CN103555830A - 用于多重扩增短串联重复基因座的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
公开了用于在单个多重反应中同时扩增基因组DNA的至少11个特定STR基因座的方法和材料，还公开了用于分析该反应产物的方法和材料。本发明包含了用于在单个多重反应中同时扩增16个特定基因座的方法和材料，包含10个AmpFISTR?SGMplus?STR基因座、Amelogenin基因座、以及5个新STR基因座，包括用于分析这些基因座的方法和材料。
Description
本申请是国际申请日为2008年10月30日、国际申请号为PCT／US2008／081861、进入国家阶段的申请号为200880122932.6、发明名称为“用于多重扩增短串联重复基因座的方法和试剂盒”的PCT申请的分案申请。
与相关申请的交叉引用
本申请要求根据35U.S.C.§119(e)的来自2008年10月30日提交的美国专利申请号60／983,737的优先权权益，所述申请在此通过引用并入本文。
介绍
本发明的教导一般地涉及基因组系统中遗传标记的检测。在各实施方案中，在多重反应中同时扩增多个不同的多态性遗传基因座，以确定每个基因座的等位基因。所分析的多态性遗传基因座可以是短串联重复(STR)基因座，其还可包括产生约200个碱基对或更少的扩增子的微-STR。
附图简述
本领域技术人员将理解以下描述的附图仅用于解释的目的。该附图不意图以任何方式限制本发明教导的范围。
图1是显示了通过多重扩增15个STR基因座(10个
基因座加上5个新基因座)和Amelogenin性别决定基因座(Amel)所产生的扩增子的相对大小范围(以碱基对为单位)的图，如实施例中所述。
图2是从5-色荧光检测同时扩增
STR基因座VWA(vWA)，D16S539(D16)，D2S1338，D8S1179(D8)，D21S11(D21)，D18S51(D18)，D19S433(D19)，TH01，FGA，D3S1358(D3)、性别决定基因座Amelogenin(Amel)以及5个新STR基因座(圈出了)D10S1248(D10)，D22S1045(D22)，D2S441，D1S1656(D1)和D12S391(D12)的产物所产生的图。从人类基因组DNA样品扩增基因座，并且用ABI
3130x1遗传分析仪进行检测，如实施例中所述。从上至下的四个图相应于6-FAMTM、NEDTM和
染料标记的峰(第5种染料LIZTM用于标记大小标准品，并且未显示)。每一图的x轴测量了扩增产物的以碱基对为单位的大小。
图3是如在实施例中所使用的5种荧光染料(6-FAMTM、
NEDTM、
和LIZTM)加上能用于6染料多重反应中的额外的第六种染料(SID)的发射谱图(波长的单位为nm)。
各实施方案描述
在本说明书中所使用的多数词语具有本领域技术人员所理解的这些词的含义。在本说明书中明确定义的词语具有在本教导上下文中作为整体所提供的、并且如本领域技术人员所一般理解的含义。在词语或短语的本领域所理解的定义与该词语或短语的在本说明书中明确教导的定义有矛盾时，以说明书为准。本文所使用的标题仅仅为了方便，并且不理解为以任何方式限制。
如本文所使用的“DNA”指如本领域所理解的以其各种形式的脱氧核糖核酸，诸如基因组DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA以及染色体DNA。“核酸”是指任何形式的DNA或RNA(核糖核酸)。如本文所使用的术语“分离的核酸分子”是指已从其自然环境中移去的核酸分子(DNA或RNA)。分离的核酸分子的一些实例是在载体中含有的重组DNA分子、维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子、部分或基本上纯化的核酸分子以及合成的DNA分子。“分离的”核酸可以没有这样的序列，即所述序列在该核酸衍生自其中的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸的侧翼(即，位于该核酸5’和3’端的序列)。此外，当通过重组技术产生时，“分离的”核酸分子(诸如cDNA分子)可以基本上没有其它细胞材料或培养基，或当化学合成时其基本上没有化学前体或其它化学物质。
“短串联重复”或“STR”基因座指含有短、重复序列元件的基因组DNA区域。所述重复的序列元件不限于但一般地为3至7个碱基对长度。每一序列元件在STR中至少重复一次，并且在本文中称为“重复单位”。术语STR还包括这样的基因组DNA区域，即其中超过一个重复单位串联地或具有中间碱基地重复，条件是至少一个序列串联地重复至少两次。
“多态性短串联重复基因座”指这样的STR基因座，其中在基因组DNA特定区域的重复序列元件数目(以及序列净长度)在等位基因间、以及在个体与个体之间不同。
如本文所使用的“等位基因梯”是指由扩增的来自基因座的等位基因组成的标准大小标记物。“等位基因”是指与DNA区段相关的遗传变异，即占据相同基因座的DNA序列的两个或多个备选形式之一。
“生物化学命名法”是指如在本文所使用的标准生物化学命名法，其中核苷酸碱基命名为腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。相应的核苷酸例如为脱氧鸟苷-5’-三磷酸(dGTP)。
“DNA多态性”是指其中DNA序列中的两种或更多种不同核苷酸序列共存于同一杂种繁殖的群体中的情况。
“基因座”或“遗传基因座”是指染色体上的特定物理位置。基因座的等位基因位于同源染色体上的相同位置。
“基因座特异性引物”是指与所指明的基因座的部分或其互补链特异性杂交的引物，其至少用于该基因座的一个等位基因，并且在用于该扩增方法的条件下不与其它DNA序列有效地杂交。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中使用变性、与引物退火、以及用DNA聚合酶延伸的重复循环来约106倍或更多地扩增靶DNA序列拷贝数的技术。用于扩增核酸的PCR方法由美国专利号4,683,195和4,683,202所覆盖，其在此通过引用将其全文地并入本文，用于描述该方法。用于任意PCR的反应条件包括反应的化学成分以及它们的浓度、在反应循环中使用的温度、反应的循环数以及反应循环阶段的持续时间。
本文所使用的“扩增”是指用酶增加特定核苷酸序列量的方法。这一扩增不限于但一般通过PCR完成。如本文所使用的，“变性”是指将两条互补核苷酸链从退火状态分开。可通过许多因素，诸如例如破坏碱基配对相互作用的缓冲液的离子强度、温度或化学物质来诱导变性。如本文所使用的，“退火”是指核苷酸链之间的特定相互作用，其中所述链基本上基于如通过Watson-Crick碱基配对所确定的链之间的互补性彼此结合。对于发生退火，不需要100％的互补性。如本文所使用的，“延伸”是指在引物寡核苷酸与靶核酸退火之后的扩增循环，其中聚合酶应用靶核酸作为复制模板实现引物延伸为适当大小的片段。
“引物”是指单链寡核苷酸或DNA片段，其与基因座的DNA链以此种方式杂交从而使得该引物的3’端可作为应用DNA聚合酶聚合并延伸的位点。“引物对”是指两条引物，其包含在待扩增的DNA序列的一端与单链杂交的引物1，以及与该待扩增的DNA序列的互补链的另一端杂交的引物2。“引物位点”是指引物与之杂交的靶DNA的区域。
“遗传标记”一般是具有用于分析(诸如DNA分型)的目的性状的基因组DNA等位基因，其中个体基于它们DNA中的变异而区别。多数DNA分型方法被设计以检测和分析群体中已知以至少两种不同形式或等位基因出现的一个或更多个DNA标记区域的长度和／或序列差异。此类变异称为“多态性”，并且其中发生了此类变异的DNA的任何区域称为“多态性基因座”。进行DNA分型的一种可能方法包括结合PCR扩增技术(KB Mullis，美国专利号4,683,202)和长度变异多态性的分析。传统上PCR仅能可靠地用于扩增相对小的DNA片段，即仅能扩增3000个碱基长度以下的DNA片段(M.Ponce和L.Micol(1992)，NAR20(3)：623；R.Decorte等(1990)，DNA CELL BI0L.9(6)：461469)。短串联重复(STR)、微卫星和可变数目串联重复(VNTR)是长度变异多态性的一些实例。含有微卫星或VNTR的DNA片段通常太长而不能通过PCR可靠地扩增。相反，含有约3至7个核苷酸的重复单位的STR足够短以在PCR应用中用作遗传标记，因为可以设计扩增方案以产生比可能来自DNA的其它可变长度区域更小的产物。
通常期望在单个扩增反应和分离的过程中同时扩增并检测多个基因座。此类同时靶向若干个用于分析的基因座的系统称为“多重”系统。已描述了含有多个STR基因座的若干种此类系统。例如参见
SGMPLUSTM PCR扩增试剂盒用户手册，AppliedBiosystems，第i-x和1-1至1-16页(2001)；
PCR扩增试剂盒用户手册，Applied Biosystems，第i-x和1-1至1-10页(2001)；JW Schumm等，美国专利号7,008,771。
若干个国家的政府保持了DNA分型信息数据库。联合王国的国家DNA数据库(NDNAD)是最大的此类数据库，具有约270万人的DNA概况。H.Wallace(2006)，EMBO REPORTS7：S26-S30(引自内政部，2006)。从1999年开始，NDNAD中的DNA概况已基于AppliedBiosystems开发的系统，同上。在DNA概况分析系统中重复发生的问题是当他们的DNA样品降解时如何鉴定个体。在欧洲和美国的实验室中已进行了许多研究，以比较常规STR(扩增子大小为约100至约450个碱基对的范围)和微-STR(约200个碱基对或更少的扩增子)作为分析降解的DNA样品的遗传标记。例如参见LA Dixon等(2006)，FORENSIC Sci.INT.164(1)：33-44。结果表明用更小尺寸的扩增子改善了从分析降解的DNA样品获得成功结果的机会，诸如从微-STR基因座获得。同上，MD Coble和JM Butler(2005)，J.FORENSICSci.50(1)：43-53。欧洲法庭科学研究所网(The European Network ofForensic Science Institutes(ENFSI))和欧洲DNA概况分析(EDNAP)组赞同应当重新设计用于DNA分型的多重PCR系统以能够进行小扩增子检测，并且欧洲内部的概况分析系统标准化应当考虑微-STR。P.Gill等(2006)，FORENSIC SCI.INT.156(2-3)：242-244。本发明的教导涉及在单个反应中同时分析多个长度变异多态性。本发明教导的各个实施方案将微-STR基因座并入了多重扩增系统中。这些系统可用于各种应用，包括它们在DNA分型中的应用。
本发明教导的方法考虑了选择合适的基因座集、引物和扩增方案，以从多个共-扩增基因座产生扩增的等位基因(扩增子)，所述扩增子可被设计以便在大小上不重叠，和／或可被用此种方式标记以使得可区别来自不同基因座的在大小上重叠的等位基因。此外，这些方法还考虑了选择多个STR基因座，其与使用单扩增方案的应用是兼容的。本文描述的基因座的特定组合在这一应用中是独特的。在本发明教导的各个实施方案中，教导了共扩增15个STR基因座，其包含至少8个具有少于约200个碱基对的最大扩增子大小的微-STR基因座。
除了本文描述的那些之外的成功组合例如可通过基因座组合的试验和误差、通过选择引物对序列、以及通过调整引物浓度以鉴定其中所有用于分析的基因座均可被扩增的平衡来产生。一旦公开了这些教导的方法和材料，则选择用于这些教导的方法和试剂盒中的基因座、引物对和扩增技术的各种方法也类似地暗示给了本领域技术人员。预期所有的此类方法均在所附权利要求的范围之内。
本发明教导的方法的实施可从选择包含D16S539，D18S51，D19S433，D21S11，D2S1338，D3S1358，D8S1179，FGA,TH01，VWA，以及D10S1248，D12S391，D1S1656，D22S1045，和D2S441中至少之一的至少11个STR基因座的集开始，所有的基因座均可在单个多重扩增反应中共扩增。除了这些15个列出的基因座之外的或附加的其它基因座也可以包含在该多重扩增反应当中。选择基因座和用于在本发明教导的多重扩增反应中扩增该基因座的寡核苷酸引物的可能方法描述于本文并在以下实施例中阐述。
可使用许多不同技术的任一个来选择用于本发明教导的基因座集。开发用于这一分析方法的有用基因座集的一个技术描述于以下实例中。一旦开发了含有该至少11个STR基因座的多重技术，则其可用作核心以产生含有超过这些11个基因座、以及含有除STR基因座之外基因座(例如，性别决定基因座)的多重技术。因此可产生包含该最先的11个STR基因座的超过11个基因座的新组合。
不管应用何种方法选择通过本发明教导的方法进行分析的基因座，所选择的用于各实施方案中多重分析的基因座共有以下特征的一个或更多个：(1)它们产生足够的扩增产物以允许进行DNA的等位基因评估；(2)在多重扩增步骤期间，它们产生很少的(如果有的话)由于在有效靶基因座的延伸期间掺入其它的碱基或产生非特异性扩增子而产生的假象；以及(3)它们产生很少的(如果有的话)由于通过聚合酶的扩增反应的过早终止而产生的假象。例如，参见JW Schumm等(1993)，FOURTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON HUMANIDENTIFICATION，第177-187页，Promega Corp。
如本文所使用的用于特定STR基因座的术语是指本领域公知的对这些基因座的命名。例如，在以下列表中的各种参考文献中以及通过不同的登录号识别基因座，其在此通过引用全文并入本文。以下的参考文献列表仅仅意图是例示基因座信息的来源。关于包含这些基因座并预期用于靶扩增的DNA区域的信息是公众可获得的，并且通过查询以下或其它参考文献和／或登录号而很容易地获得。在合适的情况下，呈现了提交时的当前登录号，如通过
(National CenterforBiotechnology Information，Bethesda，MD)所提供的那样。例如，对于基因座D3S1358，参见H.Li等(1993)，HUM.MOL.GENET.2：1327；对于D12S391，参见MV Lareu等(1996)，GENE182：151-153；对于D18S51，参见RE Staub等(1993)，GENOMICS15：48-56；对于D21S11，参见V.Sharma和M.Litt(1992)，Hum.MOL.GENET.1：67；对于FGA(FIBRA)，参见KA Mills等(1992)，HUM.MOL.GENET.1：779；对于TH01，参见A.Edwards(1991)，AM.J.HUM.GENET.49：746-756和MH Polymeropoulos等(1991)，NUCLEIC ACIDS RES.19：3753；对于VWA(vWF)，参见CP Kimpton等(1992)，HUM.MOL.GENET.1：287；对于D10S1248，参见MD Coble和JM Butler(2005)，J.FORENSIC SCI.50(1)：43-53；对于D16S539，参见J.Murray等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center，登录号G07925；对于D2S1338，参见J.Murray等(1995)，未出版的，Cooperative HumanLinkage Center，登录号G08202和Watson等PROGRESS INFORENSIC GENETICS7：PROCEEDINGS OF THE17THINT’L ISFHCONGRESS，OSLO，1997年9月2-6，B.Olaisen等，编辑，第192-194页(Elsevier，Amsterdam)；对于D8S1179，参见J.Murray等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center，登录号G08710，以及NJOldroyd等(1995)，ELECTROPHORESIS16：334-337；对于D22S1045，参见J.Murray等(1995)，未出版的，Cooperative Human LinkageCenter，登录号G08085；对于D19S433，参见J.Murray等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center，登录号G08036，以及MVLareu等(1997)，PROGRESS IN FORENSIC GENETICS7：PROCEEDINGS OF THE17TH INT’L ISFH CONGRESS，OSLO，1997年9月2-6，B.Olaisen等编辑，第192-200页，Elsevier，Amsterdam；对于D2S441，参见J.Murray等(1995)，未出版的，Cooperative HumanLinkage Center，登录号G08184；对于D1S1656，参见J.Murray等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center，登录号G07820。
微-STR(少于约200碱基对的基因座)扩增允许对高度降解的DNA进行概况分析，如在MD Coble(2005)，J.FORENSIC SCI.50(1)：43-53中所证实的那样，其在此通过引用并入本文。图1显示了对于所有15个上述基因座加上用于确定大小的Amelogenin基因座的基因座大小范围。如可在图1中看到的那样，在前述列表中鉴定的8个基因座包括此类微-STR基因座：D10S1248，VWA，D8S1179，D22S1045，D19S433，D2S441，D3S1358和D1S1656。
选择用于根据这些教导的共扩增和分析的基因座集可以除了该至少11个STR基因座外还包含至少一个基因座。附加的基因座可以包含STR或其它序列多态性，或任意其它特征，例如，其鉴定了将一个个体的DNA与该群体中其它个体的DNA分开的特性。附加基因座还可以是鉴别所分析的DNA样品来源性别的基因座。当DNA样品是人类基因组DNA时，可以选择诸如Amelogenin基因座的性别鉴定基因座用于根据本发明方法的共扩增和分析。Amelogenin基因座被GenBank鉴定为HUMAMELY(当用于鉴定男性DNA中存在的Y染色体中的基因座时)，或鉴定为HUMAMELX(当用于鉴定男性或女性DNA中存在的X染色体中的基因座时)。
一旦鉴定了用于在单个多重反应中共扩增的基因座集，则可确定适于共扩增该集中每一基因座的引物。可将寡核苷酸引物添加到反应混合物中并用来界定扩增的DNA片段5’和3’端。一个寡核苷酸引物退火至变性模板DNA的有义(+)链，并且另一寡核苷酸引物退火至该变性模板DNA的反义(-)链。寡核苷酸引物一般可为约12-25个核苷酸长，但是它们的大小可取决于诸如以下的参数而很大不同，例如待扩增模板序列的碱基组成、扩增反应条件等。引物的具体长度对于这些教导的操作不是关键的。可以设计寡核苷酸引物以退火至目的基因座侧翼的DNA的特定部分，以便特异性地扩增引物互补位点之间的DNA部分。
寡核苷酸引物可包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶，以及尿嘧啶、核苷类似物(例如，但不限于次黄嘌呤核苷、锁定核酸(LNA)、非核苷酸连接子、肽核酸(PNA)和phosporamidites)以及含有或与化学部分缀合的核苷，其中所述化学部分诸如放射性核素(例如，32P和35S)、荧光分子、小沟结合物(MGB)、或本领域公知的任何其它核苷缀合物。
一般地，可化学合成寡核苷酸引物。在PCR优化中引物设计和选择是常规步骤。本领域普通技术人员可容易地设计用于扩增目的靶基因座的特异引物，或从本文列出的参考文献中获得引物集。所有的这些引物都在本发明教导的范围之内。
在选择用于多重反应的引物序列时应当小心。引物的不恰当选择可能产生不期望的结果，诸如缺乏扩增、在预期的靶基因座之外的一个或多个位点扩增、引物-二聚体形成、不同基因座的引物间的非期望相互作用、从与来自另一基因座的等位基因重叠(在大小上)的一个基因座的等位基因产生扩增子、或需要特别地适于每一不同基因座的扩增条件或方案，其中所述条件／方案在单个多重系统是不兼容的。例如可通过本领域普通技术人员很熟悉的多重优化的反复过程开发和选择用于这一教导的多重系统的引物：选择引物序列、混合用于共扩增所选择的基因座的引物、共扩增该基因座、然后分离并检测扩增产物以确定扩增中的引物有效性。
作为引物选择的实例，可以选择在本文所引用的参考文献中鉴定的或在其它参考文献中描述的能用于扩增上述基因座中任一个的单个引物和引物对来扩增和分析根据本发明教导的STR基因座。作为另一实例，可通过应用可获得的并且本领域公知用于开发扩增和／或多重系统的各种软件程序的任一个来选择引物。例如参见Primer
软件(Applied Biosystems，Foster City，Calif)。在应用软件程序的实例中，可将来自目的基因座区域的序列信息输入该软件。该软件然后应用各种算法来选择最符合用户技术要求的引物。
开始，这一引物选择过程可能产生任意的上述扩增中的非期望效果，或者扩增产物的不平衡，即从一些基因座产生比其它基因座更多的产物，这是因为一些引物和它们各自的靶之间比其它引物更强的结合强度，例如导致对于一些基因座的优选的退火和扩增。或者，引物可能产生不代表靶基因座等位基因本身的扩增产物，即可能产生非特异性扩增产物。这些由不好的引物设计所产生的无关产物可能是由于例如引物与样品DNA中非靶区域退火，或甚至与其它引物退火，随后在退火之后扩增。
当在引物选择期间在多重系统中存在非平衡或非特异性扩增产物时，可从总多重集中取出单个引物，并且与来自相同或其它基因座的引物用于扩增，以鉴定哪些引物促成了扩增不平衡或假象。一旦鉴定了产生一种或更多种假象或不平衡的两个引物，则可修饰一个或两个贡献者，并且单独成对地或在多重系统(或多重系统的子集)中再测试。可重复这一过程，直到在多重系统中产物评估产生没有扩增假象或有可接受水平的扩增假象的扩增的等位基因。
引物浓度的优化可在确定最终引物序列之前或之后进行，但是最经常在引物选择之后进行。一般地，增加任何特定基因座的引物的浓度会增加为该基因座产生的产物量。然而，引物浓度优化也是反复的过程，因为例如增加来自一个基因座的产物产量可能会减少来自另一基因座或其它复数的基因座的产量。此外，引物可能会相互作用，其可能直接影响来自各基因座的扩增产物产量。总之，特定引物集浓度的线性增加并不必然地等于相应基因座扩增产物产量的线性增加。有关基因座特异性引物更详细的描述，参见MJ Simons美国专利号5,192,659，其教导通过引用而全文并入本文。
在多重反应中基因座-基因座间扩增产物平衡还可能受到扩增方案的许多参数的影响，例如，诸如模板(样品DNA)输入量、所使用的扩增循环数、热循环方案的退火温度以及在循环步骤的的末尾包括或不包括额外的延伸步骤。在所有等位基因和基因座中扩增产物产量的绝对均匀平衡尽管在理论上是期望的，但一般无法在实践中实现。
确定包含多重系统的基因座和开发这一系统反应条件的步骤也可以是反复的步骤。也就是，可首先开发用于小量基因座的多重系统，这一系统没有或几乎没有扩增假象和产物不平衡。然后可将这一系统的引物与期望用于分析的另一基因座或若干个其它基因座的引物联合。这一扩增的引物组合可能或可能不产生扩增假象或不平衡产物产量。反过来，可从该系统移除一些基因座，和／或可引入并评估新基因座。
可重复上述一个或更多个反复选择步骤，直到鉴定出完整的引物集，其可用于共扩增上述至少11个选择用于共扩增的基因座，包括STR基因座VWA，D16S539,D2S1338，D8S1179，D21S11，D18S51，D19S433，TH01，FGA,D3S1358，以及D10S1248，D22S1045，D2S441，D1S1656，和D12S391中的一个或更多个。应当理解可以开发许多不同的引物集，以扩增特定的基因座集。用于本发明教导的引物的合成可应用本领域技术人员公知的用于寡核苷酸合成的任意标准方法进行，和／或可商购获得。在本发明的各实施方案中，可在一个多重扩增系统中扩增所有15个这些STR基因座.VWA，D16S539，D2S1338，D8S1179，D21S11，D18S51，D19S433，TH01，FGA，D3S1358，D10S1248，D22S1045，D2S441，D1S1656，和D12S391。在本发明教导的其它实施方案中，可在一个多重扩增系统中共扩增所有15个这些STR基因座，以及且包括用于确定DNA样品来源性别的Amelogenin基因座。
可使用与随后的DNA扩增相容的任何样品制备方法制备用于本发明教导的方法的基因组DNA样品。许多此类方法是本领域技术人员公知的。一些实例是通过苯酚抽提的DNA纯化(J.Sambrook等(1989)，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，pp.9.14-9.19)、以及通过盐沉淀(S.Miller等(1988)，NUC L.ACIDS RES.16：1215)或chelex(PS Walsh等(1991)，BIOTECHNIQUES10：506-513；CT Comey等(1994)，J.FORENSIC Sci.39：1254)的部分纯化，以及应用未处理的血释放未纯化的材料(J.Burckhardt(1994)，PCRMETHODS AND APPLICATIONS3：239-243；RBE McCabe(1991)，PCR METHODS AND APPLICATIONS1：99-106；BY Nordvag(1992)，BIOTECHNIQUES12：4pp.490-492)。
当待应用这一教导的方法进行分析的至少一个DNA样品是人类基因组DNA时，可从组织样品制备DNA，所述组织样品例如，诸如是血液、精液、阴道细胞、毛发、唾液、尿、骨、口腔样品、含有胎盘细胞或胎儿细胞的羊膜水、绒膜绒毛、和／或任意这些的混合物或其它组织的一种或更多种。
任选地，可在用于本发明教导的方法之前使用本领域技术人员公知的DNA定量的任何标准方法测量DNA浓度。此类定量方法例如包括如由J.Sambrook等(1989)，同上，Appendix E.5中描述的分光光度测量；或应用诸如由CF Brunk等(1979)，ANAL.BIOCHEM.92：497-500描述的测量技术的荧光测定方法。可通过比较DNA标准品与诸如由JS Waye等(1991)，J.FORENSIC SCI.36：1198-1203(1991)中描述的人特异性探针的杂交量测量DNA浓度。在扩增反应中使用太多的模板DNA可能产生可能不代表真实等位基因的扩增假象。
一旦制备了基因组DNA样品，可在本发明教导的多重扩增步骤中共扩增靶基因座。可以使用许多不同扩增方法中的任一种扩增该基因座，例如，诸如PCR(RK Saiki等(1985)，SCIENCE230：1350-1354)、基于转录的扩增(DY Kwoh和TJ Kwoh(1990)，AMERICANBIOTECHNOLOGY LABORATORY，1990年10月)以及链置换扩增(SDA)(GT Walker等(1992)，PROC.NATL.ACAD.SCI.，U.S.A.89：392-396)。在本发明教导的一些实施方案中，可通过PCR实现多重扩增，其中使用特异于该多重中每一基因座的引物对进行DNA样品的扩蹭。
标准PCR的化学成分一般包括溶剂、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(“dNTPs”)、寡核苷酸引物、二价金属离子、以及预期含有PCR扩增靶的DNA样品。一般可使用水作为PCR的溶剂，其一般包含缓冲剂和非缓冲盐诸如KCl。缓冲剂可以是本领域公知的任意缓冲剂，诸如，但不限于Tris-HCl，并且可通过常规实验进行变化以最优化PCR结果。本领域普通技术人员能很容易地确定最佳的缓冲条件。可依赖于用于扩增的特定酶优化PCR缓冲液。
二价金属离子通常对于允许聚合酶有效工作是有利的。例如，镁离子是允许一些DNA聚合酶有效工作的一种离子。一般地，可将MgCl2或MgSO4加入到反应缓冲液中以提供最佳的镁离子浓度。最佳PCR扩增所需的镁离子浓度可能取决于所使用的特定引物集以及模板。通常经验地确定为达到最佳扩增所添加的镁盐量，并且是本领域的常规实践。一般地，对于最佳PCR的镁离子浓度可以在约1至约10mM之间变化。在PCR中镁离子浓度的一般范围可以是约1.0至约4.0mM，在约2.5mM的中点周围变化。备选地，可使用二价离子锰，例如以二氧化锰(MnO2)的形式，滴定至适于最佳聚合酶活性的浓度，这可通过本领域技术人员使用标准实验室方法而很容易地确定。
在扩增核酸分子中使用的构件模块dNTP一般可以以例如约40-200μM的脱氧腺苷三磷酸(“dATP”)、脱氧鸟苷三磷酸(“dGTP”)、脱氧胞苷三磷酸(“dCTP”)和脱氧胸苷三磷酸(“dTTP”)的每一种的浓度在标准PCR中提供。还可以使用其它dNTP，诸如脱氧尿苷三磷酸(“dUTP”)、dNTP类似物(例如，次黄嘌呤核苷)、以及缀合的dNTP，并且它们也由本文所使用的术语“dNTP”所包括。尽管使用约40-200μtM浓度的每一种dNTP适于这一教导的方法，但是超过约200μM每一dNTP的浓度将是有利的。因此，在这些教导的方法的一些实施方案中，每一dNTP的浓度一般至少约500μM并且可高达约2mM。在一些其它的实施方案中，每一dNTP的浓度为约0.5mM至约1mM。用于任意多重扩增的特定dNTP浓度可依据多重的条件而变化，并且可通过本领域技术人员应用标准实验室方法经验地确定。
在PCR中使核苷酸三磷酸聚合为扩增产物的酶可以是任意DNA聚合酶。DNA聚合酶可以是例如本领域公知的任何耐热聚合酶。可用于这一教导的一些聚合酶的实例是来自诸如水生栖热菌(Thermusaquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermococcuslitoralis、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、火球菌属物种(Pyrococcus sp.)的生物的DNA聚合酶。可通过几种可能方法的任一种获得该酶；例如从来源细菌分离、通过重组DNA技术产生或购自商业途径。此类可商购的DNA聚合酶的一些实例包括AmpliTaq
DNA聚合酶；DNA聚合酶；
DNA聚合酶Stoffel片段；rTth DNA聚合酶；以及rTth DNA聚合酶，XL(所有均通过Applied Biosystems，FosterCity，Calif.生产)。合适的聚合酶的其它实例包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌的Tne，Bst DNA聚合酶大片段、来自Thermococcus litoralis的Vent和Vent Exo-、来自海栖热袍菌的Tma、来自火球菌属物种的Deep Vent和Deep Vent Exo-以及Pfu，以及前述那些的突变体、变体和衍生物。
PCR的其它已知成分可在本教导的范围内使用。此类组分的一些实例包括山梨醇、去垢剂(例如Triton X-100、Nonidet P-40(NP-40)、Tween-20)和破坏核苷酸对错配的试剂，例如，诸如二甲亚砜(DMSO)、和氯化四甲铵(TMAC)以及尿嘧啶N-转葡糖基酶，或预防PCR的扩增子污染和／或在PCR步骤开始之前的PCR温育或预备期间产生不想要的产物的其它试剂。
PCR循环温度、循环数和它们的持续时间可以改变以优化特定的反应，这是常规实验内容。本领域普通技术人员将认识到以下是作为确定PCR各种参数的指引，并且也将认识到一个或更多个条件的变化在本教导的范围内。为PCR的三个阶段确定了温度和循环时间：变性、退火和延伸。一轮变性、退火和延伸称为一个“循环”。通常在足够高以允许DNA链分离、而又没高到破坏聚合酶活性的温度下进行变性。一般地，可在反应中使用耐热性聚合酶，其在升高的温度下不会变性而是保留了一定水平的活性。然而，如果在PCR的每一变性步骤之后补充它们的话，也可以使用热不稳定聚合酶。一般地，可在高于约90℃并低于约100℃进行变性。在一些实施方案中，可在约94-95℃进行变性。DNA变性一般地可进行至少约1至约30秒。在一些实施方案中，变性可进行约1至约15秒。在其它实施方案中，变性可进行达约1分钟或更久。除了DNA变性，对于某些聚合酶，诸如AmpliTaq
在变性温度下温育还可以活化该酶。因此，当使用这些聚合酶时，允许PCR的第一个变性步骤比随后的变性步骤更长是有利的。
在退火期间，寡核苷酸引物与靶DNA在它们的互补区域退火，并且一旦DNA聚合酶与引物-模板双链体结合，则通过DNA聚合酶大大地延伸。在常规PCR中，退火温度一般地可在或低于最不稳定的引物-模板双链体的解链点(Tm)，其中Tm可通过本领域技术人员公知的几种理论方法的任一种估计。例如，可通过以下公式确定Tm：
Tm=(4℃×G和C碱基数)+(2℃×A和T碱基数)。
一般地，在标准PCR中，退火温度可以是比最不稳定的引物-模板双链体的估计Tm低约5-10℃。退火时间可以是约30秒至约2分钟。退火期之后一般是延伸期。延伸可进行足够的时间量以允许聚合酶完成引物延伸至合适大小的扩增产物。
PCR的循环数(一个循环包括变性、退火和延伸)决定扩增的程度和随后的扩增产物量。PCR导致DNA分子的指数扩增。因此，理论上，在PCR的每一循环之后，产物的数量是前一个循环中存在的产物的两倍，直到PCR试剂耗竭并达到了不再产生其它扩增产物的平台期。一般地，可进行约20-30个循环的PCR，以达到这一平台期。更一般地，可进行约25-30个循环，尽管循环数没有特别地限制。
对于一些实施方案，在PCR最后一个循环的最后阶段之后在某些温度温育该反应是有利的。在一些实施方案中，可选择延长的延伸期。在其它实施方案中，可选择在低温(例如，约4℃)温育。
可使用各种方法评估从多重反应中获得的扩增产物混合物中扩增的等位基因产物，包括例如，检测荧光标记的产物、检测放射性同位素标记的产物、扩增产物的银染、或使用DNA插入剂染料(诸如溴化乙锭(EtBr)和SYBR绿花菁染料)以显现双链扩增产物。适于与用于本教导的引物附着的荧光标记有很多，可商业获得，并且是本领域公知的。对于荧光分析，可以使用至少一个荧光标记的引物扩增每一基因座。荧光检测可比放射性标记方法和产物检测更值得期待，例如，因为荧光检测不需要使用放射性材料，并且因此避免了与使用放射性材料相伴的管理和安全问题。使用经标记的引物的荧光检测也可在其它非放射性检测方法(诸如银染和DNA插入剂)之上选择，因为荧光检测方法一般比银染和DNA插入剂显示更少的扩增假象。这一部分原因是因为这样的事实，即在荧光检测中仅检测在其上附着了标记的DNA扩增链，而使用银染和插入剂检测方法则染色并检测每一扩增产物的两条链，这导致显现了许多非特异性扩增假象。此外，还存在与使用EtBr和SYBR相关的潜在的健康风险。EtBr是已知的诱变剂；SYBR尽管是不如EtBr的诱变剂，但其通常悬浮在能迅速通过皮肤的DMSO中。
当在多重反应中使用引物的荧光标记时，通常可使用至少三种不同的标记来标记不同的引物。当使用大小标记物评估多重反应产物时，用于制备大小标记物的引物可以用与在该反应中扩增目的基因座的引物不同的标记来进行标记。由于自动荧光成像和分析的出现，可以达到多重扩增产物的更快的检测和分析。
在本发明教导的一些实施方案中，可以使用荧光团来标记多重扩增中的至少一种引物，例如，通过共价结合至引物，因此产生荧光标记的引物。在一些实施方案中，可以使用不同的荧光团标记多重中用于不同靶基因座的引物，每一荧光团产生取决于该荧光团的发射波长的不同的着色产物。可在同一多重反应中使用这些不同地标记的引物，并且随后一起分析它们各自的扩增产物。可标记扩增特定基因座的引物对的正向或反向引物之一，尽管更通常标记正向引物。
以下是本领域公知的并且适于在本发明教导中使用的可能的荧光团的一些实例。该列表意在示例性并且不意味着是穷举的。一些可能的荧光团包括：荧光素(FL)，其在492nm处最大吸收并且在520nm处最大地发射；N,N,N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRATM)，其在555nm处最大吸收并且在580nm处最大地发射；5-羧基荧光素(5-FAMTM)，其在495nm处最大吸收并且在525nm处最大地发射；2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基荧光素(JOETM)，其在525nm处最大吸收并且在555nm处最大地发射；6-羧基-X-罗丹明(ROXTM)，其在585nm处最大吸收并且在605nm处最大地发射；CY3TM，其在552nm处最大吸收并且在570nm处最大地发射；CY5TM，其在643nm处最大吸收并且在667nm处最大地发射；四氯-荧光素(TETTM)，其在521nm处最大吸收并且在536nm处最大地发射；以及六氯-荧光素(HEXTM)，其在535nm处最大吸收并且在556nm处最大地发射；NEDTM，其在546nm处最大吸收并且在575nm处最大地发射；6-FAMTM，其在约520nm处最大地发射；
其在约550nm处最大地发射；其在约590nm处最大地发射；以及LIZTM，其在约650nm处最大地发射。参见SR Coticone等，美国专利号6,780,588；IDENTMLERTMPCR扩增试剂盒用户手册，pp.1-3，Applied Biosystems(2001)。注意到上面列举的发射和／或吸收波长是典型的并且仅可用于一般地指引作用；对于不同的应用和在不同的条件下真实的峰波长可能不同。
本发明教导的各实施方式可以包括单个多重扩增系统，其包含了至少4种不同的染料。这些至少4种染料可以包含任意4种上述列出的染料，或任何其它4种本领域公知的染料，或6-FAMTM、
NEDTM和
本教导的其它实施方案可包含包括至少5种不同染料的单个多重系统。这些至少5种染料可以包含任意5种上述列出的染料，或任何其它5种本领域公知的染料，或6-FAMTM、
NEDTM、和LIZTM。参见图2，其为从16个基因座的多重扩增中应用5种染料6-FAMTM、
NEDTM、
和LIZTM产生的DNA概况的实例，如在实施例中所描述的那样(没有显示LIZTM的扩增峰，因为LIZTM用于标记大小标准品)。本教导的其它实施方案可包含包括至少6种不同染料的单个多重系统。这些至少6种染料可以包含任意6种上述列出的染料，或任何其它6种本领域公知的染料，或6-FAMTM、
NEDTM、
LIZTM和在约620nm处具有最大发射的第6种染料(SID)。参见图3。
可在筛选或非筛选介质上分析PCR产物。在这些教导的一些实施方案中，例如，可通过电泳分析PCR产物；例如毛细管电泳，如在H.Wenz等(1998)，GENOME RES.8：69-80(还参见E.Buel等(1998)，J.FORENSIC SCI.43：(1)，第164-170页)中所描述的那样；或平板凝胶电泳，如在M.Christensen等(1999)，SCAND.J.CLIN.LAB.INVEST.59(3)：167-177中所描述的那样；或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如，参见J.Sambrook等(1989)，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，SECOND EDITION，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第13.45-13.57页)。电泳中DNA片段的分离主要基于不同的片段大小。还可通过色谱法分析扩增产物，例如通过尺寸排阻色谱法(SEC)。
一旦分离了扩增的等位基因，则然后可显现并分析例如在凝胶或毛细管中的这些等位基因以及其它DNA(例如，DNA大小标记物或等位基因梯)。可应用本领域公知的许多技术中的任一种完成DNA的显现，例如诸如，银染或通过应用报告物，诸如如本文描述的放射性同位素和荧光染料，或化学发光剂以及与可检测底物联合的酶。通常，多重基因座的检测方法可通过荧光。例如参见JW Schumm等，PROCEEDINGS FROM THE EIGHTH INTERNATIONALSYMPOSIUM ON HUMAN IDENTIFICATION，1998由PromegaCorporation出版，第78-84页；E.Buel等(1998)，同上。当在多重反应中使用荧光标记的引物检测每一基因座时，可在扩增之后应用荧光测定检测仪检测标记的产物。参见上面的荧光染料的描述。
可通过与电泳中的大小标准品(诸如已知大小的DNA标记物)相比较而确定DNA样品中在每一基因座上存在的等位基因大小。用于评估含有两个或更多个多态性STR基因座的多重扩增的标记物还可包含基因座特异性等位基因梯或用于每一进行评估的基因座的等位基因梯的组合。例如参见C.Puers等(1993)，AM.J.HUM.GENET.53：953-958；C.Puers等(1994)，GENOMICS 23：260-264。还参见美国专利号5,599,666；5,674,686；和5,783,406，用于描述适于在检测STR基因座中使用的一些等位基因梯，以及其中公开的梯构建的一些方法。在构建了单个基因座的等位基因梯后，可在与扩增产物相同的时间电泳该梯。每一等位基因梯与来自相应基因座的等位基因共迁移。
还可使用内部泳道标准品来评估本教导的多重反应的产物，所述内部泳道标准品即配置以进行电泳的特定类型的大小标记物，例如作为扩增产物在相同的毛细管中。该内部泳道标准品可包含一系列的已知长度片段。还可用荧光染料标记该内部泳道标准品，其中所述荧光染料可与在扩增反应中的其它染料相区分。该泳道标准品可与经扩增的样品或大小标准品／等位基因梯混合，并且与任一进行电泳以比较在凝胶电泳不同泳道中或在毛细管电泳不同毛细管中的迁移。内部泳道标准品迁移的不同可用于指示分离介质性能的不同。这一不同的定量以及与等位基因梯的关联可提供在不同泳道或毛细管中电泳的扩增产物的校准，并且校正未知样品中等位基因的大小确定。
当使用荧光染料标记扩增产物时，可使用荧光检测仪器分析经电泳并分离的产物，所述仪器例如诸如是ABI
310或3130x1遗传分析仪，或ABI377DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)；或Hitachi FMBIOTM II荧光扫描仪(HitachiSoftware Engineering America，Ltd.，South San Francisco，Calif)。在本教导的各实施方案中，可通过与诸如ABI
3130x1遗传分析仪(Applied Biosystems)的电泳设备联合的毛细管凝胶电泳方案分析PCR产物，并且可进行经电泳的扩增产物的等位基因分析，例如使用来自Applied Biosystems的
ID Software v3.2。在其它实施方案中，可在例如约4.5％，29：1的丙烯酰胺：双丙烯酰胺，8M尿素凝胶中电泳分离扩增产物，其中所述凝胶如为ABI
377自动荧光DNA测序仪所制备的那样。
本发明的教导还涉及使用上述方法的试剂盒。在一些实施方案中，基础试剂盒可包括容器，其具有一个或更多个基因座特异性引物。试剂盒还可任选地包含使用说明书。试剂盒还可包含其它任选的试剂盒成分，例如诸如以下中的一种或更多种：针对每一个特定基因座的等位基因梯、用于扩增的足量的酶、促进扩增的扩增缓冲剂、促进酶活性的二价阳离子溶液、在扩增期间用于链延伸的dNTP、用于制备用于电泳的扩增材料的上样溶液、作为模板对照的基因组DNA、保证材料如预期的那样在分离介质中迁移的大小标记物、以及教导用户以及限制使用中的误差的方案和手册。各试剂在试剂盒中的量也可以依据许多因素而不同，诸如该方法的最佳敏感性。提供用于手工应用的测试试剂盒或使用自动化检测仪或分析仪的测试试剂盒在这些教导的范围之内。
可在含有核酸的任意标本(诸如骨、毛发、血液、组织等)上进行个人鉴定测试、或DNA分型。可从该标本提取DNA，并且在多重中使用一组引物扩增该DNA的期望的STR基因座集，以产生扩增产物集，如本文所描述的那样。在法庭测试中，可将特定标本的扩增模式或DNA概况与取自假定受害者(假定的匹配源)的已知样品进行比较，或可与其中扩增了相同的STR基因座集的衍生自该假定受害者的家族成员(例如，母亲和／或父亲)的经扩增的基因座模式进行比较。STR基因座扩增的模式可用于确定或排除该受害者的身份。在亲权测试中，测试标本一般地可来自孩子并且可与来自假定的父亲的STR基因座模式进行比较，和／或可与来自该孩子母亲的STR基因座模式进行匹配。STR基因座扩增的模式可用于确定或排除父亲的身份。特定基因座的扩增和比较还可用于育种背景中的亲权测试，例如用于牛、狗、马和其它动物。CR Primmer等(1995)，MOL.ECOL.4：493-498。
在临床环境下，此类STR标记可用于例如在骨髓移植中监测供体移植物移入的程度。在医院中，这些标记还可用于标本匹配和跟踪。这些标记还已进入了其它科学领域，诸如对人种和种族差异(DBGoldstein等(1995)，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.92：6723-6727)、进化和物种趋异、以及动物和植物分类群中的变异(MW Bruford等(1993)，CURR.BIOL.3：939-943)的群体生物学研究。
本文引用的参考工作、专利、专利申请、科学文献和其它印刷出版物、以及GenBank数据库序列的登录号均在此通过引用全文并入本文。
实施例
本教导的各方面可根据以下实施例进一步理解，所述实施例不应理解为以任何方式限制本教导范围。
在一些实施方案中，在PCR混合物中使待分析的DNA样品与STR及Amelogenin特异性引物集联合，以扩增基因座D16S539，D18S51，D19S433，D21S11，D2S1338，D3S1358，D8S1179，FGA,TH01，VWA,Amelogenin，和5个新STR基因座D10S1248，D12S391，D1S1656，D22S1045，和D2S441。根据本文提供的方法设计用于这些基因座的引物集，上文。用6-FAMTM荧光标记来标记来自扩增D10S1248、VWA、D16S539和D2S1338的引物集中每一个的一条引物。用
荧光标记来标记来自扩增Amelogenin、D8S1179、D21S11和D18S51的引物集中每一个的一条引物。用NEDTM荧光标记来标记来自扩增D22S1045、D19S433、TH01和FGA的引物集中每一个的一条引物。用
荧光标记来标记来自扩增D2S441、D3S1358、D1S1656和D12S391的引物集中每一个的一条引物。第五个荧光标记LIZTM用于标记大小标准品。
然后使该反应混合物进行聚合酶链式反应。从STR和Amelogenin基因座产生扩增产物，其中标记的引物掺入扩增产物中。扩增产物因此被6-FAMTM、
NEDTM或
荧光标记进行了标记。扩增后使所有或部分反应混合物在单毛细管通道中进行毛细管电泳。还电泳了LIZTM标记的大小标准品。检测从荧光标记的发射并在单输出中展示。来自应用5种染料(LIZTM标记的大小标准品未显示)扩增16个基因座的DNA概况参见图2。STR和Amelogenin基因座通过该通道的迁移速率是它们的大小的函数。STR和Amelogenin扩增产物的大小以及它们标记的颜色鉴定每一基因座上的等位基因。
如本领域技术人员所理解的那样，可对本发明教导的各实施方案进行许多改变和修饰而不背离本教导的精神。预期所有此类变形均在本教导的范围之内。
Claims (10)
1.方法，其包括
(a) 在多重扩增反应中共扩增至少一个待分析的DNA样品的基因座集，其中所述反应的产物是来自共扩增的所述集中的基因座的经扩增的等位基因混合物，其中所述的基因座集包含10个STR基因座
；以及来自STR基因座
和
的一个或更多个；
(b)评估混合物中经扩增的等位基因，以确定在所述至少一个DNA样品之内的所述基因座集中所分析的基因座的每一个上存在的等位基因。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的基因座集还包含可用于鉴定所述至少一个DNA样品来源的性别的基因座。
3.权利要求2的方法，其中所述的DNA样品来源是人类，并且用于鉴定所述人类性别的基因座是Amelogenin基因座。
4.权利要求1的方法，在所述评估步骤之前还包括分离经扩增的等位基因的步骤。
5.权利要求4的方法，其中通过毛细管凝胶电泳分离所述经扩增的等位基因。
6.权利要求1的方法，其中所述的共扩增步骤包括使用用于所述基因座集中每一基因座的寡核苷酸引物对，所述引物对的每一个位于多重反应中所述基因座集的基因座的侧翼。
7.权利要求6的方法，其中每一对寡核苷酸引物的至少一个引物是经标记的引物。
8.权利要求7的方法，其中所述经标记的引物的标记是荧光标记。
9.权利要求8的方法，其中所述的共扩增步骤包括应用至少5个荧光标记的寡核苷酸引物，其中所述至少5个标记的引物具有分别共价地附着于其上的至少5种不同的荧光标记。
10.包含用于共扩增待分析的至少一个DNA样品的基因座集的寡核苷酸引物的试剂盒；其中所述的基因座集可被共扩增；其中所述的引物在一个或更多个容器中；并且其中所述的基因座集包含Amelogein基因座，10个STR基因座
以及STR基因座
的一个或更多个。
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