11和YTHDF1，或TMEM79和YTHDF1。在其他实施方式中，所述预测性基因印记包括至少3种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB和PSENEN，SATB1、SNX11和TMEM79，SNX11、TMEM79和YTHDF1，或ERGIC3、PDGFB和SATB1。在进一步的实施方式中，所述预测性基因印记包括至少4种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB、PSENEN和SATB1，SNX11、TMEM79、YTHDF1和ERGIC3，或ERGIC3、PDGFB、PSENEN和YTHDF1。在进一步的实施方式中，所述预测性基因印记包括至少5种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1和SNX11，ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1和TMEM79，或PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1。在再进一步的实施方式中，所述预测性基因印记包括至少6种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11和TMEM79，PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1，或ERGIC3、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1。在又另一种实施方式中，所述预测性基因印记包括7种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1。
在各种实施方式中，所述生物标志物不是SPTA1、PAPLN、PCDH1、TMIGD2和／或KRT24中的一种或多种。在特定实施方式中，所述生物标志物不是SPTA1、PAPLN、PCDH1、TMIGD2和KRT24。在一种实施方式中，所述生物标志物不是SPTA1。在另一种实施方式中，所述生物标志物不是PAPLN。在另一种实施方式中，所述生物标志物不是PCDH1。在另一种实施方式中，所述生物标志物不是TMIGD2。在又一种实施方式中，所述生物标志物不是KRT24。
在特定实施方式中，所述预测性基因印记可以包括ABＩ3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PHOSPHO2、TYROBP、ZIC5、ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79、YTHDF1、EDIL3和TUBB6中的2种或更多种生物标志物，例如ABＩ3和ANG，GRAMD4和HYAL2，NMU和PHOSPHO2，ZIC5和PSENEN，或SNX11和MOBKL1B。在其他实施方式中，所述预测性基因印记包括至少3种前面所述的生物标志物，例如APBB2、CDC20和CKLF，COL7A1、DYSF和GNAT1，NCBP1、SATB1和EDIL3，PSENEN、DYSF和GNAT1，MANSC1、ZIC5和CFL1，或CKLF、GRAMD4和NMU。在其他实施方式中，所述预测性基因印记包括至少4种前面所述的生物标志物，例如ANG、CCL26、CEP152和JAM3，APBB2、CYP4F3、ITFG3和TYROBP，CYP4F3、MANSC1、PDGFB和YTHDF1，TUBB6、DYSF、PHOSPHO2和CDC20，或CKLF、KLHL17、HYAL2和ZIC5。在再进一步的实施方式中，所述预测性基因印记包括至少5种前面所述的生物标志物，例如IL10、CEP152、COL7A1、TYROBP和ERGIC3，TMEM79、SNX11、PSENEN、GNAT1和GRAMD4，JAM3、SNX11、KLHL17、MOBKL1B和ERGIC3，或NMU、PHOSPHO2、PDGFB、CFL1和ANG。
在本发明的各种方法和／或试剂盒中，所述生物标志物不是ABＩ3、不是ANG、不是APBB2、不是CCL26、不是CDC20、不是CEP152、不是CFL1、不是CKLF、不是COL7A1、不是CYP4F3、不是DYSF、不是GNAT1、不是GRAMD4、不是HYAL2、不是IL10、不是ITFG3、不是JAM3、不是KLHL17、不是KRT24、不是MAD2L1BP、不是MANSC1、不是MOBKL1B、不是NCBP1、不是NMU、不是PCDH1、不是PHOSPHO2、不是SPTA1、不是TMIGD2、不是TYROBP、不是ZIC5、不是ERGIC3、不是PDGFB、不是PSENEN、不是SATB1、不是SNX11、不是TMEM79、不是EDIL3、不是PAPLN、不是TUBB6和／或不是YTHDF1。
在某些实施方式中，所述生物标志物不以可检测的水平表达。在另一种实施方式中，所述生物标志物以与对照相比的低水平表达。表达可以通过任何适合的方法直接或间接测定。在某些实施方式中，所述生物标志物的表达水平使用任何适合的方法在核酸水平上测定。例如，所述生物标志物的表达水平可以通过检测cDNA、mRNA或DNA来测定。在特定实施方式中，所述生物标志物的表达水平使用选自聚合酶链反应(PCR)扩增反应、反转录酶PCR分析、定量反转录酶PCR分析、Northern印迹分析、RNA酶保护测定法、数字RNA检测／定量(例如nanoString)及其组合或子组合的技术来测定。
在某些实施方式中，所述生物标志物的表达水平可以通过检测miRNA来测定。具体来说，可以通过评估miRNA的水平来间接评估mRNA表达，其中控制mRNA表达的miRNA的水平升高表明编码所述生物标志物的mRNA的低表达水平。
在其他实施方式中，所述生物标志物的表达水平使用任何适合的方法在蛋白质水平上测定。例如，所述蛋白质的存在或水平可以使用特异性结合所述蛋白质的抗体或其抗原结合片段来检测。在特定实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段选自鼠抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、ScFv、SMIP、亲合体、avimer、versabody、纳米抗体和结构域抗体，或任何上述抗体的抗原结合片段。在特定实施方式中，所述抗体或其抗原结合部分被标记，例如用选自放射性标记物、生物素标记物、发色团标记物、荧光团标记物和酶标记物的标记物标记。在某些实施方式中，所述生物标志物的表达水平通过使用选自免疫测定法、western印迹分析、放射免疫测定法、免疫荧光法、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、ELISA测定法、免疫聚合酶链反应及其组合或子组合的技术来测定。在特定实施方式中，所述免疫测定法是选自电化学发光、化学发光、产荧光化学发光、荧光偏振和时间分辨荧光的基于溶液的免疫测定法。在其他实施方式中，所述免疫测定法是选自电化学发光、化学发光和产荧光化学发光的夹心免疫测定法。也可以使用依赖于能够检测所述蛋白质的试剂的其他测定法，例如依赖于适合的结合伴体或酶活性的测定法(例如使用配体来检测受体分子)。
样品可以通过任何适合的方法从受试者获得，并且可以任选地经历进一步的处理步骤(例如冷冻、分级、固定、胍处理等)。可以使用源自于受试者的任何适合的样品，例如任何组织(例如活检组织)、细胞或流体及其任何组分，例如级份或提取物。在各种实施方式中，所述样品是从所述受试者获得的流体或这样的流体的组分。例如，所述流体可以是血液、血浆、血清、痰液、淋巴、囊液、乳头吸出液、尿液或从活组织检查(例如肿块活检)收集的流体。在其他实施方式中，所述样品是从所述受试者获得的组织或其组分。例如，所述组织可以是从活组织检查(例如肿块活检)获得的组织、乳腺组织、结缔组织和／或淋巴组织。在特定实施方式中，所述组织是乳腺组织或其组分(例如从所述乳腺组织收集的细胞)。在特定实施方式中，所述乳腺组织的组分是乳腺组织细胞。在另一种实施方式中，所述乳腺组织的组分是循环乳腺肿瘤细胞。
在一种实施方式中，所述受试者是人类。
另一方面，本发明提供了一种用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的试剂盒，其包括用于确定选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的表达水平的试剂，以及使用所述试剂盒来预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的说明书。例如，用于确定所述生物标志物的表达水平的所述试剂可以是用于鉴定所述生物标志物中的无效突变的探针。用于确定所述生物标志物的表达水平的所述试剂可以是用于扩增和／或检测所述生物标志物的探针。在又另一种实施方式中，用于确定所述生物标志物的表达水平的所述试剂可以是抗体，例如对所述生物标志物的野生型或无效突变形式的表达产物特异性的抗体。
在特定实施方式中，所述试剂盒还包括用于从受试者获得生物样品的试剂。在另一种实施方式中，所述试剂盒包括对照样品。
另一个方面，本发明提供了用于确定艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，其通过确定和／或鉴别所述受试者是否携带选自表1中列出的生物标志物中的至少一个含有无效突变的基因来进行。另一个方面，本发明提供了用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，其通过分析源自于所述受试者的样品以确定所述受试者是否携带选自表1中列出的生物标志物中的至少一个含有无效突变的基因来进行。进一步的方面，本发明提供了用于确定乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗的敏感性的方法，其通过确定和／或鉴定所述肿瘤是否以选自表1中列出的生物标志物中的至少一个含有无效突变的基因为特征来进行。再另一方面，本发明涉及使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐治疗患乳腺癌的受试者的方法，其通过鉴定所述受试者是否具有选自表1中列出的生物标志物中的至少一个含有无效突变的基因，并向所述受试者施用治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)来进行。
附图简述
图1示出了如实施例1中所述在乳腺癌细胞系中进行的高通量siRNA筛选方法。
图2示出了进一步考虑作为艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的效能的生物标志物的某些基因的鉴别和选择。
图3示出了如实施例1中所述进行的确认分析。
图4示出了如实施例1中所描述的在用siRNA处理后测定cDNA的相对量的QuantiTect SYBR分析的结果。
发明详述
本发明提供了用于确定艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，用于确定乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗的敏感性的方法，以及治疗患乳腺癌的受试者的方法。总的来说，所述方法包括确定源自于所述受试者的样品中如表1中列出的至少一种生物标志物的表达水平，其中所述生物标志物的低表达水平表明艾日布林或其类似物可用于治疗乳腺癌，和／或所述乳腺肿瘤对于使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗敏感。
本发明至少部分地基于下述发现，即在本文中鉴定的生物标志物的低表达水平(例如不表达)指示了对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的反应性。如本文中所示，使用siRNA技术来“减低(knock down)’’某些基因的表达，并评估得到的减低细胞对艾日布林甲磺酸盐的敏感性。基于来自于这些研究的发现，确定了表1中列出的每个基因的低表达水平与乳腺癌细胞对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗的敏感性相关。
除非在本文中另有定义，否则与本发明关联使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员所通常理解的意义。术语的意义和范围应该是明确的，然而，在存在任何潜在的意义不明确的情形中，本文中提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数项，例如以“一”或“一种’’为特征的项，应该包括复数项，例如一种或多种生物标志物。在本申请中，除非另有陈述，否则“或’’的使用意味着“和／或’’。此外，术语“包括”以及所述术语的其他形式(如“包含’’或“包括的”)的使用不是限制性的。此外，除非另有明确陈述，否则诸如“要素’’或“组分”的术语涵盖了构成一个单位的要素和组分以及构成一个以上单位的要素和组分两种情况。
短语“确定艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者”是指评估使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)治疗受试者在所述受试者中有效(例如为所述受试者提供治疗益处)或无效的可能性。评估治疗有效或无效的可能性通常可以在使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗开始之前或治疗重新开始之前进行。作为上述方案的可选方案或与其组合，可以在治疗期间进行有效治疗的可能性的评估，以例如确定治疗是应该继续还是停止。例如，这样的评估可以通过下述方式来进行：(a)确定在源自于所述受试者的样品中生物标志物(例如选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物)的表达水平，其中所述生物标志物的低表达水平表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐可用于治疗所述患乳腺癌的受试者；或者(b)分析源自于所述受试者的样品以确定所述样品中生物标志物(例如选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物)的表达水平，其中所述生物标志物的低表达水平表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐可用于治疗所述患乳腺癌的受试者。
当在本文中使用时，短语“确定乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗的敏感性’’意指评估乳腺肿瘤例如乳腺癌细胞对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗的易感性。肿瘤的敏感性可以包括艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的扩散和／或转移、和／或完全或部分抑制肿瘤细胞的生长(例如使肿瘤细胞生长减慢至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的能力。评估可以(i)在使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗开始之前；(ii)在所述受试者中重新开始治疗之前进行，和／或在治疗期间进行，以例如确定治疗应该继续还是停止。例如，这样的评估可以通过下述方式来进行：(a)确定所述肿瘤中生物标志物(例如选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物)的表达水平，其中所述肿瘤中所述生物标志物的低表达水平表明所述肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗敏感；或者(b)测定所述肿瘤中生物标志物(例如选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物)的表达水平，并且当所述生物标志物在所述肿瘤中以低水平表达时，将所述肿瘤鉴定为对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗敏感。
当在本文中使用时，术语“艾日布林”是指本领域公认的软海绵素B的全合成大环酮类似物。正如全部内容在此引为参考的美国专利号6,214,865中所述，艾日布林具有下列结构
并且可以使用其中描述的或在或全部内容在此引为参考的Kim DS等，(2009年11月)J.Am.Chem.Soc.131(43)：15636-41中描述的技术来产生。艾日布林也被称为ER-086526，并用CAS编号253128-41-5来标识。艾日布林甲磺酸盐也称为E7389。
当在本文中使用时，术语“艾日布林类似物’’包括艾日布林的一个或多个原子或官能团已被不同原子或官能团替换的化合物。例如，艾日布林类似物包括具有下式(I)的化合物，其也涵盖艾日布林：
在式(I)中，A是C1-6饱和或C2-6不饱和烃骨架，所述骨架是未取代的或具有1至13个取代基，优选地1至10个取代基，例如选自氰基、卤素、叠氮基、Q1和氧代基的至少一个取代基。各个Q1独立地选自OR1、SR1、SO2R1、OSO2R1、NR2R1、NR2(CO)R1、NR2(CO)(CO)R1、NR4(CO)NR2R1、NR2(CO)OR1、(CO)OR1、O(CO)R1、(CO)NR2R1和O(CO)NR2R1。取代基的数目可以是例如1至6、1至8、2至5或1至4。在整个本公开中，数值范围被理解为是包含性的。
各个R1、R2、R4、R5和R6独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6羟烷基、C1-6氨基烷基、C6-10芳基、C6-10卤代芳基(例如对氟苯基或对氯苯基)、C6-10羟基芳基、C1-4烷氧基-C6芳基(例如C1-3烷氧基-C6芳基、对甲氧基苯基、3，4，5-三甲氧基苯基、对乙氧基苯基或3，5-二乙氧基苯基)、C6-10芳基-C1-6烷基(例如苯甲基或苯乙基)、C1-6烷基-C6-10芳基、C6-10卤代芳基-C1-6烷基、C1-6烷基-C6-10卤代芳基、(C1-3烷氧基-C6芳基)-C1-3烷基、C2-9杂环基、C2-9杂环基-C1-6烷基、C2-9杂芳基和C2-9杂芳基-C1-6烷基。可能存在一个以上R1，例如如果A被两个不同的烷氧基(OR1)例如丁氧基和2-氨基乙氧基取代的话。
A的实例包括2,3-二羟基丙基、2-羟基乙基、3-羟基-4-全氟丁基、2，4，5-三羟基戊基、3-氨基-2-羟基丙基、1,2-二羟基乙基、2，3-二羟基-4-全氟丁基、3-氰基-2-羟基丙基、2-氨基-1-羟基乙基、3-叠氮基-2-羟基丙基、3，3-二氟-2,4-二羟基丁基、2,4-二羟基丁基、2-羟基-2(对氟苯基)-乙基、-CH2(CO)(取代或未取代的芳基)、-CH2(CO)(烷基或取代烷基例如卤代烷基或羟烷基)和3，3-二氟-2-羟基-4-戊烯基。
Q1的实例包括-NH(CO)(CO)-(杂环基或杂芳基)、-OSO2-(芳基或取代芳基)、-O(CO)NH-(芳基或取代芳基)、氨基烷基、羟烷基、-NH(CO)(CO)-(芳基或取代芳基)、-NH(CO)(烷基)(杂芳基或杂环基)、O(取代或未取代的烷基)(取代或未取代的芳基)和-NH(CO)(烷基)(芳基或取代芳基)。
各个D和D′独立地选自R3和OR3，其中R3是H、C1-3烷基或C1-3卤代烷基。D和D′的实例是甲氧基、甲基、乙氧基和乙基。在某些实施方式中，D和D′之一是H。
n的值为1或优选地为0，从而形成6元环或5元环。这个环可以是未取代的或取代的，例如当E为R5或OR5时，并且可以是杂环基或环烷基，例如当G为S、CH2、NR6或优选地为O时。
各个J和J′独立地是H、C1-6烷氧基或C1-6烷基；或者J和J′合在一起为=CH2或-O-(直链或支链C1-5亚烷基)-O-，例如环外亚甲基、亚异丙基、亚甲基或亚乙基。
Q是C1-3烷基，并且优选地是甲基。
T是任选地被(CO)OR7取代的亚乙基或亚乙烯基，其中R7是H或C1-6烷基。
各个U和U′独立地是H、C1-6烷氧基或C1-6烷基；或者U和U′合在一起是=CH2或-O-(直链或支链C1-5亚烷基)-O-。
X为H或C1-6烷氧基。
各个Y和Y′独立地是H或C1-6烷氧基；或者Y和Y′合在一起是=O、=CH2或-O-(直链或支链C1-5亚烷基)-O-。
各个Z和Z′独立地是H或C1-6烷氧基；或者Z和Z′合在一起是=O、=CH2或-O-(直链或支链C1-5亚烷基)-O-。
在某些实施方式中，艾日布林类似物包括具有下式(II)的化合物：
在式(II)中，取代如下所定义：
A是C1-6饱和或C2-6不饱和烃骨架，所述骨架是未取代的或具有1至10个(含)取代基，所述取代基独立地选自氰基、卤素、叠氮基、氧代和Q1。
各个Q1独立地选自OR1、SR1、SO2R1、OSO2R1、NR2R1、NR2(CO)R1、NR2(CO)(CO)R1、NR4(CO)NR2R1、NR2(CO)OR1、(CO)OR1、O(CO)R1、(CO)NR2R1和O(CO)NR2R1。
各个R1、R2和R4独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6羟烷基、C1-6氨基烷基、C6-10芳基、C6-10卤代芳基、C6-10羟基芳基、C1-3烷氧基-C6芳基、C6-10芳基-C1-6烷基、C1-6烷基-C6-10芳基、C6-10卤代芳基-C1-6烷基、C1-6烷基-C6-10卤代芳基、(C1-3烷氧基-C6芳基)-C1-3烷基、C2-9杂环基、C2-9杂环基-C1-6烷基、C2-9杂芳基和C2-9杂芳基-C1-6烷基。
各个D和D’独立地选自R3和OR3，其中R3是H、C1-3烷基或C1-3卤代烷基。
n是0或1。
E是R5或OR5，其中R5独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6羟烷基和C1-6氨基烷基。
G是O。
各个J和J’独立地是H、C1-6烷氧基或C1-6烷基；或者J和J’合在一起是=CH2。
Q是C1-3烷基。
T是亚乙基或亚乙烯基。
各个U和U’独立地是H、C1-6烷氧基或C1-6烷基；或者U和U’合在一起是=CH2。
X是H或C1-6烷氧基。
各个Y和Y’独立地是H或C1-6烷氧基；或者Y和Y’合在一起是=O。
各个Z和Z’独立地是H或C1-6烷氧基；或者Z和Z’合在一起是=O。
在某些实施方式中，艾日布林类似物包括具有下式(III)的化合物：
其中A是C1-6饱和或C2-6不饱和烃骨架，所述骨架是未取代的或具有1至13个取代基，例如1至10个选自氰基、卤素、叠氮基、Q1和氧代的取代基；
各个Q1独立地选自OR1、SR1、SO2R1、OSO2R1、NR2R1、NR2(CO)R1、NR2(CO)(CO)R1、NR4(CO)NR2R1、NR2(CO)OR1、(CO)OR1、O(CO)R1、(CO)NR2R1和O(CO)NR2R1；并且
各个R1、R2和R4独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6羟烷基、C1-6氨基烷基、C6-10芳基、C6-10卤代芳基、C6-10羟基芳基、C1-4烷氧基-C6芳基、C6-10芳基-C1-6烷基、C1-6烷基-C6-10芳基、C6-10卤代芳基-C1-6烷基、C1-6烷基-C6-10卤代芳基、(C1-3烷氧基-C6芳基)-C1-3烷基、C2-9杂环基、C2-9杂环基-C1-6烷基、C2-9杂芳基和C2-9杂芳基-C1-6烷基。
烃骨架含有碳和氢原子，并且可以是直链、支链或环状的。不饱和烃类包括1个、2个、3个或更多个C--C双键(sp2)或C--C叁键(sp)。不饱和烃基的实例包括乙炔基、2-丙炔基、1-丙烯基、2-丁烯基、1，3-二丁烯基、2-戊烯基、乙烯基(乙烯基)、烯丙基和异丙烯基。二价不饱和烃基的实例包括亚烯基和亚烷基，例如次甲基、亚乙基、次乙基、亚乙烯基和亚异丙基。一般来说，本发明的化合物具有用例如羟基、氨基、氰基、叠氮基、杂芳基、芳基和本文中描述的其他部分取代的烃骨架(式(I)中的“A”)。烃骨架可以具有被氧代、二价羰基氧原子(=O)或成环取代基例如-O-(直链或支链亚烷基或亚烯基)-O-取代的两个孪位氢原子，以形成缩醛或缩酮。
C1-6烷基包括直链、支链和环状烃类，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、己基、异己基、仲己基、环己基、2-甲基戊基、叔己基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基和2，3-二甲基丁-2-基。烷氧基(-OR)、烷硫基(-SR)和其他烷基衍生的部分(取代的、不饱和的或二价的)，其与烷基(R)类似。烷基和烷基衍生的基团例如代表性的烷氧基、卤代烷基、羟烷基、烯基、亚烯基和亚烷基，可以是C2-6、C3-6、C1-3或C2-4的。
被卤素、羟基、氨基、氰基、叠氮基等取代的烷基可以具有1、2、3、4、5个或更多个取代基，其独立地选择(可以相同或可以不同)，并且可以在或不在同一碳原子上。例如，卤代烷基是具有至少一个选自氟、氯、溴和碘的取代基的烷基。卤代烷基可以具有两个或更多个卤素取代基，其可以是或不是相同的卤素，并且可以在或不在同一个碳原子上。其实例包括氯代甲基、全碘代甲基、3，3-二氯丙基、1，3-二氟丁基和1-溴-2-氯丙基。
杂环基和杂芳基包括呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并吡喃基(chromenyl)、呫吨基、吩噁噻基(phenoxathieny1)、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基(例如1-、2-或4-咪唑基)、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、吡啶基(例如1-、2-或3-吡啶基)、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、氮茚基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基(例如1-、2-或3-吲哚基)、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、曾啉基、蝶啶基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌啶基、哌嗪基、吲哚满基、异吲哚满基和吗啉基。杂环基和杂芳基可以在环的任何位置处与分子的其余部分相连。杂环基和杂芳基可以为C2-9或更小的，例如C3-6、C2-5或C3-7的。
芳基包括苯基、苯甲基、萘基、甲苯基、三甲苯基、二甲苯基和枯基。
应该理解，“杂环基”、“芳基”和“杂芳基”包括具有1、2、3、4个或更多个独立地选自低级烷基、低级烷氧基、氨基、卤素、氰基、硝基、叠氮基和羟基的取代基的基团。杂环基、杂芳基和芳基也可以是式(I)中烃骨架“A”的二价取代基。
术语“艾日布林类似物”包括艾日布林前药。术语“艾日布林前药”包括已被化学修饰成无活性或低活性的艾日布林，其直至被切割艾日布林前药的化学修饰部分的酶进行生物活化(例如体内代谢)，从而提供活性形式的艾日布林。
当在本文中使用时，术语“艾日布林类似物”包括艾日布林和其他式(I)化合物的所有立体异构体，包括其非对映异构体和对映异构体。“立体异构体’’是指仅在原子的空间排列方式上有差异的异构体。“非对映异构体’’是指彼此不为镜像的立体异构体。“对映异构体”是指彼此为不可重叠的镜像的立体异构体。例如，式(IV)涵盖了艾日布林和这样的立体异构体：
当在本文中使用时，术语“药学上可接受的盐’’是由艾日布林或艾日布林类似物的酸性和碱性氮基团形成的盐。这样的盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐，例如无机酸盐或有机酸盐(例如盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、过磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐、糖精酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、扑酸盐(巴莫酸盐)以及铝、钙、锂、镁、钙、钠、锌和二乙醇胺的盐。应该理解，对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的指称包括艾日布林的药学上可接受的盐以及其类似物的药学上可接受的盐。这样的药学上可接受的盐的实例包括但不限于式I的药学上可接受的盐、式II的药学上可接受的盐、式(III)的药学上可接受的盐或式(IV)的药学上可接受的盐。
在特定实施方式中，在本发明的方法中使用艾日布林甲磺酸盐，其是艾日布林的一种药学上可接受的盐形式。艾日布林甲磺酸盐以商品名销售。艾日布林甲磺酸盐的化学名为11，15：18,21：24,28-三环氧基-7,9-桥亚乙基-12，15-桥亚甲基-9H,15H-呋喃并[3，2-i]呋喃并[2’，3’：5,6]吡喃并[4，3-b][1，4]二氧杂环二十五烷-5(4H)-酮，2-[(2S)-3-氨基-2-羟基丙基]二十六氢-3-甲氧基-26-甲基-20,27-双(亚甲基)-(2R,3R,3aS,7R,8aS,9S，10aR,11S，12R,13aR,13bS，15S，18S，21S,24S,26R,28R,29aS)-甲磺酸(盐)。艾日布林甲磺酸盐具有下列结构：
艾日布林甲磺酸盐的标签指明用于治疗患有转移乳腺癌的患者，所述患者以前已接受至少两种用于治疗转移性疾病的化疗方案，包括例如以辅助或转移设置使用蒽环类抗生素和紫杉烷的疗法。
当在本文中使用时，术语“生物标志物”打算涵盖被用作生物状态的指示物的物质，并包括例如基因(或其部分)、mRNA(或其部分)、miRNA(微RNA)和蛋白质(或其部分)。“生物标志物表达谱”意指受试者中一种或多种生物标志物与例如标准或对照相比的定量或定性总结。
可以在本文描述的方法中使用的各种生物标志物概述在表1中。表1提供了基因缩写、基因ID号和转录本的登录号，从中可以确认编码核苷酸基因序列。例如，基因ABＩ3是指人(Homo sapiens)ABI家族成员3。人ABＩ3转录本变体1的核苷酸序列可以在登录号NM_016428处找到。对基因(例如ABＩ3)的指称打算涵盖可以在受试者和／或来自于受试者的肿瘤中发现的天然存在的形式或内源形式的基因，包括基因的野生型、多态性的或等位基因变体或突变体(例如种系突变、体细胞突变)。在某些实施方式中，生物标志物基因的序列与在表1中通过登录号或基因ID号标识的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一。例如，可以通过使用NCBI BLAST(例如使用缺省参数的Megablast)对序列进行比较来确定序列同一性。
当在本文中使用时，短语“预测性基因印记”是指受试者中指示对使用艾日布林或艾日布林类似物的治疗的反应性的至少两种或更多的本发明的生物标志物的表达水平。例如，受试者中来自于表1的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种生物标志物的低表达水平可以构成指示受试者将对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗积极响应的基因印记。来自于表1的2种或更多种标志物的任何子组合可以构成本发明的预测性基因印记。在另一个实例中，在特定阈值水平以下的表1中的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种生物标志物的表达或其任何子组合构成指示受试者将对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗积极响应的基因印记。
生物标志物(例如选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物)的“低表达水平”是指测试样品(例如源自于受试者的样品)中与对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的敏感性相关的生物标志物的表达水平。这可以通过将测试样品中生物标志物的表达水平与适当对照的表达水平进行比较来确定。“低表达水平”也包括缺少生物标志物的可检测的表达。
在某些实施方式中，生物标志物的表达水平相对于对照样品(例如正常组织中生物标志物的表达水平(例如从正常组织样品中观察到的生物标志物表达水平所确定的范围))来确定。在这些实施方式中，低表达水平落于该范围之下或其较低水平之内。在某些实施方式中，生物标志物的表达水平相对于对照样品(例如来自于其他受试者的样品(例如肿瘤样品、循环肿瘤样品)中生物标志物的表达水平)来确定。例如，可以测定来自于其他受试者的样品中生物标志物的表达水平以定义与对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗的敏感性相关的表达水平，并将来自于目标受试者的样品中生物标志物的表达水平与这些表达水平进行比较，其中来自所述受试者的样品中相当的或较低的表达水平指示所述样品中生物标志物的“低表达水平”。在另一个实例中，可以确定来自于其他受试者的样品(例如肿瘤样品、循环肿瘤细胞)中生物标志物的表达水平以定义与对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗的耐受性或无反应相关的表达水平，并将来自于目标受试者的样品中生物标志物的表达水平与这些表达水平进行比较，其中来自所述受试者的样品中较低的表达水平指示所述样品中生物标志物的“低表达水平”。
术语“已知标准水平’’或“对照水平”可以是指生物标志物(例如选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物)的公认的或预先确定的表达水平，其被用于与源自于受试者的样品中生物标志物的表达水平进行比较。在一种实施方式中，生物标志物的对照表达水平是源自于受试者群体的样品中生物标志物的平均表达水平。例如，对照表达水平可以是源自于患乳腺癌的受试者群体的乳腺癌细胞中生物标志物的平均表达水平。所述群体可以是对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗不反应的受试者，或者所述群体可以是以高水平或正常水平表达相应生物标志物的一组受试者。在某些实施方式中，对照水平可以构成由如上所述的正常组织中生物标志物的表达范围。例如，对照水平可以构成由如上所述的来自于各种患乳腺癌的受试者的肿瘤样品中生物标志物的表达范围。
由于作为常规执行本文描述的方法的结果而使更多信息变得可用，因此可以使用群体平均值作为本发明的生物标志物的“对照”表达水平。在其他实施方式中，可以通过测定在怀疑受试者发生乳腺癌之前从受试者获得的受试者样品、存档的受试者样品等中相应生物标志物的表达水平来确定生物标志物的“对照”表达水平。
本发明的生物标志物的对照表达水平可以从可公开获得的数据库获得。此外，可以使用通用参比总RNA(Universal Reference Total RNA)(Clontech Laboratories)和通用人类参比DNA(Universal Human Reference RNA)(Stratagene)等作为对照。例如，可以使用qPCR来测定生物标志物的表达水平，并且在来自受试者的样品中检测生物标志物的表达所需的循环数相对于使用这种对照的检测所需的循环数的增加指示了所述生物标志物的低表达水平。
当在本文中使用时，术语“受试者”或“患者’’是指人类或非人类动物例如兽医学患者。术语“非人类动物’’包括脊椎动物例如哺乳动物，如非人类灵长动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、奶牛或其他啮齿动物、羊科动物、犬科动物、猫科动物、马科动物或牛科动物物种。在一种实施方式中，受试者是人类。
当在本文中使用时，术语“样品’’是指从受试者分离的细胞、组织或流体，以及受试者体内的细胞、组织或流体。术语“样品’’包括任何体液(例如血液、淋巴、囊液、乳头吸出液、尿液和从活组织检查(例如肿块活检)收集的流体)、来自于受试者的组织或细胞或细胞集合、及其任何组分例如级份或提取物。在一种实施方式中，组织或细胞从受试者中取出。在另一种实施方式中，组织或细胞存在于受试者中。其他样品包括泪液、血浆、血清、脑脊液、粪便、痰液和细胞提取物。在一种实施方式中，样品含有来自于受试者的蛋白质(例如蛋白质或肽)。在另一种实施方式中，样品含有来自于受试者的RNA(例如mRNA分子)或来自于受试者的DNA(例如基因组DNA分子)。
当在本文中使用时，术语“乳腺癌’’一般是指乳腺组织的不受控制的生长，更具体来说，是指以受试者的一个或两个乳腺中异常细胞的反常的快速增殖为特征的病症。异常细胞通常被称为恶性或“赘生性细胞”，其是能够形成实体肿瘤的转化细胞。术语“肿瘤”是指由过度或异常的细胞分裂产生的异常的细胞团或群体(即两个或更多细胞)(不论是恶性还是良性的)及癌前和癌性细胞。恶性肿瘤与良性生长或肿瘤的区别在于，除了不受控制的细胞增殖之外，它们能够侵入周围组织并能够转移。在乳腺癌中，赘生性细胞可能仅在一个或两个乳腺中而不在另一种组织或器官中鉴定到，或者在一个或两个乳腺中和一个或多个相邻组织或器官(例如淋巴结)中鉴定到，或者在乳腺和乳腺癌细胞转移到的一个或多个不相邻组织或器官中鉴定到。
因此，艾日布林、其类似物或药学上可接受的盐可用于治疗乳腺癌，并且因此，本发明的方法可用于乳腺癌和患乳腺癌的受试者中。
在一种实施方式中，乳腺癌是雌激素受体(ER)阴性乳腺癌、孕酮受体(PR)阴性乳腺癌和／或HER-2阴性乳腺癌。例如，乳腺癌可以是雌激素受体(ER)阴性和孕酮受体(PR)阴性乳腺癌、雌激素受体(ER)阴性和HER-2阴性乳腺癌、孕酮受体(PR)阴性和HER-2阴性乳腺癌或雌激素受体(ER)阴性、孕酮受体(PR)阴性和HER-2阴性(三重阴性)乳腺癌。ER、PR和HER-2状态的评估可以使用任何适合的方法来进行。例如，HER-2状态可以利用荧光原位杂交(FISH)，通过免疫组织化学(IHC)和／或基因扩增，例如按照国家综合癌症网络(NationalComprehensive Cancer Network)[NCCN]的指导原则来评估。
乳腺癌可以是例如腺癌、炎性乳腺癌、复发(例如局部复发)的和／或转移的乳腺癌。在某些实施方式中，乳腺癌是内分泌难治或激素难治的。术语“内分泌难治的”和“激素难治的”是指对使用乳腺癌激素疗法例如芳香酶抑制剂或他莫昔芬的治疗有抗性的癌症。乳腺癌最常见发生在乳腺的输乳管内衬中(导管癌)或在产生乳汁的小叶中(小叶癌)。因此，在本发明的各种实施方式中，乳腺癌可以是导管癌或小叶癌。来自于乳腺的癌细胞可能侵入或转移到身体的任何其他器官或组织。例如，癌细胞经常侵入淋巴结细胞和／或转移至肝、脑和／或骨。
在本发明的各种实施方式中，受试者可能患有I期、II期、III期或IV期乳腺癌。乳腺癌的分期可以根据其尺寸及其扩散的程度分为从O期至IV期的多个阶段。下表概述了这些阶段，它们对于临床医生来说是公知的：
分期 肿瘤尺寸 涉及淋巴结 转移(扩散)
I 小于2cm 否 否
II 2-5cm之间 否或在乳腺同侧 否
III 超过5cm 是，在乳腺同侧 否
IV 不适用 不适用 是
在下面的小节中，进一步详细描述本发明的各个方面。
I.在患乳腺癌受试者中对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日 布林甲磺酸盐)的反应性的预测
一个方面，本发明提供了用于确定艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者，和／或用于确定乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗的敏感性的方法。所述方法包括例如通过对源自于患乳腺癌的受试者的样品进行分析来确定至少一种生物标志物的表达水平。至少一种生物标志物的低表达水平的鉴定表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)可用于治疗乳腺癌，和／或乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗敏感。
在本发明的方法中，对选自表1中列出的生物标志物中的至少一种生物标志物的表达水平进行评估，其正如本文中解释的，可以包括使用各种方法确定一个或多个这些基因(例如ABＩ3、ANG)的表达水平，例如在适合的样品中确定某些DNA多态性或无效突变的存在，确定从基因表达的RNA(包括表1中示例的mRNA和／或来自于基因的其他转录本)的水平，或任何上述基因和RNA的蛋白质产物。
表1：对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)具有反应性的生物标志物
表1中所确定的各登录号及其相应的序列通过引用并入本文。
在各种实施方式中，测定选自表1中列出的生物标志物中的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种生物标志物的表达水平。
在特定实施方式中，使用包含选自表1中列出的生物标志物中的2种或更多生物标志物的子组合的预测性基因印记。在各种实施方式中，确定选自表1中列出的生物标志物中的至少2种、至少3种、至少4种或至少5种生物标志物的表达水平。例如，预测性基因印记可以包括至少2种生物标志物，例如DYSF和EDIL3，GNAT1和ERGIC3，KRT24和PAPLN，MANSC1和PDGFB，PCDH1和PDGFB，或PHOSPHO2和PSENEN。在另一种实施方式中，预测性基因印记可以包括至少3种生物标志物，例如COL7A1、YTHDF1和ZIC5，CKLF、IL10和TUBB6，CDC20、CFL1和TMEM79，HYAL2、NCBP1和SNX11，或CEP152、NCBP1和SATB1。在另一种实施方式中，预测性基因印记可以包括至少4种生物标志物，例如APBB2、CCL26、PSENEN和SATB1，ANG、JAM3、KLHL17和PAPLN，ITFG3、MAD2L1BP、NMU和PDGFB，SPTA1、TYROBP、SNX11和PSENEN，GRAMD4、GNAT1、TMIGD2和YTHDF1，或GRAMD4、HYAL2、PHOSPHO2和TUBB6。在另一种实施方式中，预测性基因印记可以包括至少5种生物标志物，例如CCL26、CDC20、ERGIC3、EDIL3和PCDH1，DYSF、NMU、PHOSPHO2、PSENEN和SNX11，APBB2、CKLF、CYP4F3、TUBB6和YTHDF1，或CEP152、MAD2L1BP、SPTA1、TMEM79和ZIC5。
在特定实施方式中，预测性基因印记可以包括ABＩ3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、KRT24、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PCDH1、PHOSPHO2、SPTA1、TMIGD2、TYROBP、ZIC5、ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1中的2种或更多生物标志物，例如ABＩ3和ANG，APBB2和CCL26，GNAT1和GRAMD4，IL10和ITFG3，MACSC1和MOBKL1B，NMU和PCDH1，或TYROBP和ZIC5。在其他实施方式中，预测性基因印记包括至少3种上面所述的生物标志物，例如ABＩ3、ANG和APBB2，CCL26、CKLF和COL7A1，DYSF、GNAT1和HYAL2，JAM3、KLHL17和KRT24，NCBP1、NMU和PCDH1，SPTA1、TMIGD2和TYROBP，或ZIC5、MAD2L1BP和CDC20。在其他实施方式中，预测性基因印记包括至少4种上面所述的生物标志物，例如ABＩ3、ANG、APBB2和CCL26，CEP152、CFL1、CKLF和COL7A1，KRT24、MANSC1、MOBKL1B和SPTA1，TYROBP、TMIGD2、PHOSPHO2和NMU，ABＩ3、GNATI、KLHL17和SPTA1，或CEP152、HYAL2、PCDH1和TMIGD2。在再进一步的实施方式中，预测性基因印记包括至少5种上面所述的生物标志物，例如CKLF、COL7A1、GRAMD4、JAM3和PCDH1，APBB2、CEP152、DYSF、IL10和TYROBP，CYP4F3、HYAL2、ITFG3、KLHL17和KRT24，NCBP1、SPTA1、TMIGD2、IL10和JAM3，或CCL26、PHOSPHO2、SPTA1、TMIGD2和ZIC5。
在其他实施方式中，预测性基因印记可以包括ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79或YTHDF1中的两种或更多种生物标志物或其任何子组合，例如ERGIC3和PDGFB，ERGIC3和PSENEN，ERGIC3和SATB1，ERGIC3和SNX11，ERGIC3和TMEM79，ERGIC3和YTHDF1，PDGFB和PSENEN，PDGFB和SATB1，PDGFB和SNX11，PDGFB和TMEM79，PDGFB和YTHDF1，PSENEN和SATB1，PSENEN和SNX11，PSENEN和TMEM79，PSENEN和YTHDF1，SATB1和SNX11，SATB1和TMEM79，SATB1和YTHDF1，SNX11和TMEM79，SNX11和YTHDF1，或TMEM79和YTHDF1。在其他实施方式中，预测性基因印记包括至少3种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB和PSENEN，SATB1、SNX11和TMEM79，SNX11、TMEM79和YTHDF1，或ERGIC3、PDGFB和SATB1。在其他实施方式中，预测性基因印记包括至少4种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB、PSENEN和SATB1，SNX11、TMEM79、YTHDF1和ERGIC3，或ERGIC3、PDGFB、PSENEN和YTHDF1。在进一步的实施方式中，预测性基因印记包括至少5种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1和SNX11，ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1和TMEM79，或PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1。在再进一步的实施方式中，预测性基因印记包括至少6种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11和TMEM79，PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1，或ERGIC3、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1。在又另一种实施方式中，预测性基因特征包括7种生物标志物，例如ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79和YTHDF1。
在各种实施方式中，生物标志物不是SPTA1、PAPLN、PCDH1、TMIGD2和／或KRT24中的一种或多种。在特定实施方式中，生物标志物不是SPTA1、PAPLN、PCDH1、TMIGD2和KRT24。在一种实施方式中，生物标志物不是SPTA1。在另一种实施方式中，生物标志物不是PAPLN。在另一种实施方式中，生物标志物不是PCDH1。在可选实施方式中，生物标志物不是TMIGD2。在又另一种实施方式中，生物标志物不是KRT24。
在特定实施方式中，预测性基因印记可以包括ABＩ3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PHOSPHO2、TYROBP、ZIC5、ERGIC3、PDGFB、PSENEN、SATB1、SNX11、TMEM79、YTHDF1、EDIL3和TUBB6中的2种或更多种生物标志物，例如ABＩ3和ANG，GRAMD4和HYAL2，NMU和PHOSPHO2，ZIC5和PSENEN，或SNX11和MOBKL1B。在其他实施方式中，预测性基因印记包括至少3种上面所述的生物标志物，例如APBB2、CDC2O和CKLF，COL7A1、DYSF和GNAT1，NCBP1、SATB1和EDIL3，PSENEN、DYSF和GNAT1，MANSC1、ZIC5和CFL1，或CKLF、GRAMD4和NMU。在其他实施方式中，预测性基因印记包括至少4种上面所述的生物标志物，例如ANG、CCL26、CEP152和JAM3，APBB2、CYP4F3、ITFG3和TYROBP，CYP4F3、MANSC1、PDGFB和YTHDF1，TUBB6、DYSF、PHOSPHO2和CDC20，或CKLF、KLHL17、HYAL2和ZIC5。在再进一步的实施方式中，预测性基因印记包括至少5种上面所述的生物标志物，例如IL10、CEP152、COL7A1、TYROBP和ERGIC3，TMEM79、SNX11、PSENEN、GNAT1和GRAMD4，JAM3、SNX11、KLHL17、MOBKL1B和ERGIC3，或NMU、PHOSPHO2、PDGFB、CFL1和ANG。
在本发明的各种方法和试剂盒中，生物标志物不是ABＩ3、不是ANG、不是APBB2、不是CCL26、不是CDC20、不是CEP152、不是CFL1、不是CKLF、不是COL7A1、不是CYP4F3、不是DYSF、不是GNAT1、不是GRAMD4、不是HYAL2、不是IL10、不是ITFG3、不是JAM3、不是KLHL17、不是KRT24、不是MAD2L1BP、不是MANSC1、不是MOBKL1B、不是NCBP1、不是NMU、不是PCDH1、不是PHOSPHO2、不是SPTA1、不是TMIGD2、不是TYROBP、不是ZIC5、不是ERGIC3、不是PDGFB、不是PSENEN、不是SATB1、不是SNXl1、不是TMEM79、不是EDIL3、不是PAPLN、不是TUBB6和／或不是YTHDF1。
在本发明的方法中可以利用任何适合的分析方法来评估(直接或间接)样品中生物标志物的表达水平。在某些实施方式中，当与生物标志物的对照表达水平相比时，在生物标志物的表达水平之间观察到差异。在一种实施方式中，所述差异大于用于确定生物标志物表达水平的方法的检测极限。在进一步的实施方式中，所述差异大于或等于评估方法的标准误差，并且优选地，所述差异比评估方法的标准误差大至少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约100倍、约500倍或约1000倍。在某些实施方式中，使用参数或非参数描述性统计学、比较、回归分析等来评估与对照表达水平相比的样品中生物标志物的表达水平。
在某些实施方式中，检测源自于受试者的样品中生物标志物的表达水平相对于对照的差异，并且所述差异为与对照样品中生物标志物的表达水平相比低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。
在从受试者获得的样品中生物标志物(例如表1中提出的生物标志物)的表达水平可以通过将样品中的生物标志物转变成可以检测和／或定量的部分的广泛的各种技术和方法中的任一种来测定。这样的方法的非限制性实例包括使用下述方法来分析样品：用于检测蛋白质的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交方法、核酸反转录方法和核酸扩增方法、免疫印迹、Western印迹、Northern印迹、电子显微术、质谱法例如MALDI-TOF和SELDI-TOF、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、酶联免疫吸附分析(ELISA)例如扩增ELISA、基于血液的定量分析例如血清ELISA、基于尿液的定量分析、流式细胞术、Southern杂交、阵列分析等，及其组合或子组合。
在一种实施方式中，通过检测生物标志物基因的转录多核苷酸或其部分例如mRNA或cDNA来确定样品中生物标志物的表达水平。可以使用RNA提取技术，包括例如使用酸性酚／异硫氰酸胍提取(RNAzol B;Biogenesis)、RNeasy RNA制备试剂盒(Qiagen)或PAXgene(PreAnal ytix，Switzerland)，从细胞提取RNA。利用核糖核酸杂交的典型分析方式包括核连缀分析(nuclear run-on assay)、RT-PCR、定量PCR分析、RNA酶保护分析(Melton等，Nuc.Acids Res.12：7035)、Northern印迹和原位杂交。适用于mRNA样品分析的其他系统包括微阵列分析(例如使用Affymetrix的微阵列系统或Illumina的BeadArray技术)。
在一种实施方式中，使用核酸探针来测定生物标志物的表达水平。当在本文中使用时，术语“探针”是指能够选择性结合特定生物标志物的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或源自于适合的生物制剂。通过添加或掺入标记物，可以将探针特别设计成被标记的。可以用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
正如上面指出的，分离的mRNA可以用于杂交或扩增分析(包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列)中。用于确定mRNA水平的一种方法包括将分离的mRNA与能够与生物标志物mRNA杂交的核酸分子(探针)相接触。核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分，例如长度为至少约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、250或约500个核苷酸并足以在适合的杂交条件下与生物标志物的基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。在特定实施方式中，探针在严格条件下结合生物标志物的基因组DNA。这样的严紧条件，例如在6X氯化钠／柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS中在50-65℃下清洗一次或多次，对于本领域技术人员来说是已知的，并可以在Ausubel等主编的《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(1995))的第2、4和6节中找到，所述文献的教导在此引为参考。其他的严格条件可以在Sambrook等的《分子克隆：实验指南》(Molecular Cloning：ALaboratory，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))的第7、9和11章中找到，所述文献的教导在此引为参考。
在一种实施方式中，通过例如将分离的mRNA在琼脂糖凝胶上电泳，并将mRNA从凝胶转移到膜例如硝酸纤维素而将mRNA固定在固体表面上并与探针相接触。在可选实施方式中，将探针固定在固体表面上、例如Affymetrix基因芯片阵列中，并将探针与mRNA相接触。专业技术人员可以容易地使mRNA检测方法适应于确定生物标志物mRNA的水平。
样品中生物标志物的表达水平也可以使用涉及利用核酸扩增和／或反转录酶(以制备例如样品中mRNA的cDNA)的方法测定，例如通过RT-PCR(实验实施方式在Mullis，1987，美国专利号4,683,202中提出)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：189-193)、自维持序列复制(Guatelli等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173-1177)、Q-13复制酶(Lizardi等，(1988)Bio／Technology6：1197)、滚环复制(Lizardi等，美国专利号5，854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后检测扩增的分子。这些方法对于以非常低的数量存在的核酸分子的检测特别有用。在本发明的特定方面中，生物标志物的表达水平通过定量产荧光RT-PCR(例如TaqManTM系统)来确定。这样的方法通常利用对生物标志物特异性的寡核苷酸引物对。用于设计对已知序列特异性的寡核苷酸引物的方法在本领域中是公知的。
生物标志物mRNA的表达水平可以使用膜印迹(例如在杂交分析中使用的，如Northern印迹、Southern印迹、斑点印迹等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或包含结合的核酸的任何固相载体)来监测。参见例如美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，其与这些测定法相关的内容在此引为参考。生物标志物表达水平的确定也可以包括使用溶液中的核酸探针。
在本发明的一种实施方式中，使用微阵列来检测生物标志物的表达水平。由于不同实验之间的可重复性，微阵列特别良好地适用于这一目的。DNA微阵列提供了一种用于同时测量大量基因的表达水平的方法。各个阵列由附着于固相载体的捕获探针的可重现图案构成。标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描来检测。确定阵列上各个探针的杂交强度，并将其转换成表示相对基因表达水平的定量值。参见例如美国专利号6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316，其与这些测定法相关的内容在此引为参考。高密度寡核苷酸阵列对于确定样品中大量RNA的基因表达谱来说特别有用。
生物标志物的表达也可以在蛋白质水平上使用直接或间接检测由生物标志物的mRNA编码的蛋白质产物的检测试剂来评估。例如，如果可以获得特异性结合待检测的生物标志物蛋白质产物的抗体试剂，那么这样的抗体试剂可用于使用例如免疫组织化学、ELISA、FACS分析等的技术来检测来自于受试者的样品中生物标志物的表达。
用于在蛋白质水平上检测生物标志物的其他已知方法包括诸如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散色谱等的方法，或各种免疫学方法例如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫荧光分析和Western印迹。
来自于样品的蛋白质可以使用多种不同技术来分离，包括本领域技术人员公知的技术。所使用的蛋白质分离方法可以是例如在Harlow和Lane(Harlow和Lane，1988，《抗体：实验指南》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Co1d Spring Harbor，New York)中描述的方法。
在一种实施方式中，在诸如Western印迹或免疫荧光技术的方法中使用抗体或抗体片段来检测表达的蛋白质。用于检测本发明的生物标志物的表达的抗体是可商购的。例如，ERGIC-3特异性抗体可以从Santa Cruz Biotechnology，Inc.(ERGIC-3(P-16)抗体和ERGIC-3(Y-23)抗体)和Sigma Aldrich(HPA015968、AV47209、HPA015242、SAB4502151)商购得到。PDGFB特异性抗体可以从Santa Cruz Biotechnology，Inc.(例如PDGF-B(C-5)抗体和PDGF-B(H-55)抗体)和Sigma Aldrich(例如HPA011972、SAB2101755和SAB2900226)商购得到。PSENEN特异性抗体可以从Origene(例如目录号TA306367)和Sigma A1drich(例如PRS3981、WH0055851M1、PRS3979和P5622)商购得到。其他例如SATB1抗体可以从例如Abcam(目录号ab49061、ab92307和ab70004)、Abnova Corporation(目录号PAB13379)和AvivaSystems Biology(目录号ARP33362_P050)商购得到。SNX11抗体可以从Abcam(目录号ab4128、ab67578、ab76816和ab76762)和Abnova Corporation(目录号PAB6362和H00029916-B01)商购得到。TMEM79抗体可以从例如Abcam(目录号ab81539)和SigmaAldrich(目录号SAB2102475)商购得到。最后，YTHDF1抗体可以从例如Abnova Corporation(目录号PAB17446))、Aviva Systems Biology(目录号ARP57032_P050)和Santa CruzBiotechnology(目录号sc-86026)商购得到。
一般来说，优选将抗体或蛋白质固定在固相载体上以用于Western印迹和免疫荧光技术。适合的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。公知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。
本领域技术人员知道用于结合抗体或抗原的许多其他适合的载体，并且能够改造这样的载体以适用于本发明。例如，可以将从细胞分离的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行，并固定到固相载体例如硝酸纤维素上。然后可以将载体用适合的缓冲液洗涤，然后用可检测的标记的抗体处理。然后可以将固相载体第二次用缓冲液洗涤以除去未结合的抗体。然后可以通过常规手段检测固相载体上结合的标记物的量。使用电泳技术检测蛋白质的手段对于本领域技术人员来说是公知的(总的来说参见R.Scopes(1982)《蛋白质纯化》(Protein Purification)，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher，(1990)MethodsinEnzymology Vo1.182：“蛋白质纯化指南”(Guide to Protein Purification)，AcademicPress，Inc.，N.Y.)。
其他标准方法包括免疫分析技术，其对于本领域普通技术人员来说是公知的，并且可以在《(免疫测定法原理和实践》(Principles And Practice Of Immunoassay，第二版，Price和Newman主编，MacMillan (1997))和《抗体实验指南》(Antibodies，ALaboratory Manual，Harlow和Lane主编，Cold Spring Harbor Laboratory，第9章(1988))中找到，各个所述文献在此以其全文引为参考。
在免疫分析中用于确定生物标志物的表达水平的抗体可以用可检测标记物标记。对于探针或抗体来说，术语“标记的”打算涵盖通过掺入标记物(例如放射活性原子)、将可检测物质偶联(即物理连接)到探针或抗体上来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂的反应性来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素末端标记DNA探针以使得能够用荧光标记的链霉亲合素检测。
在一种实施方式中，抗体是标记的，例如放射性标记、发色团标记、荧光团标记或酶标记的抗体。在另一种实施方式中，使用与生物标志物特异性结合的抗体衍生物(例如与底物或与蛋白质-配体对(例如生物素-链霉亲合素)中的蛋白质或配体偶联的抗体或者抗体片段(例如单链抗体或分离的抗体高变结构域)。
在本发明的一种实施方式中，使用蛋白质组方法例如质谱法。质谱法是由电离化学分子以产生带电荷分子(或其片段)和测量它们的质荷比所构成的一种分析技术。在典型的质谱分析程序中，从受试者获得样品，将其加载到质谱仪上，并将其组分(例如生物标志物)通过不同方法(例如用电子束撞击它们)进行电离，导致形成带电微粒(离子)。然后从离子越过电磁场时的运动计算微粒的质荷比。
例如，可以使用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)或表面增强激光解吸／电离飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)在蛋白质水平上确定生物标志物的表达水平，所述质谱法包括将生物样品例如血清施加到蛋白质结合芯片上(Wright，G.L，Jr.等，(2002)Expert Rev Mol Diagn2：549；Li，J.等，(2002)Clin Chem48：1296；Laronga，C.等，(2003)Dis biomarkers19：229；Petricoin，E.F.等，(2002)359：572；Adam，B.L.等，(2002)Cancer Res62：3609；Tolson，J.等，(2004)Lab Invest84：845；Xiao，Z.等，(2001)CancerRes 61：6029)。
此外，用于确定生物标志物的表达水平的体内技术包括将针对生物标志物的标记抗体引入到受试者中，所述抗体结合所述生物标志物并将其转变成可检测分子。正如上面讨论的，受试者中可检测的生物标志物的存在、水平或甚至位置可以通过标准的成像技术来检测。
总的来说，在检测生物标志物的表达水平与对照的差异时，优选地在来自于患乳腺癌并且正用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)治疗或正考虑用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)治疗的受试者的样品中生物标志物的表达水平与对照样品中生物标志物的量之间的差异尽可能大。尽管这种差异可以小到用于测定表达水平的方法的检测极限，但优选地所述差异大于方法的检测极限或大于评估方法的标准误差，并且所述差异优选地比评估方法的标准误差大至少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约100倍、约500倍、1000倍。
另一方面，本发明提供了用于确定艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌人受试者的方法，所述方法包括确定和／或鉴定所述受试者是否携带选自表1中列出的生物标志物的至少一个含有引起被编码蛋白的表达降低和／或功能降低的多态性(例如突变)的基因，其中在至少一个基因中存在多态性表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐在受试者的治疗中有效。另一方面，本发明提供了用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)在治疗患乳腺癌的受试者中是否有效的方法，所述方法包括分析源自于所述受试者的样品以确定所述受试者是否携带选自表1中列出的生物标志物的至少一个含有引起被编码蛋白的表达降低和／或功能降低的多态性(例如突变)的基因，其中在所述样品中至少一个基因中存在所述多态性表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐可用于治疗所述受试者。在进一步的方面，提供了用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐在治疗患乳腺癌的受试者中是否有效的方法，所述方法包括确定在源自于所述受试者的样品中引起编码选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物的基因的表达和／或功能降低的多态性的存在，并且根据所述多态性的存在预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐可用于治疗所述受试者。
在进一步的方面，本发明提供了用于确定乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗的敏感性的方法，所述方法包括确定和／或鉴定所述肿瘤是否在至少一个基因中含有引起被编码蛋白的表达和／或功能降低的多态性，其中所述基因选自表1中列出的生物标志物。肿瘤含有这样的多态性的鉴定和／或确定表明所述肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗的敏感性。再另一方面，本发明涉及使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐治疗患乳腺癌的受试者的方法，所述方法包括鉴定源自于所述受试者的样品是否具有选自表1中列出的生物标志物的至少一个含有引起被编码蛋白的表达和／或功能降低的多态性的基因，以及当鉴定到所述多态性时向受试者施用治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)。
另一个方面，本发明提供了用于确定艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者方法，所述方法包括确定和／或鉴定受试者是否携带选自表1中列出的生物标志物中的至少一个含有无效突变的基因，其中至少一个基因中存在无效突变表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐在治疗所述患者中有效。另一个方面，本发明提供了用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，所述方法包括分析源自于所述受试者的样品以确定所述受试者是否携带选自表1中列出的生物标志物的至少一个含有无效突变的基因，其中所述样品中至少一个基因中存在无效突变表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐在治疗所述患者中有效。在进一步的方面，提供了用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，所述方法包括确定源自于所述受试者的样品中选自表1中列出的生物标志物中的生物标志物中无效突变的存在，以及根据所述无效突变的存在来预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐可用于治疗所述受试者。
在进一步的方面，本发明提供了用于确定乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗的敏感性的方法，所述方法包括确定和／或鉴定所述肿瘤是否在选自表1中列出的生物标志物的至少一个基因中含有无效突变。所述肿瘤含有无效突变的鉴定和／或确定指示所述肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗的敏感性。再另一个方面，本发明涉及使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐来治疗患乳腺癌的受试者的方法，所述方法包括鉴定源自于所述受试者的样品是否具有选自表1中列出的生物标志物的至少一个含有无效突变的基因，并且在鉴定到无效突变时向受试者施用治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)。
当在本文中使用时，术语“无效突变”是指基因组DNA序列中导致基因产物无功能或基本上不存在的突变。这样的突变可能发生在基因的编码和／或调控区域中，并且可以是单个残基的变化或核酸区域的插入或缺失。这些突变也可以发生在可以调节或控制所述基因和／或基因产物的其他基因的编码和／或调控区域中以使所述基因产物无功能或基本上不存在。无效突变可以是原始基因或其部分的缺失。这些序列破坏或修饰可以包括DNA序列的插入、错义、移码、缺失或取代或替换，或其任何组合。例如，无效突变可能引起过早终止密码子的插入。无效突变通过例如下列方式引起基因产物的功能失活：部分或完全抑制其产生，破坏、抑制或减少蛋白质产物的翻译，或产生无功能的蛋白质。无效突变可能是受试者中已存在的突变或在肿瘤中出现的突变。生物标志物中无效突变的存在可以由生物标志物缺乏可检测的表达来指示。然而，无效突变的存在可以通过其他方法来确定。例如，在这样的实施方式中，可以对受试者的DNA样品进行测序以便鉴定无效突变的存在。在本发明的方法中可以使用任何用于测定生物标志物序列的公知方法，例如在美国专利号5,075,216；Engelke等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，544-548和Wong等，(1987)Nature330，384-386；Maxim和Gilbert(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：560或Sanger(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463中描述的方法。此外，可以利用多种自动化测序程序中的任一种，参见例如Naeve，C.W等，(1995)Biotechniques19：448，包括通过质谱法测序(参见例如PCT国际公布号WO94／16101；Cohen等，(1996)Adv.Chromatogr.36：127-162；和Griffin等，(1993)Appl.Biochem.Biotechno1.38：147-159)。
样品中无效突变的存在或不存在的确定也可以使用例如下面的各种技术来实现：聚合酶链反应(PCR)扩增反应、反转录酶PCR分析、单链构象多态性分析(SSCP)、错配切割检测、异源双链体分析、Southern印迹分析、Western印迹分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析、单倍型分析、血清分型及其组合或子组合。
从患乳腺癌的受试者获得的任何适合的样品可用于评估生物标志物(例如表1中提供的生物标志物)的表达水平，包括缺乏表达。例如，样品可以是任何流体或其组分例如级份或提取物，例如从受试者获得的血液、血浆、淋巴、囊液、尿液、乳头吸出液或从活检组织(例如肿块活检)收集的流体。在典型情况下，流体可以是从受试者获得的血液或其组分，包括全血或其组分，包括血浆、血清和血细胞例如红细胞、白细胞和血小板。样品也可以是从受试者获得的任何组织或其片段或组分，例如乳腺组织、结缔组织、淋巴组织或肌肉组织。
用于从受试者获得样品的技术或方法在本领域中是公知的，并包括例如通过口腔拭子或口腔清洗获得样品、抽血或获得活检样品。分离流体或组织样品的组分(例如细胞或RNA或DNA)可以通过多种技术来实现。
来自于癌的样品可以通过患者的癌的活检来获得。在某些实施方式中，从患者的肿瘤获得一个以上样品以便获得代表性的细胞样品用于进一步研究。例如，可以对乳腺癌患者进行针刺活检以获得癌细胞样品。可以使用肿瘤的几种活检样品来获得癌细胞样品。在其他实施方式中，样品可以从手术切除的肿瘤获得。在这种情形中，可以从切除的肿瘤获取一个或多个样品以使用本发明的方法进行分析。
在获得样品后，可以对其进行进一步处理。可以将癌细胞培养、清洗或通过其他方式进行选择以除去正常组织。可以将细胞用胰蛋白酶处理以从肿瘤样品中除去细胞。细胞可以通过荧光活化细胞分选(FACS)或其他细胞分选技术进行分选。可以将细胞培养以获得更大量的细胞用于研究。在某些情况下，可以将细胞永生化。对于某些应用来说，可以将细胞冷冻或者可以将细胞包埋在石蜡中。
II.使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的 治疗
由于观察到患乳腺癌受试者中某些生物标志物(例如表1中列出的生物标志物)的表达水平影响受试者对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的反应性，因此专业技术人员可以根据受试者中生物标志物的表达水平为所述受试者选择适合的治疗方案。因此，本发明提供了治疗患乳腺癌的受试者的方法，所述方法包括(i)鉴定患有其中选自表1中列出的生物标志物中的至少一个生物标志物具有低表达水平的乳腺癌的受试者，以及(ii)向所述受试者施用治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)。另一个方面，本发明提供了用于治疗患乳腺癌的受试者的方法，所述方法包括(i)分析源自于受试者的样品以确定选自表1中列出的生物标志物的至少一个生物标志物的表达水平，以及(ii)当在所述样品中检测到该至少一个生物标志物的低表达水平时，向所述受试者施用治疗有效量的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)。
在各种实施方式中，受试者可能以前已用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)治疗过。在其他实施方式中，受试者可能正考虑首次用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)进行治疗。确定在表1中确定的一种或多种，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物的表达水平。如果确定至少一种生物标志物(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物)的表达水平为低表达水平，则使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗可能是有效的。然而，不需要所有被测定的生物标志物与相应的对照相比都具有低表达水平。例如，尽管某些生物标志物可能以正常或高的表达水平存在，但当例如至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种生物标志物表现出低表达水平时，可以进行使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗。
当在源自于患乳腺癌的受试者的样品中发现一种或多种本发明的生物标志物的低表达水平时(例如由于在生物标志物基因中存在无效突变)，受试者可以用具有下列结构的艾日布林、用艾日布林的药学上可接受的盐或用艾日布林类似物或其药学上可接受的盐治疗。
在某些实施方式中，向受试者施用艾日布林的药学上可接受的盐例如艾日布林甲磺酸盐。
所选的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的治疗方案通常包括至少一种下列参数，更通常包括许多或所有下列参数：剂量、制剂配方、施用途径和／或施用频率。治疗方案的具体参数的选择可以基于在本领域中以前确立的艾日布林的已知治疗参数，例如在的FDA批准的标签中列出的剂量和给药方案中所描述的，在此以其全部内容引为参考。例如，艾日布林甲磺酸盐可以在21天的周期的第1和第8天，以例如1.4mg／m2的剂量，或者如果要求降低剂量(例如对于肝或肾损害来说)，以0.7mg／m2或1.1mg／m2的剂量静脉内给药。可以根据各种因素包括例如疾病、患者的年龄、性别和体重以及癌症的严重性或分期对剂量、制剂、施用途径和／或施用频率做出各种修改(参见例如美国专利号6,653,341和美国专利号6,469,182，其每个的全部内容在此引为参考)。
当在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指本文中所述的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)能够治疗乳腺癌的量。按照本发明施用的化合物的剂量当然将视病例的具体情况包括例如施用的化合物、施用途径、患者的状况和待治疗的病理情况例如乳腺癌的分期而定。
为了向受试者给药，艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)通常被配制成包含艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。治疗性组合物通常应该是无菌的，并且在制造和储存条件下足够稳定。药物组合物还可以在组合疗法中施用，即与其他药剂例如下面提出的药剂组合(参见例如美国专利号6,214,865和美国专利号6,653,341，其每个的全部内容在此引为参考)。
当在本文中使用时，“药学上可接受的载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于肠胃外(例如静脉内、肌肉内、皮下、鞘内)施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将活性化合物包被在材料中以保护化合物免于可能使化合物失活的酸和其他自然条件的作用。
药物组合物可以包括如上定义的一种或多种药学上可接受的盐。
存在大量类型的抗癌方法可以与本发明的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)治疗联合使用。这些方法包括例如使用化疗剂、生物药剂(例如激素药剂、细胞因子(例如白介素、干扰素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、趋化因子、疫苗抗原和抗体)、抗血管生成剂(例如血管抑素和内皮抑素)进行治疗、辐射和手术，正如在美国专利号6,653,341B1和美国公布号2006／0104984A1中更详细描述的，其教导内容在此以其全文引为参考。
本发明的方法可以利用这些方式来治疗与本领域中已知可使用所述方法治疗的类型相同的癌症类型以及其他癌症类型，正如可以由本领域技术人员所确定的。此外，这些方式可以按照与本领域中已知用于所述方式的参数(例如方案和剂量)相似的参数来进行。然而，正如在本领域中应该理解的，由于与这些方式一起另外使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)，因此可能希望调整这些参数中的一些参数。例如，如果一种药物通常作为单一治疗药剂给药，则当按照本发明与艾日布林组合时，可能希望降低所述药物的剂量，正如可以由本领域技术人员所确定的。下面提供了本发明的方法以及可以在这些方法中使用的组合物的实例。
几种不同类型的化疗药，尤其包括例如抗代谢物类、抗生素类、烷基化剂、植物生物碱、激素药剂、抗凝剂、抗血栓形成剂和其他天然产物等，可以与本发明的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐联合使用。这些药物种类以及可以使用它们治疗的癌症的具体而非限制性的实例如下。
用于施用抗癌药物的大量方法在本领域中是已知的，并且可以容易地适应用于本发明中。在一种或多种药物与艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)联合给药的情形中，该药物可以例如在单一组合物中一起给药，或者作为综合治疗方案的一部分单独地给药。对于系统性给药来说，药物可以通过例如静脉内输注(连续的或快速浓注)来给药。这样的给药的适当日程安排和剂量方案可以由本领域技术人员根据例如动物中的临床前研究和人类中的临床研究(例如I期研究)容易地确定。
用于施用化疗药物的许多方案包括例如静脉内施用药物(或多种药物)，然后在一段时间(例如1-4周)后重复这一治疗，在所述时间段中患者从治疗的任何不良副作用中恢复。在各次治疗时同时使用两种药物，或者作为可选方案在部分(或所有)治疗中仅包括一种药物(或亚集药物)可能是合乎需要的。
本发明的试剂盒
本发明还提供了用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的组合物和试剂盒。这些试剂盒包括用于确定选自表1中列出的生物标志物的至少一种，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物的表达水平的试剂，以及使用所述试剂盒来预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的说明书。
本发明的试剂盒可以任选地包含可用于进行本发明方法的其他组分。例如，试剂盒可以包含用于从受试者获得生物样品的试剂、对照样品和／或艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)。
在一种实施方式中，用于确定来自于受试者的生物样品中至少一种生物标志物的表达水平的试剂包括足以检测编码所述生物标志物的核酸例如mRNA的表达的核酸制剂。这种核酸制剂包括至少一个，并且可以包括一个以上核酸探针或引物，其序列被设计成使得所述核酸制剂能够检测来自于受试者的样品中编码所述生物标志物的核酸例如mRNA的表达。优选的核酸制剂包括两个或更多个PCR引物，其允许对编码目标生物标志物的mRNA的区段进行PCR扩增。在其他实施方式中，试剂盒包括用于表1中提供的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种生物标志物的每种的核酸制剂。
或者，检测受试者中预测对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)的反应性的一种或多种生物标志物的表达水平的试剂可以包含检测编码目标生物标志物的核酸的基因产物且足以将其与来自于受试者的样品中的其他基因产物区分开的试剂。这样的试剂的非限制性实例是足以检测来自于受试者的样品(例如外周血单核细胞样品)中至少一种生物标志物的蛋白质表达的单克隆抗体制剂(包含一种或多种单克隆抗体)。
用于检测表1的生物标志物的表达水平的手段还可以包括例如在用于评估表达(例如在核酸或蛋白质水平上)的测定法中使用的缓冲液或其他试剂。
在另一种实施方式中，试剂盒还可以包含如本文中所述用于在受试者中治疗乳腺癌或另一种癌症的艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐(例如艾日布林甲磺酸盐)。
优选地，试剂盒被设计成用于人类受试者。
本发明通过下面的实施例进行进一步说明，所述实施例不应被解释为进一步的限制。在整个本申请以及本文中提供的附图和序列附录中引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容在此明确地通过引用以其全文引入。
实施例
实施例1：艾日布林治疗的抗性生物标志物的鉴定
使用siRNA技术来“减低’’某些基因的表达，并评估得到的减低细胞对艾日布林的敏感性。基于这些研究，鉴定了在表1中列出的那些基因的表达与乳腺癌细胞对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗的敏感性相关。
siRNA转染的优化和分析法的建立
使用来自于Dharmacon的转染试剂DharmaFect1来优化人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC目录号HTB26TM)和BT-549(ATCC目录号HTB122TM)的转染条件。已报道MDA-MB-231和BT-549细胞系是雌激素受体(ER)阴性、孕酮受体(PR)阴性和HER-2阴性(三重阴性)的。作为非靶向阴性对照，我们使用了来自于Applied Biosystems的Silencer阴性对照#1siRNA。使用siGENOME TOX(siTOX)转染对照(Dharmacon)(被设计用于诱导细胞死亡的RNA双链体)作为细胞增殖分析的阳性对照。在所有实验中使用反向转染程序，其中首先将siRNA与转染试剂混合，然后向孔中添加细胞。在用与不同量DharmaFect1组合的siTOX试剂、培养基和阴性对照siRNA处理的细胞中，对细胞存活力进行比较。最终选择的转染条件如下：MDA-MB-231细胞为每孔0.035μl DharmaFect1，而BT-549细胞为每孔0.05μl DharmaFect1。分析和文库筛选在50nM的siRNA终浓度下进行。转染效率使用靶向PPIA和GAPDH基因的对照SMARTpool siRNA(Dharmacon)，通过qPCR来进一步确认。
高通量siRNA筛选
人类全基因组siRNA文库购自Dharmacon。将文库稀释至5μM。各个孔含有4种各自针对特定基因的SMARTpool siRNA试剂(靶向同一基因的4种siRNA在单一孔中)。使用这一文库靶定超过18,500个人类基因。将4μl的各组siRNA从文库板转移到384孔母板，其中各孔含有36μl OPTI-MEM培养基。向母板的各个孔加入40μl稀释的DharmaFect1试剂并混合。将每孔10μl siRNA和转染试剂混合物分配到5个筛选板中。温育10min后，向各个孔加入在40μl生长培养基中的细胞。各个筛选板包括几个重复的含有阴性对照siRNA、阳性对照siTOX以及培养基加转染试剂(无siRNA)的孔。温育24小时后，3个筛选板接受10μl在细胞生长培养基中稀释的DMSO，而两个重复板用10μ1生长培养基中的艾日布林甲磺酸盐(E7389)处理，以得到对应于E7389对测试细胞系的IC20的终浓度(对于MDA-MB-231来说为0.75nM E7389；艾日布林在DMSO原液中提供，并在生长培养基中稀释)(参见图1)。在转染后96小时，通过来自于Promega的CellTiter-Glo发光分析测定细胞存活率。各个孔使用10μl CellTiter-Glo溶液。将板在水平摇床上混合2分钟，温育10分钟，并在来自于PerkinElmer的多重标记读板器上读数。
初步命中的鉴定
对于细胞对E7389的敏感性具有显著影响的基因的鉴定通过与对紫杉醇siRNA筛选所描述的方法(Whitehurst等，(2007)Nature446：815-819)类似的方法来进行。简单来说，通过板上含有培养基加转染试剂的参比孔的平均值对各个孔的测量值进行归一化(32个孔／板)。对于DMSO和E7389处理的板来说，对生物学重复进行平均。对于各基因进行两个样品t-检验以鉴定对于使用两种不同条件处理的孔来说显著差异的值。为了缩减命中名单，通过将所有数据按照变化倍率(E7389平均值／DMSO平均值)以升序进行排列来考虑响应的量级。变化倍数在分布的最低5个百分位数中的364个基因通过截止水平。然后排除假设的开放阅读框和编码假设蛋白的基因，并将分析集中于剩余的240个基因(参见图2)。
确认分析
用于240个所选基因的siRNA SMARTpoo1以ON-TARGETplus的格式从Dharmacon订购。这些试剂含有修饰的正义链以防止与RISC相互作用并有利于反义链摄取。反义链种子区域被修饰以降低脱靶活性并提高靶特异性。这些试剂被用于确认性二次筛选。为了鉴定影响癌细胞对E7389的敏感性的共同基因，将BT-549乳腺癌细胞用240种所选siRNA的池进行筛选。筛选使用与用于MDA-MB-231的初次筛选相同的方案进行，其中各个孔中艾日布林甲磺酸盐(E7389)的终浓度对应于BT-549细胞的IC20(0.25nME7389)。
数据分析显示，当在两种细胞系中将E7389处理的孔与载体处理的孔相比时，240种siRNA的池中的40种进行的处理引起显著差异(表2)。
为了用siRNA池确认40个基因的特异性下调，进行了靶mRNA的定量PCR分析。按照上述方案，将MDA-MB-231和BT-549细胞用40种ON-TARGETplus siRNA或非靶向阴性对照siRNA转染。48小时后，将细胞裂解，并使用基因表达Cells-to-CTTM试剂盒(Applied Biosystems)，按照制造商的说明书合成cDNA。使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒，利用基因特异性QuantiTect Primer分析(Qiagen)，评估用siRNA处理后剩余的cDNA的相对量。分析结果示出在图4中。下面的18个基因在两种测试的细胞系中被下调超过50％：CFL1，NMU，MOBKL1B，HYAL2，PSENEN，CYP4F3，ITFG3，EDIL3，YTHDF1，CDC20，CCL26，TMEM79，MANSC1，DYSF，ERGIC3，GRAMD4，NCBP1，SNX11。14个基因在至少一种细胞系中被下调超过50％(PDGFB、APBB2、SATB1、MAD2L1BP、TUBB6、CEP152、KLH17、COL7A1、CKLF、PHOSPHO2、GNAT1、ABＩ3、TYROBP、IL10)，而其他3个基因在至少一种细胞系中被下调超过35％(ANG、ZIC5、JAM3)。SPTA1、PAPLN、PCDH1、TMIGD2和KRT24的表达在MDA-MB-231细胞中不能通过这种方法检测到，或者在BT-549细胞中在siRNA处理后不改变。上述结果表明，所述40个基因的下调可以引起对艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的敏感性增加。
表2.来自于MDA-MB-231和BT-549细胞的筛选的40个重叠基因的列表。显示了与对照相比的倍数变化(FC)和相关的p-值。
附录
生物标志物的核酸和氨基酸序列

Claims (50)

1.一种用于确定TUBB6的低表达水平的试剂和用于确定至少一种选自ABI3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、EDIL3、ERGIC3、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、KRT24、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PAPLN、PCDH1、PDGFB、PHOSPHO2、PSENEN、SATB1、SNX11、SPTA1、TMEM79、TMIGD2、TYROBP、YTHDF1和ZIC5的另外的生物标志物的低表达水平的试剂在制造用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐是否可以用于治疗患乳腺癌的受试者的方法的试剂盒中的用途，
其中所述试剂盒包含确定TUBB6以及所述至少一种另外的生物标志物在来源于所述受试者的样品中的表达水平的说明，并且其中所述说明表明所述TUBB6和所述至少一种另外的生物标志物的低表达水平表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐在治疗所述受试者中有效。
2.一种用于确定TUBB6的低表达水平的试剂和用于确定至少一种选自ABI3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、EDIL3、ERGIC3、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、KRT24、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PAPLN、PCDH1、PDGFB、PHOSPHO2、PSENEN、SATB1、SNX11、SPTA1、TMEM79、TMIGD2、TYROBP、YTHDF1和ZIC5的另外的生物标志物的低表达水平的试剂在制造用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐是否可以用于治疗患乳腺癌的受试者的方法的试剂盒中的用途，
其中所述试剂盒包含说明，以测试来源于所述受试者的样品，从而确定TUBB6以及所述至少一种另外的生物标志物在所述样品中的表达水平，并且其中所述说明表明所述TUBB6和所述至少一种另外的生物标志物的低表达水平表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐在治疗所述受试者中有效。
3.一种用于确定TUBB6的低表达水平的试剂和用于确定至少一种选自ABI3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、EDIL3、ERGIC3、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、KRT24、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PAPLN、PCDH1、PDGFB、PHOSPHO2、PSENEN、SATB1、SNX11、SPTA1、TMEM79、TMIGD2、TYROBP、YTHDF1和ZIC5的另外的生物标志物的低表达水平的试剂在制造用于预测乳腺肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗的敏感性的方法的试剂盒中的用途，
其中所述试剂盒包含确定TUBB6以及所述至少一种另外的生物标志物在所述肿瘤中的表达水平的说明，并且其中所述说明表明所述肿瘤中TUBB6和所述至少一种另外的生物标志物的低表达水平表明所述肿瘤对使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐的治疗敏感。
4.权利要求3的用途，其中所述乳腺肿瘤的样品从患乳腺癌受试者获得。
5.艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗患乳腺癌的受试者的方法的试剂盒中的用途，
其中所述试剂盒包含确定TUBB6以及至少一种选自ABI3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、EDIL3、ERGIC3、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、KRT24、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PAPLN、PCDH1、PDGFB、PHOSPHO2、PSENEN、SATB1、SNX11、SPTA1、TMEM79、TMIGD2、TYROBP、YTHDF1和ZIC5的另外的生物标志物在来源于所述受试者的样品中的表达水平的试剂和说明，并且其中所述说明表明所述TUBB6和所述至少一种另外的生物标志物的低表达水平表明所述受试者应使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐来治疗。
6.艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗患乳腺癌的受试者的方法的试剂盒中的用途，
其中所述试剂盒包含试剂和说明，以测试来源于所述受试者的样品，从而确定TUBB6以及至少一种选自ABI3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、EDIL3、ERGIC3、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、KRT24、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PAPLN、PCDH1、PDGFB、PHOSPHO2、PSENEN、SATB1、SNX11、SPTA1、TMEM79、TMIGD2、TYROBP、YTHDF1和ZIC5的另外的生物标志物在所述样品中的表达水平，并且其中所述说明表明所述TUBB6和所述至少一种另外的生物标志物的低表达水平表明所述受试者应使用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐来治疗。
7.权利要求1-6任一项的用途，其中所述艾日布林的药学上可接受的盐是艾日布林甲磺酸盐。
8.权利要求1-6任一项的用途，其中所述受试者以前没有用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐治疗过。
9.权利要求1-6任一项的用途，其中所述受试者以前用艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐治疗过。
10.权利要求1-6任一项的用途，其中所述乳腺癌是雌激素受体(ER)阴性乳腺癌。
11.权利要求1-6任一项的用途，其中所述乳腺癌是孕酮受体(PR)阴性乳腺癌。
12.权利要求1-6任一项的用途，其中所述乳腺癌是HER-2阴性乳腺癌。
13.权利要求1-6任一项的用途，其中所述乳腺癌是雌激素受体(ER)阴性和孕酮受体(PR)阴性乳腺癌。
14.权利要求1-6任一项的用途，其中所述乳腺癌是雌激素受体(ER)阴性和HER-2阴性乳腺癌。
15.权利要求1-6任一项的用途，其中所述乳腺癌是孕酮受体(PR)阴性和HER-2阴性乳腺癌。
16.权利要求1-6任一项的用途，其中所述乳腺癌是雌激素受体(ER)阴性、孕酮受体(PR)阴性和HER-2阴性乳腺癌。
17.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述试剂盒包含确定至少2种另外的生物标志物的表达水平的试剂和说明。
18.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述试剂盒包含确定至少3种另外的生物标志物的表达水平的试剂和说明。
19.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述试剂盒包含确定至少4种另外的生物标志物的表达水平的试剂和说明。
20.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述试剂盒包含确定至少5种另外的生物标志物的表达水平的试剂和说明。
21.权利要求1-6任一项的用途，其中试剂盒包含确定TUBB6与对照相比的表达水平的说明。
22.权利要求21的用途，其中TUBB6不以可检测水平表达。
23.权利要求1至6任一项的用途，其中所述试剂盒包含确定TUBB6在核酸水平上的表达水平的说明。
24.权利要求23的用途，其中所述试剂盒包含通过检测cDNA来确定TUBB6的表达水平的说明。
25.权利要求23的用途，其中所述试剂盒包含通过检测mRNA或miRNA来确定TUBB6的表达水平的说明。
26.权利要求23的用途，其中所述试剂盒包含通过检测DNA来确定TUBB6的表达水平的说明。
27.权利要求23的用途，其中所述试剂盒包含通过使用选自以下的技术来确定TUBB6的表达水平的说明：聚合酶链反应(PCR)扩增反应、反转录酶PCR分析、定量反转录酶PCR分析、Northern印迹分析、RNA酶保护试验、数字RNA检测/定量及其组合或子组合。
28.权利要求1至6任一项的用途，其中所述试剂盒包含在蛋白质水平确定TUBB6的表达水平的说明。
29.权利要求28的用途，其中所述试剂盒包含使用抗体或其抗原结合片段来确定TUBB6的表达水平的说明。
30.权利要求29的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段选自鼠抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、ScFv、SMIP、亲合体、avimer、versabody、纳米抗体、结构域抗体以及任何上述抗体的抗原结合片段。
31.权利要求29的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段被标记。
32.权利要求31的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段用选自放射性标记物、生物素标记物、发色团标记物、荧光团标记物和酶标记物的标记物标记。
33.权利要求26的用途，其中TUBB6的表达水平使用选自免疫测定法、western印迹分析、放射免疫测定法、免疫荧光法、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、ELISA测定法、免疫聚合酶链反应及其组合或子组合的技术来测定。
34.权利要求33的用途，其中所述免疫测定法是选自电化学发光、化学发光、产荧光化学发光、荧光偏振和时间分辨荧光的基于溶液的免疫测定法。
35.权利要求33的用途，其中所述免疫测定法是选自电化学发光、化学发光和产荧光化学发光的夹心免疫测定法。
36.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述样品包括流体或其组分。
37.权利要求36的用途，其中所述流体选自血液、淋巴、血清、血浆、囊液、乳头吸出液、尿液、痰液和从活组织检查收集的流体。
38.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述样品包含组织或其组分。
39.权利要求38的用途，其中所述组织选自乳腺组织、结缔组织、淋巴组织、从活组织检查获得的组织和从肿块活检获得的组织。
40.权利要求38的用途，其中所述组织是乳腺组织或其组分。
41.权利要求40的用途，其中所述乳腺组织的所述组分包含乳腺组织细胞。
42.权利要求41的用途，其中所述乳腺组织细胞是循环乳腺肿瘤细胞。
43.权利要求1、2、5或6的用途，其中所述受试者是人类受试者。
44.一种用于预测艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐是否可用于治疗患乳腺癌的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含
用于测定TUBB6的表达水平的试剂和用于测定至少一种选自ABI3、ANG、APBB2、CCL26、CDC20、CEP152、CFL1、CKLF、COL7A1、CYP4F3、DYSF、EDIL3、ERGIC3、GNAT1、GRAMD4、HYAL2、IL10、ITFG3、JAM3、KLHL17、KRT24、MAD2L1BP、MANSC1、MOBKL1B、NCBP1、NMU、PAPLN、PCDH1、PDGFB、PHOSPHO2、PSENEN、SATB1、SNX11、SPTA1、TMEM79、TMIGD2、TYROBP、YTHDF1和ZIC5的另外的生物标志物的表达水平的试剂；以及
使用所述试剂盒来确定TUBB6和所述至少一种另外的生物标志物在来源于所述受试者的样品中的表达水平的说明书，其中所述说明书表明所述TUBB6和所述至少一种另外的生物标志物的低表达水平表明艾日布林、其类似物或其药学上可接受的盐可以用于治疗所述受试者。
45.权利要求44的试剂盒，其中所述艾日布林的药学上可接受的盐是艾日布林甲磺酸盐。
46.权利要求44的试剂盒，其中所述用于测定TUBB6的表达水平的试剂是用于鉴定所述生物标志物中的无效突变的探针。
47.权利要求44的试剂盒，其中所述用于测定TUBB6的表达水平的试剂是用于扩增和/或检测所述生物标志物的探针。
48.权利要求44的试剂盒，其中所述用于测定TUBB6的表达水平的试剂是抗体。
49.权利要求44的试剂盒，其还包含用于从受试者获得生物样品的试剂。
50.权利要求44的试剂盒，其还包含对照样品。
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