CN103555616A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在防治核桃根腐病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在防治核桃根腐病中的应用，该菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens，完整命名为解淀粉芽孢杆菌Ba4，已于2013年9月12日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8177。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Ba4对核桃根腐病有特效，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，而且施用一次可长期有效、能持续控病，大幅降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及生态学领域，尤其涉及的是一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在防治核桃根腐病中的应用。
背景技术
核桃具有重要的经济价值和生态作用，在我国林业建设和生态环境建设中有十分重要的地位，特别是对于提高山区农业经济水平具有积极的作用。核桃根腐病（Fusarium solani）以幼苗期受害为主，受害苗木轻者影响生长，重者造成大量死亡，成为育苗工作的一大障碍。感病的幼苗，主要表现为根部变黑腐烂，地上部叶片发黄、叶缘变黑，死亡率很高。现在四川栽培区成年大树也可发病，对核桃产业是一潜在威胁。目前主要采用化学防治和营林技术，而生物防治措施研究尚未涉及。化学防治虽是一种有效的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用。而与环境友好的生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持续发展的重要组成部分。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术对核桃根腐病防治的缺陷，提供了一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在防治核桃根腐病中的应用。
本发明的技术方案如下：
一株解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens，已于2013年09月12日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8177。
所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，包括以下步骤：
（1）一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种所述解淀粉芽孢杆菌后，培养，制成一级种子；
（2）二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，然后在无菌状态下接种所述解淀粉芽孢杆菌斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，振荡培养，制成解淀粉芽孢杆菌液体种子；
（3）液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态下接种步骤（2）制得的解淀粉芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的10%，振荡培养，制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂，然后保存。
所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，步骤（1）中，牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂17g，水1000mL。
所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其营养肉质培养液的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL。
所述的制作方法得到液体制剂。
所述的液体制剂在防治核桃根腐病中的应用，未发病核桃林地用所述解淀粉芽孢杆菌液体制剂体积比的100-300倍稀释度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，可预防根腐病发生；发病核桃按所述解淀粉芽孢杆菌液体制剂体积比50-200倍稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，可效治疗根腐病。
本发明筛选出了对核桃根腐病有特效的新菌株Ba4，其具有抗逆性强的芽孢体，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，且施用一次可长期有效、能持续控病，大幅降低成本。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1、内生细菌的分离、纯化与保存
在四川广元市朝天区核桃根腐病发生地采集健康核桃根系，带回实验室分离。采回 的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g根组织，用70%的酒精消毒30s，无菌水洗3次后，再用4%的NaClO消毒3min后，无菌水洗3次，吸取最后一次洗涤液100μl涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，28℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。
将已表面消毒的根部组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10ml无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5共5个梯度，分别吸取100μl10-3，10-4，10-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min），每个处理3次重复，28℃黑暗培养48h，选取生长最为均匀的梯度，进行平板计数。
依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。共获10个内生细菌。
2、内生细菌对核桃根腐病病菌的平板拮抗作用
平板对峙法：在培养皿中央接种7d的核桃根腐病病菌（Fusarium solani）菌饼（直径5mm)，离该病菌饼约3cm处，分别用接种环沾取培养2d的内生菌，在病菌对称两侧各划一条细线，28℃培养，以只接种病菌的平板为对照，待对照长满皿时测量病菌的菌落生长直径，每处理重复3次。按下式计算菌落生长抑制率：
菌落生长抑制率=（对照菌落净生长直径－处理菌落净生长直径）/对照菌落净生长直径×100%
表1是内生细菌对核桃根腐病病菌（Fusarium solani）的拮抗作用，结果显示：7d之后，有4种内生细菌菌落生长抑制率达61.54%以上，其中Ba4菌株抑制率达100%。
表1内生细菌对核桃根腐病病菌的拮抗作用（7天）
注：*差异性比较：含相同字母为差异不显著，否则为显著。
3、内生拮抗菌的种类鉴定
经形态学观察，结合生理生化指标（表2）和分子生物学鉴定该内生菌Ba4为解淀粉芽孢杆菌。
在NA平板培养基上培养了2d的Ba4菌株的单菌落白色，呈圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明，G+。
表2菌株Ba4生理生化指标
4、盆栽试验
（1）Ba4生防菌准备
营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL）经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种Ba4斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养36h，制成Ba4菌剂。
（2）病原接种与处理
选取二年生盆核桃实生苗为实验对象，PDA斜面核桃根腐病菌(Fusarium solani)分生孢子（浓度3×105）接种根系一周后，用上述菌剂采用灌根法分不同浓度对核桃苗进行灌根处理，每盆200mL，并以无菌水作对照，重复3次，统计核桃发病情况。每处理核桃苗50株。
表3是Ba4内生细菌在盆栽试验30d后的防治效果，可以看出，Ba4内生细菌发酵液经稀释后，表现出不同的防治效果，原液至200倍以下效果显著，特别是100倍以下，可基本上控制病害不发生。
表3Ba4内生细菌在盆栽试验30d后的防治效果
5、田间防治实例
5.1、Ba4液体制剂制作
（1）一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂17g，水1000mL），接种Ba4后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。
（2）二级液体种子：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL）经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种Ba4斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养36h，制成Ba4液体种子。
（3）液体发酵：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL）经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种Ba4液体种子，接种量10%（体积比），温度26-28℃，初始pH值7.0，120/min振荡培养72h，制成Ba4液体制剂。
（4）制剂保存：瓶装制剂常温保存半年或低温（4度）1年半不影响预防和治疗效果。
（5）在步骤（2）、（3）中的核桃汁浸渍液的制备：10g核桃汁放入1000ml水中煮沸15分钟，过滤，制得的滤液为核桃汁浸渍液。
5.2、田间预防与治疗
（1）预防处理：未发病核桃林地用上述液体制剂100-300倍（体积比）稀释度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，可预防根腐病发生。结果见表4。
（2）防治处理：发病核桃按50-200倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，可效治疗根腐病，结果见表5。
表4Ba4内生细菌田间预防效果：未发病核桃林地（1年生）
注：*差异性比较：含相同字母为差异不显著，否则为显著。
表5Ba4内生细菌田间治疗效果：发病核桃林地
注：*差异性比较：含相同字母为差异不显著，否则为显著。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.8177。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种所述解淀粉芽孢杆菌后，培养，制成一级种子；
（2）二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，然后在无菌状态下接种所述解淀粉芽孢杆菌斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，振荡培养，制成解淀粉芽孢杆菌液体种子；
（3）液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态下接种步骤（2）制得的解淀粉芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的10%，振荡培养，制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂，然后保存。
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其特征是，步骤（1）中，牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂17g，水1000mL。
4.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其特征是，营养肉质培养液的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL。
5.根据权利要求2-4任一所述的制作方法得到的液体制剂。
6.根据权利要求5所述的液体制剂在防治核桃根腐病中的应用，其特征是，未发病核桃林地用所述解淀粉芽孢杆菌液体制剂体积比的100-300倍稀释度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，可预防根腐病发生；发病核桃按所述解淀粉芽孢杆菌液体制剂体积比50-200倍稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，可效治疗根腐病。
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