CN103547683A

CN103547683A - Kras突变和肿瘤生物学

Info

Publication number: CN103547683A
Application number: CN201280024407.7A
Authority: CN
Inventors: J·B·温迪哈斯
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2014-01-29

Abstract

本发明提供了识别有发展癌症风险的患者的方法，预测癌症发病的方法，以及通过确定KRAS致癌基因内存在或不存在单核苷酸多态性(SNP)，其被称为KRAS突变，来预测患者对化疗／治疗应答的方法。

Description

KRAS突变和肿瘤生物学

相关申请

本申请要求2011年3月21日提出的临时申请USSN61／454,765；2011年3月21日提出的USSN61／454,767；和2011年3月21日提出的USSN61／454,769的优先权，上述文献中的全部内容均作为一个整体在本发明中被引入作为参考。

以提述方式纳入

以“34592-515001WOST25.txt”为命名提交的文本文件的内容，该文本文件于2012年3月16日创建，文件大小32.2KB，参考文献均全文引入本文以供参考。

政府支持

本发明中部分的实施，具有美国政府根据临床与转化科学奖(CTSA)，授权号为UL1RR024139的支持，其中CTSA由美国国立卫生研究院分支国家研究资源中心所提供。

本发明是在美国政府支持下完成，部分支持下完成，得到美国国家癌症研究所提供的授权号RO1CA131301-01A1，美国国立卫生研究院提供的授权号CA124484(K08)，美国国立卫生研究院提供的授权号RO1CA122728，美国国立卫生研究院提供的授权号RO1CA74415，美国国家癌症研究所和美国国立卫生研究院主任办公室提供的授权号RC4CA153828的支持。

政府在本发明中享有一定的权利。

发明领域

本发明通常涉及癌症、生殖健康和分子生物学领域。本发明提供了通过确定遗传标记的存在或不存在，诊断和预测主体患有癌症的方法。此外，本发明提供了通过确定遗传标记的存在或不存在，确定患者对治疗的反映的方法。

背景技术

变动风险因子、患者治疗的反应和结果反映癌症的异质性。虽然预测基因表达标志物是高度非同源，几个模块如DNA修复缺陷，免疫应答标记或者上皮细胞-间质细胞转变通常与许多肿瘤相关。因此，在本领域中，有必要识别这些转录模块的启动子，成为发现特异性个性化治疗的一种有前途的方法。

发明内容

在本发明中提出的研究，涉及到核心的问题是miRNAs在癌症中的作用：干扰miRNAs调控致致癌基因或肿瘤抑制基因影响患癌症的风险、肿瘤的发展，以及治疗响应。MiRNAs可能直接或间接调控致致癌基因或肿瘤抑制基因。举例来说，KRAS基因突变，单核苷酸多态性(SNP)位于KRAS基因3′UTR的let-7互补位6(LCS6)，通过miRNA let-7家族的调控干扰KRAS。在这种情况下，KRAS基因let-7介导调节被阻断；然而，也有KRAS基因突变的次级效应。let-7／KRAS互动上游的阻断持续向下游因子发送异常信号。此外，信号途径而非经典RAS途径的组成受到影响。KRAS变体的存在，增加了血管生成、存活(甚至在缺氧条件下)、转移，以及对常用化疗药物的抗药性。此外，癌症细胞的表观遗传改变，如肿瘤抑制基因启动子甲基化和细胞周期基因的改变，影响了KRAS突变阳性的癌细胞的发展、存活和治疗应答。最后，KRAS基因突变的细胞后果是与KRAS其他突变无关，包括，举例来说，KRAS基因编码区的突变。对于许多癌细胞，KRAS基因突变的发生与其它KRAS基因突变的发生是相互排斥的。不像KRAS突变，KRAS基因突变是一种种系突变。因此，KRAS基因变体是一种肿瘤细胞生物学的遗传性生物标志物。

KRAS基因突变突变的发生导致KRAS基因表达增加和／或高丰度KRAS，导致miRNAs let-7家族表达降低。KRAS突变也影响转录因子，以及miRNAs而非let-7家族miRNAs的表达水平。举例来说，KRAS突变与miR-23和miR-27表达水平增加统计学上显著性相关联，miR-23和miR-27靶向抗血管生成基因如Sprouty2和Sema6A。因此，传统的化疗药物的效果差和耐药性可能源自KRAS基因突变通过RAS通路驱动激活细胞增殖的能力，通过血管生成通路，血液和养分补给肿瘤，促进肿瘤内癌细胞的生存。面对具有一种共同激活因子的两个异常通路，某些化疗药物活性可能不足以对抗癌症的发展。携带KRAS突变的肿瘤内RAS和其它通路肿瘤的扰动在癌细胞和肿瘤类型间有高度同源性(如乳腺癌和卵巢癌)。

KRAS基因突变与各种癌症临床治疗效果不佳有关，这些癌症包括，但不限于，结肠癌、卵巢癌、头颈部癌、肺癌。有证据表明，KRAS基因突变决定一名患者对治疗的响应。如果KRAS基因突变携带者对标准化疗药剂耐药，那么患者的结果较差。本文提出的数据证实，KRAS基因突变对传统化疗药物耐药，而有时对单克隆抗体疗法的敏感性增加。举例来说，当西妥昔单抗作为唯一的治疗方法给药时，KRAS突变增加了患者对西妥昔单抗的敏感性，靶向KRAS通路(EGFR)上游调控因子。因此，KRAS基因突变的发生可能表明，特异性靶向KRAS基因上游的药物将会成功，然而，靶向细胞周期检查点的传统化疗药物可能是无效的，细胞周期检查点是KRAS基因的下游。同样，KRAS基因突变对铂类化疗具有耐药性。铂类药剂交联DNA分子，以防止DNA复制，最终导致细胞凋亡。然而，DNA复制发生在KRAS活化下游，并且因此，可能是无效的，尤其根据数据显示信号通路募集而非RAS基因。

本文提供的这些KRAS肿瘤生物学的新发现具有重要的临床价值，因为化疗作为一种治疗方法对患者是很辛苦的。化疗药物的副作用，不仅增加了患者的不适，而且带来了身体机能系统并发症。例如，杀死癌细胞的化疗药物也可能损害或削弱患者的心脏。因此，KRAS基因突变是确定对已知化疗药物的耐药性或者敏感性的一种生物标志物。如果患者呈KRAS突变阳性，那么医生可能会选择一个最佳的治疗方案，或者至少避免无效治疗。

在本发明中，术语主体和患者可以互换使用。

本发明提供了一种预测肿瘤的血管生成风险增加的方法，包括(a)检测第一位患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种单核苷酸多态性(SNP)，包括LCS6位点4处尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鸟嘌呤(G)转变，及(b)确定miRNA表达水平，miRNA选自由第二位患者样本中miR-23和miR-27组成的组，其中与对照组对比，所述的(a)中突变的存在和(b)中miRNA表达水平的增加表明抗血管生成基因转录基因静默增加，从而预测肿瘤血管形成风险增加。第一位和第二位患者样本中提取自同一患者。此外，第一位和第二位患者样本可能包括相同的流体、组织或活检。优选地，第二位患者样本提取自或源自肿瘤或与肿瘤物理接触的非肿瘤组织中的区域(例如，肿瘤周围)。举例来说，抗血管生成基因可以是Sprouty2或Sema6A。肿瘤可能包括一种癌细胞，癌细胞源自艾滋病相关的癌症、乳癌、消化／胃肠道的癌症、肛门癌、阑尾癌、胆管细胞癌、结肠癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肝癌、胰脏癌、直肠癌、小肠癌、胃癌、内分泌系统癌、肾上腺皮质癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肾(肾细胞)癌、阴茎癌、前列腺癌、移行细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、肾母细胞瘤、其他儿童肾脏肿瘤、生殖细胞癌、中枢神经系统癌症、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妇科肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、头部和颈部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃肠道间质肿瘤(GIST)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、神经系统癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、中央神经系统非典型畸胎样／横纹肌样瘤、中枢神经系统的胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脊髓肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、神经母细胞瘤、呼吸系统癌、胸癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮肤癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌。可选地，或另外地，肿瘤或癌症是转移性的。

本发明提供了一种预测缺氧条件下癌症细胞增加的存活或增殖的方法，包括(a)检测第一位患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，及(b)确定第二位患者样本中miR-210miRNA的表达水平，其中与对照组对比，所述的(a)中突变的存在和(b)中miRNA表达水平的增加预测缺氧条件下癌症细胞存活或增殖的增加。第一位和第二位患者样本中提取自同一位患者。此外，第一位和第二位患者样本可能包括相同的流体、组织或活检。癌细胞可能源自于艾滋病相关的癌症、乳癌、消化／胃肠道的癌症、肛门癌、阑尾癌、胆管细胞癌、结肠癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肝癌、胰脏癌、直肠癌、小肠癌、胃癌、内分泌系统癌、肾上腺皮质癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肾癌肾细胞癌、阴茎癌、前列腺癌、过渡细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、肾母细胞瘤、其他儿童肾脏肿瘤、生殖细胞癌、中枢神经系统肿瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妇科肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、头颈部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、神经癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样／横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脊髓肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、神经母细胞瘤、呼吸系统癌、胸癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮肤癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌。

本发明提供了一种预测癌症细胞存活或增殖增加的方法，包括(a)检测第一位患者样本中人KRAS基因的let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，及(b)确定第二位患者样本中肿瘤抑制基因启动子的甲基化状态，其中与对照组对比，所述的(a)中突变的存在和启动子(b)甲基化增加预测肿瘤细胞的存活或增殖。第一位和第二位患者样本中提取自同一位患者。此外，第一位和第二位患者样本可包括相同的流体、组织或活检。任选地，肿瘤抑制基因是Notchl。存活可能包括保持致瘤潜能。癌细胞可能源自于艾滋病相关的癌症、乳癌、消化系统癌／胃肠道、肛门癌、阑尾癌、胆管细胞癌、结肠癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肝癌、胰脏癌、直肠癌、小肠癌、胃癌、内分泌系统癌、肾上腺皮质癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肾癌肾细胞癌、阴茎癌、前列腺癌、过渡细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、肾母细胞瘤、其他儿童肾脏肿瘤、生殖细胞癌、中枢神经系统肿瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妇科肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、头颈部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤胃肠道间质瘤(GIST)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、神经癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样／横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脊髓肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、神经母细胞瘤、呼吸系统癌、胸癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮肤癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌。任选地，所述癌细胞是癌干细胞。

乳腺癌

本发明提供了用于识别可能发展侵略性和高风险乳腺癌风险的患者的方法，以及预测这些形式乳腺癌发病的方法。本文提供的数据构成了第一个公开内容驱动乳腺癌肿瘤发展的基因组突变机制，其特征在于缺乏雌激素受体或孕激素受体表达。在优选的实施方案中，侵略性和高风险形式的乳腺癌是三阴性乳腺癌，其进一步特征在于缺乏人表皮生长因子受体2(HER2)基因转录或蛋白质的表达。

本发明提供了一种识别可能发展雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)阴性(ER／PR阴性)乳腺癌风险的患者的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在，表明有发展ER／PR阴性乳腺癌的更大风险。

本发明提供一种对有发展乳腺癌风险的患者预测其雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)阴性(ER／PR阴性)乳腺癌发病的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因的let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种单核苷酸多态性(SNP)，包括LCS6位点4处尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鸟嘌呤(G)转变，其中所述突变的存在，表明ER／PR阴性乳腺癌的更早发病。

本文所描述的方法的一个优选的实施方案中，ER／PR阴性乳腺癌也是HER2阴性，因此，是一种三阴性乳腺癌(TNBC)。三阴性乳腺癌(TNBC)可能是基底或luminal型或肿瘤。这些方法的某些方面，三阴性乳腺癌(TNBC)是一种基底肿瘤，表达一种转录子或者表皮生长因子受体(EGFR)或细胞角蛋白5／6(CK5／6)基因编码的蛋白质。在其它方面，ER／PR阴性乳腺癌或ER／PR／HER2阴性乳腺癌进一步特征在于低表达或阴性表达的乳腺癌1(BRCA1)基因。

主体(患者)优选绝经前女性；然而，主体可以是任何年龄。或者，另外，主体小于51岁，然而，主体可任选地，小于100岁、90岁、80岁、70岁、60岁、50岁、40岁、30岁、20岁，或者位于其间的任何年龄。

大肠癌

本发明提供一种预测患有大肠癌(CRC)主体的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中，与对照组对比，所述的KRAS基因突变的存在表明存活率增加。本方法的一个方面中，所述检测步骤进一步包括微卫星不稳定性(MSI)分析。KRAS基因突变是大肠癌细胞和患者存活的独立标志物；然而，微卫星不稳定性(MSI)分析可以用作二次分析。虽然MSI是在CRC患者预测良好的分子标志物(例如，患有MSI肿瘤的患者被认为有一个良好的预测)，确定KRAS基因突变状态，表明患有MSI肿瘤，但KRAS基因突变阴性(或者，换句话说，野生型)的个体大肠癌的预测较差。因此，本发明提供一种预测临床结果，或大肠癌预测的优越方法，尤其大肠癌患者癌症阶段分层时。

尤其在在该方法的实施方案中，大肠癌(CRC)是早期阶段大肠癌。优选的，大肠癌(CRC)是1期或2期。

测验主体可以具有KRAS基因二次突变，KRAS基因突变为一次突变。

测试主体或对照组主体BRAF基因携带一个或多个突变。可选地，或另外地，测试主体或对照组主体可能具有高甲基化RASSF1A启动子。

对照组主体不携带KRAS基因突变(例如，对照组主体是野生型KRAS基因突变突变)。然而，对照组主体可能患有大肠癌，或可能是无癌症个体。此外，对照组主体KRAS基因可能具有二次突变，不是KRAS基因突变。

在该方法的某些方面中，患者的生存率是一个总生存率(例如，一些实施例，包括，但不限于，从癌症发展，或诊断直至主体死于癌症(死亡)，进入缓解期，或医生宣布主体被治愈或所有肿瘤细胞清除掉，计算出存活率)，5年生存率或一年生存率。计算出更短的生存期，例如，从癌症发展或者癌症诊断计算，直到一个确定性时间，如1年或5年。

卵巢癌治疗应答

本发明提供了患有上皮性卵巢癌(EOC)患者的预测方法，此外，提供了通过预测患者对铂类化疗应答优化治疗的方法。本文所描述的方法和数据识别KRAS基因3′非翻译区(UTR)内let-7miRNA结合位特异性基因组突变(称作为KRAS变体)。

本发明提供一种患有卵巢上皮癌(EOC)患者预测的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种单核苷酸多态性(SNP)，包括LCS6位点4尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鸟嘌呤(G)转变，其中，与对照组对比时，所述的KRAS基因突变的存在表明存活率降低。

虽然该方法可以应用于患者和所有年龄的妇女，在此方法的某些实施方案中，测试主体是绝经后或52岁或52岁以上的老年人。对照组主体包括健康个体和那些患有卵巢上皮癌(EOC)，但不携带KRAS基因突变的妇女。此外，根据作为测试主体同一年出生女性，或者作为测试患者的同一代的女性的预期生存，对照组主体是全国平均水平。在一个优选的实施方案中，对照值不包括那些携带KRAS基因突变的个体。在该方法的某些方面中，患者生存率是总生存率(例如，一些实施例，包括，但不限于，从癌症发展，或诊断直至主体死于癌症(死亡)，进入缓解期，或医生宣布主体被治愈或所有肿瘤细胞清除掉，计算出存活率)，5年生存率或一年生存率。计算出更短的生存期，例如，从癌症发展或者癌症诊断计算，直到确定性时间，如1年或5年。

本发明还提供了一种预测卵巢上皮性癌(EOC)细胞铂类化疗响应的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在表明铂类化疗耐药性。卵巢上皮性癌细胞可以在体外或离体评价。当卵巢上皮性癌细胞体外评估时，该细胞取自主体。主体可以是任何年龄的，然而，在一个优选实施方案中，患者可以是绝经后的，或至少52岁。或者，在同一个实施方案中，患者至少30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁，或在两者之间的任何年龄。在这种方法的其他方面，由于二次医疗条件或医疗，患者不是绝经后，提出了一个类似的激素水平。示范性，但非限制性更年期荷尔蒙水平包括下降水平的雌激素和孕激素，例如，主体血液或尿液样本评估所确定。诱发绝经期激素水平的示范性、但非限制性的二次医疗条件是至少一次卵巢外科切除手术(卵巢切除术，也被称为手术绝经)，子宫颈癌、子宫癌或卵巢癌必须进行子宫切除术(尤其是，如果切除子宫结合输卵管和一侧或两侧卵巢切除)。诱发绝经期激素水平的示范性、但非限制性的、二次医疗条件是化疗和抗雌激素治疗。

当卵巢上皮性癌细胞在体外进行评估时，细胞分离、复制，或来自BG1、CAOV3、或IGR-OV1细胞株。这些细胞株是卵巢癌细胞株的非限制性实施例。卵巢上皮性癌细胞进行分离，复制，或来自任何卵巢癌的细胞株，包括，但不限于，这些携带KRAS基因突变、有害BRCA1基因突变，有害BRCA2基因突变，或其任意组合的细胞株。有害BRCA1或BRCA2基因突变是增加其携带者将发展成癌症的风险或可能性的突变，在优选的实施方案中，发展成乳腺癌或卵巢癌。有害BRCA1或BRCA2基因突变也是增加其年龄小携带者发展成癌症的风险或可能性的突变(例如，经历癌症早期发病)，在优选的实施方案中，癌症是乳腺癌或卵巢癌。

本文所描述的方法，优选的铂类化疗是卡铂或紫杉醇，然而，铂类化疗包括所有化疗药物，铂或铂盐用于治疗或预防癌症。这些方法某些方面中，铂类化疗是辅助治疗。因此，本文所述的方法预测患者采用作为单一疗法或者与其它已知抗癌药剂或技术(例如，举例来说，放疗和外科手术)联合治疗的铂类化疗的响应。

大肠癌的治疗响应

本发明提供了患有大肠癌(CRC)或转移性大肠癌(mCRC)的预测方法，此外，提供了通过预测患者进行单独单克隆抗体治疗，或者单独单克隆抗体治疗联合细胞毒性化疗的响应而优化治疗的方法。本文所描述的方法和数据识别了KRAS基因3′非翻译区(UTR)let-7miRNA结合位点特异性基因组突变，称作为KRAS突变。

本发明提供一种患有早期大肠癌(CRC)的测试主体预测的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中与对照组主体或者患有晚期大肠癌(包括，举例来说，III期、IV期，和转移性大肠癌)的主体对比，所述突变的存在显示存活率增加。

本发明提供一种患有晚期大肠癌(CRC)患者预测的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种单核苷酸多态性(SNP)，包括LCS6位点4尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鸟嘌呤(G)转变，其中与对照组主体或者患有早期大肠癌的主体对比，所述KRAS-突变的存在显示存活率降低。晚期大肠癌包括，举例来说，III期、IV期，和转移性大肠癌。

本发明提供一种预测癌细胞进行单克隆抗体单药治疗的响应的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在，表明对单克隆抗体单药治疗的敏感性。在本方法的某些实施方案中，癌细胞是大肠癌(CRC)细胞。癌细胞可以在体外或离体进行评价。单克隆抗体单药治疗的一个非限制性的实施例是西妥昔单抗。

本发明提供一种预测肿瘤细胞对化疗联合单克隆抗体治疗的响应的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在，表明对联合治疗的耐药性。在本方法的某些实施方案中，癌细胞是大肠癌(CRC)细胞。癌细胞可以在体外或离体进行评价。单克隆抗体单药治疗的一个非限制性实施例是西妥昔单抗。化疗可能是细胞毒性剂。细胞毒性剂的一个非限制性实施例是伊立替康。在某些实施例中，使用化学治疗剂(例如，伊立替康)治疗携带KRAS基因突变的主体导致KRAS基因突变表达增加。KRAS基因突变和非突变癌细胞接触伊立替康后，对比报告基因表达时，发现野生型3′UTR报告基因没有变化。然而，发现野生型3′UTR报告基因表达有统计学显著性增加(图24A和图24B)。该数据表明，伊立替康接触以激活KRAS基因突变等位基因的方式改变细胞背景。

尽管该方法可以适用于所有年龄段的患者，在这种方法某些实施方案中，测试主体新生儿、儿童、成人，或年长者(65岁或以上)。主体可能为绝经前的或绝经后的(年龄在52岁或以上)。

对照组或对照主体包括健康人和那些患有大肠癌，但不携带KRAS基因突变的个体。此外，根据作为测试主体同一年出生女性，或者作为测试主体的同一代的女性的期望生存率，对照组主体是全国平均水平。在一个优选的实施方案中，对照值不包括那些携带KRAS基因突变的个体。在该方法的某些方面中，患者生存率是总生存率(例如，一些实施例，包括，但不限于，从癌症发展，或诊断直至主体死于癌症(死亡)，进入缓解期，或医生宣布主体被治愈或所有肿瘤细胞清除掉，计算出存活率)，5年生存率或一年生存期。计算出更短的生存期，例如，从癌症发展或者癌症诊断计算，直到一个确定性时间，如1年或5年。

本发明还提供了一种预测大肠癌(CRC)细胞对单克隆抗体治疗响应的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在，表明对单克隆抗体治疗的敏感性增加。大肠癌细胞可以在体外或离体进行评价。单克隆抗体治疗可以是西妥昔单抗。

本发明还提供了一种预测大肠癌(CRC)细胞对细胞毒性化疗的响应的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种单核苷酸多态性(SNP)，包括LCS6位点4尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鸟嘌呤(G)转变，其中所述突变的存在，表示对细胞毒性化疗耐药。在此方法的某些实施方案中，大肠癌在体外或离体进行评价。细胞毒性化疗可能是伊立替康化疗。在此方法的一个实施方案中，细胞毒性化疗是一种联合治疗，包括单克隆抗体治疗。单克隆抗体治疗可能是西妥昔单抗。

当大肠癌细胞体外评估时，该细胞取自患者。患者可以是任何年龄段的。在这种方法的某些实施方案中，患者至少30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁，或两者之间的任何年龄。

当大肠癌细胞体外评估时，细胞可能被分离、复制，或者取自已建立的细胞株，包括NCI-60培养板内的结肠或大肠癌细胞株。大肠癌细胞可以分离、复制，或取自任何结肠或大肠癌细胞株，包括，但并不限于，携带KRAS基因突变，单独或与KRAS基因或其他基因内二次突变或者另外突变联合的细胞株。

对于该方法，优选的单克隆抗体单药治疗是西妥昔单抗，然而，单克隆抗体单药治疗包括任何用于治疗或预防癌症的单克隆抗体。优选地，所述单克隆抗体是部分或完全人的或人源化的。对于此方法，优选的化疗是细胞毒性化疗，如伊立替康，然而，化疗包括任何用于治疗或预防癌症的化疗剂。在此方法的某些方面中，化疗或细胞毒性化疗是一种辅助治疗。因此，该方法预测患者采用作为单一疗法或与化疗剂或用于治疗或预防癌症的其它已知技术联合治疗的单克隆抗体(例如，放疗和外科手术)的响应。

附图说明

图1A-B是一对图表，描绘KRAS突变在研究组2的所有妇女(A)和绝经前(≤51岁)妇女(B)乳腺癌亚型中的分布。数据为确诊为乳腺癌亚型病例数／测试KRAS突变的患者数。*P=0.044vs所有其他亚型。P=0.033vs所有其他亚型。

图2A-B是一对箱线图，描绘三阴性乳腺癌KRAS基因突变阳性和KRAS基因突变阴性中BRCA1基因表达。Y轴是任意单位。(A)BRCA1基因探针1，p=0·06。(B)BRCA1基因探针2，p=0.01。

图3是一系列的箱线图，描绘三阴性乳腺癌KRAS基因突变阳性与KRAS基因突变阴性病例中microRNA let-7家族表达。Y轴是任意单位。

图4是热点图，显示LIMMA模型分析得到的三阴性乳腺癌患者KRAS基因突变差异表达基因。50个最显著性基因被用于进行聚类；聚类P<0.0001。KRAS基因突变样本是深灰色；野生型样品为浅灰色。白色有未知KRAS突变状态。

图5是描绘ER／PR+与ER／PR-绝经前乳腺癌患者KRAS基因突变的图表。

图6是描绘三阴性乳腺癌患者肿瘤KRAS基因突变相关的基因表达谱的一系列箱线图。

图7是一个曲线图，显示KRAS突变预测52岁以上绝经后卵巢癌患者显著性总存活率较差。采用Kaplan-Meier分析，对比具有KRAS基因突变的卵巢癌患者(n=59)与无KRAS基因突变的卵巢癌患者(n=220)的总生存率。log-rank检验结果是52岁以上KRAS基因突变阳性上皮性卵巢癌患者显著性较差(P=0.0399)。

图8是显示KRAS基因突变与新辅助化疗后不理想肿瘤细胞减灭术相关的图表。携带KRAS基因突变(n=26)或无KRAS基因突变(n=90)的卵巢癌患者(n=116)中对比新辅助化疗后的肿瘤细胞减灭术。经χ²分析，KRAS基因突变患者比非突变患者显著性更可能使不理想肿瘤细胞减灭术具有更大的残留病变(RD)(P=0.044)。

图9A是KRAS基因突变(KV)三阴性乳腺癌肿瘤(TNBCKRAS签名)中50个差异表达候选基因签名，KRAS基因突变上皮性卵巢癌样本比非突变样本表现出更高分数。

图9B是对KRAS基因上瘾的肿瘤(KRAS成瘾标签)相关的基因标签，在KRAS基因突变上皮性卵巢癌肿瘤上调。

图9C是KRAS基因突变上皮性卵巢癌肿瘤前20个基因差异表达标签，反映卡铂敏感和卡铂耐药上皮性卵巢癌细胞基因差异表达的重新分析。

图9D是KRAS基因突变(深灰色)和非突变(浅灰色)肿瘤样本之间前部差异表达基因的热点图。颜色键描绘出蓝色(0到5)到白色(约5)，由白色转为红色(5至10)的差异表达基因谱。此热点图彩色版本，参见Ratner ES，et al.Oncogene，(5December2011)，1-8；其内容通过引述合并入本文中)。

图10是显示KRAS基因突变与细胞株卡铂和卡铂／紫杉醇化疗耐药性有关的图表。携带KRAS基因突变(BG1)细胞株和无KRAS基因突变(CAOV3)细胞株经化疗治疗，半数抑制浓度(IC50)为Y轴，X轴为化疗药剂。更高的IC50表示对化疗药剂耐药性。BG1=KRAS基因突变／BRCA基因野生型细胞株；CAOV3=非突变／BRCA野生型细胞株；IGR-OV1=KRAS-突变／BRCA1突变细胞株。误差线是预测相对误差。

图11A是显示KRAS基因突变细胞株细胞存活率降低的图表，BG1(*p<0.001)，对非突变细胞株，CAOV3，无影响。携带KRAS突变(BG1)和无KRAS突变(CAOV3)的细胞株，进行siRNA／miRNA联合治疗，选择性结合变体等位基因。

图11B是显示BG1(右)KRAS蛋白表达减少与细胞存活率减少一致的图表，对CAOV3(左)没有影响。携带(BG1)KRAS突变和无(CAOV3)KRAS突变的细胞株，进行siRNA／miRNA联合治疗，选择性结合突变等位基因。不同的siRNA用数字标出。

图12是一个图表，与非突变细胞株(CAOV3)对比，描绘携带KRAS基因突变(BG-1和IGROV1)的细胞株具有显著性较低水平let-7b。单因素Anovea和Tukey’s多重比较检验进行统计分析。

图13A-B示意性描绘KRAS-突变序列与非突变序列比对。Panel A描绘KRAS基因非突变序列。Panel B描绘靶向KRAS基因突变序列的示范性突变siRNA寡核苷酸。在两个Panel中，带下划线序列描述了let-7结合位点。在两个Panel中，框起来的核苷酸是指野生型(非突变)核苷酸(A)或KRAS基因突变单核苷酸多态性(SNP)(B)。siRNA显示起始于其3′末端。

图14是所有癌症阶段中KRAS基因突变和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲线。

图15A是早期(I期和II期)大肠癌KRAS基因突变和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲线。

图15B是III期大肠癌KRAS基因突变和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲线。

图15C是IV期大肠癌KRAS基因突变和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲线。

图16A是早期(I期和II期)大肠癌KRAS基因突变、KRAS突变和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲线，P=0.875。

图16B是III期大肠癌KRAS基因突变、KRAS突变和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲线。

图16C是IV期大肠癌KRAS基因突变、KRAS突变和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲线。

图17是早期(I期和II期)大肠癌KRAS基因突变、微卫星不稳定性状态和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲线。

图18A是一个曲线图，描绘抗表皮生长因子受体单克隆抗体单药治疗或与联合化疗作为抢救治疗的患者KRAS LCS6基因型状态的中位无进展生存期。

图18B是一个曲线图，描绘抗表皮生长因子受体单克隆抗体单药治疗或与联合化疗作为抢救治疗的患者KRAS LCS6基因型状态中位总生存期。

图19A是一个曲线图，描绘抗表皮生长因子受体单克隆抗体单药治疗的所有患者KRAS LCS6基因型状态的中位无进展生存期。

图19B是一个曲线图，描绘抗表皮生长因子受体单克隆抗体基联合化疗作为抢救治疗的所有患者KRAS LCS6基因型状态的中位无进展生存期。

图19C是描绘根据所有KRAS突变携带者治疗类型的中位无进展生存期的曲线图。

图19D是描绘根据所有无KRAS基因突变携带者治疗类型的中位无进展生存期的曲线图。

图20A是一个曲线图，描绘根据抗表皮生长因子受体单克隆抗体单药治疗作为抢救治疗的双(KRAS和BRAF)野生型患者群KRAS LCS6基因型状态的中位无进展生存期。

图20B是一个曲线图，描绘根据抗表皮生长因子受体单克隆抗体基联合化疗作为抢救治疗的双(KRAS和BRAF)野生型患者群KRAS LCS6基因型状态的中位无进展生存期。

图20C是一个曲线图，描绘根据双(KRAS和BRAF)野生型KRAS基因突变携带者治疗类型的中位无进展存活率。

图20D是一个曲线图，描绘根据双(KRAS和BRAF)野生型非KRAS突变携带者治疗类型的中位无进展存活率。

图21A是一个曲线图，根据抗表皮生长因子受体单克隆抗体单药治疗抢救治疗的所有患者中KRAS LCS6的基因型状态的中位总存活率。

图21B是一个曲线图，描绘根据基于抗表皮生长因子受体单克隆抗体的联合化疗抢救治疗的所有患者中KRAS LCS6的基因型状态的中位总存活率。

图21C是描绘根据所有KRAS突变携带者治疗类型的中位总存活率的曲线图。

图21D是描绘根据所有无KRAS基因突变携带者的治疗类型的中位总存活率的曲线图。

图22A是一个曲线图，描绘根据抗表皮生长因子受体单克隆抗体单药治疗作为抢救治疗的双(KRAS和BRAF)野生型患者群KRAS LCS6基因型状态的中位总存活率。

图22B是一个曲线图，描绘根据抗表皮生长因子受体单克隆抗体单药治疗作为抢救治疗的双(KRAS和BRAF)野生型患者群中KRAS LCS6基因型状态的中位总存活率。

图22C是一个曲线图，描绘根据双(KRAS和BRAF)野生型KRAS基因突变携带者治疗类型的中位总存活率。

图22D是一个曲线图，描绘根据双(KRAS和BRAF)野生型非KRAS基因突变携带者治疗类型的中位总存活率。

图23A是一个曲线图，描绘根据KRAS和BRAF突变KRAS基因突变携带者治疗类型的中位无进展生存期。

图23B是一个曲线图，描绘根据KRAS和BRAF突变非KRAS基因突变携带者治疗类型的中位无进展生存期。

图23C是一个曲线图，描绘根据KRAS和BRAF突变非KRAS基因突变携带者治疗类型的中位总存活率。

图23D是一个曲线图，描绘根据KRAS和BRAF突变非KRAS突变携带者治疗类型的中位总存活率。

图24A是一个曲线图，描绘经过化疗药物伊立替康治疗后，野生型KRAS和KRAS突变癌细胞内归一化荧光素酶表达。

图24A是一个曲线图，描绘了当癌症细胞采用伊立替康治疗时，倍数回归与(表示为KRAS基因突变型／KRAS野生型)伊立替康浓度的关系函数。

具体实施方式

与癌症相关的KRAS原致癌基因(rs61764370)3′UTR内let-7microRNA互补位功能性变体先前被确定(国际专利申请号PCT／US2008／065302，其全部内容通过引述合并入本文中)。本文描述了突变与肿瘤生物学相关性的研究。

乳腺癌

乳腺肿瘤分为ER(雌激素)和／或PR(孕激素)受体阳性，HER2(Her2／neu／ERBB2)扩增，三阴性肿瘤(例如，ER／PR阴性和HER2阴性)(

T，et al.Proc Natl Acad Sci USA2001；98：10869-74)。基因表达和受体分析，进一步将乳腺癌分为四个生物亚群：luminal A肿瘤(ER-和／或PR-受体阳性，HER-2阴性)，luminal B(ER-和／或PR-受体阳性，HER2阳性)，HER-2阳性(HER2-阳性，ER／PR阴性)和基底样肿瘤(ER／PR／HER2-阴性，也被称为三阴性乳腺癌(TNBC))(

T，et al.Proc Natl AcadSci USA2001；98：10869-74)。

对比其他亚型，三阴性乳腺癌(TNBC)是最具攻击性子类，具有5年特定病因生存期(Ha□ty BG et al.J Clin Oncol2006；24：5652-57)。近期转录表达谱研究表明三阴乳腺癌肿瘤异质性，这些肿瘤可分为两大亚群；表达EGFR或角蛋白(CK)5／6的ER／PR／HER2(三)阴性肿瘤，因此，被称为‘基底样’，不表达EGFR或CK5／6的ER／PR／HER2(三)阴性肿瘤。基底样三阴性(TN)肿瘤特征在于，比非基底样形式和低表达BRCA1(乳腺癌)发病年龄早(低龄)；基底样细胞表型是BRCA1基因突变携带者中常见的(Rakha EA and Ellis IO.Pathology2009；41：40-47)。异常luminal型前体细胞群(其可能是ER阳性)是BRCA-1相关的基底样肿瘤转化的靶标(Lim E，et al.Nat Med2009；15：907-13)。虽然预测基因表达标志物是高度同源的，几个模块，如DNA修复缺陷，免疫应答标记，或者上皮细胞-间质细胞转变通常在这些肿瘤子集(Bild AH，et al.Breast Cancer Res2009；11：R55)。识别这些转录模块的启动子是发现特异性、个性化治疗的一种方法。

三阴性乳腺癌表型与年轻发病的相关性，和已知风险或生殖因素缺乏相关性(Yang XR，et al.Cancer Epidemiol BiomarkersPrev2007；16：439-43)，表明这种癌症发展有遗传风险(Bauer KRet al.Cancer2007；109：1721-28)。本发明之前，不存在这种风险增加的遗传标志物。尽管BRCA1基因突变往往与三阴性肿瘤相关，这些突变是罕见的，占患有三阴性乳腺癌患者仅10％至15％，取决于种族背景和家族病史(Young SR，et al.BMC Cancer2009；9：86；Nanda R，et al.JAMA2005；294：1925-33)。

本文提供的研究在来自美国康涅狄格州415例病理证实乳腺癌患者和457位对照组(研究组1)中确定KRAS基因突变的频率分布，以及在携带已知雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、HER2状态的690名爱尔兰妇女和和360名对照者(研究组2)中确定这种突变与乳腺癌亚型的相关性。研究组1和2的数据汇集140名三阴性乳腺癌妇女患者和113名对照者，评估KRAS基因突变与三阴性乳腺癌风险，以及三阴性乳腺癌患者全基因组mRNA和特异性miRNA表达的相关性。

虽然研究组1KRAS基因突变的频率分布在所有基因型个体中无差异，对比201名绝经前对照者中27例(13％)(P=0.015)，患有ER／PR-阴性癌症的24名绝经前妇女中8例(33％)具有KRAS突变。研究组2中，对比478例luminal A乳腺癌中占64例(13％)，87例luminal B乳腺癌中占13例(15％)，35例HER2阳性亚群中占2例(6％)，KRAS突变在三阴性乳腺癌妇女中显著性富集(90例中占19例[21％])(p值=0.044)。合并研究组的多因素分析显示，KRAS基因突变与绝经前妇女三阴性乳腺癌相关(比值比2.307，95％CI1·261-4.219，P=0.0067)。三阴性乳腺癌肿瘤基因表达分析表明，KRAS基因突变阳性肿瘤显著性改变基因表达，富集luminal型前体和BRCA1缺乏标签。MiRNA分析暗示KRAS基因突变肿瘤中let-7miRNA种类的水平降低。

KRAS基因突变是绝经前妇女发生三阴性乳腺癌的一种遗传标志物。细胞基因和miRNA表达标签启动三阴性乳腺癌患者的分子和生物分层。

大肠癌

KRAS基因突变是一种早期大肠癌(CRC)预测标志物。此外，KRAS基因突变诱导更高水平的KRAS基因致癌蛋白和较低水平的肿瘤抑制剂lethal-7(let-7)miRNA。大型、前瞻性荷兰队列研究(NLCS)的409例早期(I期和II期)、182例III期和69例IV期病例中对KRAS基因突变的影响进行了研究。携带KRAS突变的早期患者有一个更好的预测，尤其是那些还携带其它KRAS突变。这一发现与微卫星不稳定性或其他预测因素无关。此外，通过荷兰队列研究(NLCS)的1，886例亚队列成员的数据，KRAS基因突变对直肠癌风险的影响也进行了研究。G等位基因(例如，KRAS突变等位基因)与发展直肠癌的可能性不相关，但G等位基因富集在晚期直肠癌中，这表明它可能预测更晚期的疾病。由于本研究人群仅是未经治疗人群的分析，这些结果提供了一个关于携带KRAS基因突变大肠癌的自然生物学的新见解。

由于本文所给出的数据证明，KRAS基因突变是指导早期阶段患者治疗决策的一种新的大肠癌(CRC)生物标志物。携带KRAS突变早期大肠癌病例有更好的结果，然而，在疾病晚期，不再有更好的结果。对于早期患者，KRAS基因突变基因型联合至少一个KRAS突变的也是治疗决策要考虑的更好治疗结果的预测标志物。

尽管诊断和治疗的创新，大肠癌(CRC)仍然是西方世界癌症死亡的第二大原因。肿瘤淋巴结转移系统(TNM)是目前提供预测信息的标准工具。肿瘤淋巴结转移系统是对两极(早期和晚期大肠癌)预测具有高度预测性，但对于中间阶段具有低的预测性。根据目前指导方针，没有给予早期患者辅助化疗(例如，T1-3-N0-M0，按国际抗癌联盟TNM)。在早期患者组中(例如，T1-3-N0-M0)的五年生存率大于70％。尽管如此，20％-30％的早期患者(I期和II期)将在5年内死于大肠癌，如果这些患者提前确诊，进行相应治疗，引发这些死亡能否被避免的问题。此前，众多研究已经发表，声称分子标志物的预测影响。与这些先前报告的断言相反，这些研究结果是不一致的。因此，在本文所述方法形成之前，分子改变影响预测的问题仍然没有得到解决(Smits KM，et al.Pharmacogenomics.2008；9(12)：1903-16)。

MicroRNAs(miRNA)，已被确定为癌症发生和发展的重要因素。有证据表明，单个miRNA可以同时调节很多mRNAs(Paranjape T，et al.Gut.2009；58(11)：1546-54)。此外，miRNA可以起到肿瘤抑制基因和致致癌基因的作用(Johnson SM，et al.Cell.2005；120(5)：635-47)。miRNAs lethal-7家族(let-7)是第一个被发现的miRNA家族中的一个。在许多癌症中，let-7家族miRNA的表达被改变。举例来说，在肺癌中，let-7低表达(CalinGA，et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101(9)：2999-3004；Takamizawa J，et al.Cancer Res.2004；64(11)：3753-6)，let-7过度表达抑制细胞体外生长(Takamizawa J，et al.Cancer Res.2004；64(11)：3753-6)并且抑制细胞体内生长(Kumar MS，et al.ProcNatl Acad Sci U S A.2008；105(10)：3903-8；Esquela-Kerscher A，etal.Cell Cycle.2008；7(6)：759-64)，这提示let-7miRNA可能起到肿瘤抑制剂的作用(Johnson SM，et al.Cell.2005；120(5)：635-47)。

在结肠癌细胞中，与非癌旁组织对比，肿瘤组织中let-7的表达显著性降低(AkaoY，et al.Biol Pharm Bull.2006；29(5)：903-6)。此外，let-7表达增加，let-7a-1miRNA前体细胞转染后RAS表达下降，这提示let-7参与调节结肠癌细胞的生长(AkaoY，et al.Biol Pharm Bull.2006；29(5)：903-6)。

结合靶mRNA3′非翻译区(UTR)互补元素，MiRNA可以控制基因表达。结合KRAS基因mRNA3’-UTR特异性位点后，let-7诱导RAS下调。KRAS基因突变影响let-7介导调控KRAS基因表达。与野生型对比，突变G等位基因(例如，KRAS突变)的发生导致更高的KRAS基因水平和较低的let-7的水平。中度吸烟者中，G-等位基因携带者具有增加肺癌的风险，增加卵巢癌的风险(特别是绝经后的妇女)，患乳腺癌的危险性增加(尤其是，三阴性乳腺癌亚型)，降低口腔癌的存活，但不降低肺癌生存。KRAS／BRAF突变的大肠癌，G等位基因携带者(KRAS基因突变携带者)显示后期大肠癌存活减少，以及对西妥昔单抗的不同应答，证实KRAS基因突变在结肠癌中的作用。因为KRAS突变基因型在早期大肠癌中的作用未解决，这里给出的实验和数据，评估了荷兰队列研究(NLCS)409例早期(I期和II期肿瘤淋巴结转移；T1-4，N0，M0)，182例III期(T1-4，N1，M0)和69例IV期(T1-4，N0-1，M1)大肠癌病例预测的影响。利用荷兰队列研究(NLCS)的1，886例亚队列成员的数据，KRAS突变基因型对大肠癌风险的影响也进行了评估。

这项研究结果表明，KRAS基因3’UTR LCS6T>G突变影响早期(I期和II期)大肠癌的预测。KRAS基因突变存在于16.4％的病例中，而仅在世界人口中的6％被发现(Chin LJ，et al.Cancer Res2008；68：8535-40)，而12％至15％的欧洲人中被发现(Ratner E，et al.Cancer Res2010；70：6509-15)。在晚期病例中发现KRAS突变(G-等位基因)频率增加(分别为患者早期14％，III期19.2％，和IV期21.4％)，与先前报道的III期频率具有可比性(Graziano F，et al.Pharmacogenomics J2010；10：458-64)。在18％的亚队列成员中发现G等位基因(KRAS突变)。发现KRAS基因突变和晚期结肠癌增加之间具有统计学显著性相关性，提供了关于KRAS基因突变携带者结肠癌自然生物学的有价值见解。此外，发现携带KRAS突变的早期大肠癌病例存活统计学显著性增加，KRAS基因突变的患者中，携带G等位基因(KRAS突变)的早期阶段患者没有死于大肠癌。携带KRAS突变的早期大肠癌病例存活的统计学显著性增加与其它预测因素无关，如肿瘤分化或错位。由于T4肿瘤在早期病例中是罕见的，因为观察到更坏结果的原因，KRAS野生型中的更高频率的IIb期病例被排除。虽然结果表明，KRAS基因突变(G等位基因)和KRAS突变的三期病例预测较差，在III期或IV期未发现统计学显著性影响。此外，KRAS基因突变(G等位基因)对大肠癌风险的影响进行了研究。发现早期大肠癌风险降低，但对晚期大肠癌的风险没有影响，这表明G等位基因(KRAS突变)与发展大肠癌的更高可能性无关。

在以前的研究中，KRAS突变与预测较差有相关性。然而，关于这一主题的结果不一致，而且，与这些结果的临床意义尚不清楚(Smits KM，et al.Pharmacogenomics2008；9：1903-16)。KRAS突变与KRAS基因突变不同，这是先天性的突变，因此，对肿瘤的发展、生物学、和预测有不同的影响。

KRAS突变与早期大肠癌生存率提高有关联的发现是引起人们的兴趣。此前研究表明，细胞衰老可以由致癌Ras的过度表达引发，可能有助于癌前病变或良性肿瘤生长停止(Mooi WJ andPeeper DS.N Engl J Med2006；355：1037-46)。人类癌症中肿瘤细胞衰老已被报道。癌前结肠腺瘤也显示衰老的特征(Collado Mand Serrano M.Nat Rev Cancer2010；10：51-7)。致癌基因诱导的衰老可能仅在癌前病变发挥作用。然而，KRAS基因的生理水平可在没有转录因子肾母细胞瘤1(WT1)的情况下诱导衰老(VicentS，et al.J Clin Invest2010；120：3940-52)。如果KRAS基因高表达的肺癌患者WT1相关基因的表达减少，他们有一个良好的预测(Vicent S，et al.J Clin Invest2010；120：3940-52)。总之，这些结果意味着其他分子因素可参与细胞命运的决定中，致致癌基因诱导的衰老可以发生在其他遗传或表观遗传目标异常表达之后。致致癌基因诱导的衰老也可以在大肠癌发挥作用：在KRAS基因-LCS6基因型可能导致晚期肿瘤，或早期肿瘤，早期肿瘤具有基于被影响的另一遗传(表观遗传)标志物的较好预测。

这两者都参与了Ras信号通路，携带KRAS突变和BRAF突变或RASSF1A甲基化的早期(I期和II期)病例发现更好的结果。BRAF相关的衰老以前报道发生在黑色素瘤中(Michaloglou C，et al.Nature2005；436：720-4)，但还没有被证实RASSF1A在致致癌基因诱导的衰老中可能发挥的作用。如文中描述的研究人群中，KRAS基因突变与BRAF突变和／或RASSF1A高甲基化同时存在是不常见的，因此，没有达到统计学意义。将这些遗传(表观遗传)事件结合时，KRAS基因突变(G-等位基因)和KRAS、BRAF、或RASSF1A交替组合更加增强患者更好的结果。因此，由于KRAS突变(G等位基因)Ras过度表达，结合Ras通路基因(表观遗传)遗传突变，可诱导早期大肠癌的衰老，从而影响存活。对于晚期病例，越来越多的分子通路受到影响，影响预测。

miRNA let-7家族证实，对比野生型(13)，KRAS基因突变存在的情况下，肿瘤生长抑制，let-7表达降低，KRAS水平增加。因此，预期携带KRAS基因突变的患者有较差的预测，如所示，例如，口腔癌(Christensen BC，et al.Carcinogenesis2009；30：1003-7)。对于大肠癌，有两个报告研究KRAS基因型对患者治疗效果的影响(Graziano F，et al.Pharmacogenomics J2010；10：458-64；Zhang w et al.Ann Oncol2011；22：104-9)。第一个报道，携带KRAS基因突变的一小群伊立替康耐药患者采用伊立替康和西妥昔单抗治疗，存活率差，以及存在KRAS突变和没有BRAF突变的相关性(Graziano F，et al.Pharmacogenomics J2010；10：458-64)，然而，由于患者未经治疗，这些研究发现在这项研究中可能不会被重复。第二个报道，转移性大肠癌单独采用西妥昔单抗治疗有更好的响应，携带KRAS基因突变没有KRAS突变的患者生存期长，但响应无统计学意义(Zhang w et al.AnnOncol2011；22：104-9)。本文提出的数据证实IV期KRAS基因突变携带者预测较好，虽然对比无统计学显著性，这可能解释为IV期患者组规模小。其他研究使用生殖细胞组织评估KRAS基因型，然而，本文描述的研究使用肿瘤DNA评估KRAS基因型。正常组织和肿瘤组织的基因型与KRAS基因突变是相同的得到证实。

对比晚期大肠癌，早期和晚期大肠癌看似不和谐的结果提出了一些关于不同癌症阶段肿瘤起源和进展的问题，是否早期大肠癌能够通过分子不同通路发展。KRAS基因突变是晚期疾病中比较常见的，然而，早期诊断携带KRAS突变的患者似乎有一个更有利的结果。因此，这些数据提示，与晚期病例对比，早期阶段的不同生物学。即使早期KRAS野生型患者有一个微卫星不稳定性肿瘤，他们预测较差的发现，可能表明，这些患者将受益于另外的辅助治疗。需要进一步研究，包括随机临床试验，以评估是否这些预测较差的早期患者将受益于另外的辅助治疗。在发现生物标志物与本文所述的方法之前，微卫星不稳定性已经被认为是预测良好的标志物(Boland CR and Goel A.Gastroenterology2010；138：2073-87.e3)然而，这项研究的数据证实KRAS突变等位基因携带者更好的结果与微卫星不稳定性状态无关。

文中提到的早期大肠癌病例KRAS突变的影响分析，证实携带KRAS突变的早期G等位基因(KRAS突变)携带者有一个更好的结果。本研究中人群仅是通常未经治疗的人群，第一次，这项研究中所收集的数据提供了对携带KRAS基因突变的早期大肠癌的自然生物学的有价值见解。因此，本文所提出的证据是第一个指出KRAS突变基因型是早期大肠癌可能的预测标志物，可以用来识别预测良好的大肠癌患者。

治疗应答

卵巢癌

上皮性卵巢癌(EOC)是美国第二个最常见的女性盆腔生殖器官癌症，在西方世界此类死亡率最高。这是美国女性癌症死亡的第五位主要原因，每年有13，850名妇女死于这种疾病。尽管有多种新的治疗方法，上皮性卵巢癌的高死亡率多年维持不变，5年生存期只有30-39％(Parmar MK，et al.(2003).Lancet361：2099-2106)。

目前采用的治疗上皮性卵巢癌的标准化疗方案是卡铂和紫杉醇(Pfisterer J，et al.(2006).J Clin Oncol24：4699-4707)，基于前瞻性随机试验(Herzog T and Pothuri B.(2006).Nat Clin PractOncol3：604-611；Esquela-Kerscher A and Slack F.(2006).Nat RevCancer6：259-269；Iorio M，et al.(2007).Cancer Res67：8699-8707)。有些患者虽然最初对铂类化疗有耐药性(统称为“铂类耐药′)，治疗6个月内复发，这是给所有上皮性卵巢癌患者的一线治疗。更好地理解上皮性卵巢癌肿瘤基本生物学差异，可以解释上皮性卵巢癌患者中铂耐药将会选择一个更合理的治疗方法(Parmar MK，et al.(2003).Lancet361：2099-2106；Pfisterer J，et al.(2006).J Clin Oncol24：4699-4707；Herzog T andPothuri B.(2006).Nat Clin Pract Oncol3：604-611)。

MicroRNAs(miRNA)是一类22个核苷酸非编码RNA，在几乎所有类型的癌症中异常表达，它们可以作为一类新的致癌基因或肿瘤抑制基因。上皮性卵巢癌，除了从恶性卵巢组织中区分正常卵巢组织之外(Iorio M，et al.(2007).Cancer Res67：8699-8707；Zhang L，et al.(2008).Proc Natl Acad Sci USA105：7004-7009)，miRNA表达模式显示对上皮性卵巢癌发病是重要的(.Int J Biochem Cell Biol42：1262-1272；van Jaarsveld M，etal.(2010).Int J Biochem Cell Biol42：1282-1290)，与上皮性卵巢癌患者结果改变(Eitan R，et al.(2009).Gynecol Oncol114：253-259)和治疗应答有关联(Lu L， et al.(2011).Gynecol Oncol122：366-371)。miRNA表达差异也与上皮性卵巢癌化疗和铂耐药有关联(Eitan R，et al.(2009).Gynecol Oncol114：253-259；Lu L，et al.(2011).Gynecol Oncol122：366-371；Chen K，et al.(2008).Carcinogenesis29：1306-1311)。

miRNAs在癌症中的重要性的其它见解来自于遗传性的单核苷酸多态性(SNP)的发现，干扰miRNA的编码序列(Chin LJ，et al.(2008).Cancer Res68：8535-8540)和miRNA原致癌基因3′非翻译区(3‘UTRs)的结合位点(Chen K，et al.(2008).Carcinogenesis29：1306-1311；Chin LJ，et al.(2008)。这种功能性突变的实施例是rs61764370，统称为KRAS基因突变，位于在中的let-7miRNA互补位KRAS基因3’UTR。曾报道rs61764370和上皮卵巢癌(EOC)的风险之间的关联(参见，国际专利申请号PCT／US2008／065302和国际专利申请号PCT／US2010／023412，其全部内容通过引述各自合并于本文中)。此外，提供的方法和实施例证明，这种突变是上皮性卵巢癌(EOC)临床结果和化疗耐药的一种生物标志物。证据支持肿瘤KRAS突变连续功能作用，与恶性肿瘤生物学和癌症较差结果之间的关联性。

本文所评估了有害BRCA突变存在和不存在的情况下，KRAS基因突变作为大肠癌结果生物标志物的潜力。而且，研究铂类新辅助化疗的响应证实KRAS基因突变大肠癌患者结果改变的潜在原因，评估了铂类耐药并且评估了大肠癌肿瘤基因表达。这些数据表明，直接靶向功能获得性KRAS基因突变可能减少具有这种病变的上皮性卵巢癌细胞株中细胞生长和存活。

KRAS基因突变是患有上皮性卵巢癌的绝经后妇女(52岁以上)预测较差的生物标志物。KRAS突变相关的卵巢癌的预测不良是由于，至少部分由于KRAS基因突变与铂类化疗耐药的关联性，基于铂类新辅助化疗的更糟糕的响应，辅助治疗的携带KRAS基因突变的上皮性卵巢癌患者具有统计学显著性增加的铂类耐药性。

KRAS基因突变上皮性卵巢癌和非突变上皮性卵巢癌肿瘤之间的生物学差异得到基因表达数据支持，表明，KRAS基因突变-相关联的上皮性卵巢癌中KRAS成瘾和AKT-介导铂类耐药。与非突变细胞株对比，进一步证实携带KRAS基因突变的卵巢癌细胞株体外铂类耐药性。通过直接靶向这种突变，KRAS突变相关上皮性卵巢癌对KRAS突变生殖病变连续依赖性的证据表明，导致显著抑制KRAS基因突变上皮性卵巢癌细胞株与非突变上皮性卵巢癌细胞株内肿瘤生长和细胞存活。

KRAS突变与绝经后妇女生存率不佳的关联性可能是由于与这种突变相关的基础生物学。支持关联性反映基础生物学的假说，KRAS突变与绝经后卵巢癌相关联(Ratner E，et al.(2010).Cancer Res15：6509-6515)，平均诊断年龄近59岁。相对生存率随年龄变化，诊断为上皮性卵巢癌的老年妇女5年之内死亡率可能为年轻妇女的两倍，进一步支持这一假设的是绝经后的妇女可能具有生物学不同的肿瘤(ACS(2010).Cancer facts&figures2010.Cancer Facts&Figures.ACS：Atlanta，GA，PP1-56)。此外，KRAS基因突变已被证明是绝经前妇女(年龄<52岁)患三阴乳腺癌风险的一种生物标志物。因此，KRAS基因突变在患癌风险中的作用与不同组织中生物学可能依赖于响应于生理条件的miRNA表达改变，如绝经。KRAS基因突变妇女患乳腺癌的风险可能是第一位，然后，可能有发展成绝经后卵巢癌的风险。

KRAS突变并不能预测一组携带已知有害BRCA基因突变的上皮性卵巢癌患者预测较差的发现，可能解释为因为BRCA基因突变与铂类敏感性相关联。BRCA基因突变与铂类敏感性相关的后果可能发生KRAS基因突变导致或加剧铂类药物耐药。这可能是本文研究的年轻患者，可能有未见文档的有害BRCA基因突变。或者，此外，研究中提供的年轻患者，也可能患有其他亚型的更常见于年轻妇女的卵巢癌，如交界性肿瘤，导致这些患者误诊。虽然本文提供的数据进行了广泛的临床注解，没有得到我们所有的上皮性卵巢癌患者BRCA状态，虽然病理报告可用，肿瘤组织无法获得重新审查。最近的一项研究未能找到KRAS突变与预测不良的关联性和用于全基因组关联研究的卵巢上皮性卵巢癌治疗的耐药，该研究具有非常有限的临床信息，例如，如BRCA状态和卵巢癌特异性存活的因素无法获得，也不包括在其分析中(Pharoah P，et al.(2011).Clin Cancer Res17：3742-3750)。

两种不同类型的KRAS基因突变相关肿瘤中发现类似的基因错误表达，表明这些肿瘤，无论组织来源，在肿瘤发生时使用类似的通路。直接靶向KRAS基因突变相关的上皮性卵巢癌细胞株中KRAS基因突变病变导致显著性增强的细胞死亡，并减少KRAS水平。这些发现表明，KRAS基因突变肿瘤对单一、非编码生殖病变的连续重度依赖。虽然通过测量肿瘤基因表达，并确定肿瘤突变，一直显著性努力定制癌症治疗，即便有，很少有生殖细胞突变，先前已被证明是癌症治疗的重要靶标。

根据本文所提供的数据，确定卵巢癌中重要的KRAS基因突变是一种功能性致癌基因突变，KRAS突变促使与它相关联的卵巢肿瘤亚型。这些发现有助于提高卵巢癌患者的预测。

大肠癌

靶向表皮生长因子受体(anti-EGFR moAbs)的两种单克隆抗体掺入到转移性大肠癌(mCRC)临床实践中，西妥昔单抗和帕尼单抗，作为单药治疗或与化疗相结合，提供给治疗前患者一个温和的临床受益(Cunningham D，et al.N Engl J Med2004；351(4)：337-345；Saltz LB，et al.J Clin Oncol2004；22(7)：1201-1208；Saltz LB，et al.N Engl J Med2000；343(13)：905-914；Van CE，et al.J Clin Oncol2007；25(13)：1658-1664)。不过，它很快变得明显，其功效仅限于一个群患者。非随机的回顾性研究(Amado RG et al.J Clin Oncol2008；26(10)：1626-1634；De RW,et al.Ann Oncol2008；19(3)：508-515；Lievre A，et al.Cancer Res2006；66(8)：3992-3995；Lievre A，et al.JClin Oncol2008；26(3)：374-379；Moroni M，et al.Lancet Oncol2005；6(5)：279-286；Sartore-Bianchi A，al.J Clin Oncol2007；25(22)：3238-3245)，前瞻性随机试验回顾性分析(BokemeYer C，etal.J Clin Oncol2009；27(5)：663-671；Douillard J et al.AnnOncolsupp.2009；Karapetis CS，et al.N Engl J Med2008；359(17)：1757-1765；Tol J，et al.N Engl J Med2009；360(6)：563-572；Van Cutsem E，et al.N Engl J Med2009；360(14)：1408-1417)，大欧洲联盟研究表明(De RW,et al.LancetOncol2010；11(8)：753-762)，肿瘤KRAS突变的存在预测了抗EGFR单克隆抗体治疗耐药性，并且与预测差、生存期短相关。强制性启动抗EGFR单抗治疗KRAS突变状态有很多年了，问题没有得到解决，因为，约50-65％的患有KRAS野生肿瘤的转移性大肠癌患者没有受益于这些治疗，这意味着，耐药的另外的遗传决定因素或者灵敏度存在(De RW,et al.Ann Oncol2008；19(3)：508-515；Allegra CJ，et al.J Clin Oncol2009；27(12)：2091-2096；De RW,al.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762；RooCk WD，et al.Lancet Oncol2010)。越来越多的证据表明，BRAF V600E突变赋予抗EGFR单克隆抗体耐药性(De RW,et al.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762；Di NF，et al.J Clin Oncol2008；26(35)：5705-5712；Laurent-Puig P，et al.J Clin Oncol2009；27(35)：5924-5930；Saridaki Z，et al.IPLoS One2011；6(1)：e15980；Souglakos J，et al.Br J Cancer2009；101(3)：465-472)，然而，尽管并不完全清楚，PIK3CA突变肿瘤似乎没有或很少受益于这样的治；疗(De RW,et al.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762；Prenen H，etal.Clin Cancer Res2009；15(9)：3184-3188；Sartore-Bianchi A，et al.Cancer Res2009；69(5)：1851-1857；Jhawer M，et al.Cancer Res2008；68(6)：1953-1961；Ogino S，et al.J Clin Oncol2009；27(9)：1477-1484)。

除了肿瘤遗传特征，有越来越多的证据表明，患者的生殖细胞基因组也可能在给予anti-EGFR单克隆抗体治疗耐药性或者敏感性发挥作用。支持这个概念，FcγRIIa和FcγRIIIa、表皮生长因子受体、表皮生长因子、细胞周期蛋白D1和COX-2基因编码多态性，与单一疗法和与联合化疗给药的西妥昔单抗治疗转移性大肠癌患者的结果有关联。

MicroRNAs(miRNAs)是一类高度同源、内源性的、非编码的小RNA分子，长度为18-25个核苷酸，结合靶标mRNA3′-非翻译区(UTR)部分互补位负调控基因表达。经Dicer和Drosha酶RNase III核酸内切酶处理后，成熟的miRNA可以通过引导RNA诱导的沉默复合体向靶mRNA抑制mRNA翻译。miRNA调节一些参与了基础生物过程，如细胞增殖、细胞分化和凋亡的基因，无论是作为致癌基因或肿瘤抑制基因在癌症发生和发展中起到重要角色。虽然，迄今已确认人类基因组中700多个miRNA序列，这一数字预计将增加一倍。此外，每个miRNA可以同时通过调节许多miRNA来控制数百个基因。

MiRNA结合mRNA基因对mRNA水平的调控过程和随后的蛋白表达是至关重要的，并且这种调节可以受到miRNA靶标位点单核苷酸多态性(SNP)(SNPs)的影响。这些单核苷酸多态性(SNP)可以创建错误的结合位点或者取消(消除)正确的结合位点，导致miRNA调节抗性，反映能够在人类的疾病，如癌症中发挥作用的另一种遗传突变(或给某些疾病，如癌症增加风险)。新兴的研究主要集中在这些结合位点的系统基因组评价和检测单核苷酸多态性(SNP)的功能和生物相关性，这是个性化医疗快速增长领域的重要分子标志物。出现这样的单核苷酸多态性(SNP)不仅影响基因表达，而且还影响肿瘤生物学和药物反应及耐药性。

miRNA Lethal-7家族(let-7)在许多癌症中首次被发现，并且已检测到其差异表达。KRAS原致癌基因是let-7miRNA家族的直接作用靶点，更确切地说，一经结合KRAS基因mRNA3′非翻译区(3′-UTR)某些位点，let-7诱导KRAS基因下调。

KRAS基因突变是一种功能性的单核苷酸多态性(SNP)(SNP)，发生在KRAS基因3′-UTR mRNA let-7互补位点(LCS)。所述单核苷酸多态性(SNP)(rs61764370)将T置换为G碱基，被发现改变成熟let-7结合KRAS基因mRNA的能力，并导致KRAS基因癌蛋白体外表达增加，并导致体内let-7miRNA水平更低，这可能是由于负反馈回路。与KRAS基因的致癌性质一致，KRAS基因突变(也称为G等位基因)显示增加了中度吸烟者患非小细胞肺癌(NSCLC)的风险，增加了发展三阴性乳腺癌的风险，增加了一群妇女中患卵巢癌的风险。此外，在小队列BRCA1携带者中检测KRAS突变等位基因的频率增加。而且，KRAS基因突变携带者(等位基因G-)，患有头部和颈部癌症，但不是患有非小细胞肺癌，显示出总生存率降低。统计学显著性较差的生存率和铂耐药被发现在携带KRAS基因突变(G等位基因)的卵巢癌患者中。证据也一起证明了KRAS基因突变(也被称为KRAS基因3′-UTR LCS6SNP)的功能及临床显著性。

转移性大肠癌靶向抗EGFR单抗治疗设置日期，KRAS基因突变已在小部分人群并具有矛盾和冲突的结果的两项研究中进行评估(Graziano F，et al.Pharmacogenomics J2010；10(5)：458-464；Zhang W，et al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109)。携带KRAS和BRAF野生型等位基因患者人群的第一项研究中(Graziano F，et al.Pharmacogenomics J2010；10(5)：458-464)，伊立替康-西妥昔单抗联合治疗进行救助治疗，KRAS基因突变(G-等位基因)携带者均表现具有统计学显著性更糟的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。相反，在第二项研究中(Zhangw，et al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109)，其中患者接受西妥昔单抗单药救助治疗，KRAS基因突变(G-等位基因)携带者显示出较长的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，有一个更好的客观有效率(ORR)。虽然这些研究似乎有相反的结果，这些患者治疗不相同，而事实上，伊立替康化疗加西妥昔单抗还被发现预测了KRAS基因突变(G-等位基因)携带者的不佳反应(Winder T，et al.J.Clin.Oncol.[27(15S Suppl)].2009.Abstract)。有证据表明，不像肿瘤并发KRAS蛋白突变，对KRAS基因突变(G-等位基因)携带者进行联合治疗差异性影响对西妥昔单抗的响应(Winder T，et al.J.Clin.Oncol.[27(15SSuppl)].2009.Abstract)。这与疾病中动态调节miRNA结合位变体的数据一致。

在这项研究中，KRAS基因突变，以及其他分子标志物，如KRAS和BRAF突变状态，在接受anti-EGFR单克隆抗体单药治疗或者单克隆抗体与化疗联合治疗的一系列559名转移性大肠癌患者中进行了评价。本文中所给出的数据明确了预测单克隆抗体治疗应答中KRAS基因突变的作用。在此患者队列中，以及细胞株中，KRAS基因突变(G等位基因)预测了单克隆抗体单药治疗的阳性响应，细胞毒性化疗没有任何额外的益处。

本文提出的研究证实，患有转移性结肠癌的所有KRAS突变携带者的中位无进展生存期统计学显著性改善(一对野生型患者改善总生存期的趋势)，KRAS突变携带者接受anti-EGFR单克隆抗体单药治疗。此外，相对于抗表皮生长因子受体单克隆抗体响应研究的所有队列中的非KRAS突变携带者，包括KRAS或RAF突变患者，发现这些患者统计学显著性预测良好。这种预测改善是不取决于化疗的加入，而事实上，除了anti-EGFR单克隆抗体治疗之外，KRAS基因突变(G等位基因)携带者显示出化疗没有效果。这与非KRAS突变患者相反，其得出所有队列中显著性受益于化疗加anti-EGFR单克隆抗体，化疗的加入给接受anti-EGFR单克隆抗体单药治疗的同一水平KRAS突变等位基因携带者带来了预测。细胞株研究表明，对比非突变细胞株，KRAS基因突变细胞株缺乏联合治疗中获益的同样效果。这些研究结果表明，第一时间，患有转移性结肠癌的KRAS基因突变等位基因患者，可以，也许应该避免化疗的毒性，有时甚至是致命的影响，并且可以单独进行有意义的anti-EGFR单克隆抗体单药治疗。

对比报告的基线患病率，主要起源于欧洲的一群患者表现出KRAS基因突变频率升高19.5％。在6％的世界人口中发现KRAS突变，在健康白种人中其频率已估计将上升10％以上。此外，患有非小细胞肺癌患者中，KRAS基因突变的患病率大幅增加近20％，突出了风险增加的关联性。Graziano等人(Pharmacogenomics J2010；10(5)：458-464)研究的具有欧洲血统的白人转移性大肠癌患者群中，KRAS基因突变(G等位基因)(掺入TG和GG基因型)被发现在25％的患者中，然而Zhang等人研究的更异质人群中(Ann Oncol2011；22(1)：104-109)，KRAS突变的频率为15.3％。本文提供的数据没有发现KRAS突变等位基因是患结肠癌的风险，虽然IV期患者富集KRAS突变。总之，证据表明，虽然KRAS突变(G等位基因)不是所有类型的结肠癌的风险，它与发展晚期和转移性结肠癌的可能性有关联。KRAS突变预测了采用西妥昔单抗单药治疗时，早期结肠癌以及转移性结肠癌患者预测良好。然而，KRAS基因突变(G等位基因)可能与结肠癌中转移性疾病的发展有关联，这是普遍致命的。

对比以前的报告，在关于转移性大肠癌患者人群这项研究中观察到根据KRAS和BRAF突变状态的KRAS突变基因型的不同分布。在这项研究中，KRAS基因型在KRAS野生型和突变组之间平均分配，但是，在BRAF突变组中，KRAS突变的频率是统计学显著性增加，例如，与野生型相比高两倍。在大肠癌癌变的后期阶段，KRAS基因突变等位基因可能介导低分化且更具攻击性的克隆的选择，这种克隆携带BRAF突变。此外，KRAS基因突变的存在下，选择性压力可能有利于KRAS或BRAF突变发展，这取决于接受特异性疗法。当进行西妥昔单抗治疗时，不管患者已经有KRAS或BRAF基因突变，KRAS突变(G等位基因)患者有不同的预测，提示这些组需要重新评估西妥昔单抗治疗的潜力。

当依据治疗分析生存结果时，采用anti-EGFR单克隆抗体单药治疗整个和一对野生型患者群中，KRAS突变基因型携带者有统计学显著性更长的无进展生存期(分别，P=0.019和P=0.039)。虽然，在整个单药治疗的患者群中，对比野生型携带者28.85周，KRAS突变基因型携带者有45周更长的总生存期(OS)，然而这种差异并未达到统计学显著性。在KRAS基因突变携带者双(KRAS和BRAF)野生型患者群中，观察到统计学显著性(P=0.087)更长总生存期(OS)的趋势(55.43与35.71周)。

对比具有LCS6野生型基因型(P=0.037，log-rank检验)患者12周无进展生存期，具有KRAS基因突变(G-等位基因)基因型的西妥昔单抗／伊立替康治疗的KRAS突变患者，表现出显著性更差的无进展生存期(PFS)6.4周。在我们的分析中，anti-EGFR单克隆抗体为基础的联合化疗组中，人们分别使用多种药剂治疗，KRAS突变和野生型基因型携带者之间任一人群中发现无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)无统计学显著性差异。具有KRAS或RAF突变的KRAS突变携带者，当他们分别接受化疗与单药治疗时，存在更差生存期(23周与28周)的趋势。这些结果共同表明，KRAS突变携带者采用化疗联合基于anti-EGFR单克隆抗体的治疗是不利的。

在其他癌症中，大肠癌发展的一个重要步骤，是miRNA失调。在过去几年中，miRNA已被带到分子肿瘤学的中心舞台，并大大改变了我们看待和理解基因调控的方式。KRAS基因突变是与癌症风险相关的miRNA结合位内第一个单核苷酸多态性(SNP)。本文提出的数据表明，携带KRAS突变等位基因的患者比非突变、或LCS6野生型患者更具有生物学差异性。加用化疗无收益的情况下，携带KRAS基因突变等位基因基因型的患者有较高概率收益于anti-EGFR单克隆抗体单药治疗以及更好的总体预测。由于KRAS突变肿瘤诱导KRAS通路的过度表达，上游抑制这一通路可能使这些肿瘤特别敏感。这种机制显示出否认KRAS基因突变肿瘤单克隆抗体治疗缺乏疗效，然而，有可能KRAS基因突变不会诱发像KRAS基因突变肿瘤一样高水平的独立KRAS通路信号。

KRAS突变肿瘤不能从细胞毒药物治疗加单克隆抗体单药治疗中得到好处。因为miRNA let-7家族调节KRAS突变，因为化疗降低let-7水平，允许更高的KRAS基因表达(尤其在KRAS基因突变存在下)，使用化疗的治疗方案可能会增加该等位基因的激活，从而去除上游单克隆抗体疗法克服KRAS通路激活的能力。3’UTR功能性突变(包括KRAS基因突变)的潜在可能性，预测肿瘤生物学改变和对治疗的响应，得到患者更好的危险评分。

MicroRNA

MicroRNAs(miRNAs)是一类新的小非编码RNA，具有靶mRNA3′非翻译区(UTR)，以及5′非翻译区(UTR)和编码序列区内序列的碱基配对调控基因表达，导致mRNA的裂解和／或翻译抑制(He L，et al.Nature2005；435：828-33；Esquela-KerscherA.and Slack FJ.Nat Rev Cancer2006；6：259-69)。迄今研究的每一例癌症中MiRNAs被错误调控，包括，但不限于，乳腺癌和大肠癌，在肿瘤起始细胞中发现某些miRNA改变(尤其减少let-7)，这表明低let-7使这些细胞自更新和增殖(Yu F，et al.Cell2007；131：1109-23)，并增加患癌症的风险。

因为miRNA起到全局基因调控的作用，miRNA遗传突变与癌症风险增加相关。证据快速增长，干扰miRNA编码序列(Ho□man A，et al.Cancer Res2009；69：5970-77)或3′UTRmiRNA结合位点的多态性是癌症风险强有力的预测因子，包括，但不限于，乳腺癌和大肠癌(Pongsavee M，et al.Genet Test MolBiomarkers2009；13：307-17；Tchatchou S，et al.Carcinogenesis2009；30：59-64)。然而，没有先前发现的miRNA-改变多态性与三阴性乳腺癌(TNBC)或与肿瘤中改变的基因和／或miRNA表达相关。

最近确定了KRAS原致癌基因3’UTR let-7miRNA互补位点内的一种新的种系多态性(rs61764370)(国际专利申请号PCT／US2008／065302，其全部内容通过引用合并于本文中)，统称为“LCS6-SNP′或‘KRAS基因突变’。

KRAS突变与肿瘤内低浓度let-7和肺癌改变的KRAS基因调控相关(Chin L，et al.Cancer Res2008；68：8535-40)。此外，KRAS基因突变预测了头部和颈部癌症中较差的癌症特异性结果(Christensen BC，et al.Carcinogenesis2009；30：1003-07)，也预测了结肠癌中改变的药物应答(Graziano F，et al.Pharmacogenomics J2010；10：458-64；Zhang W，et al.Ann Oncol2011；22：104-09)。KRAS基因突变也富集在卵巢癌中，是最常见与遗传性乳腺癌和卵巢癌(HBOC)家族的患者相关联(RatnerE，et al.Cancer Res2010；70：6509-15)。本文提供的研究进一步评估了癌症风险和肿瘤生物学中KRAS基因突变的作用。

本文提供的数据显示，举例来说，KRAS基因3′UTR种系多态性，被称为“KRAS基因突变”，是绝经前妇女发展三阴性乳腺癌风险增加的一种遗传标志物。因为研究组1规模小，只能在具有已知的ER和PR状态患者中评估，相关性在全受体状态的更大规模的病例对照组中得到验证。最重要的是，数据证实与没有KRAS基因突变的患者对比，具有KRAS基因突变的三阴性乳腺癌(TNBC)患者的肿瘤有不同的基因表达模式，证实KRAS基因突变驱动特异性通路，该特异性通路众所周知影响肿瘤生物学并修改肿瘤发展。因此，KRAS基因突变可以将肿瘤分类为有意义的生物亚组，在未来预测预测以及指导治疗决策。

三阴乳腺癌肿瘤内let-7表达减少与KRAS基因突变相关的发现在临床上是重要的。通过NFKB，KRAS基因过度表达可诱导lin-28、let-7负调控，因此，降低let-7表达(Iliopoulos D，et al.Cell2009；139：1-14；Meylan E，et al.Nature2009；462：104-08；Barbie D，et al.Nature2009；462：108-12)。这提示了，预恶性组织，最终，KRAS基因突变相关的肿瘤中let-7降低的潜在机制。此外，let-7调控乳腺样干细胞增殖(Yu F，YaoH，Zhu P，et al.Cell2007；131：1109-23)，并调控let-7低表达或低浓度使这组细胞扩张，从而增加了携带KRAS基因突变的妇女患乳腺癌的风险。KRAS基因突变只与绝经前妇女三阴性乳腺癌风险的相关性指出了KRAS基因突变和激素暴露之间的意义交互。

尽管半数以上携带BRCA1基因突变的乳腺癌肿瘤(TNBC)发展成三阴性亚型(Atchlev DP，et al.J Clin oncol2008；26：4282-88)，BRCA1基因突变是罕见的，因此，大约占所有三阴乳腺癌病例的10-15％(Young SR，et al.BMC Cancer2009；9：86；Nanda R，et al.JAMA2005；294：1925-33)。在23％以上的绝经前三阴乳腺癌患者中发现KRAS基因突变，这些队列的BRCA突变基因携带者或者年轻的ER／PR阴性BRCA1基因突变携带者中没有明显的显著性富集(miRNA表达图谱，公众可登录WWW.appliedbiosystems.com／absite／us／en／home／applications-technologies／real-time-pcr／mirna-profiling.html(accessed Jan1，2008))。KRAS基因突变与BRCA1基因突变类基因表达标签相关联，表明无论是通过突变或其他机制，有可能增加KRAS基因突变、KRAS基因高表达和BRCA1低表达存在下的致癌风险。

KRAS基因突变影响体外调控KRAS基因表达，并引发更高的KRAS浓度(Chin L，et al.Cancer Res2008；68：8535-40)。KRAS致致癌基因是MAPK通路重要的上游调节，其过度表达可以导致Raf/MEK／MAPK通路活化增加，从而促使肿瘤的发生。本文提供的研究证实，具有KRAS基因突变和三阴性乳腺癌的患者显示出MAPK通路活化(表X)。乳腺癌细胞中MAPK超活化降低ER表达，导致ER-阴性表型(Atchley D P，et al.J ClinOncol2008；26：4282-88)，与我们的发现一致，KRAS基因突变与这些组织学ER阴性肿瘤内更低雌激素信号相关。MAPK活化与非雌激素依赖型肿瘤的生长和抗雌激素治疗不敏感性有关(Oh AS，et al.Mol Endocrinol2001；15：1344-59)，可能是KRAS基因突变驱动乳腺癌肿瘤不只是其它乳腺癌亚型发展的机制。

KRAS基因突变是一些癌症预测较差的生物标志物，包括头部和颈部癌症(Christensen BC，et al.Carcinogenesis2009；30：1003-07)。KRAS基因突变也是结肠癌靶向治疗联合化疗反应不佳的生物标志物(Graziano F，et al.Pharmacogenomics J2010；10：458-64)。KRAS基因突变阳性三阴性乳腺癌患者具有luminal型前体血管标签，标签内血管生成和转移性标志物的差异表达证实，KRAS突变肿瘤是侵略性亚组三阴性乳腺癌。

本文提供的研究证实，KRAS基因突变与肿瘤相关，肿瘤保持独特的基因表达模式。虽然工作正在进行，这些研究数据提供了针对转化关键步骤和通路以及妇女肿瘤发展的有价值见解。这些都是了解功能miRNA破坏多态性的癌症生物学机制非常有意义的步骤，功能miRNA破坏多态性功能上不同于先前发现的癌症风险遗传标志物。

KRAS突变

本发明是基于，部分基于意外发现，存在KRAS基因3′非翻译区(UTR)单核苷酸多态性(SNP)，本文统称为“LCS6SNP”’或“KRAS基因突变”，预测个体患癌症风险和个体治疗癌症的响应。KRAS基因突变位于LCS6，在下面提供了野生型和突变序列。

KRAS突变可以由一个或多个下列序列表示。举例来说，KRAS基因突变可以由GenBank登录号rs61764370和序列GTCTCGAACTCCTGACCTCAAGTGATGCACCCACCTTGGCCTCATAAACCTG(SEQ ID NO：22，其中单核苷酸多态性(SNP)用粗体下划线标出)定义。

由HRAS、KRAS和NRAS组成的三种人RAS基因。每个基因包括多个其mRNA转录物3′UTR内miRNA互补位点。具体来说，每种人RAS基因包括多个let-7互补位点(LCSs)。microRNAs let-7家族(miRNAs)包括结合其靶标信使RNAs(mRNAs)3′UTRs(非编码区)控制肺癌致癌基因表达的重要的全局遗传调控因子。

具体而言，术语“let-7互补位”是为了描述结合miRNAs let-7家族成员的基因或基因转录物的任何区域。此外，这个术语包括与let-7家族miRNA序列互补的基因或基因转录物内这些序列。术语“互补”描述两个序列间结合的阈值，其中每个序列中的大部分核苷酸能反式结合另一序列内大多数核苷酸。

人KRAS3′UTR包括8个LCS1，分别命名为LCS1-LCS8。下列序列，胸腺嘧啶(T)可取代为尿嘧啶(U)。LCS1包括序列GACAGUGGAAGUUUUUUUUUCCUCG(SEQ ID NO：1)。LCS2包括序列AUUAGUGUCAUCUUGCCUC(SEQ ID NO：2)。LC S3包括序列AAUGCCCUACAUCUUAUUUUCCUCA(SEQ IDNO：3)。LCS4包括序列GGUUCAAGCGAUUCUCGUGCCUCG(SEQ ID NO：4)。LCS5包括序列

GGCUGGUCCGAACUCCUGACCUCA(SEQ ID NO：5)。LCS6包括序列GAUUCACCCACCUUGGCCUCA(SEQ ID NO：6)。LCS7包括序列GGGUGUUAAGACUUGACACAGUACCUCG(SEQ ID NO：7)。LCS8包括序列

AGUGCUUAUGAGGGGAUAUUUAGGCCUC(SEQ ID NO：8)。

人KRAS基因有两个野生型形式，由转录物a和b编码，分别为下文中所提供的序列号：9和10。每个人KRAS转录物的序列，含有LCS6SNP，如下文中所提供的序列号：11和12。

人KRAS基因，转录剪接体a，由下列mRNA序列编码(NCBI登录号：NM_033360和SEQ ID NO：9)(非编码区以粗体显示，LCS6以下划线标出)：

人KRAS，转录剪接体b，由下列mRNA序列编码(NCBI登录号：NM_004985和SEQ ID NO：10)(非编码区以粗体显示，LCS6以下划线标出)：

人KRAS，转录剪接体a，包括LCS6SNP，由下列mRNA序列编码(SEQ ID NO：11)(非编码区以粗体显示，LCS6以下划线标出，SNP以大写字母写出)：

人KRAS，转录剪接体b，包括LCS6SNP，由下列mRNA序列编码(SEQ ID NO：12)(非编码区以粗体显示，LCS6以下划线标出，SNP以大写字母写出)：

KRAS突变是LCS6SEQ ID NO：6第4位G取代为U的结果。KRAS突变包括序列GAUGCACCCACCUUGGCCUCA(SNP用粗体强调)(SEQ ID NO：13)。

KRAS突变通过扰乱KRAS基因miRNA调控导致KRAS表达改变。国际申请号为PCT／US08／65302(WO2008／151004)中进一步描述了KRAS基因突变的鉴别和表征，其全部内容通过引用合并于本文中。

Let-7家族miRNAs

携带KRAS突变的细胞中let-7家族miRNA的表达提高。有趣的是，let-7家族miRNA结合LCS，其中KRAS突变位于此。KRAS突变的存在干扰let-7结合KRAS。通过干扰，KRAS基因突变或者诱导let-7结合，或者多或少紧紧结合KRAS LCS6。据发现，与野生型细胞相比，含有KRAS基因突变的细胞具有较低水平的KRAS基因mRNA，具有水平增加的KRAS蛋白。因此，虽然不希望被理论所束缚，细胞内KRAS基因突变的存在，可能会干扰let-7结合KRAS的能力并抑制蛋白质的翻译，从而使KRAS基因蛋白水平更高。

三重阴性乳腺癌内KRAS基因突变的存在也与显著性较低水平的let-7miRNA相关联。例如，let-7miRNA表达减少2倍(2X)、3倍(3X)、4倍(4X)、5倍(5X)、6倍(6X)、7倍(7X)、8倍(8X)、9倍(9X)、10倍(10X)、20倍(20X)、50倍(50X)、100倍(100X)、200倍(200X)、500倍(500X)、1000倍(1000X)，或在两者之间任何倍数。可选地，或此外，对比于未患有三阴性乳腺癌主体身上获得的细胞内let-7miRNA表达水平，患有三阴性乳腺癌主体身上获得的细胞内let-7miRNA表达减少，两者之间统计显著性差异(例如正常细胞或对照细胞)体现为p值小于0.05，优选地，p值小于0.01，或最优选的是，p值小于0.001。从患有三阴性乳腺癌主体身上获得的细胞中let-7miRNA表达水平，也可以与本领域已知的标准水平对比。此外，也可以在患有乳腺癌，或者，尤其是三阴性乳腺癌的主体的受影响细胞和未受影响的细胞之间进行比较let-7表达的水平，其中所述未受影响的细胞作为内部对照组。

示例性let-7miRNA包括，但不限于，let-7a(let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3)、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f(let-7f-1和let-7f-2)、let-7g、和let-7i。对于下列序列，胸腺嘧啶(T)可取代为尿嘧啶(U)。let-7a包括序列UUGAUAUGUUGGAUGAUGGAGU(SEQ ID NO：14)。let-7b包括序列UUGGUGUGUUGGAUGAUGGAGU(SEQ ID NO：15)。let-7c包括序列UUGGUAUGUUGGAUGAUGGAGU(SEQID NO：16)。let-7d包括序列UGAUACGUUGGAUGAUGGAGA(SEQ ID NO：17)。let-7e包括序列UAUAUGUUGGAGGAUGGAGU(SEQ ID NO：18)。let-7f包括序列UUGAUAUGUUAGAUGAUGGAGU(SEQ ID NO：19)。let-7g包括序列GACAUGUUUGAUGAUGGAGU(SEQ ID NO：20)。let-7i包括序列UGUCGUGUUUGUUGAUGGAGU(SEQ IDNO：21)。

另外的let-7家族成员的序列，公众可登录miRBase(www.mirbase.org)。

治疗方法

KRAS突变突变的识别表明三阴性乳腺癌发展的危险性增加。在本发明的上下文中，“风险”涉及在一个特定时间期间会发生一件事件的概率，可以意味着主体的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可以对照实际观察后测量相关时间队列进行测量，或者对照统计学有效的历史队列的指数值进行测量，历史队列遵循相关的时间段。相比低风险队列或平均人群风险的绝对风险，相对危险度是指主体绝对风险的比率，它可以通过临床危险因素评估进行更改。比值比，对于一个给定的测试结果的正性事件相对于负性事件的比例，也通常不用转换(比值是通式P／(1-P)，其中p是事件概率，(1-p)是根据没有事件的概率)。

“风险评价”，或“风险评估”在本发明的上下文中包括概率预测、机率、或一件事件或疾病状态可能会发生的可能性，该事件发生率或从一个疾病状态到另一个状态的转换，例如，从原发肿瘤向转移性肿瘤的转变或发展成转移性的风险，或从原发转移性事件向二次转移性事件转变的风险，或从发展一种类型的原发肿瘤向发展不同类型的一个或多个原发肿瘤的风险。风险评估还可以包括预测未来的临床参数，传统实验室危险因素值，或其它癌症的指数，与先前被测人群有关的绝对或相对术语。

相比于不携带KRAS突变的个体，“风险增加”用来形容携带KRAS突变的个体发展或已发展癌症的概率增加。在某些实施方案中，KRAS基因突变携带者可能发展或患有癌症是不携带KRAS突变的个体的1.5X、2X、2.5X、3X、3.5X、4X、4.5X、5X、5.5X、6X、6.5X、7X、7.5X、8X、8.5X、9X、9.5X、10X、20X、30X、40X、50X、60X、70X、80X、90X、或100X。

预测较差是指发展侵略性、高风险、严重的、或继承形式的癌症(例如，三阴性乳腺癌)个体存活概率，或者侵略性、高风险、严重的、或继承形式的癌症发展或恶化个体存活的概率，小于更加良性型癌症发展或恶化个体存活的概率。

预测较差也用来形容一个不太令人满意的恢复、恢复期较长、更具侵入性或高风险的治疗方案，或癌症的复发或转移的概率增加。举例来说，三阴性乳腺癌或其转移与乳腺癌亚型预测最差密切相关，导致主体预测较差。

术语主体、患者、个体在说明书中交替使用。主体优选哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但并不限于这些实施例。主体是男性或者女性。主体可能先前已被诊断为患有癌症，特定类型的癌症(例如，乳腺癌)，或癌症的一个亚型(例如，作为乳腺癌的一个亚型的三阴性乳腺癌)。主体表现出一个或多个癌症风险因素，一个特定类型的癌症(例如，乳腺癌)，或癌症的一个亚型(例如，作为乳腺癌的一个亚型的三阴性乳腺癌)。可供选择地，主体不表现出癌症的一个危险因素，一种特定类型的癌症(例如，乳腺癌)，或一种癌症亚型(例如，作为乳腺癌亚型的三阴性乳腺癌)。

乳腺癌，包括三阴性乳腺癌，危险因素包括，但不限于，存在KRAS基因突变；女性、衰老、肥胖、缺乏生育或哺乳期、激素水平较高、吸烟、暴露在辐射、个人乳腺癌病史、乳腺癌家族史，特别是乳房的变化(例如，那些与纤维囊性疾病相关的变化，包括，但不限于，不典型增生和小叶原位癌)。对于三阴性乳腺癌发展的示范性保护措施包括，但不限于，经常锻炼，避免环境诱发因素(如吸烟、饮酒、高脂肪的饮食导致肥胖、职业性辐射暴露)，选择母乳喂养孩子，对于那些最严重的风险，预防性双侧乳房切除术。本发明的主体可能会出现一个或多个危险因素，风险因素可能会进一步得到缓解或经保护措施来改变。

本文所述的方法从主体身上获得样品。样品可以是任何组织或液体，其中包含核酸。多种实施方案包括，但不限于，石蜡嵌入组织、冰冻组织、手术细针穿刺术，和乳房细胞(包括导管、小叶、或结缔组织得到的细胞)，淋巴结(包括前哨或腋窝淋巴结)，胸部或腹部肌肉或结缔组织，器官(包括潜在的转移性细胞的任何潜在损伤部位，如脑、肝、肾、胃、肠、骨髓、胰、结肠、或肺)。其它实施方案包括流体样品，如血液、血浆、血清、淋巴液、腹水、浆液、和尿液。

SNP分型方法

KRAS基因突变是一种发生在人类KRAS基因3’UTR的单核苷酸多态性(SNP)。连锁不平衡(LD)是指在两种或多种不同的SNP位点等位基因共同继承，其频率大于指定人群每个等位基因出现分开频率(例如，替代核苷酸)。独立遗传的两个等位基因共生的预期频率第一个等位基因的频率乘以第二个等位基因的频率。预期频率下共生的等位基因被认为是“连锁平衡”。与此相反，连锁不平衡是指两个或多个不同的SNP位点的等位基因之间任何非随机的遗传关联，这通常是由于沿着一条染色体的两个位点的物理接近性。连锁不平衡时，可能会发生两个或两个以上的单核苷酸多态性(SNP)站点在给定的染色体上彼此密切物理接近，因此，在这些SNP位点的等位基因倾向于多代不分离，一个SNP位点处的特定的核苷酸(等位基因)显示与附近的不同的SNP位点处的特定核苷酸(等位基因)非随机关联。因此，SNP位点基因分型会给出与连锁不平衡中另一个SNP位点基因分型相同的信息。

用于筛选遗传性疾病的个体(例如预测或风险)的目的，如果一个特定的SNP位点被发现筛选疾病是有用的，则本领域技术人员将认识到该SNP位点连锁不平衡的其它SNP位点也将有效筛选病症。两个或两个以上的单核苷酸多态性(SNP)之间可能遇到不同程度的连锁不平衡，其结果是，一些单核苷酸多态性(SNP)比其它的更为密切相关(例如，更强的连锁不平衡)。此外，沿着染色体的连锁不平衡的物理距离在基因组的不同区域之间是不同的，因此发生LD所需的两个或多个SNP位点之间的物理隔离的程度在基因组不同区域之间也有差异。

筛选应用，多态性也是有用的(例如，SNPs和／或单倍型)，不是实际的致病(致病)多态性，而是具有这种致病基因多态性的连锁不平衡。在这种情况下，预测具有致病基因多态性的连锁不平衡中的多态性的基因型，预测受致病基因多态性影响的基因型(如，疾病)。因此，致病基因多态性连锁不平衡中多态标志物是有效的标志物，当实际致病基因多态性是未知的时候，尤其有用。

人类基因组连锁不平衡在Wall et al.，″Haplotype blocks andlinkage disequilibrium in the human genome″，Nat Rev Genet.2003August；4(8)：587-97；Gamer et al.，″On selecting markers forassociation studies：patterns of linkage disequilibrium between twoand three diallelic loci″，Genet Epidemiol.2003January；24(1)：57-67；Ardlie et al.，″Patterns of linkage disequilibrium in thehuman genome″，Nat Rev Genet.2002April；3(4)：299-309(erratumin Nat Rev Genet2002July；3(7)：566)；和Remm et al.，″High-density genotyping and linkage disequilibrium in the humangenome using chromosome22as a model″；Curr Opin Chem Biol.2002February；6(1)：24-30.中进行了评论。

本发明的筛选技术，可以采用各种不同的方法，以确定测试主体是否具有单核苷酸多态性(SNP)，或者与发展可检测的特征的风险增加或风险减少有关联的SNP模式，确定是否主体患有可检测的特征，可检测特征是特定多态性／突变的结果，包括，举例来说，分析个体染色体的单体型、家族研究、单精子DNA分析、或体细胞杂种的方法。使用本公开诊断方法分析的特征，可能是病理和疾病通常观察到的任何可被探测的特征。

确定特定核苷酸(即等位基因)存在于一个或多个SNP位置的每一个内，如在SEQ ID NO：11，12，13或22中公开的核酸分子内SNP位置，被称为SNP基因分型。本发明提供的SNP基因分型的方法，例如用于各种疾病筛选，或易感性确定，或者确定一种治疗形式的响应，预测，或基因组作图或SNP关联分析等

通过本领域公知的方法，核酸样品可以进行基因分型，以确定等位基因出现在任何给定的基因区域(例如，SNP位置)。相邻的序列可用于设计SNP的检测试剂，例如寡核苷酸探针，其可任选以试剂盒形式来实施。示例性SNP基因分型方法在Chen etal.，″Single nucleotide polymorphism genotyping：biochemistry，protocol，cost and throughput″，Pharmacogenomics J.2003；3(2)：77-96；Kwok et al.，″Detection of single nucleotidepolymorphisms″，Curr Issues Mol.Biol.2003April；5(2)：43-60；Shi，″Technologies for individual genotyping：detection of geneticpolymorphisms in drug targets and disease genes″，Am JPharmacogenomics.2002；2(3)：197-205；和Kwok，″Methods forgenotyping single nucleotide polymorphisms″，Annu Rev GenomicsHum Genet2001；2：235-58中进行了描述。高通量SNP分型方法示范性技术在Marnellos，″High-throughput SNP analysis forgenetic association studies″，Curr Opin Drug Discov Devel.2003May；6(3)：317-21中进行了描述。常见SNP基因分型方法包括，但不限于，TaqMan分析、分子信标检测、核酸阵列、等位基因特异性引物延伸法、等位基因特异性PCR技术，阵列引物延伸，均匀的引物延伸分析，通过质谱法检测的引物延伸、焦磷酸测序、引物延伸多重排序的遗传分析、滚环扩增结扎、均匀结扎、OLA(美国专利号：4,988，167)、多重连接反应排序的遗传分析、限制性片段长度多态性、单碱基延伸标记检测和侵入检测技术。这种方法可以与检测机制联合使用，例如，举例来说，发光或化学发光检测器、荧光检测、时间分辨荧光检测、荧光共振能量转移、荧光偏振、质谱法、和电检测的检测机制。

用于检测基因多态性的多种方法包括，但不限于，切割试剂保护方法用来检测RNA／RNA或RNA／DNA双链中错配碱基(Myers et al.，Science230：1242(1985)；Cotton et al.，PNAS85：4397(1988)；and Saleeba et al.，Meth.Enzymol.217：286-295(1992))，突变型和野生型核酸分子的电泳迁移率比较(Orita et al.，PNAS86：2766(1989)；Cotton et al.，Mutat.Res.285：125-144(1993)；和Hayashi et al.，Genet.Anal.Tech.Appl.9：73-79(1992))，和采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)检验含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中多晶型或野生型片段的运动(Myers et al.，Nature313：495(1985))。特定位置的序列突变也可以通过核酸酶保护试验进行评估，如核糖核酸酶和SI保护或化学裂解法。

在一个优选的实施方案中，使用TaqMan方法进行SNP基因分型，这也被称为5′核酸酶测定法(美国专利号5，210,015和5，538，848)。TaqMan方法检测到PCR期间特定的扩增产物的积累。TaqMan法利用荧光报告基团和淬灭基团标记的寡核苷酸探针。报告基团被适当波长照射激发，通过荧光共振能量转移(FRET)方法，转移能量到相同探针内的淬灭基团。当连接到探针时，激发的报告基团不发射信号。淬灭基团接近完整探针内的报告基团保持报告基团降低的荧光性。报告基团和淬灭基团可能分别在5′和3′最末端，或反之亦然。可供选择的，报告基团可能是在5′或3′最末端，而淬灭基团附着到一个内核苷酸上，或反之亦然。在另一个实施方案中，报告基团和淬灭基团可被连接到彼此相距一段距离的内核苷酸上，使得报告基团的荧光降低。

PCR过程中，DNA聚合酶的5′核酸活性裂解探针，从而将报告基团和淬灭基团分离，由此导致报告基团的荧光增加。通过监测报告基团的荧光的增加直接检测PCR扩增产物的积累。如果当探针杂交到PCR过程中扩增的含靶标单核苷酸多态性(SNP)的模板上，DNA聚合酶裂解报告基团和淬灭基团之间的探针，只有当特定SNP等位基因存在，探针设计用于杂交到靶标SNP位点。

使用SNP和本文所提供的相关的核酸序列信息可以很容易地确定优选的TaqMan引物和探针序列。一些计算机程序，如Primer Express(美国应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州)，可以用来迅速获得最佳的引物／探针组。对于本技术领域的技术人员是显而易见的，用于检测本发明的单核苷酸多态性(SNP)的引物和探针在包括癌症的多种疾病的预测检测中是有效的，可以容易地加入到试剂盒中。本发明还包括本领域周知的Taqman法的修改，如使用分子信标探针(美国专利号5,118,801和5,312,728)，和其它突变形式(美国专利号5,866,336和6,117,635)。

使用不匹配的检测技术，也可以确定多态性的识别，包括但并不限于使用核糖探针(Winter et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA82：7575，1985；Meyers et al.，Science230：1242，1985)和识别核苷酸错配的蛋白质，如大肠杆菌mutS蛋白(Modrich，P.Ann.Rev.Genet.25：229-253，1991)的核糖核酸酶保护方法。可供选择地，单链构象多态性分析(SSCP)(Orita et al.，Genomics5：874-879，1989；Humphries et al.，in Molecular Diagnosis of Genetic Diseases，R.Elles，ed.，pp.321-340，1996)，或变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell et al.，Nuci.Acids Res.18：2699-2706，1990；Sheffield etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：232-236，1989)，可以识别突变等位基因。

聚合酶介导的引物延伸方法也可用于识别多态性。在专利和科学文献中已经描述了几种这样的方法，包括“遗传位分析”的方法(WO92／15712)和连接酶／聚合酶介导的遗传位分析(美国专利号5,679,524)。相关方法公开在WO9I／02087、WO90／09455、WO95／17676、美国专利号5,302,509和5,945,283中。通过质谱法可以检测到含有多态性的扩展引物，如美国专利号5,605,798中所描述的。另一种引物延伸方法是等位基因特异性PCR(Ruanoet al.，Nucl.Acids Res.17：8392，1989；Ruano et al.，Nucl.Acids Res.19，6877-6882，1991；WO93／22456；Turki et al.，J Clin.Invest.95：1635-1641，1995)。此外，如Wallace等人所描述的(WO89／10414)，使用等位基因特异性引物集，同时扩增核酸的多个区域研究多个多态位点。

KRAS基因突变基因分型的另一种优选方法是OLA中使用两个寡核苷酸探针(参见，例如，美国专利号4,988,617)。在这种方法中，一个探针杂交到其3′最末端具有SNP位点的靶核酸的片断。第二个探针杂交到靶标核酸分子的相邻片断直接向3′端第一探针。两个并置探针杂交到靶标核酸分子，如果具有SNP位点的第一探针3′最末端核苷酸之间完美互补，在连接剂如连接酶存在下连接在一起。如有不匹配，连接将不会发生。反应后，该连接探针与靶标核酸分子分离，连接探针作为SNP存在的指示剂被检测到。

以下专利、专利申请，和已公布的国际专利申请，通过引述都合并于本文中，提供执行各种类型OLA的技术的额外信息：美国专利号6,027,889、6,268,148、5494810、5830711、和6054564描述了执行SNP检测的OLA策略；WO97／31256和WO00／56927描述了使用通用阵列进行SNP检测的OLA策略，其中zipcode序列可被引入到杂交探针中的一个之内，所得产物，或扩增产物，杂交到普通的zip code阵列；美国专利申请US01／17329(序列号09／584,905)描述了OLA(或LDR)，然后进行PCR反应，其中zipcode加入到OLA探针内，电泳或通用zipcode阵列读出确定PCR扩增产物；美国申请60／427,818、60／445,636、和60／445,494描述SNPlex方法和使用OLA，随后PCR技术的多样本多位点SNP检测软件，其中zipcodes纳入OLA探针内，扩增的PCR产物与zipchute试剂杂交，从zipchute的电泳读出确定单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，PCR(或核酸扩增的另一种方法)之前进行OLA。在其它实施方案中，在OLA之前进行PCR(或核酸扩增的另一种方法)。

SNP基因分型的另一种方法是基于质谱。质谱法利用DNA的4个核苷酸中每一个的独特质量。单核苷酸多态性(SNP)可以通过质谱法测量具有替代的单核苷酸多态性(SNP)等位基因的核酸的质量的差异而明确基因型。MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱技术是优选的极为精确测定分子质量，如单核苷酸多态性(SNP)。已经开发了基于质谱的多种SNP分析方法。优选的基于质谱的SNP基因分型的方法，包括引物延伸分析，也可以联合其他方法使用，如传统的凝胶格式和凝胶芯片。

通常情况下，引物延伸分析涉及设计和引物退火到靶向SNP位置的模板PCR扩增子上游(5′)。双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)和／或脱氧核苷三磷酸(dNTPs)混合加入到含有模板(例如，含有SNP的核酸分子，通常已经被扩增，例如通过PCR)、引物和DNA聚合酶的反应混合物中。引物延伸终止在该模板中第一位置，此处核苷酸互补混合中ddNTPs之一。引物可以直接邻接(例如，引物3′端的核苷酸杂交到毗连靶点SNP位置的核苷酸)，或者为SNP位置除去的两个或更多个核苷酸。如果引物是从靶点SNP位置除去的几个核苷酸，唯一的限制是，引物3′端和单核苷酸多态性(SNP)位置之间的模板序列可以不包含相同类型的核苷酸，如被检测到的核苷酸，或这会导致延伸引物的过早终止。可供选择地，如果所有四个ddNTPs，没有dNTPs，单独加入到反应混合物中，引物将仅延伸一个核苷酸，对应于靶点SNP位置。在这种情况下，引物被设计成结合SNP位置的一个核苷酸的上游(例如，引物3′端的核苷酸杂交到靶点SNP位点5′侧核苷酸，该核苷酸紧邻靶点SNP位置)。延长一个核苷酸是优选的，因为它最大限度地减少延伸引物的总质量，从而提高了替代SNP核苷酸之间的质量差异分辨率。此外，质量标记的ddNTPs应用在引物延伸反应中替代未修饰的ddNTPs。这会增加这些ddNTPs延伸引物之间的质量差，从而提供更高的灵敏度和准确度，键入杂合碱基位置是尤其有用的。质量标记也缓解密集样品制备程序的需要，减少质谱仪必要的分辨率。

延伸的引物，然后进行纯化，并通过MALDI-TOF质谱法分析，以确定靶点SNP位置处核苷酸的身份。在一种分析方法中，引物延伸反应的产品结合光吸收晶体，形成基质。然后，能量源激光轰击基质，使核酸分子离子化并解吸成气相。然后，离子化分子喷进飞行管，并朝检测器加速到管下。电离(如激光脉冲)和分子与检测器碰撞的时间是该分子的飞行时间。飞行时间与电离分子的质荷比(m／z)精确相关。较小m／z离子顺管而下的速度比m／z较大的快，因此，较轻离子在较重离子之前到达检测器。然后，飞行时间转换成相应的、高精度m／z。在这种方式下，可以基于质量微小差异以及相应的飞行时间差异识别单核苷酸多态性(SNP)，核酸分子在单个碱基位具有不同核苷酸。欲了解引物延伸实验结合MALDI-TOF质谱仪用于SNP基因分型的更多信息，请参见，例如，Wise et al.，A standard protocol forsingle nucleotide primer extension in the human genome usingmatrix-assisted laser desorption／ionization time-of-flight massspectrometry″，Rapid Commun Mass Spectrom.2003；17(11)：1195-202。

下列参考文献进一步提供了描述基于质谱的SNP基因分型方法的言息：Bocker，′′SNP and mutation discovery usingbase-specific cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry″，Bioinformatics.2003July；19Suppl1：144-153；Storm et al.，″MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping″，MethodsMol.Biol.2003；212：241-62；Jurinke et al.，″The use ofMassARRAY technology for high throughput genotyping″，AdvBiochem Eng Biotechnol.2002；77：57-74；和Jurinke et al.，″Automated genotyping using the DNA MassArray technology″，Methods Mol.Biol.2002；187：179-92.。

单核苷酸多态性(SNP)也可以通过DNA直接测序进行评价。各种自动测序程序可以利用((1995)Biotechniques19：448)，包括通过质谱仪测序(参见，例如，PCT国际公开号WO94／16101；Cohen et al.，Adv.Chromatogr.36：127-162(1996)；和Griffin et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.38：147-159(1993))。本发明的核酸序列，使本领域中的普通技术人员很容易为这样自动测序程序设计测序引物。商业仪器，如美国应用生物系统公司377、3100、3700、3730、和3730.times.1DNA分析仪(福斯特市，加利福尼亚州)，是本领域自动测序通常使用的。

可用于KRAS基因突变基因分型的其他方法，包括单链构象多态性(SSCP)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Myers et al.，Nature313：495(1985))。SSCP通过单链PCR产物电泳迁移改变确定碱基差异，如Orita et al.，Proc.Nat.Acad中所描述的。单链PCR产物可以通过加热产生，或以其他方式使双链PCR产物变性产生。单链核酸可折叠或形成部分依赖于碱基序列的二级结构。单链扩增产物的不同电泳迁移率与SNP位置的碱基序列差异有关。基于不同的序列依赖稳定性和多态性DNA固有的熔融性和变性梯度凝胶电泳迁移模式相应差异性，DGGE区分单核苷酸多态性(SNP)的等位基因(Erlich，ed.，PCR Technology，Principles and Applications for DNA Amplification，W.H.Freemanand Co，New York，1992，Chapter7)。

基于核酶切割位点的发展或损失，序列特异性核酶(美国专利号5,498,531)也可以用于对单核苷酸多态性(SNP)评分。通过核酸酶裂解消化检测或通过熔融温度的差异，优选的匹配序列可以区分于不匹配序列。如果SNP影响限制酶切割位点，可以通过限制性内切酶酶切图谱改变，并通过凝胶电泳确定核酸片段长度的相应变化确定SNP。

SNP基因分型可以包括以下步骤，举例来说，从人类主体收集生物样本(例如，组织样本，细胞、体液、分泌物，等)，来自样本细胞分离出核酸(例如，基因组DNA、mRNA或两者都有)，一个或多个引物接触核酸，特异性杂交到含有靶点SNP的被分离出来的核酸的区域，发生靶核酸区域杂交和扩增，确定SNP位置核苷酸，或者，在某些试验中，检测扩增产物的存在或不存在(设计检测，如果特定SNP等位基因存在或者不存在，将只发生杂交和／或扩增)。在某些分析中，检测到扩增产物尺寸，对比对照样本的长度；举例来说，对比正常基因型，扩增产物尺寸的变化可以检测出缺失和插入。

实施例

实施例1：三阴性乳腺癌(TNBC)KRAS基因突变

研究人群

在该病例对照研究和基因分析中，评估四个队列数据(表1)。为了评估KRAS基因突变基因型频率分布，对耶鲁大学乳腺癌研究(研究组)的个体进行了评估。耶鲁大学乳腺癌研究(研究组1)个体报名参加在美国康涅狄格州的乳腺癌病例对照研究，得到耶鲁大学的机构审查委员会批准(Ho□man A，et al.Cancer Res2009；69：5970-77)。简而言之，患者年龄在30-80岁并且易发生、病理证实的乳腺癌并没有癌症史(非黑色素瘤皮肤癌除外)。所有病例建立了ER和PR状态，但HER2状态未知并且不能得到。对照主体或者从耶鲁-纽黑文医院(纽黑文，CT，USA)或美国Tolland县，CT，USA征集。耶鲁-纽黑文医院对照主体接受了乳腺癌相关手术，病理证实乳腺良性疾病。Tolland县对照主体可以通过随机数字拨号(个人年龄<65岁)或通过卫生保健财务管理文件(≥65岁)确定。从所有参与者获得知情同意和癌症家族史、生育史、人口因素、以及血液样本的数据。1990年至1999年间，从这项研究中415名患者和457名对照主体获得的DNA样本。

表1研究组

TNBC=三阴性乳腺癌，ER=雌激素受体，和PR=黄体酮受体

为了确定KRAS基因突变与受体状态和乳腺癌亚型的关联性，具有完整受体状态和亚型分类的诊断患有乳腺癌的690爱尔兰妇女队列进行了评估。来自该队列的患者(研究组2)组织学确诊患有乳腺癌，经戈尔韦大学医院(戈尔韦，爱尔兰)伦理委员会伦理批准后，从爱尔兰西部招募来。从所有病例中获得知情同意和乳腺癌或卵巢癌的详细的家族史、血液样本。710例所有阶段的乳腺癌和组织学类型，排除了浸润前癌。使用标准组织病理学分析及免疫组化学，建立了所有样品的ER、PR和HER2状态，HER2阳性荧光原位杂交进行证实。这些样品分类为luminalA、luminal B、HER2、或三阴性乳腺癌受体状态(表2)。在710名患者中，690名患者有完整的信息，并在这项研究进行了评估。这个队列中的360对照主体是来自同一地区的健康妇女，主要是年龄超过60岁，没有任何癌症的自我报告个人史，无乳腺癌或卵巢癌的家族史。病例组和对照组主要从2006年7月至2010年7月招募。

表2.亚型受体状态

以确定是否KRAS突变预测三阴性乳腺癌发展的风险增加，三阴性乳腺癌患者队列和来自耶鲁大学的对照主体(研究组3)，三阴性乳腺癌患者和来自研究组2的对照主体，和研究组1的对照主体，进行汇总分析。研究组3的患者在耶鲁-纽黑文医院或布里奇波特医院(布里奇波特，康涅狄格，美国)接受治疗。经耶鲁人力调查委员会批准后，组织或唾液标本取自156例患者。在1990-2007年被诊断的140例患者提供完整的数据，这些数据包括在这项研究中。基因和miRNA表达分析的任何治疗前，130例三阴性乳腺癌有可用的肿瘤样本，78人也进行了KRAS突变基因分型分析。这个队列的113名对照主体是健康妇女，没有癌症个人历史，耶鲁-纽黑文医院提供的，排除非黑色素瘤皮肤癌，2000年至2007年间被招募的。从所有病例和对照主体获得了临床资料、年龄、种族、家族史。表3总结这三个队列的基本信息。

表3.该研究中利用的三个独立的乳腺癌病例-对照队列的说明。

为了评估KRAS基因突变与ER阴性肿瘤内BRCA基因突变的相关性，具有乳腺癌的BRCA1基因突变携带者和我们以前研究的鹿特丹人群的已知KRAS基因突变状态进行了分析。对鹿特丹人群进行了描述(Hollestelle A，et al.Breast Cancer Res Treat2010；published online July30.DOI：10.1007／s10549-010-1080-z)，但是，简单地说，该人群包括患有乳腺癌和被记录的BRCA1基因突变的荷兰患者，伊拉斯谟大学通过鹿特丹家庭诊所(荷兰鹿特丹)调查确定。

步骤

KRAS基因突变基因型分析：使用custom TaqMan SNP基因分型检测，所有样品的DNA进行KRAS基因突变基因分型。突变G等位基因杂合或纯合的样品被认为是KRAS基因突变阳性(Chin L，et al.Cancer Res2008；68：8535-40)。

基因表达分析：来自耶鲁大学三阴性队列的78例患者测定全基因组mRNA基因表达，对KRAS突变进行了测试。使用RecoverAll total核酸分离试剂盒(美国应用生物系统公司)总RNA提取自组织标本，杂交到全基因组DASL分析(HumanRef-8版本3.0，Illumina公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。使用Bioconductor／R软件lumi软件包进行数据预处理和统计分析。合并并一起处理三个全基因组DASL分析运行得到的基因表达数据。具有小于30％的检测探针的样本和小于10％的样本中检测到的探针，在quantile-normalization之前被丢弃。过滤后剩下74个样本和18345个探针。

microRNA分析：使用Multiplex RT和TaqMan低密度阵列人类miRNA培养板实时PCR系统(美国应用生物系统公司)，按照制造商的协议，进行microRNA分析(miRNA表达谱，公众可登录

www.appliedbiosystems.com／absite／us／en／home／applications-technologies／real-time-pcr／mirna-profiling.html(2008年1月1日后可访问)。miRNAs表达水平进行了检查。

统计分析

所有病例和对照组的基因型分布被用于测试Hardy-Weinberg平衡，并且被认为是处于平衡状态。非条件Logistic回归被用于估算与每个基因型相关的相对风险。调整对照主体年龄(连续)和民族血统(白人、黑人、西班牙裔、或其它种族)。研究人群分为绝经期状态(通过年龄≤51岁或>51岁进行评估)，经多元logistic回归分析，独立风险估算ER和PR状态，三个水平结果变量编码为，0为对照组，1为患有ER阳性和／或PR阳性的肿瘤的病例，并且2为ER／PR阴性肿瘤的病例。使用Waldχ²检验测试交互作用，相对于ER／PR阴性疾病，比较ER阳性和／或PR阳性疾病病例中每个基因型的参数估计。

根据乳腺癌亚型，研究组2患者进行分层，使用GraphPadPrism4软件进行χ²检验，计算p值、比值比(Ors)和95％可信区间(CI)。由于低频率KRAS基因突变，显性模型被用于所有遗传关联分析。

在研究组之间，χ²检验或双面Fisher精确检验比较分类变量(例如，民族血统、阶段和研究站点)，t检验比较连续变量(如年龄)。使用无条件logistic回归模型，以及二进制结果变量，计算对照组和三阴性乳腺癌病例组KRAS突变的比值比(Ors)和95％可信区间(95％CI)。二进制结果变量编码为对照组和病例组，具有该二进制结果变量的多因素Logistic回归分析包括的变量，如KRAS基因突变状态、年龄、种族、和研究站点。人群按年龄组分层，患者年龄在51岁或年轻(绝经前组)或年龄超过51岁(绝经组)进行单独的logistic回归分析。用SAS版本9.1.3进行统计分析。

测量通路活化，对应于先前公布的表达标签和表达集主成分分析作为轴。主成分分析法用于分离基因表达数据集内生物技术信息来源。每个成分对应RNA质量，批处理效果的结构和贡献探头的生物学注解(即表达谱探针，表达谱具有指定组分的绝对高的投影值)。基因表达标签提供为基因列表，在特定条件其表达改变。这些标签是特别有价值的噪声数据，因为它们需要多个探针协调差异表达，通常在100顺序内。因为mRNA提取自福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)块，达到20年，用标签方法分析数据集是有根据的(Kibriya M，et al.BMC Genomics2010；11：622)。基因贡献的标签向量和每个样品这些基因表达谱之间的皮尔森相关性计算S标签分数。配对Kolmogorov-Smirnov检验用来分析KRAS基因突变与野生型样本中间KRAS基因突变与各自标签记述的结果的相关性。采用线性模型对基因表达差异进行了评估，同时考虑批量处理的偏移。采用LIMMA软件包的R进行倍数变化的模型拟合和经验贝叶斯误差调整(Smyth GK.Limma：linear models for microarray data.In：Gentleman R，et al，eds.Bioinformatics and computational biology solutions using Rand bioconductor.New York，USA：Springer，2005：397-420)。

8批次46个miRNA和2个内对照分析miRNA表达。使用几何平均值，将所有表达样本miRNA表达标准化：低于35个周期后(CT<35)，如果检测到基线荧光值，判别被表达的miRNA，减去所有表达的miRNA的几何平均周期数。miRNA在所有样本的三分之二以上不被表达，除去miRNA，所有剩余的阈值循环(C_t)值归一化。

KRAS基因突变基因型的频率分布在病例和对照组之间没有显著性差异，研究组1对照组进行基因分型(表1和表4)。然而，KRAS突变与具有ER／PR阴性肿瘤的绝经前患者的乳腺癌显著相关(表4)。绝经后的妇女没有观察到这种相关性。对比于201名对照主体中27名(13％)和44名患有ER和／或PR呈阳性癌症的绝经前妇女中4名(9％)，患有ER／PR阴性癌症的24名绝经前妇女中8名具有KRAS突变(33％)(图5)。因此，KRAS基因突变可能是为绝经前妇女发展受体阴性乳腺癌的风险增加的一种遗传标志物。

表4.KRAS基因突变与ER／PR阳性和ER／PR阴性乳腺癌的相关性。

研究组2中，478名妇女患有luminal A型乳腺癌，87名患有luminal B型乳腺癌，90名患有三阴性乳腺癌，和35名患有HER2阳性乳腺癌。该队列的690名乳腺癌病例中98名(14％)携带KRAS基因突变，但乳腺癌亚型之间患病率变化：对比478例luminal A中的64例(13％)，87例luminal B中13例(15％)，和35例HER2阳性亚组中的2例(6％)，KRAS突变统计学显著性富集在三阴性乳腺癌妇女中(90例中19例[21％])(P=0.044，图1)。也注意到年龄未超过51岁女性中三阴性乳腺癌的相关性(P=0.033，图1)。

对比所有三个队列2组、3组和对照组的三阴性乳腺癌病例(n=1160)，在病例组间KRAS基因突变的患病率发现有统计学显著性差异，或者对照组间KRAS基因突变的患病率发现有统计学显著性差异(表5)。研究组1和3的对照组比研究组2有更多的非白人妇女，多变量分析评估KRAS基因突变与非白人妇女患有三阴性乳腺癌的相关性。控制年龄、种族、研究站点之后，KRAS基因突变没有预测多变量分析中所有妇女发展三阴性乳腺癌的危险性增加(表6和表7)。然而，KRAS基因突变与多变量分析的合并组中361名绝经前妇女发展三阴性乳腺癌的危险性增加具有统计学显著相关性(表6、表8、和表9)。

表5.使用卡方检验分类变量，如种族和t检验连续变量(例如，年龄)，爱尔兰队列与耶鲁队列的三阴乳腺癌病例组(A)和对照组(B)人口统计学变量。

A.三阴乳腺癌病例组

B.对照组

表6.研究组1-3汇总分析的930名对照者进行对比，230名三阴性乳腺癌患者的KRAS基因突变相关性。

logistic回归模型调整了年龄、种族、绝经状态、和研究站点。G／G表型发生在小于5％的病例组和对照组中，与G／T的表型组合。

表7.采用卡方检验分类变量，如种族，t检验连续变量(例如年龄)，所有年龄段三阴乳腺癌病例组和对照组的人口统计学变量。

人口统计学

表8.采用卡方检验分类变量，如种族，t检验连续变量(例如，年龄)，绝经前三阴乳腺癌病例组和对照组的人口统计学变量。

人口统计学

表9.爱尔兰队列和耶鲁队列的51岁病例组和对照组中KRAS基因突变与三阴性乳腺癌的相关性。

爱尔兰队列*

*所有对照组单因素分析

耶鲁队列

多因素分析，控制种族和年龄

由于BRCA1基因编码序列突变与患三阴性乳腺癌风险是相关联的，并且因为KRAS突变富集在乳腺癌BRCA1基因突变携带者中(Hollestelle A，et al.Breast Cancer Res Treat2010；published online July30.DOI：10.1007／s10549-010-1080-z)，确定是否绝经前三重阴性乳腺癌与KRAS突变相关性仅是由于其与BRCA1基因突变携带者的相关性。队列2和3的BRCA基因测试的患有三阴性乳腺癌的36名患者中，25名(69％)是BRCA阴性和11名(31％)是BRCA阳性。这些患者中，对比于BRCA阳性的3名(27％)妇女，8例(32％)BRCA-阴性妇女有KRAS基因突变。这些发现表明，KRAS基因突变与无BRCA突变的一组独立的三阴性乳腺癌患者是相关的。

发现鹿特丹人群队列中KRAS基因突变状态和ER或PR阴性状态之间的相关性(Hollestelle A，et al.Breast Cancer Res Treat2010；published online July30.DOI：10.1007／s10549-010-1080-z；Kibriya M，et al.BMC Genomics2010；11：622)，然而，绝经状态不考虑在这些研究中。对于本文所述的研究结果，相比鹿特丹队列的268名BRCA1-基因突变-携带者，在126名ER／PR阴性乳腺癌的绝经前BRCA1-基因突变携带者中没有观察到KRAS突变富集(21·8％vs23·5％，p=0.95)。因此，绝经前三重阴性乳腺癌的KRAS突变的相关性是与BRCA1基因突变相关性无关。

为了进一步评估KRAS突变和三重阴性乳腺癌的BRCA1基因表达改变之间潜在的生物交互作用，来自研究组3的74例三重阴性肿瘤中确定BRCA1基因表达水平(表1)。与KRAS基因突变-阴性三阴性肿瘤相比，KRAS基因突变患者证实BRCA1表达统计学上显著性减少(探针1：p=0.06[ILMN_2311089]和探针2：p=0.01[ILMN_1738027]，图2)。此外，KRAS基因突变证实与BRCA1活性降低的基因表达标签有统计学显著相关性(P=0.04)(van‘t Veer LJ，et al.Nature2002；415：530-36)。本文提供的数据指出，虽然KRAS突变不局限于具有已知BRCA1突变的三阴性乳腺癌患者，KRAS基因突变、BRCA1基因表达或功能性改变与三阴性乳腺癌发展之间的生物相互作用可能存在。

研究组3的患者中，KRAS基因突变阳性的三阴性乳腺癌肿瘤中信号通路与KRAS基因突变阴性的的三阴性乳腺癌肿瘤中信号通路进行对比。虽然KRAS基因miRNA分析没有按KRAS基因突变状态变化，数据与其他出版物关于miRNA结合KRAS基因3′-UTR的作用是一致的(Chin L，et al.Cancer Res2008；68：8535-40；Johnson SM，et al.Cell2005；120：635-47)。在携带KRAS基因突变的肿瘤中发现NRAS突变增加(Croonquist PA，etal.Blood2003；102：2581-92)和MAP-激酶活化标签增加(Creighton CJ，et al.Cancer Res2006；66：3903-11)(表10)。数据表明，KRAS突变改变了典型的RAS通路的基因表达。此外，数据提供了第一个体内研究证据，KRAS基因突变导致与其相关联的肿瘤内下游基因表达连续改变。

表10.KRAS基因突变与阳性KRAS基因突变的三阴性乳腺癌患者肿瘤内通路标签的相关性。

由于携带KRAS突变的肺癌肿瘤中let-7miRNA的浓度被改变，在携带KRAS突变的三阴性乳腺癌肿瘤中检查let-7浓度。数据证实了KRAS基因突变相关肿瘤中低浓度的所有let-7miRNA家族成员(图3)。

为了确定KRAS突变如何与三阴性乳腺癌的已知基因表达标签集成，对此类肿瘤内差异表达的已知标签进行了评估。KRAS基因突变肿瘤具有一些三阴性和基底样型肿瘤生物学的几个特征，包括来自于表达组的主要成分内雌激素信号减少(p=0.04)。此外，KRAS基因突变肿瘤具有luminal型前体细胞标签(P=0.04)，是基底样乳腺癌的候选前体细胞(Lim E，et al.NatMed2009；15：907-13)(表10和图6)。luminal型前体细胞和BRCA基因突变类标签内，差异调节细胞黏附、组织侵袭、增殖、和血管生成的标志物(例如α5整合素、DUSP6、和极光激酶B)(表11)。这一发现与功能注释的轻微富集一致，与KRAS基因突变与非突变的数据集对比，根据线性模型中差异表达基因，伤口愈合的41个基因中的3个基因中观察到(P=0.02)，聚糖表达的151个基因中3个基因中观察到(P=0.05)，MEK激活的148个基因中4个基因中观察到(P=0.009)(图4、表12和表13)。

表11.LIMMA分析三阴性乳腺癌患者的luminal型前体细胞标签内KRAS突变差异表达基因和BRCA突变标签。

表12.经LIMMA分析，源自文献的标签富集在三阴性乳腺癌患者内，这些标签具有确定为差异表达的KRAS基因突变的基因。

缩写：p.adj：FDR-调整p-值，MAXG：Illumina基因芯片上标签中基因数目，diff.Exp：发现差异表达的该签名内的基因数目。表13.LIMMA分析确定的KRAS突变阳性的三阴性癌症患者50个差异表达基因列表

实施例2：KRAS基因突变在多种肿瘤细胞株的患病率

材料与方法

基因分型.NCI-60细胞株培养板DNA来自NCI’s发展治疗计划。如前所述，进行Taqman基因分型确定是否KRAS突变等位基因存在，(Bussey KJ，et al.Mol Cancer Ther2006；5：853-67)。标准条件下培养细胞(参见dtp.cancer.gov／branches／btb／ivclsp.html；Monks A，et al.J NatlCancer Inst1991；83：757-66)，冰冻保存最多20代。使用QiagenQIAamp DNA血液抽提试剂盒程序提取DNA(cat.51192)。

统计分析.KRAS基因突变等位基因数据进行数字编码，1代表KRAS基因突变等位基因存在和0表示不存在。这种模式被用来作为比较分析的“种子”(Paull KD，et al.J Natl Cancer Inst1989；81：1088-9248)，探查NCI-DTP数据库里现有的NCI-60数据集。相关性包括，举例来说，miRNA测量和DNA甲基化测量。正相关性表明，举例来说，携带突变等位基因的细胞株往往具有更高表达的miRNA／mRNA或者更大比例的DNA甲基化。相反，负相关性表明携带突变等位基因的细胞株往往具有低表达的给定miRNA／mRNA或者指定基因的较低百分比DNA甲基化。这些数据集可以在dtp.cancer.gov查询或下载。

KRAS基因突变的存在是预测风险和肿瘤生物学以及多种癌症治疗响应的一个遗传标志物。KRAS突变的存在导致KRAS基因3′UTR调控改变。此研究阐明了肿瘤细胞中KRAS基因突变的生物学意义。本文提供的数据阐明了受KRAS基因突变存在影响的示例性分子通路。为了同时分析范围广泛的癌症类型，使用肿瘤细胞株的综合NCI-60培养板(Blower PE，et al.Mol CancerTher2007；6：1483-91；Liu H，et al.Mol Cancer Ther2010；9：1080-91)。研究多种分子参数，以确定哪些分子事件与这些肿瘤细胞株内KRAS基因突变的存在相关(Kundu，S.T.et al.2012Jan15.Cell Cycle11：2，361-366)。

NCI-60培养板内60个细胞株中的7个具有KRAS突变等位基因(表14)。基于KRAS基因编码区显性突变存在(KRAS基因突变)或KRAS基因突变存在，对细胞株NCI-60培养板进行分类时，确定了KRAS基因活化突变存在，含有KRAS基因突变的7个细胞株为阴性的。同样，携带KRAS基因编码序列突变的细胞株缺乏KRAS基因突变等位基因。因此，在这些细胞株中KRAS基因编码突变或KRAS突变等位基因的存在或发生是相互排斥的。此外，由于这种相互排他性发生在来自于多种类型癌症的细胞株中，这互斥不是特定于一个特定的组织类型。相反，这种相互排斥是这些癌细胞株的共同特点，不论其来源。这些结果表明，这两个事件之一单独发生(例如，KRAS突变发生或KRAS基因编码突变发生)，足以影响这些癌症类型的肿瘤的发生。这些结果还表明，标准编码序列突变所引起的KRAS活化水平与3′UTR内KRAS基因突变存在诱导的KRAS表达升高功能上具有可比性。非小细胞肺癌患者也被发现KRAS基因编码突变和KRAS突变的这种相互排他性(Chin LJ，et al.Cancer Res2008；68：8535-40)and in ovarian cancer patients(Ratner E，Cancer Res20l0；70：6509-15)，但不是发现在结肠癌患者中(ZhangW，et al.Ann Oncol2011；22：484-5；Zhang W，et al.Ann Oncol2011；22：104-9)。

表14.NCI-60培养板内细胞株，具有KRAS基因突变等位基因或KRAS基因编码序列功能突变。

要确定是否携带KRAS基因突变等位基因的细胞株显示miRNA表达中保守改变，与NCI-60培养板剩余细胞株的miRNA表达谱对比，包含KRAS突变等位基因的7个细胞株生成的miRNA表达谱进行统计分析(Blower PE，et al.Mol Cancer Ther2007；6：1483-91；Gaur A，et al.Cancer Res2007；67：2456-68)。KRAS基因突变等位基因的存在显示，与miR-23、miR-27和miR-210表达增加有统计学显著正相关性(表15)。miR-23和miR-27表达同一聚类和血管生成和转移的恶性发展(Zhou Q，etal.Proc Natl Acad Sci USA20l1；108：8287-92)。举例来说，miR-23和miR-27富集在血管内皮细胞和高度血管组织内。此外中，通过减少具有抗血管生成功能的Sprouty2和Sema6A的表达，miR-23和miR-27提升血管生成必不可少的信号通路。阻断miR-23或miR-27的功能，导致的毛细管形成和转移减少，响应体外血管内皮生长因子和体内产后视网膜血管减少(Zhou Q，et al.Proc Natl Acad Sci USA2011；108：8287-92)。KRAS基因突变与miR-23、miR-27表达增加的统计学显著正相关性，表明由于miR-23和miR-27水平升高，具有KRAS基因突变等位基因的肿瘤容易出现细胞生长和转移。

表15.具有KRAS突变等位基因的细胞株microRNAs具有统计学显著性表达增加。

miR-210的表达与细胞内KRAS突变等位基因的存在有统计学显著性关联。MiR-210是慢性缺氧的标志物。此外，miR-210是与乳腺癌和黑色素瘤肿瘤的增殖和转移以及预测较差相关。MIR-210是HIF蛋白的直接转录靶标。缺氧条件下，肿瘤细胞的生存需要miR-210的水平升高。MiR-210直接调控MNT的表达，细胞周期所需要的MYC拮抗剂在缺氧条件下停滞。因此，在肿瘤细胞低氧应激的条件下，miR-210水平的增加促进细胞周期停滞撤销。因为miR-210表达增加与KRAS突变存在相关，含有KRAS突变的肿瘤细胞在缺氧条件下存活和增殖。

本文所提供的数据证实，KRAS突变有助于或启动异常信号通路，异常信号通路控制几个miRNAs的表达(包括，举例来说，miR-23、miR-27和miR-210)。扰动信号通路，调控miRNA表达，例如miR-23、miR-27和miR-210，导致肿瘤增殖和转移的启动、发展、维持或增强。

启动子甲基化是通过基因表达在许多癌症中沉默的一种机制，因为基因启动子的甲基化状态变化导致基因表达减少。具体而言，DNA甲基化是CpG二核苷酸甲基化而引起的表观遗传效应，通常在基因的启动子区域。由于甲基化阻碍介导基因转录的分子接近启动子，启动子甲基化导致基因沉默。不同的癌症表现出不同的甲基化模式，其结果是基因表达谱改变。因此，要确定是否存在具有KRAS基因突变的肿瘤细胞株内DNA甲基化模式的改变，NCI-60培养板内这些细胞株的甲基化状态与非KRAS基因突变细胞株对比(Ehrich M，et al.Proc Natl Acad Sci USA2008；105：4844-9)。KRAS基因突变等位基因的存在显示出与许多基因的启动子甲基化增加统计学显著性正相关，包括，举例来说，Notchl基因，细胞周期蛋白D3和CNBP(也称为ZNF9)(表16)。

表16.KRAS基因突变阳性细胞株内统计学显著性启动子超甲基化的基因。

癌症中Notchl表达的作用是多样的。在许多肿瘤中，Notchl基因过度表达或活化驱动肿瘤发展和转移。举例来说，Notchl活化导致乳腺癌细胞入侵与迁移特性增加。或者，在MYC背景下Notchl基因过表达诱导小鼠肺腺瘤，导致肺腺癌形成。因此，证据表明，Notchl可以作为一种致致癌基因。与此相反，Notchl也可以起到肿瘤抑制基因的功能。举例来说，已经确定头部和颈部鳞状细胞癌中Notchl基因抑制突变。小鼠皮肤角质Notchl的耗竭导致化学致癌物质或Ras致致癌基因引起的肿瘤发生增加。在人乳头状瘤病毒(HPV)阳性的子宫颈癌中，与正常组织相比，Notchl表达下降。在人乳头状瘤病毒(HPV)阳性的子宫颈癌和神经母细胞瘤细胞中的活化Notchl基因的过度表达(ZagePE，et al.Pediatr Blood Cancer2011)导致生长抑制。结合起来考虑，证据显示Notchl基因在许多癌症中失调，在某些情况下，可能起到待定肿瘤抑制的功能。由于Notch1基因启动子的甲基化在KRAS基因突变阳性癌细胞中增加，Notch1表达在携带KRAS基因突变等位基因的细胞中减少，因此，通过抑制Notch1肿瘤抑制作用，KRAS基因突变细胞株可能诱发或维持其致瘤潜能。

cyclin D3是细胞周期蛋白家族的成员，细胞周期蛋白是细胞周期G1／S转换所需要的。在KRAS突变细胞株中，cyclin D3的启动子甲基化增加，这表明抑制cyclin D3转录。因此，证据表明，两个示例性机制，其中cyclin D3不是这些细胞株转化表型所需的，或cyclin D3启动子的甲基化阻滞cyclin D3转录抑制因子。

对比于Notch1和cyclin D3，细胞核酸结合蛋白(CNBP)，也称为ZNF9，与癌症的发生或发展不相关。然而，CNBP／ZNF9是结合MYC基因启动子的配合物的一部分。当MYC表达失调时，MYC促进癌症的发生和进展。KRAS突变与ZNF9甲基化状态的相关性有助于KRAS基因突变细胞癌症进展的机制尚不清楚。

拥有KRAS基因突变等位基因的7个细胞株的基因表达与NCI-60培养板内剩余细胞株基因谱进行比较，来确定这些细胞株基因表达的特异性改变。如表17中所示，表达升高与细胞株中KRAS基因突变的存在具有统计学显著性相关的基因是谷胱甘肽转硫酶theta1(GSTT1)。GSTT1基因编码人II期解毒酶的谷胱甘肽S转移酶家族的成员，通过这些化合物与谷胱甘肽基团共轭，解毒复杂代谢产物、外源性化学物质和药物，从而使他们更具水溶性，容易排出细胞外。多种癌症与theta1亚型相关。举例来说，GSTT1表达增加与恶性膀胱癌统计学显著相关。在其他不同的肿瘤类型中，由于有毒代谢产物积累或积累增加，从而导致癌变的危险性增加和预测差，GSTT1不起作用或因遗传多态性而缺失。

表17.具有KRAS基因阳性细胞株统计学显著性较高mRNA表达的基因。

丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)是MAP激酶家族的一员。此外，丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)的表达增加与肿瘤细胞中KRAS基因突变相关。MAPK3转导细胞外基质信号，调节细胞内过程，如细胞增殖和分化。举例来说，磷酸化MAPK3表达增加与侵略性大肠癌肿瘤和转移性髓母细胞瘤相关。KRAS基因突变阳性癌细胞内KRAS基因水平提高与MAPK3mRNA增加相关。至少部分，MAPK3表达增加诱导这些细胞内的细胞增殖和肿瘤进展增长。同样，另一个MAPK(MAP2K4)的表达在KRAS基因突变阳性表达谱中增加。此外，KRAS和MAPK(MAPK3和／或MAP2K4)可能有助于KRAS基因突变癌细胞内KRAS和MAPK信号之间协同交互作用，诱导或增强细胞增殖和／或肿瘤发展。

突触结合蛋白-12表达增加和中间α-球蛋白抑制-H1表达增加与肿瘤细胞株中KRAS基因突变的存在正相关。在正常条件下，突触传递过程中，突触结合蛋白调控钙依赖性膜运输。虽然目前还没有证据证明突触结合蛋白-12参与癌症，突触结合蛋白-13是突触结合蛋白-12家庭成员，突触结合蛋白-13过度表达抑制来自大鼠肝肿瘤细胞株的细胞转化表型。KRAS基因突变阳性肿瘤细胞株中突触结合蛋白-12的过度表达，表明涉及癌细胞内突触结合蛋白的新通路失调。中间α-(球蛋白抑制)-H1是血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂的重链。在功能上，细胞外基质的稳定性需要中间α-(球蛋白抑制)-H1。虽然癌症中中间α-(球蛋白抑制)-H1的作用仍然未被开发，最近的证据表明，在各种实体瘤中中间α-(球蛋白抑制)-H1的表达或者丢失或者被压抑，包括，举例来说，肺癌、结肠癌和乳腺癌。

例3：KRAS突变和患者对治疗的响应(卵巢癌)

材料与方法

总生存期分析队列。完整的临床数据，诊断为没有已知BRCA基因突变的上皮性卵巢癌妇女的DNA，包括来自国际审查委员会批准的以下三个机构。所有协议在就诊时应预期积累患者，以避免选择偏倚。参考文献显示了先前对这些患者的详细说明：(1)意大利都灵#1组(n=197)(Lu L， et al.(2007).Cancer Res67：10117-10122)，(2)意大利布雷西亚，#2组(n=59)(RatnerE，et al.(2010).Cancer Res15：6509-6515)，和(3)耶鲁大学纽黑文医院(YNHH)组(n=198)。耶鲁患者预先收集在耶鲁大学医学院的两项临床试验中，在2000年和2009年之间初诊诊断为上皮性卵巢癌患者(表18)。

表18.总生存期分析的临床病理参数。

从以下两个机构收集了记录的BRCA突变上皮性卵巢癌病例，这病例具有已知结果：(1)YNHH组(n=17)和(2)美国希望城癌症研究中心(n=62)(表19)。

表19.BRCA突变上皮性卵巢癌患者的临床病理参数。

*未从希望城患者中到组织学信息

由于不是所有一期卵巢癌患者都接受辅助化疗，当亚期信息不是来自一期肿瘤患者时，这些患者被排除在分析之外。否则，1B期和1C期肿瘤包括2-4期。为了最大限度地减少交界性肿瘤意外列入，分级不明肿瘤排除在该分析之外。对于新辅助化疗治疗的女性，病理诊断日期被认为是治疗的开始日期。对于辅助化疗治疗女性，手术日期被认为是治疗的开始日期。野生型BRCA或未测试BRCA基因突变的共386例患者与记录的BRCA基因突变的79例患者符合上述参数，包括在两项生存分析中。

新辅助化疗队列。确定了妇女与平等机会委员会接受铂类为基础的新辅助化疗后肿瘤细胞减灭术在1996年和2010年之间的YNHH国际审查董事会批准的协议组(n=125)(表20)。由于肿瘤负荷，对最佳的减积手术来说肿瘤太大，这个队列患者接受化疗作为主要的治疗。患者接受化疗后的肿瘤细胞减灭术和额外的辅助治疗。只有进行四个周期或更多周期的新辅助含铂的组合治疗的患者被纳入本分析组(n=116)。理想减瘤术被定义为手术后剩余的残留病灶测量<1厘米，而不理想肿瘤细胞减灭术被定义为完成手术残留病灶测量≥1厘米。在耶鲁大学同一组外科医生对妇女进行手术，避免作为影响残留病灶因素的手术技能引起的偏倚。

表20.接受新辅助化疗的患者的临床病理参数。

铂耐药性分析患者。铂耐药性定义为含铂辅助化疗完成到复发日期的无进展生存期<6个月。从意大利#1组、意大利#2组和YNHH患者组(n=291)的妇女中得到无进展生存期间隔。表21描述了这些患者的临床病理参数。

[01]表21.铂耐药性分析的临床病理参数。

KRAS突变的检测。使用标准的方法从肿瘤、血液或唾液中分离DNA。KRAS突变不会从体细胞获得，也不需要杂合性丢失(Chin LJ，et al.(2008).Cancer Res68：8535-8540)；因此，血液和唾液，举例来说，不适宜测试，不考虑被测试的组织，结果是相同的。使用对KRAS基因突变特异性的引物和TaqMan探针(应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州，美国)对所有样品进行KRAS突变等位基因检测。YNHH组进行基因分型分析，除了对COH样品进行基因分型，在其设备中进行基因分型。不到3％的人口携带双拷贝KRAS突变(Chin LJ，et al.(2008).CancerRes68：8535-8540)。因此，携带至少一个拷贝的KRAS突变等位基因的患者分类为KRAS基因突变携带者。

携带和未携带KRAS突变的上皮性卵巢癌的基因表达分析。Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus2.0platform(Affymetrix公司，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国)描绘出取自16例患者的新鲜冷冻肿瘤样本(9个非突变和7个KRAS突变)的基因表达。所有样品均来自III期或IV期高等级浆液性上皮性卵巢肿瘤。MAS5算法处理图像，去除探针，至少75％的样品被判定为不存在探针。强度值进行对数变换和分位数归一。在R统计软件LIMMA软件包中执行，采用线性模型与经验贝叶斯误差适度，对52岁以上患者身上取得的样本进行基因表达差异评估(n=6个非突变和4个KRAS基因突变)，(R Foundation for StatisticalComputing，公众可登录www.r-project.org)(Smyth G.(2005).Limma.in Gentleman R，et al.(eds)Bioinformatics andComputational Biology Solutions using R and Bioconductor.Springer：New York，pp.397-420)。

使用标签方法评估这组数据中KRAS突变与已公布结果的相关性，以减少跨平台影响(Paranjape T，et al.(2011).Lancet Oncol12：377-386)。简单地说，按照基因贡献的标签向量和每个样品这些基因表达谱之间的皮尔森相关性计算标签分数。

配对Kolmogorov-Smirnov检验用来分析KRAS基因突变与非突变上皮性卵巢癌样本标签分数之间的差异。除非另有说明，来自各自出版物的基因列表作为标签矢量。Peters等人研究中的数据(Mol Cancer Ther4：1605-1616)来自基因表达库(GSE1926)，并进行重新分析，生成铂敏感和耐药样本之间的50个最显著性差异表达基因的标签。

化疗敏感性和细胞活力分析。高通量CellTiter-Blue细胞活力检测确定单独使用或组合使用的药物的活性。对于这些检测，利用精密XS液体处理工作站(BIO-TEK仪器公司，威努斯基，佛蒙特州，美国)，1.2×10³个细胞接种在384孔板的每个孔中，并允许在37℃下、5％CO₂气氛下孵育过夜。使用液体处理工作站，所有药物在介质中按照2：3或1：2比例连续稀释，在指定时间内，5μl稀释液加入到适宜的孔中。四个复制孔用于每种药物浓缩，另外四个对照孔加入无药物的对照稀释液。药物培养周期结束时，5μlCellTiter-Blue试剂(Promega公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)加入到各个孔中。通过剩余活细胞将刃天青生物还原成试卤灵的能力来评估细胞活力。使用Synergy4酶标仪(Bio-Tek InstrumentsInc.)测定试卤灵的荧光性(579nm Ex／584nm Em)。荧光数据转移到Microsoft Excel(微软)，相对于没有加入药物的4个重复细胞孔，计算存活率百分比。使用XLfit版本5.2(ID BusinessSolutions Ltd)，S型平衡模型回归，确定IC50。IC50定义为生长／存活率减少50％所需的药物浓度。所有的实验都进行至少3次。

靶向KRAS突变。小干扰RNA序列，设计成靶向KRAS基因突变序列，对应于所谓的“种子序列”，在siRNA引导链的5′末端6个核苷酸的不同位置放置单核苷酸多态性(SNP)。进行Blast搜索以减少交叉反应。在某些siRNA序列中，引入DNA核苷酸优化热能特征，引导链优选掺入到argonaute效应复合物中，或者引入DNA核苷酸增加突变的特异性。

在实验中使用的小干扰RNA引导链列如下(小写=RNA，大写=DNA；GS=引导链，PS=互补链)：

2-l GS ugcaucacuugaggucaggag(SEQ ID NO：23)

2-l PS ccugaccucaagugaugcacc(SEQ ID NO：24)

2-3GS TGCATCACuugaggucaggag(SEQ ID NO：25)(passenger strand same as2-1)

3-2GS ucaucacuugaggucaggagu(SEQ ID NO：26)

3-2PS uccugaccucaagugaugcac(SEQ ID NO：27)

所用的阴性对照组购自Qiagen公司(瓦伦西亚，加利福尼亚州，美国)(AllStars阴性对照siRNA)。使用双荧光素酶检测，确定这些序列的敲除功效和KRAS基因突变特异性(参见wO／2009／155100，其内容通过引述合并于本文中)。寡核苷酸组合标准条件下进行退火，然后使用标准协议转染细胞。采用MTT法测定细胞存活率，实验进行四份，所有行重复4个独立实验。转染后72小时收集细胞裂解液，如前所述，使用KRAS特异性探针测定KRAS基因蛋白水平(Chin LJ，et al.(2008).Cancer Res68：8535-8540)。

统计学。为了评估人口统计学变量的显著性，χ²检验或双侧Fisher′s确切检验用于分类变量。t检验用于连续变量，如年龄。采用Kaplan-Meier方法，比较KRAS基因突变和野生型患者的总生存时间(Kaplan E and Meier P.(1958).J Am Stat Assoc53：457-481)，生存曲线统计显著性由log-rank检验确定(Mantel N.(1966).Cancer Chemother Rep50：163-170)。Cox比例风险回归模型(Cox D.(1972).J R Stat Soc34：187-220)被用于评估KRAS基因突变、人口和预测因素对总生存率的影响(如年龄、分期、病理分级和组织学)。多变量logistic回归分析(Cox D.(1970).二进制数据分析.梅休因，伦敦)用于确定KRAS突变、其他人口和预测因素对不理想肿瘤细胞减灭术概率的影响。多变量logistic回归分析(Cox D.(1970).二进制数据分析.梅休因，伦敦)用于评估KRAS基因突变及其它预测因素对铂耐药性概率的影响。采用SAS9.1.3(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)和R2.12.1(R基础统计计算)进行所有统计分析。

数据与结果

KRAS突变与经测试对有害的BRCA突变呈阴性或未经测试有害的BRCA突变的454例卵巢上皮癌患者总生存期的相关性进行了评估。考虑整个队列时，Kaplan-meier生存分析表明，KRAS突变没有预测生存期差。由于KRAS基因突变与绝经后卵巢癌最密切相关(Chin LJ，et al.(2008).Cancer Res68：8535-8540)，对52岁以上妇女(n=279)的生存期进行了评价。超过52岁并包括52岁被认为是一个合适的替代绝经状态。Kaplan-Meier生存分析，对比于非突变的卵巢上皮癌患者组(n=220，图7，logrank检验P=0.0399，非KRAS基因突变中位生存期为60个月，KRAS基因突变中位生存期34个月)，绝经后KRAS基因突变的卵巢上皮癌患者组生存期显著降低(n=59)。当其它变量包括年龄、分期、病理分级、组织学和治疗中心，以及KRAS基因突变状态包括在多变量Cox比例风险回归模型中，KRAS基因突变是患有卵巢上皮癌绝经后妇女总生存期减少的统计学显著性预测因子(表22)；KRAS基因突变的风险比为1.67(95％可信区间：1.09-2.57，P=0.019)。

表22.KRAS基因突变与绝经后卵巢癌患者组存活期降低相关(>52岁)(n=279)。

KRAS基因突变与单独队列的携带有害BRCA1或BRCA2突变的EOC患者组(n=79)的生存期的相关性进行了评估。携带BRCA基因突变的EOC患者比没有BRCA基因突变的EOC患者统计学显著性年轻(52.7vs60.8岁，P<0.0001)。此外，经多因素分析，控制年龄、分期、病理分级和组织学，与没有BRCA基因突变的EOC患者相比，携带BRCA基因突变的EOC患者具有显著性较长中位生存期(120个月vs52个月，P=0.0036)。在多因素分析中，采用多变量Cox比例风险回归模型，携带BRCA基因突变且具有或没有KRAS基因突变的EOC患者之间的生存期没有显著性差异(表23，KRAS基因突变的风险比=0.75，95％置信区间：0.21-2.72，P=0.66)。在这项研究中，只有极少的患者评估KRAS基因突变对携带有害BRCA基因突变的绝经后EOC患者中生存期的影响。

表23.具有有害BRCA基因突变的EOC患者组的KRAS基因突变和总生存期(n=79)。

HR：多元Cox比例风险分析得到的危险比；

CI：置信区间；

研究包括：耶鲁大学纽黑文医院、希望城。

为了解释绝经后KRAS基因突变阳性EOC患者的存活期降低，KRAS基因突变阳性与铂类化疗响应的相关性进行评估。铂类化疗是EOC治疗的标准一线化疗。首先，对具有EOC的所有妇女进行评估，这些妇女在耶鲁-纽黑文医院(YNHH)进行含铂新辅助化疗，然后通过肿瘤细胞减灭术(n=116)。术后(肿瘤细胞减灭术)残留病灶被用来作为患者对化疗响应的替代标志物。已经确定，相比较于只有3.33％的非突变患者组(n=90)，15.4％的KRAS基因突变的患者(n=26)进行了不理想肿瘤细胞减灭术(术后残留病灶为41厘米)(图8，P=0.044)。多因素logistic回归模型中，控制了年龄、分期、病理分级和组织学，KRAS基因突变也与新辅助化疗和手术后不理想肿瘤细胞减灭术显著性相关(表24，比值比=9.36，95％置信区间：1.34-65.22，P=0.024)。

表24.KRAS基因突变预测新辅助化疗后不理想肿瘤细胞减灭术组(n=116)。

1.OR：logistic回归模型得互的比值比

2.CI：置信区间

3.多因素：调整年龄、分期、病理分级和组织学类型、方案、和手术前周期数

为了确定是否KRAS基因突变EOC患者中新辅助铂类化疗反应不佳的原因是由于耐铂类化疗，对进行铂类化疗辅助治疗，没有记录BRCA基因突变，具有可用响应数据的所有EOC患者铂耐药性进行评估(n=291)。已经确定，KRAS基因突变阳性EOC患者明显比非KRAS突变EOC患者更有可能发生铂耐药性(在该实施例中定义为接受铂类化疗后6个月内疾病复发)(16.67vs7.56％，P=0.034)。多因素logistic回归分析，控制肿瘤细胞减灭术后残留病灶、分期、组织学、年龄和病理分级，KRAS基因突变是所有年龄EOC患者铂类耐药显著性预测因子(表25，比值比=3.18，95％置信区间：1.31-7.72，P=0.0106)。

表25.KRAS基因突变与铂类耐药相关。

对可提取新鲜冰冻组织的一小组卵巢癌患者进行基因表达研究(Brescia队列)，7个具有KRAS基因突变的浆液EOC样本和9个无KRAS突变的浆液EOC样本(n=16)间进行比较。在该队列中，超过52岁绝经后EOC患者(n=10)，先前所发现的与KRAS突变相关三阴乳腺癌有关联的基因标签(Paraniape T，et al.(2011).Lancet Oncol12：377-86)在KRAS基因突变相关的EOC中上调(图9a)。类似于先前的TNBC分析，发现EOC KRAS突变肿瘤中KRAS相关的下游通路的过度表达，这与‘KRAS成瘾性’一致(Singh A，et al.(2009).Cancer Cell15：489-500)(图9b)。

使用识别铂耐药与敏感标志的先前基因表达数据分析(Peters D，et al.(2005).Mol Cancer Ther4：1605-1616)，可以确定相对于非突变EOC样本，KRAS基因突变EOC样本有一个较低的卡铂敏感性标签(图9c)。与AKT通路活化经常参与铂耐药性的调查结果一致，可以确定AKT3是KRAS基因突变EOC肿瘤中最显著的上调转录子之一(图9d)。

虽然肿瘤样本提供miRNA表达数据，具有KRAS突变的两种细胞株中let-7b miRNA的表达(BG-1和IGROV1)与非KRAS突变细胞株内let-7b的表达(CAOV3)对比。let-7b miRNA表达在KRAS突变-阳性的肺癌肿瘤(Chin LJ，et al.(2008).Cancer Res68：8535-8540)和三阴性乳腺癌肿瘤(Paranjape T，et al.(2011).LancetOncol12：377-386)中改变。

确定KRAS突变细胞内let-7b统计学显著性较低(图12)。

为了确认KRAS基因突变存在下药物敏感性改变，携带和未携带KRAS突变的EOC细胞株用于测试不同化疗药物的敏感性。举例来说，KRAS基因突变阳性／BRCA基因野生型(BG1)的细胞株、非突变／BRCA野生型细胞株(CAOV3)和KRAS基因突变阳性／BRCA1突变的细胞株(IGR-OV1)进行了测试。已确定，相对于CAOV3，没有KRAS突变的细胞株，KRAS基因突变系，BG1，对卡铂(P<0.04)和卡铂／紫杉醇联合化疗(P<0.0001)具有统计学显著性耐药性。相比之下，对比于IGROV3，携带KRAS基因突变和有害BRCA1基因突变的细胞株，IGROV1，对这些制剂不具有耐药性(图10)。这些结果与证实了KRAS突变与铂耐药性相关的相应临床结果一致，但不存在有害的BRCA基因突变。

此外，对卡铂／紫杉醇化疗失败的患者进行二线治疗的药物进行了评估。这些第二线治疗药物包括阿霉素、拓扑替康、吉西他滨。相对于CAOV3(非突变细胞株)，KRAS突变细胞株，BG1，对这些药物中的每一个具有显著耐药性(表26)。

表26.KRAS基因突变细胞株(BG1)与非突变细胞株(CAOV3)的化疗敏感性。

由于本文中所给出的数据证实KRAS基因突变相关的肿瘤内KRAS信号的继续使用，对直接靶向KRAS基因突变的影响进行评价。小干扰RNA(siRNA)／miRNA类似复合物被设计成直接结合KRAS突变转录子改变的等位基因，但不结合非-KRAS基因突变转录子，(图13)。已经确定，转染这些靶向KRAS突变的寡核苷酸双链，造成携带KRAS基因突变的BG1细胞株内细胞存活期统计学显著性减少(P<0.001)，但在CAOV3(图11a)或SKOV3、两个非突变EOC细胞株中没有影响。此结果与治疗后BG1内，但不在CAOV3内(图11b)或不在SKOV3内，免疫印迹测试KRAS蛋白水平的适度下降是一致的。

例4：预测早期大肠癌(CRC)的生物学标志物KRAS突变

材料与方法

研究人群。直到1994年，起始于1986年，55岁至69岁之间120,852b健康人中，研究荷兰的饮食与癌症队列研究(NLCS)确定925例发病CRC病例(ICD-O：153.0-154.1)。荷兰癌症登记处(NCR)和PALGA，全国性组织病理学和细胞病理学登记处，联合确定事故癌病例(Van den Brandt PA，et al.Int J Epidemiol.1990；19(3)：553-8)。已在别处详细描述了荷兰的饮食与癌症队列研究(Van den Brandt PA，et al.J Clin Epidemiol.1990；43(3)：285-95)。整个荷兰54个病理登记处收集可能与PALGA和石蜡包埋肿瘤组织挂钩的815例大肠癌。足够数量的好质量DNA提取于734例病例(90％)(Brink M，et al.Carcinogenesis.2003；24(4)：703-10)。在基线水平，整个队列中随机抽样5000个健康人亚队列，通过两年一次的随访期的生命状态估计队列风险的人年数。1,886人口腔拭子DNA进行KRAS基因突变分型。

数据收集。可通过荷兰癌症登记处获得肿瘤定位、分期、分化程度、发病日期及诊断后3个月治疗的信息。直到2005年5月的生命状态从中央统计局家谱和市人口登记处检索到，并可以从所有734例病例中得到。通过荷兰统计局联动检索到死亡原因。CRC相关的死亡被定义为结肠、直肠、直肠、胃肠道(非特异性)或肝转移癌造成的死亡。肠道(非指定)或肝转移的情况下，荷兰癌症登记处(NCR)和PALGA的信息用来消除另一个主要癌症死因的可能性。

DNA提取和KRAS基因突变确定。每个肿瘤组织块5μm切片采用苏木精和曙红染色，由病理学家修订。五段为20μm，去除石蜡，根据制造商说明书，使用Puregene

DNA分离试剂盒提取DNA(Gentra系统)。简而言之，细胞裂解液和蛋白酶K(20毫克／毫升，Qiagen公司)添加到组织中，并在55℃下温育过夜。在37℃下72小时后提取DNA，除去蛋白质，用100％的2-丙醇沉淀DNA。最后，DNA在水化缓冲液中水化。TaqMan PCR检测扩增分离的DNA，专为鉴别KRAS基因3′UTR内let-7互补位6(LCS6)内T或G等位基因(分别为野生型和突变等位基因)(应用生物科学)。虽然肿瘤DNA被用来评估基因型，很好地证实正常组织和肿瘤组织的基因型与KRAS突变等位基因携带者相同(Chin LJ，et al.Cancer Res.2008；68(20)：8535-40)。

如前所述，巢式聚合酶链反应(PCR)和直接测序(KRAS)，以及限制性片段长度多态性(BRAF)评估KRAS和BRAF突变(Brink M，et al.Carcinogenesis.2003；24(4)：703-10；de Vogel S，et al.Carcinogenesis.2008；29(9)：1765-73)。通过使用亚硫酸氢钠化学修饰基因组DNA和甲基化特异性PCR(MSP)(de Vogel Setal.Carcinogenesis.2008；29(9)：1765-73；26.Herman J G，et al.ProcNatl Acad Sci U S A.1996；93(18)：9821-6；Derks S，et al.Cell Oncol.2004；26(5-6)：291-9)评估Weisenberger提出的RASSF1A、O⁶-MGMT、CHFR的启动子甲基化和CIMP标志物(WeisenbergerDJ，et al.Nat Genet.2006；38(7)：787-93)。如前所述，使用BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-22、NR-24确定MSI状态(Suraweera N，et al.Gastroenterology.2002；123(6)：1804-11)。当主要研究终点设盲时，例如，CRC相关死亡，进行所有检测并进行分析。

统计分析。直到CRC相关死亡或随访期终结，病因特异性生存率被定义为癌症诊断的时间。Kaplan-Meier曲线和Log-Rank检验被用来评估KRAS突变对病因特异性生存率的影响。使用调整潜在影响因素的Cox比例风险模型评估HR和相应的95％CI。如果这些因素是CRC已知预测因素，影响粗估危险机率超过10％，被认为是可能的混杂因素。混杂因素包括诊断时的年龄(连续)、性别、肿瘤分化程度(分化良好、中度分化、分化不良、未分化)，位置(近端、远端、乙状结肠和直肠)。使用Schoenfeld残差和log(-log)hazards plots测试比例风险假设。这一点后CRC相关死因是不可能的，存活分析只限于诊断后的10年。使用Cox比例风险模型评估发病率比(RR)和95％CI。使用robust Huber-White夹心方差估计量评估标准误差，考虑队列抽样引入自加性方差。所有分析都使用统计软件包STATA10.0完成。

数据与结果

这项研究中的患者往往是男性(55.6％)，诊断早期肿瘤(62.0％)或近端或远端肿瘤(65.3％；表27)。在随访期间，41.4％的患者死于CRC。14.0％的早期阶段(I期和II期)、19.2％的III期和21.4％的IV期患者中检测到KRAS基因-LCS6突变(P=0.160；P_trend=0.060)。KRAS突变的患者更经常诊断出患有晚期疾病(KRAS突变的患者：野生型的患者=47.5％：36.9％，P=0.046)。野生型和KRAS基因突变携带者的性别、年龄、诊断、分化程度、肿瘤部位、微卫星不稳定性、或KRAS突变(表27)、BRAF(P=0.640)、或RASSF1A启动子CpG岛甲基化(P=0.423)之间未发现其他统计学显著性差异。正如预期的那样，III期或IV期疾病的患者往往死于CRC(P<0.001)，往往具有一种低分化肿瘤(P<0.001)。较于早期患者，晚期阶段患者往往具有一种近端(P=0.036)或微卫星稳定性肿瘤(P=0.047)。

表27.1986年和1994年之间荷兰饮食与癌症队列研究中包含的总人群、KRAS基因突变和野生型携带者、早期和晚期CRC病例的基线特征。

相对于其它阶段G等位基因(KRAS基因突变)携带者，IV期G等位基因(KRAS基因突变)携带者更可能是女性(66.7％；P=0.097)，并且更可能出现近端肿瘤(71.4％；P=0.004)，(表28)。

表28.依据KRAS突变状态，早期阶段、III期、IV期患者的基线特征和分子特征。

KRAS基因突变与早期CRC生存期良好相关。总人群的KRAS突变和特定病因生存期的Kaplan-Meier分析中没有观察到统计学显著性差异(log-rank检验，P=0.864)(图14)。

由于生存期取决于的癌症分期，分析进行阶段分层。相对于野生型病例，早期G等位基因(KRAS突变)携带者显示出统计学显著性更好的生存期(log-rank检验，P=0.038；图15A)。晚期病例并没有观察到这种差异(图1B和图C；log-rank检验，III，IV期病例分别为P=0.775和P=0.875)。

KRAS／BRAF突变状态提高KRAS突变和生存之间的关联。图16A显示了携带KRAS突变和KRAS突变的早期(I期和II期)CRC病例的Kaplan-Meier分析。由于CRC，有KRAS突变的20G-等位基因(KRAS突变)携带者没有死亡。KRAS野生型患者有较差的生存期，尤其如果他们有KRAS突变(log-rank检验，P=0.043；相对比于没有KRAS突变的KRAS突变型等位基因，log-rank检验具有KRAS突变的KRAS突变型等位基因携带者，P=0.017)。该发现与T分期无关；携带KRAS突变的115例KRAS野生型病例，只有5例(4％)被确诊为高危IIb期(T4N0M0)。G-等位基因(KRAS突变等位基因)携带者中，没有患者被确诊为IIb期。对于晚期患者，没有发现生存率差异(图16B和图16C，log-rank检验，III阶P=0.989，IV阶P=0.535))。III期患者结果表明，携带KRAS基因突变的KRAS野生型患者的预测最差。亚组分析显示，第二阶段病例中主要发现早期KRAS突变携带者的更好结果。由于患者数量有限，T分期的分层分析是不可能的。

携带G等位基因的BRAF突变的CRC表现出类似的更好结果，虽然不是统计学显著性(log-rank检验，P=0.166)，可能由于少数患者进行KRAS基因突变和KRAS突变(9名患者)。同样地，相对于没有RASSF1A甲基化的野生型携带者，具有异常RASSF1A启动子甲基化的G-等位基因携带者(KRAS突变等位基因)，参与Ras通路的另一种基因，有更好的预测，虽然更不具有统计学显著性(log-rank检验，P=0.062)。与KRAS、BRAF、和RASSFlA状态相结合的分析表明，具有KRAS、BRAF、或RASSF1A其它改变的早期G等位基因(KRAS突变)携带者提供了较好的预测(log-rank检验，P=0.026)。相反，当加入不涉及Ras通路如MGMT或CHFR的基因甲基化状态时，没有观察到生存期差异(MGMT：log-rank检验，P=0.220；CHFR：log-rank检验，P=0.118)。

KRAS基因突变结合KRAS基因突变状态的生存期影响与其他预测因素无关。在多变量分析中，与野生型相比，具有G等位基因(KRAS突变)的早期(HR0.46，95％CI：0.18-1.14)，III期(HR0.98，95％CI：0.55-1.74)或IV期病例(HR0.42，95％CI：0.17-1.06)特定病因生存期均未发现统计学显著性差异，虽然早期和IV期G-等位基因(KRAS突变)携带者证实生存期提高(表29)。

表29.荷兰饮食与癌症队列研究的734例CRC中特定病因死亡率、临床病理参数和KRAS突变的危险机率和95％CI。

具有KRAS突变的早期G等位基因(KRAS突变)携带者有良好的预测，因为这些患者没有死于CRC。相反，具有KRAS基因突变的KRAS基因未突变的早期(HR0.77，95％CI：0.30-1.97)，III期(HR0.95，95％CI：0.44-2.05)或IV期病例(HR0.35，95％CI：0.11-1.13)之间未发现统计学显著性差异的生存期。然而，具有KRAS突变的III期G-等位基因(KRAS突变)携带者呈现预测较差(HR1.52；95％CI：0.66-3.54)，虽然对比没有统计学显著性。尽管荷兰饮食与癌症队列研究中荷兰指南不建议被诊断为CRC的患者进行辅助治疗，接受辅助治疗的患者比例非常低。在早期病例中，9％接受辅助化疗。对于更晚期，31％的III期和19％的IV期患者接受辅助化疗。排除辅助化疗治疗的患者并没有改变我们的结论。事实上，排除辅助化疗治疗的患者提高了具有KRAS基因突变的早期和III期G-等位基因(KRAS突变)携带者之间的差异(早期：无CRC相关死亡；III期：HR2.36，95％CI：0.99-5.67)，表明III期G-等位基因(KRAS突变)携带者具有一个更糟的自然病程。然而，这种分析是基于数量规模小的患者。

KRAS基因突变的生存影响与微卫星不稳定性(MSI)无关。本文所提供的生物标志物和方法之前，MSI是唯一的大肠癌分子预测标志物。因此，对MSl分层患者人群中KRAS突变基因型的影响进行了研究。排除预测良好的具有微卫星不稳定性肿瘤的患者，没有改变本文提供的结论；具有KRAS突变的微卫星不稳定性和微卫星稳定性病例具有良好的预测。相反，具有KRAS野生型的患者预测较差，即使他们有一个微卫星不稳定性肿瘤(log-rank检验，P=0.036)(图17)。由于患者数量有限，微卫星不稳定性患者性别、肿瘤定位或分化程度的其它分层分析是不可能的。

晚期CRC的风险与KRAS突变不相关。为了研究易患晚期CRC的KRAS基因突变等位基因的可能性，对KRAS基因型与CRC发病风险之间的关联性进行了研究。18％的亚队列成员发现了KRAS基因突变(G-等位基因)。对于CRC，当携带KRAS基因突变(G-等位基因)时，发现发展早期CRC(I期或II期)的风险降低(RR0.68，95％CI：0.49-0.94)。发展晚期CRC(III期或IV期)的风险没有受到KRAS基因型的影响(RR III期：1.02，95％CI：0.68-1.53；RR IV期：1.15，95％CI：0.63-2.09)。

实施例5：KRAS突变、转移性大肠癌患者预测和治疗响应

材料与方法

患者的特点。总共559名转移性大肠癌患者，300例在鲁汶大学医院接受抗EGFR单抗单药治疗以及单抗结合化疗的治疗，148例在巴黎笛卡尔大学接受西妥昔单抗为基础的抢救联合化疗(De RW,et al.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762)，111例之前公布过(Zhang W，al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109)氟嘧啶、伊立替康和奥沙利铂方案治疗失败后接受西妥昔单抗单药治疗的转移性大肠癌患者(Zhang W， al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109；Lenz HJ，et al.J Clin Oncol2006；24(30)：4914-4921)提供了组织，并适于KRAS基因突变多态性分析。上述患者人群的KRAS和BRAF基因突变状态是公开的(De RW,et al.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762；Zhang W，al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109)。上面提到的分子特征与ORR、PFS和OS相关。进入该研究的559例转移性大肠癌患者，由于其它分子检测的DNA耗尽，在512名患者中确定了KRAS基因3′-UTR LCS6突变。

遗传分析。如前面所述的，使用手术刀刀片肉眼解剖患者标本的福尔马林固定、石蜡包埋的正常组织，分离DNA(De RW,etal.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762；Zhang W，al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109)。如前所述，扩增DNA(Hollestelle A，et al.BreastCancer Res Treat2010)，专门设计定制TaqMan基因分型检测(美国应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚)识别具有上游引物的KRAS基因突变T或突变G等位基因(rs61764370)：5′-GCCAGGCTGGTCTCGAA-3′(SEQ ID NO：28)，下游引物：5′-CTGAATAAATGAGTTCTGCAAAACAGGT T-3′(SEQID NO：29)，VIC报告探针：5′-CTCAAGTGATTCACCCA C-3′(SEQ ID NO：30)，FAM报告探针：5′-CAAGTGATTCACCCAC-3′(SEQ ID No：31)。如前所述确定KRAS和BRAF突变状态(De RW,et al.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762；Zhang W，al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109)。

细胞株研究。对具有KRAS基因突变(G-等位基因)(HCC2998)的细胞株和无等位基因的细胞株和无KRAS肿瘤获得性突变(HT-29)的细胞株进行了研究，评估单独化疗治疗的影响，或结合西妥昔单抗治疗的影响。细胞株分别使用西妥昔单抗(100nM)治疗，或未进行治疗，和使用伊立替康稀释液(1mg／ml-100mg／ml)治疗。接种细胞，接种后使用药物处理24小时，介质在曝光24小时后被改变，然后使用MTT检测，生存评分48小时。

统计分析。Hardy-Weinberg平衡测试基因型分布，χ²检验P=0.8。由于低频率的KRAS突变等位基因的纯合子，患者样本或者是KRAS突变等位基因的杂合子(TG)或纯合子(GG)，被认为是LCS6阳性(KRAS基因突变或G等位基因)，进入分析作为至少一种KRAS突变(G等位基因)基因型的一个组。如前所述测量PFS和OS(De RW,et al.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762；Zhang W，al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109)

双尾Fisher精确检验用于比较野生型(wt)TT基因型携带者和至少一个G等位基因基因型(TG和GG)携带者之间的比例。采用Kaplan-Meier法评估PFS和OS，使用log-rank检验测试其与基因型的相关性。列联表和Fisher精确检验确定基因型与客观疗效。为充分发掘KRAS突变可能造成的影响，在整个转移性大肠癌人群，KRAS和BRAF基因中无突变的患者(双野生型人群)中和KRAS突变人群中进行分析。显著性水平设定为双侧检验P值<0.05。所有统计检验均采用统计软件包SPSS第13版完成。

结果

整个患者队列的KRAS LCS6。这512名转移性大肠癌患者中，有403名野生型LCS6TT基因型携带者(72％)，102名杂合子KRAS基因突变TG等位基因的携带者(18％)，和7名纯合子KRAS突变GG等位基因(1.3％)，109名至少一个G等位基因基因型的携带者(19.5％)。184例患者(33％)中发现密码子12、13和61内KRAS基因突变，BRAF V600E被发现在29名患者中(5.3％)。所有患者接受基于抗EGF受体单克隆抗体的抢救治疗，169接受单药治疗和377名结合化疗治疗。KRAS基因野生型和KRAS突变携带者诊断的性别和年龄之间发现了无统计学显著性差异。此前已公布了559例患者的特点(De RW,etal.Lancet Oncol2010；11(8)：753-762；Zhang W，al.Ann Oncol2011；22(1)：104-109)。

如表30所示，KRAS和BRAF突变的患者之间KRAS基因型的分布是不同的。尤其是，至少一个G突变等位基因基因型的百分比在KRAS基因野生型和突变组中均匀分布(各20％)，相对于野生型组(20％)，BRAF V600E突变组内KRAS基因突变(G等位基因)增加了两倍(40％)，具有统计学显著性差异(Fisher精确检验P=0.030)。

表30.依据转移性大肠癌患者队列KRAS和BRAF突变状态，KRAS基因3′-UTR LCS6基因型的分布。

缩写：3’-UTR LCS6，Let-7互补位3’非翻译区，WT，野生型

整个患者队列结果和生存期分析。在整个队列中，PFS和OS信息和LCS6基因分型患者(分别n=510和n=503)，LCS6野生型TT基因型携带者和LCS6G突变(KRAS突变)基因型携带者之间中位PFS和OS(图18A和图18B)没有检测到显著性差异。同样，双野生型(KRAS和BRAF)或KRAS突变患者队列没有观察PFS和OS中的差异。此外，整组和双野生型患者队列中KRAS基因突变和野生型携带者之间没有观察到响应组(n=483)和皮疹组(n=359)的显著相关性(表31)。

表31.根据KRAS基因型和全部患者群的其他临床变量的结果和生存期分析。

缩写：3’-UTR LCS6，Let-7互补位3’非翻译区；WT，野生型；PFS，无进展生存率；OS，总生存期；CR，完全应答；PR，部分应答；SD，病情稳定；PD，疾病进展。

治疗相关无进展生存期分析。分别分析接受单克隆抗体单药治疗和单克隆抗体联合治疗的患者。评价LCS6SNP基因分型和治疗给药的501位患者中，160位(32％)接受抗EGF受体单克隆抗体单药治疗。单药治疗的患者中，有128位(80％)为LCS6野生型TT基因型的携带者，32位(20％)为LCS6G突变基因型的携带者。有341位(68％)患者接受多种化疗组合。联合治疗的患者中，266位(78％)为LCS6野生型TT基因型的携带者，75位(22％)为LCS6至少一个G突变基因型的携带者。

全单药治疗患者人群的中位PFS为10.43周(95％CI：7.73-13.12周)，观察到统计学显著性差异(P=0.019，log-rank检验)，LCS6野生型TT基因型携带者，7.85周(95％CI：3.897-11.817周)，LCS6G突变(KRAS突变)基因型携带者，16.86周(95％CI：10.2-23.51周)(图19A)。整个联合治疗的患者群的中位PFS为18周(95％CI：15.87-20.12周)，观察到无统计学显著性差异(P=0.760，log-rank检验)，LCS6野生型TT基因型携带者，18.43周(95％CI：16.16-20.69周)，LCS6G突变基因型携带者，18周(95％CI：9.97-26.02周)(图19B)。接受单克隆抗体治疗的KRAS突变患者的PFS[16.86周，(95％CI：8.55-25.18周)]与接受联合治疗的KRAS突变患者的PFS[18周，(95％CI：13.37-22.64周)]之间没有显著性差异(p=0.291，log-rank检验)(图19C)，而非KRAS突变患者增加化疗有显著好处[P<0.0001，log-rank检验]，单克隆抗体单药治疗PFS为7.86周)，(95％CI：3.9-11.82周)，联合治疗PFS为19.29周，(95％CI：17-21.58周)(图19D)。值得注意的是，单药治疗的KRAS突变患者PFS与联合疗法治疗的非KRAS突变患者PFS之间没有显著性差异。

在双(KRAS和BRAF)野生型患者群中，单药治疗患者中位PFS为12周(95％CI：8.38-15.61周)，再次观察到统计学显著性差异(P=0.039，log-rank检验)，LCS6野生型TT基因型携带者，10.43周(95％CI：6.74-14.11周)，LCS6G突变基因型携带者，18周(95％CI：5.16-30.83周)(图20A)。在双野生型患者群中，联合治疗患者的中位PFS为28.71周(95％CI：24.98-32.43星期)，LCS6野生型TT基因型携带者，28.3周(95％CI：24.15-32.45周)，LCS6G突变基因型携带者，28.85周(95％CI：14.82-42.87周)(图20B)，观察到无统计学显著性差异(P=0.39，log-rank检验)。接受单克隆抗体单药治疗的LCS6突变患者的PFS[23周，(95％CI：9.5-36.5周)]与接受联合治疗的LCS6突变患者的PFS[28周，(95％CI：14.83-42.87周)]之间没有显著性差异(P=0.096，log-rank检验)(图20C)，而非LCS6患者增加化疗有显著好处[P<0.0001，log-rank检验]，单克隆抗体单药治疗PFS为10.43周，(95％CI：6.75-14.15周)，联合治疗PFS为28.71周，(95％CI：24.8-32.6周)(图20D)。单药治疗的KRAS突变(等位基因)患者PFS与联合疗法治疗的非KRAS突变患者PFS之间没有显著性差异。

治疗相关总生存期分析。整个单药治疗的患者群的中位OS期为33.14周(95％CI：26.70-39.57星期)，LCS6野生型TT基因型携带者为28.85周(95％CI：22.53-35.18周)，LCS6G突变基因型携带者为45周(95％CI：35.02-54.97周)，两者之间观察到无统计学显著性差异(P=0.139，log-rank检验)(图21A)。整个联合治疗的患者群中位OS期为44周(95％CI：40.11-47.88星期)，LCS6野生型TT基因型携带者为44周(95％CI：40.06-47.93周)，LCS6至少一个G突变基因型携带者为43周(95％CI：29.8-56.2周)，两者之间观察到无统计学显著性差异(P=0.759，log-rank检验)(图21B)。再次，接受单克隆抗体单药治疗的KRAS突变患者的OS[45周(95％CI：35-55周)]与接受联合治疗KRAS突变患者的OS[43周，(95％CI：29.8-56.2周)]之间没有显著性改善(P=0.574，log-rank检验)(图21C)，而KRAS突变患者增加化疗有益处[P<0.0001，log-rank检验]，单克隆抗体单药治疗OS为28.86周，(95％CI：22.53-35.18周)，联合治疗OS44周，(95％CI：40-47.93周)(图21D)。再次，单药治疗的LCS6G突变携带者OS和联合疗法治疗的非KRAS突变携带者OS之间没有显著性差异。

在双(KRAS和BRAF)野生型患者群中，单药治疗患者的中位OS为37周(95％CI：30.82-43.17周)，LCS6野生型TT基因型携带者35.71周(95％CI：32.03-39.4周)和LCS6至少一个G突变基因型携带者55.43周(95％CI：36.98-73.87周)之间观察到统计学显著性差异的趋势(p=0.087，log-rank检验)(图22A)。在双野生型患者群中，联合治疗患者的中位OS为55周(95％CI：48.3-61.7周)，LCS6野生型TT基因型携带者57周(95％CI：49.4-64.6周)和LCS6至少一个G突变基因型携带者54周(95％CI：45.46-62.53周)之间观察无统计学显著性差异(P=0.649，log-rank检验)(图22B)。接受单克隆抗体单药治疗的KRAS基因突变(G等位基因)患者的OS[55.43周，(95％CI：37-73.87周)]和接受联合治疗的KRAS基因突变(G等位基因)患者的OS[54周，(95％CI：45.47-62.54周)]之间没有显著性改善(P=0.705，log-rank检验)(图22C)，而非KRAS突变患者增加化疗有显著好处[P<0.0001，log-rank检验]，单克隆抗体单药治疗OS为35.71周(95％CI：32-39.4周)，联合治疗OS为57周(95％CI：49.4-64.6周)(图22D)。单药治疗的双野生型患者KRAS基因突变携带者与联合治疗的非LCS6携带者之间没有显著性差异。

LCS6突变为KRAS和BRAF突变患者的预测。在KRAS和BRAF突变患者群中，同时进行抗表皮生长因子受体单克隆抗体单药治疗和联合化疗治疗的患者中观察到PFS和OS无统计学显著性差异(数据未显示)。KRAS突变和非KRAS突变患者的中位PFS之间是相同的，接受单克隆抗体单药治疗的KRAS突变患者的PFS[6周，(95％CI：0-13.25周)]与接受联合治疗的KRAS突变患者的PFS[12周，(95％CI：6.45-17.56周)]之间没有显著性改善(P=0.641，log-rank检验)(图23A)。单克隆抗体单药治疗的非KRAS突变患者的PFS[6周，(95％CI：4.46-7.53周)]与联合治疗的非KRAS突变患者的PFS[12周，(95％CI9.72-14.28周)]有显著性改善[P<0.0001，log-rank检验](图23B)。对于OS，接受单克隆抗体单药的KRAS基因突变(G等位基因)患者[28.43周，(95％CI：9.47-47.39周)]与联合治疗的KRAS基因突变(G等位基因)患者[23周，(95％CI：10.8-35.19周)]的OS之间没有显著性差异(p=0.303，log-rank检验)(图23C)，而有非KRAS基因突变患者[P=0.002，log-rank检验，单克隆抗体单药的OS21.29周(95％CI：15-27.55周)与联合治疗OS31周(95％CI：25.65-36.34周)之间没有显著性差异(图23D)。

KRAS突变和响应。483位评价响应和KRAS突变基因分型整个人群中，147位(30.4％)曾接受EGF受体单克隆抗体作为单一疗法，336位接受多种化疗联合治疗(69.6％)。在单药治疗组中，123位患者(83.6％)是无效者(SD和PD)，104位LCS6野生型和19位LCS6突变(KRAS突变)携带者，24位(16.4％)是有效者(PR和CR)，13位LCS6野生型和11位LCS6突变(KRAS突变)携带者。有效和无效组中野生型和KRAS突变基因型携带者分布之间观察到有统计学显著性差异(Fisher精确检验P=0.002)。联合化疗组中，252位(75％)患者为无效者(病情稳定和疾病进展)，84位(25％)为有效者(部分应答和完全应答)。野生型和KRAS突变基因型携带者之间观察到无统计学显著性差异，分别为197位vs.55位无效者和66位vs.18位有效者(Fisher精确检验P=1)。

270位双(KRAS和BRAF)野生型人群中，90位(33.3％)曾接受抗EGF受体单克隆抗体作为单一疗法，180位(66.6％)接受多种化疗联合治疗。在单药治疗组中，71位(78.8％)为无效者(病情稳定和疾病进展)，60位LCS6野生型，11位LCS6突变(KRAS基因突变)携带者，19位(21.2％)为有效者(部分应答和完全应答)，10位LCS6野生型，9位LCS6突变(KRAS突变)携带者。有效和无效组中，野生型和KRAS突变基因型携带者分布之间观察到统计学显著性差异(Fisher’s精确检验P=0.010)。联合化疗组中，102位(56.6％)患者为无效者(病情稳定和疾病进展)，78位(43.4％)为有效者(部分应答和完全应答)。野生型和KRAS突变基因型携带者之间观察到无统计学显著性差异，分别为81位vs.21位无效者，62位vs.16位有效者(Fisher’s精确检验P=1)。

单克隆抗体单药治疗和联合治疗的效果和LCS6突变的细胞株研究。为确定KRAS基因突变(G等位基因)预测单克隆抗体单药治疗的响应，没有任何额外的细胞毒药物治疗好处，携带和LCS6G突变的结肠癌细胞株单药治疗与联合疗法的影响进行评价。人们发现，相比于细胞毒药物治疗，在非KRAS基因突变细胞株中，细胞毒药物治疗中增加西妥昔单抗，辐射以及伊立替康化疗，增加细胞死亡。相反，在携带KRAS基因突变(G等位基因)的细胞株中，细胞毒药物治疗中增加西妥昔单抗没有额外的细胞杀死，当加入西妥昔单抗时，辐射情况下，细胞存活率较高。这些研究结果与我们体内发现是一致的，KRAS基因突变(G等位基因)携带者西妥昔单抗联合细胞毒药物治疗没有任何益处。

其它实施方案

虽然本发明已经连同其详细描述进行了描述，前面的描述旨在举例说明，而不是限制本发明的范围，由所附权利要求书的范围定义。其他方面，优点和修改都在下列权利要求的范围之内。

本文提及的专利和科学文献提供给本领域技术人员的知识。本文中引用的所有美国专利和公布或未公布的美国专利申请引入本文以供参考。本文中引用的所有公布的外国专利和专利申请引入本文以供参考。本文中引用的登录号的基因库(GENBANK)和NCBI提交引入以供参考。本文中引用的所有其他公布参考文献、文件、手稿和科学文献引入本文以供参考。

虽然本发明已经具体参考其优选实施例示出并进行描述，本领域中的技术人员应当理解，在不背离所附的权利要求书包括本发明范围的条件下可以对其进行本文中所做出的形式和细节上的各种改变。

Claims

1.一种用于识别具有使雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)阴性(ER／PR阴性)发展为乳腺癌风险的主体或患者的方法，包括检测在患者样本中人KRAS的let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种包括在LCS6位点4处的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在表明具有将ER／PR阴性发展为乳腺癌的增加风险。

2.一种用于在有发展为乳腺癌风险的主体或患者中预测雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)阴性(ER／PR阴性)发展为乳腺癌的发病的方法，包括检测患者样本中人KRAS的let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种包括LCS6位点4处的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在表明具有将ER／PR阴性发展为乳腺癌的更早发病。

3.根据权利要求2所述的方法，其中ER／PR阴性乳腺癌也是HER2阴性，从而其是一种三阴性乳腺癌(TNBC)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中三阴性乳腺癌(TNBC)是一种基底肿瘤或luminal型肿瘤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中三阴性乳腺癌(TNBC)是一种基底肿瘤，其表达一种转录子或者表皮生长因子受体(EGFR)或细胞角蛋白5／6(CK5／6)基因编码的蛋白质。

6.根据权利要求1、2、或3所述的方法，其中乳腺癌的进一步特征在于低表达或阴性表达的乳腺癌1(BRCA1)基因。

7.根据权利要求1、2、或3所述的方法，其中主体或患者是绝经前女性。

8.根据权利要求1、2、或3所述的方法，其中主体或患者的年龄是51岁或更年轻。

9.一种对患有卵巢上皮癌(EOC)的主体或患者进行预测的方法，包括检测患者样本中人KRAS的let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中，当与对照组对比时，突变的存在表明存活率降低。

10.根据权利要求9所述的方法，其中主体或患者为绝经后、52岁或至少52岁。

11.根据权利要求9所述的方法，其中对照组不携带突变。

12.根据权利要求1所述的方法，其中生存率是总的生存率、五年的生存率或一年的生存率。

13.一种对卵巢上皮性癌(EOC)细胞铂类化疗响应进行预测的方法，包括检测患者样本中人KRAS的let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在表明铂类化疗耐药性。

14.根据权利要求13所述的方法，其中卵巢上皮性癌细胞在体外或离体评价。

15.根据权利要求14所述的方法，其中主体是绝经后、52岁或至少52岁，主体卵巢上皮性癌细胞离体评价。

16.根据权利要求14所述的方法，其中卵巢上皮性癌细胞在体外进行评估，其中卵巢上皮性癌细胞被分离、复制，或来自BG1、CAOV3、或IGR-OV1细胞株。

17.根据权利要求13所述的方法，其中铂类化疗是卡铂或紫杉醇。

18.根据权利要求13所述的方法，其中铂类化疗是辅助治疗。

19.一种患有大肠癌(CRC)的测试主体预测的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在显示存活率增加。

20.根据权利要求19所述的方法，其中检测步骤进一步包括微卫星不稳定性(MSI)分析

21.根据权利要求19所述的方法，其中大肠癌(CRC)是早期阶段大肠癌。

22.根据权利要求19所述的方法，其中大肠癌(CRC)是1期或2期大肠癌。

23.根据权利要求19所述的方法，其中对照组主体不携带KRAS基因突变。

24.根据权利要求23所述的方法，其中对照组主体KRAS基因具有二次突变。

25.根据权利要求19所述的方法，其中主体或患者KRAS基因具有二次突变。

26.根据权利要求19所述的方法，其中主体或对照组主体BRAF基因携带一个或多个突变。

27.根据权利要求19所述的方法，其中主体或对照组主体具有高甲基化RASSFlA启动子。

28.根据权利要求19所述的方法，其中生存率是总生存率率，五年生存率或一年生存率。

29.一种预测癌细胞进行单克隆抗体单药治疗的响应的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在，表明对单克隆抗体单药治疗的敏感性。

30.根据权利要求29所述的方法，其中癌细胞是大肠癌(CRC)细胞。

31.根据权利要求29所述的方法，其中癌细胞在体外或离体进行评价。

32.根据权利要求29所述的方法，其中单克隆抗体单药治疗是西妥昔单抗。

33.一种预测肿瘤细胞对化疗联合单克隆抗体治疗的响应的方法，包括检测患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6突变，其中所述突变是一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述突变的存在表明对联合治疗的耐药性。

34.根据权利要求33所述的方法，其中癌细胞是大肠癌(CRC)细胞。

35.根据权利要求33所述的方法，其中癌细胞在体外或离体进行评价。

36.根据权利要求33所述的方法，其中单克隆抗体单药治疗是西妥昔单抗。

37.根据权利要求33所述的方法，其中化疗是一种细胞毒性剂。

38.根据权利要求37所述的方法，其中细胞毒性剂是伊立替康。

39.一种预测肿瘤的血管生成风险增加的方法，包括

(a)检测第一位患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)；

(b)确定miRNA表达水平，miRNA选自由第二位患者样本中miR-23和miR-27组成的组；

其中与对照组对比，所述的(a)中突变的存在和(b)中miRNA表达水平的增加表明抗血管生成基因转录基因静默增加，从而预测肿瘤血管形成风险增加。

40.根据权利要求39所述的方法，其中抗血管生成基因是Sprouty2或Sema6A。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其中肿瘤包括一种癌细胞，该癌细胞源自艾滋病相关的癌症、乳癌、消化／胃肠道的癌症、肛门癌、阑尾癌、胆管细胞癌、结肠癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肝癌、胰脏癌、直肠癌、小肠癌、胃癌、内分泌系统癌、肾上腺皮质癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肾(肾细胞)癌、阴茎癌、前列腺癌、移行细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、肾母细胞瘤、其他儿童肾脏肿瘤、生殖细胞癌、中枢神经系统癌症、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妇科肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、头部和颈部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃肠道间质肿瘤(GIST)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、神经系统癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、中央神经系统非典型畸胎样／横纹肌样瘤、中枢神经系统的胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脊髓肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、神经母细胞瘤、呼吸系统癌、胸癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮肤癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌。

42.根据权利要求39或41所述的方法，其中肿瘤是转移性的。

43.一种预测缺氧条件下癌症细胞存活或增殖增加的方法，包括

(a)检测第一位患者样本中人KRAS基因let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，及

(b)确定第二位患者样本中miR-210miRNA的表达水平，

其中与对照组对比，所述的(a)中突变的存在和(b)中miRNA表达水平的增加预测缺氧条件下癌症细胞存活或增殖的增加。

44.根据权利要求43所述的方法，其中癌细胞源自于艾滋病相关的癌症、乳癌、消化／胃肠道的癌症、肛门癌、阑尾癌、胆管细胞癌、结肠癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肝癌、胰脏癌、直肠癌、小肠癌、胃癌、内分泌系统癌、肾上腺皮质癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肾癌肾细胞癌、阴茎癌、前列腺癌、过渡细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、肾母细胞瘤、其他儿童肾脏肿瘤、生殖细胞癌、中枢神经系统肿瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妇科肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、头颈部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、神经癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样／横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脊髓肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、神经母细胞瘤、呼吸系统癌、胸癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮肤癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌。

45.一种预测癌细胞存活或增殖增加的方法，包括

(a)检测第一位患者样本中人KRAS基因的let-7互补位LCS6中的突变，其中所述突变是一种包括在LCS6位点4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)的单核苷酸多态性(SNP)，及

(b)确定第二位患者样本中肿瘤抑制基因启动子的甲基化状态，

其中与对照组对比，所述的(a)中突变的存在和启动子(b)甲基化增加预测肿瘤细胞的存活或增殖。

46.根据权利要求45所述的方法，其中肿瘤抑制基因是Notchl。

47.根据权利要求45所述的方法，其中癌细胞源自于艾滋病相关的癌症、乳癌、消化系统癌／胃肠道、肛门癌、阑尾癌、胆管细胞癌、结肠癌、大肠癌、食道癌、胆囊癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肝癌、胰脏癌、直肠癌、小肠癌、胃癌、内分泌系统癌、肾上腺皮质癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、甲状腺癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、肾癌肾细胞癌、阴茎癌、前列腺癌、过渡细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌、肾母细胞瘤、其他儿童肾脏肿瘤、生殖细胞癌、中枢神经系统肿瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妇科肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、头颈部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤胃肠道间质瘤(GIST)、骨肉瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、神经癌、脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样／横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脊髓肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤、神经母细胞瘤、呼吸系统癌、胸癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮肤癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌。

48.根据权利要求45所述的方法，其中存活包括保持致瘤潜能。

49.根据权利要求45或48所述的方法，其中癌细胞是癌干细胞。