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CN103534268A - 抗体 - Google Patents

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CN103534268A CN201180050390.8A CN201180050390A CN103534268A CN 103534268 A CN103534268 A CN 103534268A CN 201180050390 A CN201180050390 A CN 201180050390A CN 103534268 A CN103534268 A CN 103534268A
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Abstract

本发明提供了抗体，包括分离的单克隆抗体，其以高亲和力特异性结合CDH17。还提供了编码CDH17抗体的核酸分子、用于表达CDH17抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含CDH17抗体的双特异性分子和药物组合物。公开了用于检测CDH17的方法，以及用于治疗各类癌症包括胃癌、胰腺癌、结肠癌和结肠直肠癌的方法。

Description

抗体
技术领域
本发明一般性地涉及免疫学和分子生物学领域。更具体地，本文提供了抗细胞粘着分子钙粘素-17的抗体和其它治疗性蛋白，编码此类抗体和治疗性蛋白的核酸，用于制备本发明的单克隆抗体和其它治疗性蛋白的方法，以及用于治疗疾病(例如由钙粘素-17的表达/活性介导的，和/或与其配体的异常表达/活性相关的)的方法。
背景
钙粘素是钙依赖性的细胞粘着分子。在连接的细胞中，它们优选地以嗜同性的方式与其自身相互作用；因此，钙粘素可促成对异质细胞类型的分选。钙粘素分子钙粘素-17(此后称为CDH17)也已知为肝-肠钙粘素或肠肽相关转运子HPT-1。CDH17可在肝和肠的形态组织中起作用。其还参与肠的肽转运。CDH17结构的特征在于，其具有含有7个钙粘素结构域的细胞外结构域、单一的疏水性跨膜结构域和短的C末端胞质尾区。仅已知一种人CDH17同种型，即Genbank登录号NM_004063。CDH17在SWISS-PROT和trEMBL数据库(由瑞士生物信息研究所(SIB)和欧洲生物信息研究所(EBI)所有，可在www.expasy.com获得)中具有登录号Q12864(SEQ ID NO:38)。小鼠的CDH17直向同源物(Q9R100)与人CDH17显示出76%的同一性。
根据SWISS-PROT，CDH17在胃肠道和胰管中表达。其未在肾、肺、肝、脑、肾上腺或皮肤中被检测到。CDH17的表达已在下列中被报导：胃癌(参见，例如Ito et al.，Virchows Arch.2005Oct;447(4):717-22;Su et al，Mod Pathol.2008Nov;21(11):1379-86;Ko etal.，Biochem Biophys Res Commun.2004Jun25;319(2):562-8;和Dong et al.，Dig Dis Sci2007Feb;52(2):536-42)，胰腺癌和结肠直肠癌(Su et al.，Mod Pathol.2008Nov;21(11):1379-86)以及肝细胞癌(Wong et al.，Biochem Biophys Res Commun.2003Nov21;311(3):618-24)。国际专利申请WO2008/026008公开了CDH17作为结肠直肠癌的标记物以及作为治疗性抗体和其它药物试剂的生物学靶点。
概述
本发明提供了针对CDH17的抗体、编码此类抗体和治疗性蛋白的核酸；用于制备抗CDH17单克隆抗体和其它治疗性蛋白的方法；和用于治疗疾病的方法，所述疾病为例如CDH17介导的病症，例如人类的癌症，包括胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌。
在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合钙粘素-17的分离的抗体，其包含：
a)包含下列的重链可变区:
i)含有与SEQ ID NO:46具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:47具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第二CDR;
iii)含有与SEQ ID NO:48具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第三CDR；和
b)包含下列的轻链可变区:
i)含有与SEQ ID NO:49具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:50具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第二CDR；和
iii)含有与SEQ ID NO:51具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第三CDR。
在优选实施方案中，本发明还提供了特异性结合钙粘素-17的分离的抗体，其包含：
a)包含下列的重链可变区：
i)含有与SEQ ID NO:46具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:47具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的第二CDR;
iii)含有与SEQ ID NO:48具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列的第三CDR；和
b)包含下列的轻链可变区：
i)含有与SEQ ID NO:49具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:50具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列的第二CDR；和
iii)含有与SEQ ID NO:51具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第三CDR。
在另一个优选实施方案中，本发明还提供了特异性结合钙粘素-17的分离的抗体，其包含：:
a)包含下列的重链可变区：
i)含有与SEQ ID NO:46具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:47具有至少95%的序列同一性的氨基酸序列的第二CDR;
iii)含有与SEQ ID NO:48具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的第三CDR；和
(b)包含下列的轻链可变区：
i)含有与SEQ ID NO:49具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:50具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的第二CDR；和
iii)含有与SEQ ID NO:51具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的第三CDR。
在其它实施方案中，本发明提供了如上定义的分离的抗体，其中
(a)重链框架区包含与SEQ ID NO:26具有至少85%，优选至少90%或95%的序列同一性的氨基酸序列；和/或；
(b)轻链框架区包含与SEQ ID NO:31具有至少85%，优选至少90%或95%的序列同一性的氨基酸序列。
优选抗体的实例包括全长抗体、抗体片段、单链抗体、双特异性抗体、迷你抗体(minibody)、结构域抗体、合成的抗体和抗体融合物、以及其片段。
在一个实施方案中，前述抗体的任一种具有Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域是人的。在其它实施方案中，Fc结构域是变异的人Fc结构域。
在另一个实施方案中，前述抗体的任一种是单克隆抗体。
在一个实施方案中，前述抗体的任一种包含治疗性部分或试剂或者被缀合于治疗性部分或试剂。在一些实施方案中，治疗性部分是细胞毒素，放射性毒素或药物。在其他实施方案中，被缀合的试剂是聚合物。在另一个实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在另一个实施方案中，PEG是PEG衍生物。
在其它实施方案中，提供了引发或能够引发抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的本发明的抗体。
其它实施方案提供了包含本发明的抗体(任选地与药学上可接受的载体一起)的药物组合物。
还提供了用作药剂或用于治疗或诊断的本发明的抗体或药物组合物。
其它实施方案提供了治疗或预防与CDH17相关的疾病或与表达CHH17的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的分离的抗体。还提供了本发明的抗体用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗或预防与CDH17相关的疾病或与表达CHH17的靶细胞相关的疾病。优选，疾病是癌症，例如胃癌、胰腺癌或结肠癌。优选，癌症是人癌症。
因此，本发明提供了分离的抗体，优选单克隆抗体，尤其是人源化的和全人单克隆抗体，其与CDH17结合并且显示出一种或多种所需的功能特性。此类特性包括例如，与人类CDH17的高亲和力特异性结合。还提供了使用本发明的抗体、蛋白和组合物治疗多种由CDH17介导的疾病的方法。
在一些实施方案中，所述分离的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的全长抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体选自：完整抗体、抗体片段、人源化抗体、单链抗体、免疫缀合物、去岩藻糖化(defucosylated)的抗体，和双特异性抗体。抗体片段可以选自：UniBody、结构域抗体和纳米抗体(Nanobody)。在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含治疗剂。在本发明的另一个方面，治疗剂是细胞毒素或放射性的同位素。
在一些实施方案中，本发明的抗体选自：Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody和Duocalin。
在备选实施方案中，本发明的组合物包含分离的抗体或抗原结合部分和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明包括编码结合人类CDH17上的表位的本发明的分离的抗体或抗原结合部分的重链或轻链的分离的核酸分子。本发明的其它方面包括包含此类核酸分子的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了用于制备抗CDH17抗体的方法，所述方法包括步骤：获得包含编码本发明的抗体的一个或多个核酸分子的宿主细胞；使所述宿主细胞在宿主细胞培养物中生长；为宿主细胞培养物提供所述一个或多个核酸分子被表达的条件；和从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收抗体。
本发明的另一个实施方案是表达本发明的任一抗体或其抗原结合部分的杂交瘤。
如本文中所用，术语“癌症”包括胃癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、甲状腺癌、胃癌、皮肤癌、食管癌、肝癌和/或宫颈癌。
根据以下不应被解释为限制性的详细描述和实施例，本发明的其它特征和优点将是显然的。本申请各处所引用的所有参考文献、Genbank条目、专利和公开的专利申请的内容明确地通过引用方式并入本文。
附图说明
图1显示了CDH17_A4单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO:9)和氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。划线的是CDRl(SEQ ID NO:1)，CDR2(SEQ ID NO:2)和CDR3(SEQ ID NO:3)区域。
图2显示了CDH17_A4单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO:10)和氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。划线的是CDRl(SEQ ID NO:4)，CDR2(SEQ ID NO:5)和CDR3(SEQ ID NO:6)区域。
图3a显示了CDH17_A4的重链CDR1区域的核苷酸序列(SEQ IDNO:11)与小鼠种系VHII基因H17核苷酸序列的核苷酸67-96(SEQ IDNO:17)的比对。
图3b显示了CDH17_A4的重链CDR2区域的核苷酸序列(SEQ IDNO:12)与小鼠种系VHII区域VH105核苷酸序列的核苷酸1096-1146(SEQ ID NO:18)的比对。
图3c显示了CDH17_A4的轻链CDR1区域的核苷酸序列(SEQ IDNO:14)与小鼠种系VK8-30核苷酸序列的核苷酸510-560(SEQ ID NO:19)的比对。
图3d显示了CDH17_A4的轻链CDR2区域的核苷酸序列(SEQ IDNO:15)与小鼠种系VK8-30核苷酸序列的核苷酸606-626(SEQ ID NO:20)的比对。
图3e显示了CDH17_A4的轻链CDR3区域的核苷酸序列(SEQ IDNO:16)与小鼠种系VK8-30核苷酸序列的核苷酸723-749(SEQ ID NO:21)的比对。
图4显示了在LoVo细胞中对于CDH17_A4和抗-CDH17抗体的FACS分析的结果。
图5显示了在LoVo和LS174T细胞中对于CDH17_A4和抗-CDH17抗体的FACS分析的结果。
图6a显示了温育60分钟后，CDH17_A4/二抗FITC缀合物复合物与LoVo细胞的表面结合。
图6b显示了与LoVo细胞温育120分钟后，CDH17_A4/二抗FITC缀合物复合物的内吞作用。
图7a显示了在LoVo结肠癌细胞中，通过MabZAP测定检测的CDH17_A4的内吞作用结果。
图7b显示了在LoVo结肠癌细胞中，通过MabZAP测定检测的CDH17_A4的内吞作用结果。
图7c显示了在LS174T结肠癌细胞中，通过MabZAP测定检测的CDH17_A4的内吞作用结果。
图7d显示了在LS174T结肠癌细胞中，通过MabZAP测定检测的CDH17_A4的内吞作用结果。
图8a显示了在LoVo结肠癌细胞中，通过MabZAP测定检测的CDH17_A4的内吞作用结果。
图8b显示了在LS174T结肠癌细胞中，通过MabZAP测定检测的CDH17_A4的内吞作用结果。
图9显示了SEQ ID No:7的残基37-160(SEQ ID No:24)、3个具有转移至人种系L01278VH的相应位置的SEQ ID No:7的CDR区(以粗体突出显示的)(SEQ ID No:1、2和3)的人源化VH链(SEQ ID No:26、27和28)与人种系L01278VH(SEQ ID No:34)的比对。显示与CDR区密切接触的残基置换了相应的人残基。在位置29、37、48、66、67和71上进行这些置换(下划线标示的)。
图10显示了SEQ ID No:8的残基47-160(SEQ ID No:25)、2个具有转移至人种系X02990VL的相应位置的SEQ ID No:8的CDR区(以粗体突出显示的)(SEQ ID No:4、5和6)的人源化VL链(SEQ ID No:31和32)与人种系X02990VL(SEQ ID No:35)的比对。显示与CDR区密切接触的残基置换了相应的人残基。在位置46上进行一个置换(下划线标示的)。
图11a显示了A4重链的CDR1区域的氨基酸6-10(SEQ ID No:36)与可能的氨基酸置换(SEQ ID No:29)的比对以及A2重链的CDR2区域(SEQ ID No:2)与未丧失抗原结合亲和力的可能的氨基酸置换(SEQ ID No:30)的比对。
图11b显示了A4轻链的CDR1区域(SEQ ID No:4)与未丧失抗原结合亲和力的可能的氨基酸置换(SEQ ID No:33)的比对。
图12a显示了LoVo细胞的使用人源化CDH17_A4_4K和人源化CDH17_A4_4R的FACS分析的结果。
图12b显示了CORL23细胞的使用人源化CDH17_A4_4K和人源化CDH17_A4_4R的FACS分析的结果。
图13a显示了利用HumZAP测定在LoVo结肠癌细胞中进行的人源化CDH17_A4_4K和人源化CDH17_A4_4R的内吞作用的结果。
图13b显示了利用HumZAP测定在SNU-1胃癌细胞中进行的人源化CDH17_A4_4K和人源化CDH17_A4_4R的内吞作用的结果。
图14a显示了在转染了Flag标记的食蟹猴CDH17的HEK293细胞中使用人源化CDH17_A4_4K和人源化CDH17_A4_4R的FACS分析的结果。
图14b显示了在转染了Flag标记的人CDH17的HEK293细胞中使用人源化CDH17_A4_4K和人源化CDH17_A4_4R的FACS分析的结果。
图15显示人源化CDH17_A4单克隆抗体的重链可变区(SEQ ID NO:26)和轻链可变区(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列。划线的是重链的CDR1(SEQID NO:46)、CDR2(SEQ ID NO:47)和CDR3(SEQ ID NO:48)区和轻链的CDR1(SEQ ID NO:49)、CDR2(SEQ ID NO:50)和CDR3(SEQ ID NO:51)。
发明详述
本发明涉及以高亲和力特异性结合CDH17的分离的抗体，包括但不限于例如单克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体，去岩藻糖化的抗体，免疫缀合物，双特异性分子，affibodies，结构域抗体，纳米抗体和unibodies，制备所述分子的方法，和包含所述分子与药学载体的药物组合物。本发明还涉及使用所述分子的方法,例如用来检测CDH17，以及用来治疗与CDH17的表达(例如CDH17在肿瘤上的表达)相关的疾病，所述肿瘤包括胃癌、胰腺癌和结肠直肠癌的那些肿瘤。
为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其它的定义贯穿于详细描述中而给出。
术语"CDH17"，"肝-肠钙粘素"，“LI-钙粘素”，“肠肽相关转运子HPT-1”和“CDH17”可互换地使用。国际专利申请WO2008/026008中，CDH17还被鉴定为OGTA00l，该申请通过引用方式全文并入本文。在一些情况下，该公开中的人源化和鼠抗体可以与来自人类以外的其它物种的CDH17交叉反应。在一些实施方案中，抗体可以是完全特异于一种或多种人类CDH17的，并且可以不显示出物种或其它类型的非人类交叉反应活性。示例性的人类CDH17的完整氨基酸序列具有Genbank登记号NM_004063。CDH17可具有SEQ ID NO：38所示的序列。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，该作用引起对于入侵的病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌性细胞或正常人类细胞或组织(在自身免疫或病理性炎症的情况下)的选择性损伤、对它们的破坏，以及从人体清除它们。
“信号转导途径”是指在将信号从细胞的一个部分传送至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。如本文所使用的，用语“细胞表面受体”包括例如能够接收信号并将此信号跨越细胞的质膜传送的分子和分子的复合物。本发明的“细胞表面受体”的实例是CDH17受体。
本文所称的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指可包含由二硫键互连的至少2个重链(H)和2个轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每个重链包含重链可变区(在本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1，CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(本文中简写为VL或VK)和轻链恒定区(λ或κ)。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL/VK区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，其散布在更为保守的被称作框架区(FR)的区域内。每个VH和VL/VK由3个CDR和4个FR构成，按照下列顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
"抗体"的定义包括但不限于全长抗体、抗体片段、单链抗体、双特异性抗体、迷你抗体(minibodies)、结构域抗体、合成的抗体(有时在本文中称作“抗体模拟物”),嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合(有时称作“抗体缀合物”),以及每一种各自的片段。
在一个实施方案中，抗体为抗体片段。特异性抗体片段包括但不限于(i)由VL，VH，CL和CHl结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段，(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段，(iv)由单一的可变结构域组成的dAb片段，(v)分离的CDR区域，(vi)F(ab')2片段，其为包含两个相连的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域与VL结构域通过允许所述两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽连接子相连，(viii)双特异性单链Fv二聚体，和(ix)"diabodies"或"triabodies",其为通过基因融合构建的多价或多特异性片段。抗体片段可以被修饰。例如，所述分子可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥而被稳定化。抗体形式和架构的实例被描述于Holliger&Hudson，2006，NatureBiotechnology23(9):1126-1136，和Carter2006，Nature ReviewsImmunology6:343-357中，并且其中所引用的参考文献均明确地通过引用而并入。
在一个实施方案中，本文所公开的抗体可以是多特异性抗体，并且特别是双特异性抗体(有时也称作“diabodies”)。这些是结合两种(或更多种)不同抗原的抗体。可通过本领域已知的多种方式制造diabodies，例如化学地制备或从杂交的杂交瘤制备。在一个实施方案中，所述抗体为迷你抗体。迷你抗体是最小化的抗体样蛋白，其包含与CH3结构域相连的scFv。在一些情况中，scFv可与Fc区相连并且可包括一些或全部铰链区。关于多特异性抗体的描述，参见Holliger&Hudson，2006，Nature Biotechnology23(9):1126-1136，并且其中所引用的参考文献均明确地通过引用而并入。
如本文中所使用的，“CDR”是指抗体可变结构域的互补决定区。已由Kabat开发了对CDR中所包括的残基的系统化鉴别(Kabat et al.，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.，United States Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda)，这也备选地由Chothia开发了(Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia et al.，1989，Nature342:877-883;Al-Lazikani et al.，1997，J.MoI.Biol.273:927-948)。为了本发明的目的，与Chothia所定义的CDR相比，本发明的CDR被定义为略微更小的残基组。在本文中，VL CDR被定义为包括位置27-32(CDRl)，50-56(CDR2)和91-97(CDR3)的残基,其中编号是根据Chothia的。因为Chothia与Kabat定义的VL CDR是相同的，这些VL CDR位置的编号也是根据Kabat的。在本文中，VH CDR被定义为包括位置27-33(CDRl)，52-56(CDR2)和95-102(CDR3)的残基，其中编号是根据Chothia的。这些VH CDR位置对应于Kabat位置27-35(CDRl),52-56(CDR2)和95-102(CDR3)。
如本领域技术人员将认可的，本文中所公开的CDR可包括变体，例如当将本文中所公开的CDR回复突变为不同的框架区时。通常，个体变体CDR与本文所述序列的氨基酸同一性为至少70%或80%，更典型地具有优选至少75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和几乎100%的渐增的同一性。
类似地，关于本文中所鉴别的结合蛋白的核酸序列，"核酸序列同一性百分比(%)"被定义为候选序列中与抗原结合蛋白编码序列中的核苷酸残基同一的核苷酸残基的百分比。一种具体的方法利用了设置为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠跨越和重叠部分被分别设置为1和0.125。
一般地，编码个体变体CDR的核苷酸序列与本文中所示核苷酸序列的核酸序列同一性为至少70%或80%，更典型地具有优选至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，和几乎100%的渐增的同一性。
因此，"变体CDR"与本发明的亲本CDR具有特定的同源性、相似性或同一性并且共享生物学功能，其包括但不限于，亲本CDR的特异性和/或活性的至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
虽然引入氨基酸序列变异的位点或区域是预先确定的，不需要预先确定突变本身。例如，为了优化给定位点的突变的表现，可在靶密码子或靶区域处进行随机诱变并且就所需活性的最佳组合筛选所表达的抗原结合蛋白CDR变体。在具有已知序列的DNA中预先确定的位点处制造取代突变的技术是公知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。使用本文中描述的抗原结合蛋白活性测定来进行对突变体的筛选。
氨基酸取代通常是单个碱基的;插入通常将为大约一个(1)至大约二十个(20)氨基酸残基的数量级，虽然可能容忍显著更大的插入。缺失的范围为大约一(1)个至大约二十(20)个氨基酸残基，虽然在一些情况下，缺失可以大得多。
可利用取代、缺失、插入或其任意组合来实现最终的衍生物或变体。通常，这些变化在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小化，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可以容忍更大的变化。
如本文中所用的，"Fab"或"Fab区域"是指包含VH、CHl、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离的此区域，或在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白、或本文所列的任何其它抗体实施方案的情境中的此区域。
如本文所用的，"Fv"或"Fv片段"或"Fv区域"是指包含单个抗体的VL和VH结构域的多肽。
如本文所用的，"框架"是指除去被定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可被进一步细分为由CDR分隔的连续区域(FRl、FR2、FR3和FR4)。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保持与抗原(例如，CDH17)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经表明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL/VK、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为包含在铰链区由二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，其实质上是具有部分铰链区的Fab(见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed.，第3版.1993)；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体：包含单一可变域和2个恒定域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL/VK和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法通过合成的连接子将它们连接起来，所述连接子使其成为单一的蛋白链，其中VL/VK和VH区配对以形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；见例如Bird et al.(1988)Science242:423-426;和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意在被涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，按照与完整抗体相同的方式就功用来筛选片段。
如本文中所使用的，“分离的抗体”意指实质上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合CDH17的分离的抗体是实质上不含特异性结合除了CDH17之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合CDH17的分离的抗体可以具有与其它抗原(例如来自其它物种的CDH17分子)的交叉反应活性。此外和/或任选地，分离的抗体可以实质上不含不是通常在自然界中发现的形式的其它细胞物质和/或化学物质。
在一些实施方案中，本发明的抗体是重组蛋白质，分离的蛋白质或基本上纯的蛋白质。“分离的”蛋白质至少伴随一些其在天然状态中所通常结合的物质，例如在给定样品中构成总蛋白质的至少约5%，或至少约50%按重量。理解的是，取决于情况，分离的蛋白质可构成总蛋白质含量的5%至99.9%按重量。例如，可通过使用可诱导的启动子或高表达启动子而以显著更高的浓度制备蛋白质，从而使得蛋白质以增加的浓度水平被制备。在重组蛋白质的情形中，定义包括在不天然地产生抗体的、本领域已知的广泛生物体和/或宿主细胞中产生所述抗体。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体成分”是指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体成分显示出对于特定表位的单一的结合特异性和亲和力。
如本文中所使用的，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgGl)。
用语“识别抗原的抗体”和“特异于抗原的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换地使用。
术语“抗体衍生物”是指抗体的任何经修饰的形式，例如抗体与另一种试剂或抗体的缀合物。例如，本发明的抗体可与毒素、标记等缀合。本发明的抗体可以是非人的、嵌合的、人源化的或全人的。关于嵌合抗体概念的描述，参见Clark et al，2000和其中所引用的参考文献(Clark，2000，Immunol Today21:397-402)。嵌合抗体包括非人抗体的可变区，例如小鼠或大鼠来源的VH和VL结构域，其与人抗体的恒定区可操作地连接(参见，例如美国专利号4,816,567)。在优选的实施方案中,本发明的抗体是人源化的。如本文中所使用的，"人源化的"抗体是指包含人框架区(FR)和非人(通常是小鼠或大鼠)抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的抗体。提供CDR的非人抗体被称为"供体"，而提供框架的人免疫球蛋白被称为"受体"。原则上，人源化依赖于将供体CDR移植到受体(人)VL和VH框架上(美国专利No号5,225,539)。这一策略被称作"CDR移植"。常常需要将选择的受体框架残基"回复突变"为相应的供体残基以重新获得在起初的移植构建体中丧失的亲和力(US5,530,101;US5,585,089;US5,693,761;US5,693,762;US6,180,370;US5,859,205;US5,821,337;US6,054,297;US6,407,213)。人源化抗体最佳地还将包含至少一部分免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白的)恒定区，并因此将通常包含人Fc区域。用于人源化非人抗体的方法是本领域公知的，并且可基本上根据Winter和同事的方法进行(Jones et al，1986，Nature321:522-525;Riechmann et al.,1988，Nature332:323-329;Verhoeyen et al，1988，Science，239:1534-1536)。人源化鼠单克隆抗体的其它实例也是本领域已知的，例如结合下列的抗体：人蛋白C(O'Connor et al，1998，Protein Eng11:321-8)，白介素2受体(Queen et al，1989，Proc Natl Acad Sci，USA86:10029-33)，和人表皮生长因子受体2(Carter et al，1992，Proc Natl Acad Sci USA89:4285-9)。在备选的实施方案中，本发明的抗体可以是全人的，即抗体的序列完全或基本上是人的。本领域已知许多用于生成全人抗体的方法，包括使用转基因小鼠(Bruggemann et al，1997，Curr Opin Biotechnol8:455-458)或与选择方法相结合的人抗体库(Griffiths et al，1998，Curr Opin Biotechnol9:102-108)。
术语“人源化抗体”意指这样的抗体：其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类框架序列上。可以在人类框架序列内进行另外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”意指这样的抗体：其中可变区序列源自一个物种而恒定区序列源自另一物种，例如这样的抗体：其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人类抗体。
术语“特异性结合”(或"免疫特异性结合")不是意欲指抗体唯一地结合其目的靶标。而是，如果抗体对与其目的靶标的亲和力是其对于非靶分子的亲和力的约5倍大的话，那么抗体"特异性结合"。合适地,没有与不希望的物质(特别是健康的人或动物的天然存在的蛋白质或组织)的显著交叉反应或交叉结合。抗体对于靶分子的亲和力将是其对于非靶分子的亲和力的例如，至少约5倍，例如10倍、例如25倍、特别是50倍、以及特别是100倍或更多。在一些实施方案中，抗体与其它结合试剂以及抗原的特异性结合是指至少106M-1的结合亲和力。抗体可以，例如以下列亲和力结合：至少约107M－1，例如在约108M－1至约109M－1之间,约109M－1至约1010M－1，或约1010M－1至约1011M－1。抗体可以，例如以下列的EC50结合：50nM或更少，10nM或更少，1nM或更少，100pM或更少，或更优选地10pM或更少。
如本文中所使用的，术语“不实质性结合”蛋白质或细胞的意思是：不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与蛋白或细胞结合，即，以1x10-6M或更高，更优选1x10-5M或更高，更优选1x10-4M或更高，更优选1x10-3M或更高，甚至更优选1x10-2M或更高的KD与蛋白或细胞结合。
如本文中所使用的，术语“EC50”意指通过定量引起50%的最大应答/效应的浓度而得的化合物效力。EC50可通过Scratchard或FACS测定。
如本文中所使用的，术语"Kassoc"或“Ka”意指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文中所使用的，术语"Kdis"或“Kd,”意指特定的抗原-抗体相互作用的解离速率。如本文中所使用的，术语“KD”意指解离常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并且被表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域已确立的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的优选方法是使用表面等离子共振，优选使用生物传感器系统例如
Figure BDA00003070674100161
系统。如本文中所使用的，术语对IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原的KD为1x10-7M或更低，更优选5x10-8M或更低，更优选1x10-8M或更低，更优选5x10-9M或更低，更优选1x10-9M或更低的抗体。然而，“高亲和力”结合对于其它的抗体同种型可变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合是指具有10-6M或更低，更优选10-7M或更低，更优选10-8M或更低的KD的抗体。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上的与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由连续的氨基酸或者由通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂后通常仍然会保留，而通过三级折叠形成的表位在经变性溶剂处理后通常会丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文中描述的技术，例如x射线结晶和二维核磁共振(见，例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996))。
可以使用常规测定法来确定竞争性抑制，其中待测免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。有多种类型的竞争性结合测定法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心式竞争测定(见Stahl et al.，Methodsin Enzymology9:242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(见Kirkland et al.，J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定，固相直接标记夹心式测定(见Harlow and Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记物的固相直接标记RIA(见Morel et al.，Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung etal.，Virology176:546(1990))和直接标记RIA(Moldenhauer et al.，Scand.J.Immunol.32:77(1990))。通常，此类测定法包括使用结合于固体表面的纯化的抗原或携带这些的任一的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。通过测定在存在测试免疫球蛋白的情况下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将以至少50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%或更多来抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。
其它技术包括例如，表位定位法，例如抗原：抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子分辨率。其它的方法监控抗体与抗原片段或抗原的突变变体的结合，其中，由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰而导致的结合的丧失通常被认为是表位组分的指征。此外，还可以使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。然后所述肽被认为是用于定义对应于用于筛选肽文库的抗体的表位的引导(lead)。对于表位定位，还开发了计算算法，已经表明其定位构象型不连续表位。
如本文中所使用的，术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、母牛、鸡、两栖类、爬行类等。
在以下部分中进一步详细描述了本发明的各个方面。
抗CDH17抗体
本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，抗体特异性结合人CDH17。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合CDH17，例如以8x10-7M或更低，更通常为1x10-8M或更低的KD结合。本发明的抗CDH17抗体优选显示出一个或多个下列特征：以50nM或更低，10nM或更低，1nM或更低，100pM或更低，或更优选10pM或更低的EC50结合人CDH17;结合表达CDH17的人细胞。
在一个实施方案中，抗体优选结合存在于CDH17中的抗原性表位，所述表位不存在于其它蛋白中。抗体通常结合CDH17但不结合其它蛋白，或者，以低亲和力例如1x10-6M或更高，更优选1x10-5M或更高，更优选1x10-4M或更高，更优选1x10-3M或更高，更优选1x10-2M或更高的KD与蛋白结合。优选地，抗体不与相关蛋白结合，例如，抗体实质上不与其它细胞粘附分子结合。在一个实施方案中，抗体可以被内吞进入表达CDH17的细胞。用于评价抗体内吞的标准测定法是本领域已知的，包括例如HumZap内吞测定法。
用于评价抗体与CDH17的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。在实施例中详细描述了适宜的测定法。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，例如通过
Figure BDA00003070674100191
系统分析。为了评估与Raji或Daudi B细胞肿瘤细胞的结合，可以从公众可获得的来源例如美国典型培养物保藏中心获得Raji(ATCC DepositNo.CCL-86)或Daudi(ATCC Deposit No.CCL-213)细胞，并用于标准测定法(例如流式细胞术分析)中。
本发明的单克隆抗体
本发明具体地涉及本文中关于SEQ ID No:46-51的CDR定义的分离的抗体。
本发明的其它抗体是如实施例1-6和11中所述进行分离和结构表征的单克隆抗体CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R。CDH17_A4_4K的人源化VH氨基酸序列显示于SEQ ID NO:26中，CDH17_A4_4K的人源化VK氨基酸序列显示于SEQ ID NO:31中。CDH17_A4_4R的人源化VH氨基酸序列显示于SEQ ID NO:44中并且CDH17_A4_4R的人源化VK氨基酸序列显示于SEQ ID NO:46中。
鉴于这些抗体中的每一个都能结合CDH17，可以“混合并匹配”所述VH和VK序列以产生本发明的其它抗CDH17结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CDH17的结合。优选地，当混合并匹配VH和VK链时，来自特定VH/VK对的VH序列被替换为结构上相似的VH序列。类似地，优选地，来自特定VH/VK对的VK序列被替换为结构上相似的VK序列。
因此，在一个方面，本发明提供了抗体,其包含：
含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区；
其中所述抗体特异性结合CDH17，优选人CDH17。
因此，在一个方面，本发明提供了人源化抗体，其包含：
包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列的轻链可变区；其中抗体特异性结合CDH17，优选人CDH17。
在另一个方面，本发明提供了人源化抗体，其包含：
包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列的轻链可变区；
其中抗体特异性结合CDH17，优选人CDH17。
在另一方面，本发明提供了包含CDH17_A4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。CDH17_A4的VH CDR1的氨基酸序列显示于SEQID NO:1中。CDH17_A4的VH CDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2中。CDH17_A4的VH CDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:3中。CDH17_A4的VK CDR1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:4中。CDH17_A4的VK CDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:5中。CDH17_A4的VK CDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:6中。优选，在重链可变区和/或轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3中的氨基酸中存在1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加和/或缺失。
在另一个方面，本发明提供了包含CDH17_A4_4K的重链和轻链CDR1、CDR2及CDR3或其组合的抗体。CDH17_A4_4K的VH CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:36中。CDH17_A4_4K的VH CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2中。CDH17_A4_4K的VH CDR3的氨基酸序列示于SEQID NO:39中。CDH17_A4_4K的VK CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4中。CDH17_A4_4K的VK CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:40中。CDH17_A4_4K的VK CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO:41中。优选，在重链可变区和/或轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸中存在1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加和/或缺失。
在另一个方面，本发明提供了包含CDH17_A4_4R的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。CDH17_A4_4R的VH CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:36中。CDH17_A4_4R的VH CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:42中。CDH17_A4_4R的VH CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO:39中。CDH17_A4_4R的VK CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO:43中。CDH17_A4_4R的VK CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:40中。CDH17_A4_4R的VK CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO:41中。在一些实施方案中，在重链可变区和/或轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸中存在1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加和/或缺失。
在另一个方面，本发明提供了特异性结合钙粘素-17的分离的抗体，其包含：
a)包含下列的重链可变区:
i)含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第二CDR；
iii)含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第三CDR；和
b)包含下列的轻链可变区:
i)含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的第二CDR；和
iii)含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的第三CDR。在一些实施方案中，在重链可变区和/或轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸中可存在1、2、3、4或5个氨基酸置换、添加和/或缺失。
使用Kabat系统(Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242)标示CDR区。
本发明特别地提供了治疗胃癌、胰腺癌或结肠癌的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的本文中定义的抗体，特别地上文中定义的抗体。
鉴于这些抗体中的每一个都能结合CDH17并且抗原结合特异性主要由CDR1，CDR2和CDR3区域提供，所以可以“混合并匹配”VHCDR1，CDR2和CDR3序列和VKCDR1，CDR2和CDR3序列(即，可以混合并匹配来自不同抗体的CDR，虽然每一个抗体通常包含VHCDR1，CDR2和CDR3和VKCDR1，CDR2和CDR3)以产生本发明的其它抗CDH17结合分子。因此，本发明特别包括重链和轻链的CDR的每种可能的组合。
可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如ELISA、
Figure BDA00003070674100221
分析)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CDH17的结合。优选地，当混合并匹配VHCDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构上相似的CDR序列。类似地，当混合并匹配VKCDR序列时，来自特定VK序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域普通技术人员而言将为很显然的是：可以通过将一个或多个VH和/或VL/VKCDR区序列替换为来自如本文中公开的单克隆抗体CDH17_A4的CDR序列的结构上相似的序列来产生新的VH和VK序列。
因此，在另一个方面，本发明提供了包含下列的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分：
包含选自SEQ ID NO:1、29、36和46的氨基酸序列的重链可变区CDR1;
包含选自SEQ ID NO:2、30、42和47的氨基酸序列的重链可变区CDR2;
包含选自SEQ ID NO:3、39和48的氨基酸序列的重链可变区CDR3;
包含选自SEQ ID NO:4、33、43和49的氨基酸序列的轻链可变区CDR1;
包含选自SEQ ID NO:5、40和50的氨基酸序列的轻链可变区CDR2;和
包含选自SEQ ID NO:6、41和51的氨基酸序列的轻链可变区CDR3;并且所有可能的组合都是可能的，其中所述抗体特异性结合CDH17，优选人CDH17。
在优选的实施方案中，抗体包含：
含有SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO:2的重链可变区CDR2；
含有SEQ ID NO:3的重链可变区CDR3；
含有SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR2；和
含有SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR3。
在另一个优选的实施方案中，抗体包含：
含有SEQ ID NO:36的重链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO:2的重链可变区CDR2；
含有SEQ ID NO:39的重链可变区CDR3；
含有SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO:40的轻链可变区CDR2；和
含有SEQ ID NO:41的轻链可变区CDR3。
在另一个优选的实施方案中，抗体包含：
含有SEQ ID NO:36的重链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO:42的重链可变区CDR2；
含有SEQ ID NO:39的重链可变区CDR3；
含有SEQ ID NO:43的轻链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO:40的轻链可变区CDR2；和
含有SEQ ID NO:41的轻链可变区CDR3。
在另一个优选的实施方案中，抗体包含：
含有SEQ ID NO:46的重链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO:47的重链可变区CDR2；
含有SEQ ID NO:48的重链可变区CDR3；
含有SEQ ID NO:49的轻链可变区CDR1；
含有SEQ ID NO:50的轻链可变区CDR2；和
含有SEQ ID NO:51的轻链可变区CDR3。
本领域公知的是：不依赖于CDR1和/或CDR2域，CDR3域能够单独地决定抗体对于关联抗原(cognate antigen)的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列可预测性地产生具有相同结合特异性的多个抗体。见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer83(2):252-260(2000)(其描述了仅使用鼠抗-CD30抗体Ki-4的重链可变区CDR3域来产生人源化抗-CD30抗体);Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296:833-849(2000)(其描述了仅使用亲本鼠MOC-31抗-EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体);Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8910-8915(1998)(其描述了使用鼠抗-整合素αvβ3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3域的一组人源化抗-整合素αvβ3抗体，其中每个抗体成员在CDR3域之外包含不同的序列并且能够与亲本鼠抗体结合相同的表位，其亲和力等于或高于亲本鼠抗体);Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(1994)(其公开了CDR3域提供了对与抗原结合的最显著的贡献);Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2529-2533(1995)(其描述了将针对人胎盘DNA的3个Fab(SI-1，SI-40和SI-32)的重链CDR3序列移植到抗-破伤风类毒素Fab的重链上，从而替换已有的重链CDR3，并且证明了CDR3域单独地赋予结合特异性);和Ditzel et al.，J.Immunol.157:739-749(1996)(其描述了移植研究，其中仅将亲本多特异性Fab LNA3的重链CDR3转移至单特异性IgG破伤风类毒素-结合性Fab p313抗体的重链上就足以保留亲本Fab的结合特异性)。这些参考文献中的每一篇通过引用方式全文并入本文。
因此，本发明提供了包含来自源于人或非人动物的抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体,其中所述单克隆抗体能够特异性地结合CDH17。在一些方面，本发明提供了包含来自非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性结合CDH17。在一些实施方案中，包含来自非人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的此类本发明的抗体相对于对应的亲本非人类抗体而言，(a)能够与其竞争结合；(b)保留功能性特性；(c)结合至相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
在其它方面，本发明提供了包含来自人类抗体(例如获自非人动物的人类抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述人类抗体能够特异性结合CDH17。在其它方面，本发明提供了包含来自第一人类抗体(例如获自非人动物的人类抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中所述第一人类抗体能够特异性结合CDH17并且其中来自所述第一人类抗体的CDR3域替换缺乏对于CDH17的结合特异性的人类抗体的CDR3域，以产生能够特异性结合CDH17的第二人类抗体。在一些实施方案中，包含来自第一人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3域的此类本发明的抗体相对于对应的亲本第一人类抗体而言，(a)能够与其竞争结合；(b)保留功能性特性；(c)结合至相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
具有特定种系序列的抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在优选的实施方案中，本发明提供了包含重链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区是鼠VHII区域VH105基因或鼠VHII基因H17的产物或源自鼠VHII区域VH105基因或鼠VHII基因H17，其中所述抗体特异性结合CDH17。在另一个优选实施方案中，本发明提供了包含轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区是鼠VK8-30基因的产物或源自鼠鼠VK8-30基因，其中所述抗体特异性结合CDH17。
在另一个优选实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体：
包含是鼠VHII基因H17或鼠VHII区域VH105基因的产物或源自鼠VHII基因H17或鼠VHII区域VH105基因(所述基因分别包括如SEQID NO:17和18所示的核苷酸序列)的重链可变区；
包含是鼠VK8-30基因的产物或源自鼠VK8-30基因(该基因包括如SEQ ID NO:19、20和21所示的核苷酸序列)的轻链可变区；并且
特异性结合CDH17，优选人CDH17。
分别具有VHII基因Hl7或VHII区域VH105的VH和VK8-30的Vκ的抗体的实例为CDH17_A4。
如本文中所使用的，如果抗体的可变区获自使用鼠种系免疫球蛋白基因的系统，则人类抗体包含“是特定种系序列的产物”或“源自特定种系序列”的重链或轻链可变区。此类系统包括使用目的抗原筛选展显示于噬菌体上的鼠免疫球蛋白基因文库。可以通过将抗体的氨基酸序列与鼠种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并选择在序列上与抗体的序列最接近(即具有最大的％同一性)的鼠种系免疫球蛋白序列来鉴定“是鼠种系免疫球蛋白序列的产物”或“源自鼠种系免疫球蛋白序列”的抗体。“是特定的鼠种系免疫球蛋白序列的产物”或“源自特定的鼠种系免疫球蛋白序列”的抗体可以包含相比于种系序列的氨基酸差异，所述差异是由于例如天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变。然而，所选择的抗体在氨基酸序列上通常与鼠种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%同一，并且当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如人的种系序列)相比时，包含那些将抗体鉴定为是鼠的氨基酸残基。在一些情况下，抗体在氨基酸序列上可以与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%同一。通常，相对于鼠种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，源于特定鼠种系序列的人类抗体将显示出不超过10个氨基酸差异。在一些情况下，相对于种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，抗体可以显示出不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
同源抗体
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含含有同源于本文描述的优选抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的重链和轻链可变区，并且其中所述抗体保留本发明的抗CDH17抗体的所需功能特性。
例如，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其中
重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID No:7,26,27,28和44具有至少80%的同一性的氨基酸序列；
轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID No:8、31、32和45具有至少80%的同一性的氨基酸序列；并且
所述抗体结合人CDH17。本发明的抗体可以以50nM或更少，10nM或更少，1nM或更少，100pM或更少，或更优选地10pM或更少的EC50结合人CDH17。
抗体还可以结合经过人CDH17转染的CHO细胞。
在多个实施方案中，抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其它实施方案中，VH和/或VK氨基酸序列可以与上文给出的序列85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。含有与上文给出的序列的VH和VK区具有高度同源性(即80%或更高)的VH和VK区的抗体可以这样获得：使编码SEQ ID NO:9、10的核酸分子发生诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)，然后使用本文描述的功能测定法就保留的功能测试所编码的经改变的抗体。
两个序列之间的百分比同一性取决于这两个序列共有的相同位置的数目(即%同源性=相同位置的数目/总位置数目x100)，这考虑到了缺口数目和每个缺口的长度，缺口的引入是为了两个序列的最优比对。可以使用数学算法(例如以下非限制性实施例中描述的)来实现序列的比较和确定两个序列之间的百分比同一性。
可以使用并入到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，其中使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，可以使用并入到GCG软件包(可以从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，其中使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4、长度权重为1、2、3、4、5或6。
另外或备选地，本发明的蛋白序列还可以被用作“查询序列”以针对公共的数据库进行搜索，以便例如鉴定相关的序列。可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版)进行此类搜索。可以使用XBLAST程序、得分=50、词长=3来进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口化比对，可以使用如Altschul etal.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守性修饰的抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文描述的优选抗体(例如，CDH17_A4)的指定氨基酸序列或其保守性修饰，并且其中所述抗体保留本发明的抗CDH17抗体的所需功能特性。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO:3、39和48的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；
轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO:6、41和51的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且所述抗体结合人CDH17。此类抗体可以50nM更少、10nM或更少、1nM或更少、100pM或更少或更优选地10pM或更少的EC50结合人CDH17。
抗体还可以结合经过人CDH17转染的CHO细胞。
在优选的实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:2、30、42和47的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:5、40和50的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:1、29、36和46的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ IDNO:4、33、43和49的氨基酸序列及其保守性修饰的氨基酸序列。
在多个实施方案中，抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文中所使用的，术语“保守性序列修饰”意指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰导入本发明的抗体中。保守性氨基酸置换是这样的置换：其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以使用本文描述的功能测定法就保留的功能来检测经改变的抗体。
SEQ ID NO:1、29、36或46的重链CDR1序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO:4、33、43或49的轻链CDR1序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO:2、30、42或47中显示的重链CDR2序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO:5、40或50中显示的轻链CDR2序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；SEQ ID NO:3、39或48中显示的重链CDR3序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失；和/或SEQ ID NO:6、41或51中显示的轻链CDR3序列可以包含一个或多个保守性序列修饰，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加或缺失。
与本发明的抗-CDH17抗体结合相同表位的抗体
在另一个实施方案中，本发明提供了与本发明的任意CDH17单克隆抗体结合人CDH17上的相同表位的抗体(即，具有与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合CDH17的能力的抗体)。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参考抗体可以是单克隆抗体CDH17_A4(其具有分别如SEQ ID NO:7和8所示的VH和VK序列)。可以在标准的CDH17结合测定中基于它们与CDH17_A4、CDH17_A4_4K或CDH17_A4_4R交叉竞争的能力来鉴定此类交叉竞争性抗体。例如，可以使用BIAcore分析、ELISA测定法或流式细胞术来证明与本发明的抗体的交叉竞争。测试抗体抑制例如CDH17_A4、CDH17_A4_4K或CDH17_A4_4R与人CDH17结合的能力证明该测试抗体能够竞争CDH17_A4、CDH17_A4_4K或CDH17_A4_4R与人CDH17的结合，因此与CDH17_A4、CDH17_A4_4K或CDH17_A4_4R结合人CDH17上的相同表位。
工程化和修饰的抗体
还可以使用具有本文公开的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来工程化修饰的抗体，从而制备本发明的抗体，所述修饰的抗体与所述起始抗体相比可具有改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内(例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内)的一个或多个氨基酸来工程化抗体。另外或备选地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程化抗体，例如，为了改变抗体的效应子功能。
在一些实施方案中，可以使用CDR移植来工程化抗体的可变区。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)内的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，相对于CDR外的序列而言，CDR内的氨基酸序列在各抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体来表达模拟特定的天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的来自所述特定的天然存在的抗体的CDR序列(见，例如Riechmann,L.et al.(1998)Nature332:323-327;Jones,P.et al.(1986)Nature321:522-525;Queen,C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033;Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有分别选自SEQ ID NO:1、29、36和46；SEQ ID NO:2、30、42和47；和SEQ ID NO:3、39和48的氨基酸序列的CDR1，CDR2和CDR3序列；所述轻链可变区包含含有分别选自SEQ ID NO:4、33、43和49；SEQ ID NO:5、40和50；和SEQ ID NO:6、41和51的氨基酸序列的CDR1，CDR2和CDR3序列。因此，此类抗体包含单克隆抗体CDH17_A4、CDH17_A4_4K或CDH17_A4_4R的VH和VKCDR序列，但可以包含与这些抗体不同的框架序列。
此类框架序列可以获自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的文献。例如，鼠重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在下列中找到：IMGT(国际ImMunoGeneTics)鼠种系序列数据库(可在因特网上，于imgt.cines.fr/获得)，以及Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242;其中每一个的内容均明确地通过引用方式并入本文。作为另一个实例，鼠重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可在Genbank数据库中找到。
使用本领域技术人员熟知的被称作Gapped BLAST(Altschul etal.(1997)Nucleic Acids Research25:3389-3402)的一种序列相似性搜索方法针对汇编的蛋白质序列数据库来比较抗体蛋白序列。BLAST是启发式的算法，因为抗体序列与数据库序列之间的统计学上显著的比对可能包含所比对单词的高得分区段配对(high-scoringsegment pairs，HSP)。其得分不能通过延伸或截短被改善的区段配对被称作命中。简要地，数据库中的核苷酸序列被翻译，FR1至FR3框架区之间并包括FR1和FR3的区域被保留。数据库序列具有98个残基的平均长度。去除那些在蛋白的整个长度上精确匹配的重复序列。BLAST蛋白质搜索以默认的标准参数(除了被关闭的低复杂性过滤外)使用blastp程序以及BLOSUM62的置换矩阵，过滤产生序列匹配的5个最高命中。以所有6个框翻译核苷酸序列，并且在数据库序列的匹配区段中不含终止密码子的框被认为是潜在的命中。继而使用BLAST程序tblastx(其以所有6个框翻译抗体序列)进行确认，并将这些翻译与以所有6个框动态翻译的数据库中的核苷酸序列进行比较。
同一性(identity)是抗体序列与蛋白质数据库在序列全长上的精确的氨基酸匹配。正数(同一+置换匹配)是不相同的，而是由BLOSUM62置换矩阵引导的氨基酸置换。如果抗体序列以相同的同一性与数据库序列中的两个匹配，则具有最多正数的命中将被确定为匹配序列命中。
用于本发明的抗体中的优选的框架序列是与本发明所选择的抗体所使用的框架序列在结构上相似的那些，例如，与本发明优选的单克隆抗体所使用的VHII基因H17框架序列，VHII区域VH105框架序列和/或VK8-30框架序列相似。可以将VHCDR1、CDR2和CDR3序列和VKCDR1、CDR2和CDR3序列移植到与框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中所发现的那些序列具有相同序列的框架区上；或者，可以将CDR序列移植到相比于种系序列包含一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在一些情况下，使框架区内的残基突变有益于维持或增强抗体的抗原结合能力(见例如Queen等人的美国专利号5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VKCDR1,CDR2和/或CDR3区域内的氨基酸残基突变，从而改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以导入突变，并且可以在如本文描述和实施例中提供的体外或体内测定法中评价对于抗体结合或其它感兴趣的功能特性的影响。在一些实施方案中，导入保守性修饰(如上文所讨论)。备选地，可进行非保守性修饰。突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但优选为置换。此外，通常改变CDR区内的不多于1个、2个、3个、4个或5个残基，虽然如本领域技术人员将理解的，在其它区域(例如框架区)中的变异可更大。
因此，在另一个实施方案中，本公开提供了分离的抗-CDH17单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述抗体或其抗原结合部分包含：(a)VHCDR1区域，其包含选自SEQ ID NO:1、29、36和46的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1、29、36或46相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列;(b)VHCDR2区域，其包含选自SEQ ID NO:2、30、42和47的氨基酸序列或与SEQ IDNO:2、30、42和47相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列;(c)VHCDR3区域，其包含选自SEQ ID NO:3、39和48的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3、39和48相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列;(d)VKCDR1区域，其包含选自SEQ ID NO:4、33、43或49的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4、33、43或49相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列;(e)VKCDR2区域，其包含选自SEQ ID NO:5、40和50的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5、40和50具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3区域，其包含选自SEQ ID NO:6、41和51的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6、41和51相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的工程化抗体包括这样的抗体：其中对VH和/或VK内的框架残基进行了修饰，例如以便改善抗体的特性。通常，进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方式是使一个或多个框架残基“回复突变”至对应的种系序列。更特别地，经历了体细胞突变的抗体可以包含不同于抗体所衍生自的种系序列的框架残基。可以通过将抗体框架序列与抗体所衍生自的种系序列进行比较来鉴定此类残基。
另一种类型的框架修饰包括使框架区内、甚至是一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体潜在的免疫原性。该方法也被称作“去免疫”，在Carr等人的美国专利公开号2003/0153043中有更详细的描述。
除了框架或CDR区内的修饰之外或作为其备选，可以对本发明的抗体进行工程化以使其包括Fc区内的修饰，通常是为了改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞性细胞毒性。此外，可以对本发明的抗体进行化学修饰(例如，可以向抗体连接一个或多个化学部分)或进行修饰以改变其糖基化，这也是为了改变抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案中的每一个在下文有更详细的描述。Fc区内的残基的编号是Kabat的EU索引中的编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，从而改变(例如增大或减少)铰链区内的半胱氨酸残基数目。这种方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中有更详细的描述。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数目被改变是为了例如促进轻链和重链的组合，或为了增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以减小抗体的生物学半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，从而抗体相对于天然Fc铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合，具有受损的SpA结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中有更详细的描述。
在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。有多种方法是可能的。例如，可以导入一种或多种下列突变：T252L,T254S,T256F，如Ward的美国专利号6,277,375中所描述的。备选地，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体以使其包含获自IgG的Fc区的CH2结构域的2个环的清道夫受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所描述的。
在另一个实施方案中，按照WO2007/059782中的描述以UniBody的形式产生抗体，该文献通过引用方式全文并入本文。
在其它实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被替换为不同的氨基酸残基，从而抗体对于效应子配体具有改变的亲和力，但保持亲本抗体的抗原结合能力。针对其的亲和力被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。
在另一个实例中，可以将选自氨基酸残基329,331和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，从而抗体具有改变的C1q结合和/或减少的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中有更详细的描述。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO94/29351中有更详细的描述。
在另一个实例中，通过修饰下列位置上的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体的介导抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对于Fcγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法在Presta的PCT公开WO00/42072中有更详细的描述。此外，已经定位了人IgG1上的对于FcγR1,FcγRII,FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(见Shields,R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。显示了在位置256,290,298,333,334和339上的特定突变会改善与FcγRIII的结合。另外，显示了以下组合突变会改善FcγRIII结合：T256A/S298A,S298A/E333A,S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。其它的ADCC变体被描述于，例如WO2006/019447中。
在另一个实例中，可修饰Fc区域以增加抗体的半衰期，通常是通过增加与FcRn受体的结合，如，在例如PCT/US2008/088053，US7,371,826，US7,670,600和WO97/34631中所描述的。
在另一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，以便例如增加抗体对于抗原的亲和力。可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点处的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。该方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中有更详细的描述，并且可通过去除位置297处的天冬酰胺实现。
另外或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的数量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的等分GlcNac结构的抗体。这在本领域内有时被称作“工程化糖型”。已经证明此类改变的糖基化模式会增加抗体的ADCC能力。通常可以通过两种方式来实现此类碳水化合物修饰，例如在一些实施方案中，在具有改变的糖基化装置(machinery)的宿主细胞中表达抗体。本领域中已经描述了具有改变的糖基化装置的细胞，并且可被用作宿主细胞而在其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参考
Figure BDA00003070674100361
技术。例如，细胞系Ms704,Ms705和Ms709缺少岩藻糖转移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖转移酶)，从而在Ms704,Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺少岩藻糖。通过使用2个替换载体(见Yamane等的美国专利公开号2004/0110704，美国专利7,517,670和Yamane-Ohnuki et al.(2004)Biotechnol Bioeng87:614-22)靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而创建Ms704,Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系。作为另一个实例，Hanai等人的EP1,176,195描述了具有功能受损的FUT8基因(其编码岩藻糖转移酶)的细胞系，从而在此细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖化(通过减少或消除α1,6键-相关的酶)。Hanai等人还描述了具有低的或不具有将岩藻糖添加至结合抗体的Fc区的N-乙酰葡萄糖胺的酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT公开WO03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其具有减小的将岩藻糖附加至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(同样见Shields,R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO99/54342描述了被工程化为表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如beta(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而在所述经工程化的细胞系中表达的抗体显示出增加的等分GlcNac结构，这产生抗体的增加的ADCC活性(同样见Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。备选地，可以使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖残基(Tarentino,A.L.et al.(1975)Biochem.14:5516-23)。
备选地，可使用糖基化通路酶的小分子抑制剂来实现工程化糖型(特别是无岩藻糖基化)。参见例如Rothman et al.，Mol.Immunol.26(12):113-1123(1989);Elbein，FASEB J.5:3055(1991);PCT/US2009/042610和美国专利号7,700,321。
本发明涉及的本文中的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体进行聚乙二醇化，以便例如增加该抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的有反应活性酯或醛衍生物)在使一个或多个PEG基团附加至所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，通过与有反应活性的PEG分子(或类似的有反应活性的水溶性聚合物)发生酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文中所使用的,术语“聚乙二醇”意在涵盖任意形式的已经被用于衍生其它蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，将被聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于将蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可被应用于本发明的抗体。见，例如，Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384。
在其它的实施方案中，例如，当将本发明的抗体用于诊断或检测目的时，抗体可包含标记物。本文中“经标记的”是指化合物附着了至少一种元件、同位素或化学化合物，以使得能够检测所述化合物。一般而言，标记物属于下述三类：a)同位素标记物，其可以是放射性的或重同位素;b)磁性的、电的、热的；和c)有色的或发光的染料；尽管标记物也包括酶和粒子(例如磁性粒子)。优选的标记物包括但不限于荧光镧系元素复合物(包括铕和铽的那些)，并且荧光标记包括但不限于量子点、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、Malacite绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade蓝、德克萨斯红、Alexa染料、Cy染料和Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook(第六版)中所描述的其它物质，所述文献通过引用而在此明确地并入。
抗体的物理性质
可以通过抗CDH17抗体的各种物理性质进一步表征本发明的抗体。可以使用多种测定法基于这些物理性质来检测和/或区分不同类别的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或多个糖基化位点。一个或多个糖基化位点在可变区中的存在可以导致由于改变的抗原结合而产生的增加的抗体免疫原性或抗体pK的改变(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem41:673-702;Gala FA and Morrison SL(2004)J Immunol172:5489-94;Wallicket al(1988)J Exp Med168:1099-109;Spiro RG(2002)Glycobiology12:43R-56R;Parekh et al(1985)Nature316:452-7;Mimura et al.(2000)Mol Immunol37:697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。可以使用Glycoblot测定法来测试可变区的糖基化，该测定法切割抗体以产生Fab，然后使用测量高碘酸盐氧化和Schiff碱形成的测定法检测糖基化。备选地，可以使用Dionex光色谱法(Dionex-LC)来检测可变区糖基化，其从Fab上将糖切割为单糖，并分析单一糖的含量。在一些情况下，优选制备不含可变区糖基化的抗-CDH17抗体。这可以如下实现：通过选择在可变区内不含糖基化基序的抗体，或者使用本领域熟知的标准技术使糖基化基序内的残基突变。
在优选的实施方案中，本发明的抗体不含天冬酰胺异构位点。在N-G或D-G序列可能分别发生脱酰胺或异天冬氨酸效应。脱酰胺或异天冬氨酸效应导致产生异天冬氨酸，其通过形成脱离侧链羧基末端(而非主链)的纽结的结构而降低抗体的稳定性。可以使用等量(iso-quant)测定法来测量异天冬氨酸的产生，其使用反相HPLC来检测异天冬氨酸。
每一种抗体都具有独特的等电点(pI)，但是一般地，抗体将落在6至9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7至9.5的pH范围内。IgG4抗体的pI通常落在6至8的pH范围内。抗体可具有该范围之外的pI。虽然效应一般是未知的，但是存在以下推测：具有处于正常范围之外的pI的抗体在体内条件下可能具有某些解折叠和不稳定性。可以使用毛细等电聚焦测定法来测试等电点，其产生pH梯度并且可以使用激光聚焦用于增加的精确性(Janini et al(2002)Electrophoresis23:1605-11;Ma et al.(2001)Chromatographia53:S75-89;Hunt et al(1998)J Chromatogr A800:355-67)。在一些情况下，优选的是含有落在正常范围内的pI值的抗CDH17抗体。这可以如下实现：通过选择具有在正常范围内的pI的抗体，或通过使用本领域熟知的标准技术使带电的表面残基突变。
每种抗体都将具有指示热稳定性的熔化温度(Krishnamurthy Rand Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol3:361-71)。较高的热稳定性表示更大的总体上体内抗体稳定性。可以使用技术(例如差别扫描量热法(Chen et al(2003)Pharm Res20:1952-60;Ghirlandoet al(1999)Immunol Lett68:47-52))来测量抗体的熔点。TM1表示抗体的最初解折叠的温度。TM2表示抗体的完全解折叠的温度。一般地，优选的是，本发明的抗体的TM1大于60℃，优选大于65℃，更优选大于70℃。备选地，可以使用圆二色谱法测量抗体的热稳定性(Murray etal.(2002)J.Chromatogr Sci40:343-9)。
在优选的实施方案中，选择不迅速降解的抗体。可以使用如本领域熟知的毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem67:3626-32)来测量抗CDH17抗体的片段化。
在另一个优选实施方案中，选择具有最小的聚集效应的抗体。聚集可以导致引发不想要的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学性质。一般地，具有25%或更低，优选20%或更低，更优选15%或更低，更优选10%或更低，更优选5%或更低的聚集的抗体是可以接受的。可以通过数种本领域熟知的技术(包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色谱(HPLC)和光散射)来测量聚集，以鉴定单体、二聚体、三聚体或多聚体。
工程化抗体的方法
如上文所讨论的，可以通过修饰VH和/或VK序列或与其相连的恒定区，使用具有本文公开的VH和VK序列的抗CDH17抗体来产生新的抗CDH17抗体。因此，在本发明的另一个方面，利用本发明的抗CDH17抗体(例如CDH17_A4、CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R)的结构特征来产生结构上相关的保持本发明的抗体的至少一种功能特性(例如结合人CDH17)的抗CDH17抗体。例如，可以将CDH17_A4、CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R的一个或多个CDR区或其突变与已知的框架区和/或其它CDR重组地组合，以产生另外的、重组工程化的、如上文讨论的本发明的抗CDH17抗体。其它类型的修饰包括之前的部分中所描述的那些。用于工程化方法的起始材料是本文提供的一个或多个VH和/或VK序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，无需实际上制备出(即表达为蛋白)具有本文提供的一个或多个VH和/或VK序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，使用序列内包含的信息作为起始材料来产生衍生自原始序列的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列并表达为蛋白。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备抗CDH17抗体的方法，包括：
提供：(i)包含选自SEQ ID NO:1、29、36或46的CDR1序列、选自SEQ ID NO:2、30、42和47的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:3、39和48的CDR3序列的重链可变区抗体序列；和/或(ii)包含选自SEQ ID NO:4、33、43和49的CDR1序列、选自SEQ ID NO:5、40和50的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:6、41和51的CDR3序列的轻链可变区抗体序列；
改变所述重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；和
将所述改变的抗体的序列表达为蛋白。
可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达所述改变的抗体序列。
优选地，由改变的抗体序列编码的抗体是这样的抗体：其保留本文描述的抗CDH17抗体的一种、一些或全部功能特性，所述功能特性包括但不限于：
以1x10-7M或更低的KD结合人CDH17；
结合经CDH17转染的人CHO细胞。
可以使用本领域可获得的和/或本文描述的标准测定法(例如实施例中给出的那些(例如流式细胞术，结合测定法))来评估经改变的抗体的功能特性。
在本发明的工程化抗体的方法的一些实施方案中，可以在抗CDH17抗体编码序列的全长或部分上随机或选择性地导入突变，并且可以就结合活性和/或如本文描述的其它功能特性筛选所产生的经修饰的抗CDH17抗体。本领域中已经描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的PCT公开WO03/074679描述了使用计算筛选法来优化抗体的生理化学特性的方法。
编码本发明的抗体的核酸分子
本发明的另一个方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中或以部分纯化的或实质上纯的形式存在。当使用标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl显带(banding)、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它技术)从其它细胞成分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白)中纯化出来时，核酸是“分离的”或“使得实质上纯的”。见F.Ausubel,et al.,ed.(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或不含内含子序列。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。
可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于获自人免疫球蛋白基因文库的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从该文库回收编码抗体的核酸。
本发明的优选的核酸分子是编码本发明的抗体，例如CDH17_A4单克隆抗体的VH和VK序列的核酸分子。编码CDH17_A4的VH序列的DNA序列显示在SEQ ID NO:9中。编码CDH17_A4的VK序列的DNA序列显示在SEQ ID NO:10中。
本发明的其它优选核酸是与SEQ ID NO:11-16所示的序列之一具有至少80%序列同一性，例如至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%序列同一性的核酸，所述核酸编码本发明的抗体，或其抗原结合部分。
两个核酸序列之间的百分比同一性是序列中核苷酸相同的位置的数目，考虑到了缺口数目和每个缺口的长度，缺口的引入是为了两个序列的最优比对的需要。可以使用数学算法(例如上文描述的Meyers和Miller的算法或Altschul的XBLAST程序)来实现序列的比较和确定两个序列之间的百分比同一性。
另外，本发明的优选核酸包含SEQ ID NO:11-16所示的核酸序列的一个或多个CDR编码部分。在该实施方案中，核酸可以编码CDH17_A4的重链CDR1、CDR2和/或CDR3序列或CDH17_A4的轻链CDR1,CDR2和/或CDR3序列。
与本发明的核苷酸例如SEQ ID NO:11-16(VH和VK序列)的CDR编码部分具有至少80%，例如至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%序列同一性的核酸也是本发明的优选核酸。此类核酸与SEQID NO:16的对应部分可在非CDR编码区和/或CDR编码区中相区别。当所述区别在CDR编码区中时，核酸编码的核酸CDR区与CDH17_A4的对应的CDR序列相比通常包含一个或多个如本文定义的保守性序列修饰。
一旦获得编码VH和VK区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以便将可变区基因转变为全长抗体链基因，转变为Fab片段基因，或转变为scFv基因。在这些操作中，编码VK或VH的DNA片段可操作地与另一个编码另一蛋白(例如抗体恒定区或灵活的连接子)的DNA片段连接。如本文的情境中所使用的，术语“可操作地连接”意指两个DNA片段被连接在一起，从而由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持是符合读框的。
可以通过将编码VH的DNA可操作地与编码重链恒定区(CH1,CH2和CH3)的另一DNA分子连接而将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。鼠重链恒定区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号No.91-3242)，可以通过标准的PCR扩增来获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA,IgE,IgM或IgD恒定区，但最优选是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
可以通过将编码VL的DNA可操作地与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子连接而将编码VL/VK区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。鼠轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(见，例如Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequence of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH公开号No.91-3242)，可以通过标准的PCR扩增来获得包含这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL/VK的DNA片段可操作地与编码灵活连接子(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的)另一片段连接，从而VH和VL/VK序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中VL/VK和VH区通过所述灵活连接子被连接(见，例如Bird et al.(1988)Science242:423-426;Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCafferty et al.,(1990)Nature348:552-554)。
单克隆抗体的产生
根据本发明，CDH17或者其片段或衍生物可被用作免疫原以产生免疫特异性地与此种免疫原相结合的抗体。可通过任何便利的手段来分离此类免疫原。本领域技术人员将认识到，许多用于生产抗体的程序是可得的，例如，如在下列中所描述的：Antibodies，A LaboratoryManual，Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)，Cold Spring Harbor，N.Y。本领域技术人员还将了解，模拟抗体的结合片段或Fab片段也可通过各种程序由遗传信息制备(Antibody Engineering:A Practical Approach(Borrebaeck，C.，ed.)，1995，Oxford University Press，Oxford;J.Immunol.149，3914-3920(1992))。
在本发明的一个实施方案中，产生了针对CDH17的特定结构域的抗体。在具体的实施方案中，将CDH17的亲水性片段作为免疫原用于抗体的生产。
在抗体的生产中，可通过本领域已知的技术来实现对于所需抗体的筛选，例如ELISA(酶联免疫吸附测定)。例如，为了选择识别CDH17的特定结构域的抗体，可针对结合含有所述结构域的CDH17片段的产物来测定所产生的杂交瘤。为了选择特异性结合第一CDH17同源物但不特异性结合(或较弱地结合)第二CDH17同源物的抗体，可基于对于所述第一CDH17同源物的积极结合以及对于所述第二CDH17同源物缺乏结合(或减少的结合)来进行选择。类似地，为了选择特异性结合CDH17但不特异性结合(或较弱地结合)同一蛋白的不同同种型(例如与CDH17具有相同核心肽的不同糖型)的抗体，可基于对于CDH17的积极结合以及对于所述不同的同种型(例如不同的糖型)缺乏结合(或减少的结合)来进行选择。因此，本发明提供了这样的抗体(例如单克隆抗体)：与对于CDH17的不同同种型(例如糖型)的结合相比，其以更高的亲和力结合CDH17(例如至少2倍、如至少5倍，特别是至少10倍的更高的亲和力)。
可用于本发明的方法中的多克隆抗体是源自经免疫的动物的血清的抗体分子的异质性群体。可使用未分级的免疫血清。可使用本领域已知的各种程序来产生抗CDH17、CDH17的片段、CDH17相关多肽或CDH17相关多肽的片段的多克隆抗体。例如，一种方式是使用例如本领域熟知的固相肽合成方法来纯化目的多肽或合成目的多肽。见例如，Guide to Protein Purification，Murray P.Deutcher，ed.，Meth.Enzymol.Vol182(1990);Solid Phase Peptide Synthesis，GregB.Fields ed.，Meth.Enzymol.Vol289(1997);Kiso et al，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)38:1192-99，1990;Mostafavi et al，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids1:255-60，1995;Fujiwara et al，Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)44:1326-31，1996。然后，所选择的多肽可被用于通过注射而免疫各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以产生多克隆或单克隆抗体。可使用各种佐剂(即免疫刺激剂)来增强免疫应答；取决于宿主物种，这包括但不限于完全或不完全弗氏佐剂、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、表面活性物质(例如溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚、和佐剂例如BCG(卡介苗菌株)或短小棒状杆菌。其它的佐剂也是本领域熟知的。
为了制备抗CDH17的单克隆抗体(mAbs)，可使用任何这样的技术：其允许在培养物中由连续的细胞系产生抗体分子。例如，最初由Kohler和Milstein(1975，Nature256:495-497)开发的杂交瘤技术、以及三元杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，1983，Immunology Today4:72)和EBV-杂交瘤技术来生产人单克隆抗体(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和任何其亚类。产生单克隆抗体的杂交瘤可在体外或体内培育。在本发明的其它实施方案中，可利用已知的技术在无菌动物中生产单克隆抗体(PCT/US90/02545，在此通过引用而并入)。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是被良好建立了的程序。免疫方案和分离用于融合的经免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体和嵌合单克隆抗体(例如人-小鼠嵌合体)。
可以基于如上文的描述而制备的非人单克隆抗体的序列来制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。可以从非人目标杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA并使用标准的分子生物学技术进行工程化以使其包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法(见，例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)将鼠可变区连接至人恒定区。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法(见，例如Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)将鼠CDR区插入至人框架中。
可使用这样的转基因或转染色体(transchromosomic)小鼠来生产全人抗体：其不能表达内源性的免疫球蛋白重链和轻链基因但是可表达人重链和轻链基因。用所选择的抗原(例如CDH17的全部或部分)以通常的方式免疫所述转基因小鼠。可使用常规的杂交瘤技术获得针对所述抗原的单克隆抗体。所述转基因小鼠带有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化的过程中重排，并随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能产生治疗上有用的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括
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Inc.)和
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株的小鼠。Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.13:65-93)描述了HuMAb
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株
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Inc.)。关于用此技术生产人抗体和人单克隆抗体以及生产此类抗体的方案的详细讨论，见例如美国专利5,625,126;美国专利5,633,425;美国专利5,569,825;美国专利5,661,016和美国专利5,545,806。KM
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株是指携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，其被详细描述于Ishida等的PCT公开WO02/43478中。
另外，本领域中可以获得表达人免疫球蛋白基因的备选的转基因动物系统，其可用于产生本发明的抗CDH17抗体。例如，可以使用被称作Xenomouse(Amgen,Inc.)的备选转基因系统；此类小鼠被描述于例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584和6,162,963中。
可使用被称为“引导选择”的技术来产生识别所选表位的全人抗体。在这种方法中，使用所选的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)来引导选择识别相同表位的全人抗体(Jespers et al.(1994)Bio/technology12:899-903)。
此外，本领域中可以获得表达人免疫球蛋白基因的备选的转染色体动物系统，其可用于产生本发明的抗CDH17抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小鼠”；此类小鼠被描述于Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中。此外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的母牛(Kuroiwa et al.(2002)Nature Biotechnology20:889-894和PCT申请WO/2002/092812)，并且可被用于产生本发明的抗CDH17抗体。
还可以使用这样的SCID小鼠来制备本发明的人单克隆抗体：向其中重构了人免疫细胞，从而可以在免疫后产生人类抗体应答。此类小鼠被描述于例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
可以通过使用噬菌体展示技术来产生并且就与所选靶标的结合而筛选多肽库，从而产生本发明的抗体。见例如，Cwirla et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，6378-82，1990;Devlin et al.，Science249，404-6，1990，Scott和Smith，Science249，386-88，1990;以及Ladner等人，美国专利号5,571,698。噬菌体展示方法的基本概念是在编码待筛选的多肽的DNA与所述多肽之间建立物理关联。这种物理关联是由噬菌体颗粒提供的，其将多肽作为衣壳的一部分展示，所述衣壳包装着编码所述多肽的噬菌体基因组。在多肽与其遗传物质之间建立物理关联允许对携带不同多肽的很大数目的噬菌体同时进行大规模筛选。展示出具有与靶标的亲和力的多肽的噬菌体与靶标结合并且这些噬菌体通过针对靶标的亲和力筛选而被富集。可从其各自的基因组来确定这些噬菌体所展示的多肽的特性(identity)。使用这些方法，被鉴别为具有对于所需靶标的结合亲和力的多肽然后可通过常规的手段被大量合成。见例如，美国专利号6,057,098，在此将其全部并入，包括所有的表格、附图和权利要求。特别地，此类噬菌体可被用于展示由库或组合的抗体文库(例如人或鼠的)表达的抗原结合结构域。可用抗原来选择或鉴别表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体，例如使用经标记的抗原或者结合至或被捕获至固体表面或珠的抗原。用于这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包括从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，其中Fab，Fv或经二硫稳定的Fv抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组地融合。可用于制备本发明的抗体的噬菌体展示方法包括下列中所公开的：Brinkman etal，J.Immunol.Methods182:41-50(1995);Ames et al.，J.Immunol.Methods184:177-186(1995);Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24:952-958(1994);Persic et al.，Gene1879-18(1997);Burton et al.，Advances in Immunology57:191-280(1994);PCT申请No.PCT/GB91/01134;PCT公开WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401;以及美国专利号5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108;其中的每一个都在此以其全部通过引用而被并入。
如上面的参考文献中所描述的，噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可被分离并用于产生完整的抗体，包括人抗体或任何其它所需的抗原结合片段，并在任何所希望的宿主中被表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如如下文中所详述的。例如，也可通过使用本领域中已知的方法、采用重组产生Fab，Fab'和F(ab')2片段的技术，所述方法为例如下列中所公开的：PCT公开WO92/22324;Mullinax et al.，BioTechniques12(6):864-869(1992);和Sawai et al.，AJRI34:26-34(1995);以及Better etal.，Science240:1041-1043(1988)(所述参考文献以其全部通过引用而被并入)。
可用于生产单链Fv和抗体的技术的实例包括下列中所描述的那些：美国专利4,946,778和5,258,498;Huston et al，Methods inEnzymology203:46-88(1991);Shu et al，PNAS90:7995-7999(1993);以及Skerra et al，Science240:1038-1040(1988)。
本发明提供了抗CDH17免疫球蛋白分子的功能活性片段、衍生物或类似物。功能活性片段是指所述片段、衍生物或类似物能够引起抗-抗个体型抗体(即第三抗体)，其与所述片段、衍生物或类似物所源自的抗体识别相同的抗原。具体地，在特别的实施方案中，免疫球蛋白分子个体型的抗原性可通过删除特异性识别抗原的CDR序列C末端的框架和CDR序列而被提高。为了确定哪些CDR序列结合抗原，可通过本领域已知的任何结合测定方法，在与抗原的结合测定中使用含有CDR序列的合成肽。
本发明提供抗体片段，例如但不限于F(ab')2片段和Fab片段。可通过已知的技术产生识别特定表位的抗体片段。F(ab')2片段是由可变区，轻链恒定区和重链的CHl结构域组成的，并且是通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的。Fab片段是通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生的。本发明还提供本发明的抗体的重链和轻链二聚体，或其任何最小的片段，例如Fv或单链抗体(SCAs)(例如，如下列中所描述的：美国专利4,946,778;Bird，1988，Science242:423-42;Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;和Ward et al.，1989，Nature334:544-54)，或与本发明的抗体具有相同的特异性的任何其它分子。单链抗体是由通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段而产生单链多肽形成的。可使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.，1988，Science242:1038-1041)。
在其它实施方案中，本发明提供了本发明的免疫球蛋白(或其功能活性片段)的融合蛋白，例如其中所述免疫球蛋白通过共价键(例如，肽键)在N末端或C末端与不是免疫球蛋白的另一个蛋白(或其部分，优选蛋白的至少10、20或50个氨基酸的部分)的氨基酸序列相融合。优选地，所述免疫球蛋白或其片段在恒定结构域的N末端与其它蛋白共价连接。如上文中所述，此类融合蛋白可促进纯化、增加体内的半衰期以及提高抗原跨过上皮屏障而向免疫系统的递送。
本发明的免疫球蛋白包括经修饰的类似物和衍生物，所述修饰为例如通过共价连接任何类型的分子，只要所述共价连接不损害免疫特异性结合。例如(但是不作为限制)所述免疫球蛋白的衍生物和类似物包括被进一步修饰的那些，例如所述进一步修饰是通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护性/阻碍性基团的衍生、蛋白水解切割、与细胞配体或其它的蛋白相连等。可通过已知的技术进行许多化学修饰中的任意，包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，所述类似物或衍生物可含有一个或多个非经典氨基酸。
小鼠的免疫
可以使用CDH17抗原和/或重组CDH17的纯化的或富集的制备物或表达CDH17的细胞来免疫小鼠。优选地，小鼠在第一次输注时是6-16周龄。例如，可以使用CDH17抗原的纯化的或重组的制备物(100μg)腹膜内地免疫小鼠。
以多种抗原获得的累积的经验已经表明：当以完全弗氏佐剂中的抗原通过腹膜内(IP)方式进行免疫时，小鼠有应答。然而，发现除了弗氏佐剂以外的其它佐剂也是有效的。另外发现：在不存在佐剂的情况下，全细胞是高度免疫原性的。可以通过眶后取血获得的血浆样品在免疫程序的过程中监控免疫应答。可以通过ELISA筛选血浆(如下文描述)以就满意的滴度进行测试。可以在处死前连续3天使用抗原通过静脉内方式对小鼠加强免疫，并在5天后取出脾脏。在一个实施方案中，可以使用A/J小鼠株(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Me.)。
制备产生单克隆抗体的转染瘤
可以使用例如本领域熟知的重组DNA技术与基因转染方法的组合(例如Morrison,S.(1985)Science229:1202)在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达目的抗体的杂交瘤进行cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将该DNA插入至表达载体，从而基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在此情境中，术语“可操作地连接的”意指抗体基因被连接到载体中，从而该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。将表达载体和表达控制序列选择为与所用的表达宿主细胞相容的。
可用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一种载体编码衍生自重链的多肽而第二种载体编码衍生自轻链的多肽。这两种载体可含有相同的选择性标志物，使得能够平等地表达重链和轻链多肽。备选地，可使用编码重链和轻链多肽的单一载体。在这种情形中，轻链应被置于重链之前以避免过量的无毒性重链(Proudfoot，1986，Nature322:52;Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2197)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上的互补性限制性位点的连接，或者，如果不存在限制性位点，则进行平末端连接)将抗体基因插入至表达载体。本文描述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因：通过将所述轻链和重链可变区插入至已经编码所需的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，从而VH区段可操作地连接于该载体内的CH区段，并且VK区段可操作地连接于该载体内的CL区段。另外或备选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，从而信号肽与抗体链基因的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞内表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷化信号)，它们控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列被描述于例如Goeddel[GeneExpression Technology.Methods in Enzymology185,AcademicPress,San Diego,CA(1990)]中。本领域技术人员将理解，表达载体的设计、包括调节序列的选择可取决于如下因素，例如，待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导蛋白在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如源自下列病毒的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)，猴病毒40(SV40)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤。备选地，可以使用非病毒的调节序列，例如泛素启动子或β-球蛋白启动子。另外，调节元件包括来自不同来源的序列，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复的序列(Takebe,Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除了抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起始点)和可选择的标志物基因。所述可选择的标志物基因促进其中导入了载体的宿主细胞的选择(见，例如Axel et al.的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择的标志物基因赋予其中导入了载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的可选择标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在dhfr-宿主细胞中以氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的多种形式意在涵盖通常用于将异源DNA导入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐转染等。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞(最优选在哺乳动物宿主细胞中)表达抗体是最优选的，因为此类真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)比原核细胞更易于组装和分泌正确折叠且免疫上有活性的抗体。已经报道了抗体基因的原核表达对于高产率产生活性抗体是无效的(Boss,M.A.and Wood,C.R.(1985)Immunology Today6:12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其与载体(例如来自人巨细胞病毒的主要即刻早期基因启动子元件(Foecking et al，1986，Gene45:101;Cockettet al，1990，Bio/Technology8:2)相结合；dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220，与DHFR可选择标志物一起使用，例如描述于R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中；NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是公开于WO87/04462(Wilson的),WO89/01036(Bebbington的)和EP338,841(Bebbington的)中的GS基因表达系统。
可使用各种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体分子。此类宿主表达系统代表媒介(通过所述媒介，目的编码序列可被产生并随后被纯化)，但是也代表细胞(当其被转化或转染了适当的核苷酸编码序列时，原位表达本发明的抗体分子)。这些包括但不限于，经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、赤壁酵母属(Pichia))；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)感染的、或者经含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或带有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)，所述构建体含有下列启动子：源自哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。
在细菌系统中，可根据所表达的抗体分子所欲的用途有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量此类蛋白时，对于产生包含抗体分子的药物组合物，可能需要的是指导易纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.2:1791)，其中抗体编码序列可被单独地连接到载体中并与lacZ编码区同框，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13:3101-3109;Van Heeke&Schuster，1989，J.Biol.Chem.24:5503-5509)等。pGEX载体也可被用于表达外来多肽，作为与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，此类融合蛋白是可溶的并且可如下容易地从裂解的细胞中纯化：通过吸附和结合到基质谷胱甘肽-琼脂糖珠上，随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱。pGEX载体被设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而经克隆的靶基因产物可从GST部分被释放。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)被用作载体，以表达外来基因。此病毒在草地夜蛾细胞中生长。可将抗体编码序列单独地克隆到病毒的非必要区域(例如多角体基因)中并将其置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制之下。在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统(例如，腺病毒表达系统)。
如上文所讨论的，可选择这样的宿主细胞株：其调节被插入的序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。此种对蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如剪切)对于蛋白质的功能可能是重要的。
对于长期、高产率地生产重组抗体而言，稳定的表达是优选的。例如，可如下生产稳定表达目的抗体的细胞系：用包含抗体的核苷酸序列以及可选择标志物(例如新霉素或潮霉素)的核苷酸序列的表达载体转染细胞，并且就可选择标志物的表达进行选择。此类经工程化的细胞系可特别用于筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的化合物。
可通过载体扩增而增加抗体分子的表达水平(关于综述，见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammaliancells in DNA cloning，Vol.3.(Academic Press，New York，1987))。当表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的时候，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于所扩增的区域是与抗体基因相关的，抗体的产生也将增加(Crouse et al，1983，Mol.Cell.Biol.3:257)。
当把编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间而产生抗体，所述时间足以允许抗体在该宿主细胞中表达或更优选地，允许抗体被分泌到该宿主细胞所生长的培养基中。一旦本发明的抗体分子被重组地表达，可通过本领域已知的任何纯化抗体分子的方法将其纯化，例如通过色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱(如使用蛋白A或特定抗原的亲和色谱)、和尺寸柱色谱)，离心，差异溶解性，或任何其它的用于纯化蛋白的标准技术。
备选地，通过使用特异于所表达的融合蛋白的抗体，可容易地纯化任何融合蛋白。例如，Janknecht等人描述的系统允许容易地纯化在人细胞系中表达的非变性融合蛋白(Janknecht et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8972-897)。在这一系统中，目的基因被亚克隆到牛痘重组质粒中，从而使基因的开放阅读框被翻译地融合至由6个组氨酸残基组成的氨基末端标签。此标签作为融合蛋白的基质结合结构域。将来自感染了重组牛痘病毒的细胞的提取物加载到Ni2+次氮基乙酸-琼脂糖柱上，并且用含有咪唑的缓冲液选择性地洗脱经组氨酸标记的蛋白。
表征抗体与抗原的结合
通过这些方法产生的抗体然后可如下被选择：首先用纯化的目的多肽就亲和力和特异性进行筛选，如果需要的话，将结果与用希望排除结合的多肽获得的抗体亲和力和特异性进行比较。可通过例如标准的ELISA就与CDH17的结合测试抗体。筛选过程可涉及将纯化的多肽固定在微量滴定板的单独的孔中。然后，将含有潜在抗体或抗体组的溶液置于各个微量滴定孔中并温育约30分钟至2小时。然后清洗所述微量滴定孔，并将经标记的二抗(如果所产生的抗体为小鼠抗体，所述二抗为例如与碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体)加入孔中，温育大约30分钟，然后清洗。将底物加入孔中，在抗经固定的多肽的抗体存在的位置将出现颜色反应。
然后可在所选择的测定设计中就亲和力和特异性对这样鉴别的抗体进行进一步分析。在靶蛋白免疫测定的开发中，纯化的靶蛋白作为标准，用于判断使用所选择的抗体的免疫测定的灵敏度和特异性。由于不同抗体的结合亲和力可能不同，某些抗体对(例如在夹心测定中)可能在空间上等彼此干扰，相比于抗体的绝对亲和力和特异性，抗体的测定表现可能是更重要的量度。
本领域技术人员将认识到，可采用许多方法来生产抗体或结合片段，以及就亲和力与特异性筛选和选择各种多肽，但是这些方法不改变本发明的范围。
为了测定所选择的抗CDH17单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用商业上可获得的试剂(Pierce,Rockford,IL)将每个抗体生物素化。可以使用CDH17包被的ELISA平板，使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体，进行竞争性研究。可以使用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的mAb的结合。
为了测定纯化的抗体的同种型，可以使用特异于特定同种型的抗体的试剂进行同种型ELISA。
可以通过蛋白质印迹就与CDH17抗原的反应活性进一步测试抗CDH17抗体。简要地，可以制备CDH17并使其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，以10%的胎牛血清封闭，并用待测的单克隆抗体进行探测。
还可以通过例如流式细胞术通过监控抗体与表达CDH17的细胞的结合来测定本发明的抗体结合特异性。通常，可以使用编码CDH17的表达载体来转染细胞系(例如CHO细胞系)。转染的蛋白可以包含标签，例如myc标签，优选在N末端，以便使用针对该标签的抗体进行检测。可以通过将经转染的细胞与抗体一起温育并检测所结合的抗体来测定本发明的抗体与CDH17的结合。抗体与转染的蛋白上的标签的结合可被用作阳性对照。
还可以使用相同的方法(测定与CDH17的结合的方法)通过测定抗体是否与其它蛋白(例如钙粘素家族的其它成员)结合来进一步研究本发明的抗体对于CDH17的特异性。
免疫缀合物
另一方面，本发明提供了与治疗性部分(例如细胞毒素，药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素)缀合的抗CDH17抗体或其片段，尤其是本文中描述的抗体。此类缀合物在本文中被称作“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性试剂包括任何对于细胞有害(例如杀死细胞)的试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾甾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素、及其类似物或同源物。治疗性试剂还包括，例如抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖孢苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、噻替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二氨基铂(II)((DDP)顺铂))、蒽环类(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(以前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
可与本发明的抗体缀合的治疗性细胞毒素的其它优选的实例包括duocarmycins、calicheamicins、美登素和auristatins，及其衍生物。calicheamicin抗体缀合物的实例是商业上可得的(
Figure BDA00003070674100581
American Home Products)。
可以使用本领域可获得的连接子技术将细胞毒素与本发明的抗体缀合。已经用于将细胞毒素与抗体缀合的连接子类型的实例包括但不限于：腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽连接子。可以选择连接子而使得例如，易于被溶酶体区室内的低pH切割，或易于被蛋白酶(例如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，例如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D))切割。
细胞毒素的实例在例如下述中被描述：美国专利号6,989,452，7,087,600，和7,129,261，和PCT申请Nos.PCT/US2002/17210，PCT/US2005/017804，PCT/US2006/37793，PCT/US2006/060050，PCT/US2006/060711，WO2006/110476，以及美国专利申请No.60/891,028，所有这些均在此以其全部通过引用而并入。关于细胞毒素类型、连接子和用于将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论，还见Saito，G.et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215;Trail，P.A.et al.(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337;Payne，G.(2003)Cancer Cell3:207-212;Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763;Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091;Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
本发明的抗体还可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射药剂，也称作放射免疫缀合物。可与抗体缀合用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥l77。用于制备放射免疫缀合物的方法是本领域已经建立的。放射免疫缀合物的实例是商业上可得的，包括
Figure BDA00003070674100591
(IDEC Pharmaceuticals)和
Figure BDA00003070674100592
(Corixa Pharmaceuticals)，类似的方法也可被用于使用本发明的抗体来制备放射免疫缀合物。
本发明的抗体缀合物可被用于修饰给定的生物学应答，且药物部分将不被解释为受限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白或多肽。此类蛋白可以包括，例如酶促活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素;蛋白，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ;或者，生物学应答修饰剂例如，淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生长因子。
将此类治疗性部分与抗体相缀合的技术是公知的，见例如Arnonet al.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy”在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985);Hellstrom et al.，“Antibodies For Drug Delivery”,在ControlledDrug Delivery(2nd Ed.)中，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987);Thorpe，“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,在MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications中，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985);“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy”，在Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy中，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press1985)，和Thorpe et al.，Immunol.Rev.，62:119-58(1982)。
双特异性分子
在另一个方面，本发明的特征在于包含本发明的抗CDH17抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以被衍生或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如另一抗体或针对受体的配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。本发明的抗体事实上可以被衍生或连接至多于一种其它功能分子以产生结合多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也意在被如本文中所使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以被官能地连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它)至一种或多种其它结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。
因此，本发明包括双特异性分子，其包含至少一种针对CDH17的第一结合特异性和针对第二靶表位的第二结合特异性。在本发明的具体实施方案中，所述第二靶表位是Fc受体，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括能够结合表达FcγR或FcαR的效应子细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))、并结合表达CDH17的靶细胞的双特异性分子。这些双特异性分子将表达CDH17的细胞靶向效应子细胞并激发Fc受体介导的效应子细胞活性，例如表达CDH17的细胞的吞噬作用，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，细胞因子释放，或产生超氧阴离子。
在本发明的一个实施例中，其中双特异性分子是多特异性的，该分子除了抗-Fc结合特异性和抗CDH17结合特异性之外，可以进一步包括第三结合特异性。在一个实施方案中，所述第三结合特异性是抗-增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合，从而增加抗靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是结合给定分子(例如抗原或受体)从而导致针对Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效应的增强的抗体、功能抗体片段或配体。“抗增强因子部分”能够结合Fc受体或靶细胞抗原。备选地，抗增强因子部分能够结合与第一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体。例如，抗增强因子部分能够结合细胞毒性T-细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其它引起抗靶细胞的增强的免疫应答的免疫细胞)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体，或其抗体片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，例如Fv或如Ladner等人的美国专利号4,946,778中描述的单链构建体，其内容明确地通过引用方式并入。
在一个实施方案中，由单克隆抗体提供了对于Fcγ受体的结合特异性，其结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文中所使用的，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ-链基因中的任一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，其被分组为3个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64),FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人高亲和性FcγRI。人FcγRI是72kDa的分子，其显示出对于单体IgG的高亲和力(108-109M-1)。
某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的产生和表征描述于Fanger等人的PCT公开WO88/00052和美国专利号4,954,617中，其教导通过引用方式完全并入本文。这些抗体结合FcγRI,FcγRII或FcγRIII的表位，其结合位点不同于受体的Fcγ结合位点，因此，它们的结合实质上不被生理水平的IgG阻断。用于本发明的特定的抗-FcγRI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。产生mAb32的杂交瘤可以从美国典型微生物保藏中心ATCC以登记号HB9469获得。在其它实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征被描述于Graziano,R.F.et al.(1995)J.Immunol155(10):4996-5002和Tempest等人的PCT公开WO94/10332中。产生H22抗体的细胞系保藏于美国典型微生物保藏中心，其被命名为HA022CL1，登记号为CRL11177。
在其它优选的实施方案中，针对Fc受体的结合特异性由结合人IgA受体的抗体提供，例如Fc-α受体(FcαRI(CD89))，其结合优选不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语"IgA受体"意在包括位于染色体19上的1个α-基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码数个备选地剪接的跨膜的55至110kDa的同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜曙红细胞和嗜中性粒细胞上组成性表达，但是在非效应子细胞群体上不表达。FcαRI具有针对IgA1和IgA2的中等亲和力(≈5x107M-1)，在暴露于细胞因子(例如G-CSF或GM-CSF)时该亲和性增加(Morton,H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology16:423-440)。已经描述了4种FcαRI-特异性单克隆抗体，称作A3、A59、A62和A77，它们结合IgA配体结合域外的FcαRI(Monteiro,R.C.et al.(1992)J.Immunol.148:1764)。
FcαRI和FcγRI是用于本发明的双特异性分子的优选的激发受体，因为它们(1)主要表达在免疫效应子细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞)上；(2)以高水平表达(例如5,000-100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介导剂；和(4)介导靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。
可在本发明的双特异性分子中采用的抗体有：鼠的，嵌合的和人源化的单克隆抗体。
可以使用本领域已知的方法通过缀合组成性结合特异性(例如抗-FcR和抗CDH17结合特异性)来制备本发明的双特异性分子。例如，可以分别产生双特异性分子的每种结合特异性，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白或肽时，可以使用多种偶联或交联剂来进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)和硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)(见例如Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160:1686;Liu,MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648)。其它方法包括描述于Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132;Brennan et al.(1985)Science229:81-83和Glennie et al.(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中的那些。优选的缀合剂是SATA和硫代-SMCC，二者皆可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的C末端铰链区的巯基键合来缀合。在特别优选的实施方案中，在缀合之前修饰铰链区以使其包含奇数的巯基残基，优选1个。
备选地，两种结合特异性可在同一载体中被编码，并且在相同的宿主细胞中被表达和组装。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以是包含1个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含2个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少2种单链分子。用于制备双特异性分子的方法被描述于例如美国专利号5,260,203;5,455,030;4,881,175;5,132,405;5,091,513;5,476,786;5,013,653;5,258,498;和5,482,858中，所有这些文献均明确地通过引用方式并入本文。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认双特异性分子与它们的特定靶标之间的结合。这些测定法中的每一种一般通过采用特异于目的复合物的经标记的试剂(例如抗体)来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。备选地，可以使用多种其它免疫测定法中的任一种来检测复合物。例如，可以对抗体进行放射性标记并用于放射免疫测定(RIA)(见，例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques,The EndocrineSociety,March,1986,通过引用方式并入本文)。可以通过例如使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影的方法来检测放射性同位素。
抗体片段和抗体模拟物
本发明不限于传统抗体，可以通过使用抗体片段和抗体模拟物来实施。如下文详述，现在已经开发了多种抗体片段和抗体模拟物技术并且是本领域广泛已知的。虽然多种这些技术(例如结构域抗体、纳米抗体和UniBody)利用传统抗体结构的片段或其它修饰，但也有备选的技术，例如Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer和Versabody，它们采用这样的结合结构：虽然它们模拟传统抗体结合，但是它们是通过不同的机制产生的并且通过不同的机制发挥作用。
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单元，对应于人类抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体具有大约13kDa的分子量。Domantis已经开发了一系列全人VH和VLdAb的大的和高度功能性的文库(每个文库中有超过100亿个不同的序列)，并使用这些文库来选择特异于治疗靶标的dAb。与很多传统抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好地表达。可以通过参考美国专利6,291,158;6,582,915;6,593,081;6,172,197;6,696,245;美国系列号2004/0110941;欧洲专利申请号1433846和欧洲专利0368684和0616640;WO05/035572,WO04/101790,WO04/081026,WO04/058821,WO04/003019和WO03/002609来获得结构域抗体及其制备方法的进一步详细内容，这些文献的每篇皆通过引用方式全文并入本文。
纳米抗体是抗体衍生的治疗蛋白，其包含天然存在的重链抗体的独特的结构和功能特性。这些重链抗体包含单一的可变域(VHH)和2个恒定域(CH2和CH3)。重要地，所克隆和分离的VHH域是非常稳定的多肽，其携带原始重链抗体的完全的抗原结合能力。纳米抗体与人类抗体的VH域具有高度同源性，并且可以进一步被人源化而不丧失任何活性。重要地，纳米抗体具有低免疫原性潜力，已经使用纳米抗体先导化合物在灵长类研究中证实了这一点。
纳米抗体组合了传统抗体的优点与小分子药物的重要特征。像传统抗体一样，纳米抗体显示出针对它们的靶标的高靶标特异性、高亲和性和低内在毒性。然而，像小分子药物一样，它们能够抑制酶并容易地接触受体缝隙。此外，纳米抗体是极度稳定的，可以通过注射之外的方式来施用(见，例如WO04/041867，通过引用方式全文并入本文)并且易于制造。纳米抗体的其它优点包括识别不常见的或隐藏的表位(由于它们的尺寸小)、以高亲和力和选择性结合到蛋白靶标的腔中或活性位点中(由于它们独特的三维结构)、药物形式的灵活性、半衰期的调节(tailoring)和药物发现的容易性和速度。
纳米抗体由单基因编码，在几乎所有原核和真核宿主中高效产生，所述宿主例如：大肠杆菌(见，例如US6,765,087，通过引用方式全文并入本文)、霉菌[例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)]和酵母[例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)](见，例如US6,838,254，通过引用方式全文并入本文)。生产过程可以按比例扩大，已经生产了数量为数千克的纳米抗体。由于纳米抗体显示出相对于传统抗体的优越的稳定性，所以它们可以被配制为长保质期、即用型的溶液。
纳米克隆(nanoclone)方法(见例如WO06/079372，通过引用方式全文并入本文)是用于产生针对需要的靶标的纳米抗体的专利方法，其是基于自动化的高通量选择B细胞，并且可以被用于本发明的情境中。
UniBody是另一种抗体片段技术；然而其是基于去除IgG4抗体的铰链区的。铰链区的缺失产生基本上是传统的IgG4抗体一半大小的分子，并且具有单价结合区，而不是如IgG4抗体的二价结合区。还公知的是：IgG4抗体是惰性的，因此不与免疫系统相互作用，这对于治疗无需免疫应答的疾病是有利的，并且该优点被传递给UniBody。例如，UniBody可以发挥抑制或沉默而不杀死与其结合的细胞的功能。另外，UniBody与癌细胞的结合不刺激它们增殖。此外，由于UniBody是传统IgG4抗体的大约一半大小，所以它们可显示出在较大的实体肿瘤上的更好的分布，具有潜在的有利功效。UniBody以类似于完整IgG4抗体的速率从身体中被清除，并且能够以类似于完整抗体的亲和力结合其抗原。可以通过参考专利申请WO2007/059782获得关于UniBody的进一步详细内容，该文献通过引用方式全文并入本文。
Affibody分子代表基于58个氨基酸残基的蛋白结构域的一类新的亲和蛋白，其衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合性结构域之一。这种三螺旋束结构域已经被用作支架以构建组合型嗜菌粒文库，可以使用噬菌体展示技术从所述文库中选择靶向所需分子的Affibody变体(Nord K,Gunneriusson E,Ringdahl J,Stahl S,Uhlen M,NygrenPA,Binding proteins selected from combinatorial libraries ofanα-helical bacterial receptor domain,Nat Biotechnol1997;15:772-7.Ronmark J,Gronlund H,Uhlen M,Nygren PA,Humanimmunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorialengineering of protein A,Eur J Biochem2002;269:2647-55)。Affibody分子简单、坚实的结构结合其低分子量(6kDa)使其适合于多种应用，例如，作为检测试剂(Ronmark J,Hansson M,Nguyen T,et al,Construction and characterization of affibody-Fcchimeras produced in Escherichia coli,J Immunol Methods2002;261:199-211)以及用于抑制受体相互作用(Sandstorm K,Xu Z,Forsberg G,Nygren PA,Inhibition of the CD28-CD80co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody liganddeveloped by combinatorial protein engineering,Protein Eng2003;16:691-7)。可以通过参考美国专利号5831012获得关于Affibody及其生产方法的进一步的详细内容，该文献通过引用方式全文并入本文。
经标记的Affibody也可用于测定同种型丰度的成像应用中。
DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)是已经被开发用于利用非抗体多肽的结合能力的抗体模拟DRP(设计的重复蛋白)技术的一个实例。重复蛋白(例如锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白)是普遍存在的结合性分子，与抗体不同，其存在于细胞内和细胞外。它们独特的模块架构的特征在于重复性的结构单元(重复)，这些重复性的结构单元堆积在一起以形成延长的、显示出可变和模块靶标结合表面的重复结构域。基于这种模块性，可以产生具有高度多样性的结合特异性的多肽的组合型文库。该策略包括显示可变表面残基的自我相容的重复的共有设计，以及将它们随机组装到重复结构域中。
可以在细菌表达系统中以非常高的产率产生DARPin，它们属于已知的最稳定的蛋白。已经选择了针对多种靶蛋白(包括人类受体、细胞因子、激酶、人类蛋白酶、病毒和膜蛋白)的高特异性、高亲和力的DARPin。可以获得具有单数位nM至pM范围的亲和力的DARPin。
DARPin已被用于广泛的应用中，包括ELISA、夹心式ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组化(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白质印迹。还证明了DARPin在细胞内区室中具有高度活性，例如作为融合至绿色荧光蛋白(GFP)的细胞内标志物蛋白。DARPin还被用于以pM范围内的IC50抑制病毒的进入。DARPin不仅对于阻断蛋白-蛋白相互作用是理想的，而且还抑制酶。已经成功抑制了蛋白酶、激酶和转运蛋白，常常是变构抑制模式。在肿瘤上非常快的和特异性的富集和非常有利的肿瘤与血液的比例使DARPin非常适合于体内诊断或治疗方法。
关于DARPin和其它DRP技术的其它信息可见于美国专利申请公开号2004/0132028和国际专利申请公开号WO02/20565，二者均通过引用方式全文并入本文。
Anticalin是另一种抗体模拟技术，然而在该情况下，结合特异性源自lipocalin，其是在人组织和体液中天然且丰富表达的低分子量蛋白家族。Lipocalin已经进化为在体内执行多种与化学上敏感的或不可溶的化合物的生理学转运和储存相关的功能。Lipocalin具有坚实的内在结构，包含高度保守的β-桶，其在蛋白的1个末端支持4个环。这些环形成进入结合袋的入口，并且分子的该部分中的构象差异解释了单个的lipocalin之间结合特异性的差异。
虽然由保守的β-片层框架支持的高变环的总体结构暗示其是免疫球蛋白，但是lipocalin与抗体在大小方面具有显著差异：其由160-180个氨基酸的单一多肽链组成，其略微大于单一的免疫球蛋白结构域。
克隆了Lipocalin并使它们的环经历工程化以产生Anticalin。已经产生了结构上多样的Anticalin的文库并且Anticalin展示允许选择和筛选结合功能，然后在原核或真核系统中表达并产生可溶性蛋白用于进一步的分析。研究已经成功地表明了可以开发并分离特异于几乎任意人类靶蛋白的Anticalin，并且可以获得nM或更高范围的结合亲和力。
Anticalin也可以被制为双靶向蛋白的形式，即所谓的Duocalin。Duocalin结合使用标准制造方法容易地产生的一个单体蛋白中的两个单独的治疗靶标，并且保持靶标特异性和亲和性，与其两个结合结构域的结构方向无关。
通过单一分子调整多个靶标在已知涉及多于一个单一诱因的疾病中是特别有利的。此外，双或多价结合形式(例如Duocalin)具有靶向疾病中的细胞表面分子、介导对于信号转导途径的激动效应或诱导增强的内吞效应(通过结合并簇集细胞表面受体)的巨大潜力。此外，Duocalin的高内在稳定性与单体Anticalin是相当的，这为Duocalin提供了灵活的配制和递送潜在可能性。
关于Anticalin的其它信息可以见美国专利号7,250,297和国际专利申请公开号WO99/16873，二者均通过引用方式全文并入本文。
用于本发明的情境中的另一种抗体模拟技术是Avimer。Avimer是通过体外外显子改组和噬菌体展示而由人细胞外受体结构域的大家族进化来的，其产生具有结合和抑制特性的多结构域蛋白。已经表明连接多个独立的结合结构域会产生亲和力并产生与常规的单表位结合蛋白相比改进的亲和力和特异性。其它潜在优点包括在大肠杆菌中简单并有效产生多靶标-特异性分子，改进的热稳定性和对于蛋白酶的抗性。已经获得了针对多种靶标的亚nM的亲和力的Avimer。
关于Avimer的其它信息可以见美国专利申请公开号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756，这些文献全部通过引用方式全文并入本文。
Versabody是另一种可用于本发明的情境中的抗体模拟技术。Versabody是具有>15%的半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白，其形成高的二硫化物密度支架，替代通常的蛋白质具有的疏水性核心。将大数目的疏水性氨基酸(构成疏水性核心)替换为小数目的二硫化物导致产生更小的、更加亲水的(更少的聚集和非特异性结合)、对于蛋白酶和热的抗性更高并且具有更低密度的T-细胞表位的蛋白，因为对于MHC呈递贡献最大的残基是疏水性的。公知所有这4个特征影响免疫原性，并且预期它们联合起来会引起免疫原性的大幅降低。
Versabody的启迪来源于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛和银莲花属(anemone)产生的天然的可注射的生物药物，这些药物已知显示出出人预料的低免疫原性。从所选择的天然蛋白家族出发，通过设计并通过筛选尺寸、疏水性，蛋白水解性抗原加工，而使表位密度最小化至远低于天然可注射蛋白的平均水平。
鉴于Versabody的结构，这些抗体模拟物提供了多方面的形式，包括：多价性、多特异性、多种半衰期机制、组织靶向模块以及不存在抗体Fc区。此外，Versabody是在大肠杆菌中以高产率制备的，由于它们的亲水性和小的尺寸，Versabody是高度可溶的并且可以被配制为高浓度。Versabody具有格外的热稳定性(它们可以被煮沸)并且提供延长的保质期。
关于Versabody的其它信息可以见美国专利申请公开号2007/0191272，该文献通过引用方式全文并入本文。
以上提供的关于抗体片段和抗体模拟技术的详细描述不是意在穷举所有的可用于本说明书的情境的技术。例如，并且也不是以限制的方式：有多种其它的技术可被用于本发明的情境中，所述技术包括备选的基于多肽的技术，例如互补决定区的融合，如Qui et al.,NatureBiotechnology,25(8)921-929(2007)(通过引用方式全文并入本文)所概述的；以及基于核酸的技术(例如RNA适体技术，其描述于美国专利号5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774和6,387,620中(全部通过引用方式并入本文))。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或组合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分。此类组合物可以包括一种或组合的(例如两种或更多种不同的)本发明的抗体或免疫缀合物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以包含结合靶抗原上的不同表位或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性物质)的组合。
本发明的药物组合物还能够以组合治疗(即与其它试剂相组合)的方式被施用。例如，组合治疗可包括本发明的抗CDH17抗体，其与至少一种其它抗肿瘤试剂、或者抗炎或免疫抑制试剂组合。可以用于组合治疗的治疗剂的实例在下文中关于本发明的抗体的用途部分有更详细的描述。
如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包被物、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)包被于材料内以保护化合物免受酸和其它可能灭活该化合物的天然条件的作用。
本发明的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持亲本化合物的所需生物学活性并且不赋予任何不希望的毒理学效应的盐(见例如Berge,S.M.,et al.(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生于非毒性无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)的那些，以及衍生自非毒性的有机酸(例如脂肪族单和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的那些。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)的那些，以及衍生自非毒性有机胺(例如N,N'-二苄乙烯二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如维生素C棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明的药物组合物中的适宜的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适宜的混合物；植物油，例如橄榄油；和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。可以例如通过使用包被物质(例如卵磷脂)、通过维持需要的颗粒大小(在分散液的情况下)和通过使用表面活性剂来维持合适的流体性。
这些组合物还可以包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过灭菌程序(见上文)和通过包括多种抗细菌和抗真菌试剂(例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可能需要向组合物中加入等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过加入延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂在药学活性物质中的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂达到与活性化合物不相容的程度，其在本发明的药物组合物中的使用均被考虑到。也可以向组合物中整合补充性活性化合物。
治疗组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌的和稳定的。组合物可以被配制为溶液、微乳液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及适宜的它们的混合物。可以例如通过使用包被物质(例如卵磷脂)，通过维持所需的颗粒大小(在分散液的情况下)和通过使用表面活性剂来维持合适的流体性。在很多情况下，优选使组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可以通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长的吸收。
无菌可注射溶液可以这样制备：将所需量的活性化合物加入到合适的溶剂与一种或组合的上文所列成分(根据需要)中，然后灭菌微过滤。一般地，通过将活性化合物加入到含有基本分散介质和来自上述的所需其它成分的无菌媒介中来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其由之前无菌过滤的溶液产生活性成分的粉末加上任何其它所需的成分。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗的受试者和特定的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量一般是产生治疗效应的组合物的量。一般地，在100％中，此量的范围是大约0.01%至大约99%的活性成分，优选大约0.1%至大约70%，最优选大约1%至大约30%的活性成分与药学上可接受的载体的组合。
将剂量方案调整为提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单一推注，可以在一定时间内施用数次经划分的剂量，或者可以根据治疗状况的紧急性所显示的而按比例减少或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制为单元剂型以便容易施用和用于剂量的均一性。如本文中所使用的，单元剂型是指适合作为用于待治疗的受试者的单元化剂量的物理上不连续的单元；每个单元包含预定量的活性化合物(计算为产生所需的治疗效应)与所需的药学载体相联合。本发明的单元剂型的规格由下列规定并直接依赖于下列：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效应；和(b)组合领域中内在的限制，例如用于治疗个体中的敏感性的活性化合物。
对于抗体的施用，剂量范围为大约0.0001至100mg/kg，更通常是0.01至5mg/kg的宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案使得每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。对于本发明的抗CDH17抗体，优选的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重(通过静脉内施用)，使用下列给药安排之一给予所述抗体：(i)每4周1次共6剂，然后每3个月1次；(ii)每3周1次；(iii)3mg/kg体重1次，然后1mg/kg体重每3周1次。
在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，所施用的每种抗体的剂量均在所表明的范围内。通常多次地施用抗体。单次剂量之间的间隔可以是例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不规律的，如通过测量针对患者中的靶抗原的抗体的血液水平所指明的。在一些方法中，将剂量调整为达到大约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中是大约25-300μg/ml。
备选地，可以以缓释制剂施用抗体，在这种情况下，需要更少频率的施用。剂量和频率根据患者中的抗体的半衰期而变化。一般地，人类抗体显示出最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对不经常的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生持续接受所述处理。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直至减少或终止疾病的进展，优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以按照预防性方案向患者施用。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效达到针对特定患者、组合物和施用模式的所需治疗性应答而对所述患者无毒性的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括所采用的本发明的特定成分或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的特定成分组合使用的其它药物、化合物和/或材料，被处理的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前的医疗史，以及医学领域熟知的其它因素。
“治疗上有效剂量”的本发明的抗CDH17抗体优选引起疾病症状的严重性的降低，无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或防止由于疾病折磨而造成的损害或失能。例如，为了治疗CDH17+肿瘤，“治疗上有效的剂量”优选使细胞生长或肿瘤生长相对于未经治疗的受试者被抑制至少大约20%，更优选至少大约40%，更优选至少大约60%，更优选至少大约80%。可以在预测人类肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。备选地，可以通过测定化合物抑制细胞生长的能力评价组合物的这种性质，此类抑制可以通过本领域技术人员已知的测定法在体外被测量。治疗上有效量的治疗化合物能够减小肿瘤大小，或缓解受试者中的症状。本领域普通技术人员将能够基于例如下列因素来确定所述量：受试者的尺寸(size)、受试者症状的严重性以及特定组合物或所选择的施用途径。
可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径来施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据需要的结果而变化。用于本发明的抗体的优选施用途径包括静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文中所使用的，短语“肠胃外施用”的意思是除了经肠道和表面施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于：静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
备选地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径而被施用，例如表面，表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或表面。
可以使用将保护化合物不会快速释放的载体来制备活性化合物，例如控释制剂，包括移植物、透皮贴和微胶囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的很多方法已经被专利化或者是本领域技术人员通常已知的。见，例如Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可以使用本领域已知的医疗设备来施用治疗组合物。例如，在优选的实施方案中，可以使用无针头的皮下注射设备来施用本发明的治疗组合物，例如公开于美国专利号5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824;或4,596,556中的设备。用于本发明的移植物和模块的熟知的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分散药物的可移植的微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于透过皮肤施用药物的治疗设备；美国专利号4,447,233，其公开了以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于持续性药物递送的可变流可移植输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔隔室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。这些专利通过引用方式并入本文。许多其它此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，可以将本发明的人单克隆抗体配制为确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物穿越BBB(如果需要)，可以将它们配制于例如脂质体中。关于制造脂质体的方法，见例如美国专利4,522,811;5,374,548;和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种被选择性转运到特定细胞或器官、由此增强靶向的药物递送的部分(见，例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括：叶酸或生物素(见，例如Low等人的美国专利5,416,016);甘露糖苷(Umezawa et al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBSLett.357:140;M.Owais et al.(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233:134);p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269:9090);另外见K.Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler(1994)Immunomethods4:273。
用途和方法
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有多种体外和体内的诊断性和治疗性用途，所述用途涉及诊断和治疗CDH17介导的病症。
在一些实施方案中，可以在体外或离体地向培养物中的细胞施用这些分子，或例如体内向人类受试者施用这些分子，以治疗、预防和诊断多种病症。如本文中所使用的，“受试者”意在包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、母牛、马、鸡、两栖类和爬行类。优选的受试者包括具有由CDH17活性介导的病症的人类患者。所述方法特别适合用于治疗具有与异常的CDH17表达相关的病症的人类患者。当与另一种试剂一起施用针对CDH17的抗体时，可以按照任意顺序或同时施用二者。
鉴于本发明的抗体针对CDH17的特异性结合，本发明的抗体可被用于特异性地检测细胞表面上的CDH17的表达，此外，本发明的抗体可被用于通过免疫亲和纯化法纯化CDH17。
此外，鉴于CDH17在肿瘤细胞上表达，本发明的抗体、抗体组合物和方法可被用于治疗具有肿瘤形成性病症的受试者，例如其特征在于存在表达CDH17的肿瘤细胞的病症，包括例如胃癌、胰腺癌或结肠直肠癌。已显示CDH17在抗体结合时被内吞(如下面的实施例10中所示)，因此使得本发明的抗体能够被用于任何有效负荷的作用机制中，例如ADC方法、放射免疫缀合物或ADEPT方法。
在一个实施方案中，本发明的抗体(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可被用于检测CDH17的水平，或在其膜表面上包含CDH17的细胞的水平，所述水平可以与某些疾病症状相关联。备选地，抗体可被用于抑制或阻断CDH17的功能，继而可以与预防或缓解某些疾病症状相关联，从而暗示CDH17是所述疾病的介导者。这可以如下实现：将样品和对照样品与抗CDH17抗体在允许在所述抗体与CDH17之间形成复合物的条件下接触。检测在抗体与CDH17之间形成的任何复合物，并在样品和对照中进行比较。
在另一个实施方案中，最初可以就与体外治疗或诊断用途相关的结合活性测试本发明的抗体(例如人类抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)。例如，可以使用以下实施例中描述的流式细胞术测定法来检测本发明的组合物。
本发明的抗体(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子、免疫缀合物和组合物)在治疗和诊断CDH17相关的疾病中有额外的用处。例如，单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫缀合物可被用于在体内或体外引发一种或多种下列生物学活性：抑制表达CDH17的细胞生长和/或杀死表达CDH17的细胞；在存在人效应子细胞的情况下介导表达CDH17的细胞的吞噬或ADCC；或阻断CDH17配体与CDH17的结合。
在具体的实施方案中，所述抗体(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在体内被用于治疗、预防或诊断多种CDH17相关的疾病。CDH17相关的疾病的实例尤其包括表现出结肠直肠癌的人类癌组织。
适合于在体内和体外施用本发明的抗体成分(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的途径是本领域熟知的，并且可以由本领域普通技术人员选择。例如，可以通过注射(例如静脉内或皮下)施用抗体成分。所使用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和重量以及抗体成分的浓度和/或制剂。
如上文所述，本发明的抗-CDH17抗体可以与一种或多种其它治疗剂(例如细胞毒性试剂、放射毒性试剂或免疫抑制剂)共同施用。抗体可以与试剂(例如免疫复合物)连接或者可以与所述试剂分别施用。在后者的情况下(分别施用)，可以在所述试剂之前、之后或与其并行地施用抗体，或者可以与其它已知的治疗(例如抗癌治疗例如放射)共同施用。此类治疗剂尤其包括抗肿瘤剂，例如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲，它们自身仅在对患者有毒性或亚毒性的水平才有效。以100mg/kg的剂量每4周1次通过静脉内施用顺铂，以60-75mg/ml的剂量每21天通过静脉内施用阿霉素。其它适于与本发明的抗体共同施用的试剂包括其它用于治疗癌症(例如胰腺癌或结肠直肠癌)的试剂，例如
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5FU和吉西他滨。与化疗试剂共同施用本发明的抗CDH17抗体或其抗原结合片段提供了通过不同的机制起作用而对人类肿瘤细胞产生细胞毒性效应的两种抗癌试剂。此类共同施用能够解决由于出现药物抗性或肿瘤细胞的抗原性变化(这会使它们对于抗体无反应)而产生的问题。
靶标特异性效应子细胞(例如与本发明的成分(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)连接的效应子细胞)也可用作治疗剂。用于靶向的效应子细胞可以是人白细胞，例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其它的细胞包括嗜酸细胞、天然杀伤细胞和其它携带IgG-或IgA-受体的细胞。如果需要，可以从待治疗的受试者获得效应子细胞。靶标特异性效应子细胞可以作为生理上可接受的溶液中的细胞的悬浮液而被施用。所施用的细胞的数目可以是108-109的数量级，但是将根据治疗目的而变化。一般地，所述量将足以获得在靶细胞(例如表达CDH17的肿瘤细胞)上的定位，并通过例如吞噬影响细胞杀伤。施用途径也可以变化。
使用靶标特异性效应子细胞的治疗可以与用于去除靶细胞的其它技术联合进行。例如，使用本发明的成分(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)和/或用这些成分装备的效应子细胞的抗肿瘤治疗可与化疗联合使用。另外，组合免疫治疗可被用于将两个不同的细胞毒性效应子群体引向肿瘤细胞排斥。例如，连接于抗-Fc-γRI或抗-CD3的抗CDH17抗体可与IgG-或IgA-受体特异性结合剂联合使用。
本发明的双特异性和多特异性分子还可被用于调节效应子细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面上的受体加帽和清除它们。抗-Fc受体的混合物也可被用于此目的。
也可以在存在补体的情况下使用具有补体结合位点的本发明的成分(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)，所述位点为例如来自IgG1、IgG-2或IgG-3或IgM的结合补体的部分。在一个实施方案中，可以通过加入补体或含补体的血清来补充以本发明的结合剂和合适的效应子细胞对包含靶细胞的细胞群体的离体处理。可以通过补体蛋白的结合来改善使用本发明的结合剂包被的靶细胞的吞噬。在另一个实施方案中，也可以通过补体来裂解用本发明的成分(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞。在另一个实施方案中，本发明的成分不激活补体。
本发明的成分(例如单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)也可以与补体一起施用。在一些实施方案中，本公开物提供了包含抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。当补体位于接近抗体、多特异性或双特异性分子的位置时，这些组合物可以是有利的。备选地，本发明的抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清可以被单独施用。
在本发明范围内的还有包含本发明的抗体成分(例如单克隆抗体、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒。所述试剂盒还可以包含一种或多种另外的试剂，例如免疫抑制试剂、细胞毒性试剂或放射毒性试剂，或一种或多种另外的本发明的抗体(例如具有互补活性的、结合CDH17抗原上的与第一抗体所结合的表位不同的表位的抗体)。
因此，可以向以本发明的抗体成分治疗的患者另外施用(在施用本发明的抗体之前、与之同时或之后)增强或增加抗体的治疗效应的另一种治疗剂(例如细胞毒性试剂或放射毒性试剂)。
在其它实施方案中，可以另外使用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的试剂来处理受试者，例如用细胞因子处理受试者。用于在使用多特异性分子进行处理的过程中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本发明的组合物(例如抗体、多特异性和双特异性分子)也可被用于靶向表达FcγR或CDH17的细胞，例如用于标记此类细胞。对于此类应用，结合剂可以被连接至可以被检测的分子。因此，本发明提供了用于离体或在体外定位表达Fc受体例如FcγR或CDH17的细胞的方法。可检测的标记物可以是例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
在具体的实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的CDH17抗原的存在的方法，或测量CDH17抗原的量的方法，所述方法包括：使特异性结合CDH17的单克隆抗体或其抗原结合部分在允许在抗体或其部分与CDH17之间形成复合物的条件下接触样品和对照样品。然后检测复合物的形成，其中，样品与对照样品相比较，复合物形成的差异表示样品中CDH17抗原的存在。
在其它实施方案中，本发明提供了用于治疗受试者中由CDH17介导的病症的方法，所述病症为例如人类的癌症，包括胃癌、胰腺癌或结肠直肠癌。
在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物可以通过将化合物连接至抗体而被用于将所述化合物(例如治疗剂、标记物、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有CDH17细胞表面受体的细胞。例如，抗CDH17抗体可以被缀合于美国专利号6,281,354和6,548,530，美国专利公开号2003/0050331、2003/0064984、2003/0073852和2004/0087497，或公开于WO03/022806中的任意毒素化合物。因此，本发明还提供了用于离体或在体内定位表达CDH17的细胞的方法(例如使用可检测的标记物，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。备选地，免疫缀合物可以通过将细胞毒素或放射性毒素靶向CDH17而被用于杀死具有CDH17细胞表面受体的细胞。
通过下列实施例进一步阐释了本发明，下列实施例不应被解释为进一步的限制。
本说明书中引用的所有参考文献，包括但不限于所有的论文、公开物、专利、专利申请、展示、文本、报告、书稿、宣传册、书、互联网公布、杂志文章、期刊、产品情况说明书等，在此通过引用方式全文并入本说明书。关于本文的参考文献的讨论仅仅意在总结它们的作者所作出的论断，不是承认任何参考文献构成现有技术，申请人保留对所引用的参考文献的精确性和妥当性提出质疑的权利。
虽然已经通过阐释以及为了清楚理解的目的的实施例的方式对前述发明进行了一定的详细描述，但根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员显而易见的是，可以不脱离随附的权利要求的精神或范围对本发明作出一定的改变和修饰。
实施例1:构建噬菌体展示文库
通过标准重组方法在细菌中产生了由CDH17的细胞外结构域的结构域1-2构成的重组蛋白(SEQ ID NO:22)并将其用作抗原进行免疫(见下文)。还通过标准重组方法真核地合成了由CDH17的全长细胞外结构域构成的重组蛋白(SEQ ID NO:23)并将其用于筛选。
免疫和mRNA分离
如下构建了用于鉴别结合CDH17的分子的噬菌体展示文库。使用弗氏完全佐剂中的100μg蛋白(在第0天)以及100μg抗原(在第28天)，用重组的CDH17抗原(细胞外结构域的结构域1-2)腹膜内免疫A/J小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Me.)。通过眼窝后窦穿刺而获得小鼠的测试取血。如果通过测试滴度，认为所述滴度是高的(通过ELISA，使用通过亲和素固定的生物素化的CDH17抗原(Reacti-BindTMNeutrAvidinTM-包被的聚苯乙烯板，Pierce，Rockford，I11.)，在第70,71和72天用100μg蛋白对小鼠进行加强免疫，随后处死并实施脾切除术(在第77天)。如果认为抗体的滴度不满意，在第56天用100μg抗原对小鼠进行加强免疫并在第63天进行测试取血。如果获得了满意的滴度，在第98、99和100天用100μg抗原对动物进行加强免疫并在第105天收获脾脏。
在层流净化罩中收获脾脏并将其转移到培养皿中，剪掉并丢弃脂肪和结缔组织。通过来自无菌5cc注射器的活塞、在下列的存在下快速浸渍脾脏：1.0ml溶液D(25.0g异硫氰酸胍(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)，29.3ml无菌水，1.76ml0.75M柠檬酸钠pH7.0，2.64ml10%十二烷基肌氨酸钠(Fisher Scientific，Pittsburgh，Pa.)，0.36ml2-巯基乙醇(Fisher Scientific，Pittsburgh，Pa.)。将此脾脏悬浮物推过18规格(gauge)的针头，直至所有的细胞都被裂解，将粘稠的溶液转移到微量离心管中。用100μl溶液D清洗培养皿以回收任何剩余的脾脏。然后将此悬浮物推过22规格的针头另外5-10次。
将样品平分到两个微量离心管中并依次加入下列(每次加入后通过颠倒混合)：50μl2M乙酸钠pH4.0，0.5ml水饱和酚(FisherScientific，Pittsburgh，Pa.)，100μl氯仿/异戊醇49:1(FisherScientific，Pittsburgh，Pa.)。振荡此溶液10秒并在冰上孵育15分钟。在2-8℃、以14krpm离心20分钟后，将水相转移到新鲜的管中。加入同等体积的水饱和酚：氯仿：异戊醇(50:49:1)，将管振荡10秒。在冰上孵育15分钟后，将样品在2-8℃离心20分钟，将水相转移到新鲜的管中并在-20℃用等体积的异丙醇沉淀至少30分钟。于4℃、以14krpm离心20分钟后，将上清液吸走，简短地离心管子并从RNA粒状沉淀中移除所有痕量的液体。
将RNA粒状沉淀各自溶解在300μl溶液D中，相结合，并用等体积的异丙醇在-20℃沉淀至少30分钟。在4℃以14krpm将样品离心20分钟，如同之前一样吸走上清液，用100μl冰冷的70%乙醇漂洗样品。然后，再在4℃以14krpm将样品离心20分钟，吸掉70%乙醇溶液，并在真空使RNA粒状沉淀干燥。将所述粒状沉淀重悬于100μl无菌的、经焦碳酸二乙酯处理的水中。通过A260确定浓度，其中对于40μg/ml的浓度所用的吸光度为1.0。将RNA储存在-80℃。
互补DNA(cDNA)的制备
将如上所述从小鼠脾脏纯化的总RNA直接用作模板来制备cDNA。用无菌水将RNA(50μg)稀释至100μL，并加入10μL130ng/μL的寡核苷酸dT12(在Applied Biosystems Model392DNA合成仪上合成的)。将样品在70℃加热10分钟，然后在冰上冷却。在冰上，加入40μL的5*第一链缓冲液(Gibco/BRL，Gaithersburg，Md.)，以及20μL的0.1M二硫苏糖醇(Gibco/BRL，Gaithersburg，Md.)，10μL的20mM脱氧核苷三磷酸(dNTP's，Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)，以及10μL水。然后将样品在37℃温育2分钟。加入10μL反转录酶(SuperscriptTMII，Gibco/BRL，Gaithersburg，Md.)并继续于37℃温育1小时。将cDNA产物直接用于聚合酶链式反应(PCR)。
通过PCR扩增抗体基因
为了使用PCR扩增基本上所有的H和L链基因，选择了对应于基本上所有已公开的序列的引物。由于H和L的氨基末端的核苷酸序列含有可观的多样性，合成了33种寡核苷酸以作为用于H链的5'引物，并且合成了29种寡核苷酸以作为κL链的5'引物，如1997年4月4日递交的美国专利6,555,310中所描述的。每条链的恒定区核苷酸序列仅需要一种用于H链的3'引物和一种用于κL链的3'引物。
对于每种引物对进行了50μL的反应，其中含有50μmol的5'引物，50μmol的3'引物，0.25μL Taq DNA聚合酶(5单位/μL，Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)，3μL cDNA(如所述制备的)，5μL2mM dNTP's，5μL含有MgC12的10*Taq DNA聚合酶缓冲液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)，以及H2O至50μL。使用GeneAmp(R)9600热循环仪(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)进行扩增，用下列的热循环程序:94℃，1min;30个循环为：94℃20秒，55℃30秒，和72℃30秒;72℃6分钟;4℃。
然后使PCR过程的dsDNA产物经受仅使用3’引物的不对称PCR以基本上仅产生靶基因的反义链。对于每种dsDNA产物进行了100μL的反应，其中含有200μmol的3'引物，2μL的ds-DNA产物，0.5μL Taq DNA聚合酶，10μL的2mM dNTP’s，10μL含有MgCl2的10*TaqDNA聚合酶缓冲液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)，以及H2O至100μL。使用了如上所述的相同的PCR程序来扩增单链(ss)－DNA。
通过高效液相色谱和激酶化单链DNA来纯化单链DNA
通过加入2.5体积的乙醇和0.2体积的7.5M乙酸铵，并在-20℃孵育至少30分钟而乙醇沉淀H链ss-PCR产物和L链单链PCR产物。通过在Eppendorf离心机中于2-8℃、以14krpm离心10分钟而离心DNA粒状沉淀。小心地吸出上清液，简短地第二次将管子离心。用移液管移除最后一滴上清液。在真空中以中热使DNA干燥10分钟。将H链产物汇集到210μL水中并将L链产物另外汇集到210μL水中。通过高效液相色谱(HPLC)纯化单链DNA，使用的是Hewlett Packard 1090HPLC和Gen-PakTMFAX阴离子交换柱(Millipore Corp.，Milford，Mass.)。用于纯化单链DNA的梯度显示在表1中，炉温为60℃。在260nm处监测吸光度。从HPLC洗脱的单链DNA以0.5分钟的级分被收集。对含有单链DNA的级分进行乙醇沉淀，如上文所述进行粒状沉淀并干燥。将经干燥的DNA粒状沉淀汇集到200μL无菌水中。
表1-用于纯化ss-DNA的HPLC梯度
缓冲液A是25mM Tris，1mM EDTA，pH8.0
缓冲液B是25mM Tris，1mM EDTA，1M NaCl，pH8.0
缓冲液C是40mm磷酸
对单链DNA进行5'磷酸化准备用于诱变。向每个样品中加入24μL10*激酶缓冲液(United States Biochemical，Cleveland，Ohio)，10.4μL的10mM腺苷5'三磷酸(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)和2μL多核苷酸激酶(30单位/μL，UnitedStates Biochemical，Cleveland，Ohio)，将管子在37℃温育1小时。通过将管子在70℃温育10分钟而停止反应。通过用Tris平衡的酚(pH>8.0，United States Biochemical，Cleveland，Ohio):氯仿:异戊醇(50:49:1)提取一次并且用氯仿:异戊醇(49:1)提取一次而纯化DNA。提取之后，如上文所述用乙醇沉淀DNA并且对其进行粒状沉淀。干燥DNA粒状沉淀，然后将其溶解于50μL无菌水中。通过在260nm处测量DNA等份的吸光度而确定浓度，所使用的是对于33μg/ml的吸光度为1.0。将样品储存在-20℃。
制备用于产生脾脏抗体噬菌体文库的尿嘧啶模板
在250ml的振荡培养瓶中，将1ml大肠杆菌CJ236(BioRAD，Hercules，Calif.)的过夜培养物加入50ml2*YT中。使培养物在37℃生长至OD600=0.6，接种10μl的BS45载体噬菌体储液(描述于1997年4月4日递交的美国专利6,555,310中)的1/100稀释物并继续培养6小时。于4℃、以12krpm将大约40ml培养物离心15分钟。将上清液(30ml)转移到新鲜的离心管中并在加入15μl的10mg/ml的RNaseA(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.)后，在室温温育15分钟。通过加入7.5ml的20%聚乙二醇8000(FisherScientific，Pittsburgh，Pa.)/3.5M乙酸铵(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)并在冰上孵育30分钟而沉淀噬菌体。于2-8℃、以12krpm将样品离心15分钟。小心地弃去上清液，并简短地离心管子以移除所有痕量的上清液。将粒状沉淀重悬于400μl的高盐缓冲液(300mM NaCl，100mM Tris pH8.0，1mM EDTA)中，并转移到1.5ml的管中。
用等体积的经平衡的酚:氯仿:异戊醇(50:49:1)重复提取噬菌体储液直至不可见白色交界的痕迹，然后用等体积的氯仿:异戊醇(49:1)提取。使用2.5体积的乙醇和1/5体积的7.5M乙酸铵，并在-20℃孵育30分钟而使DNA沉淀。在4℃、以14krpm将DNA离心10分钟，用冷的70%乙醇清洗粒状沉淀一次，并在真空中干燥。将尿嘧啶模板DNA溶解在30μl无菌水中并通过A260确定浓度，使用的是对于40μg/ml的浓度吸光度为1.0。用无菌水将模板稀释至250ng/μL，等分并存储在-20℃。
以ss-DNA诱变尿嘧啶模板并电穿孔到大肠杆菌中以产生抗体噬菌体文库
通过同时将单链重链基因和轻链基因引入噬菌体展示载体尿嘧啶模板中而生成抗体噬菌体展示文库。典型的诱变是以2μg的规模通过将下列在0.2ml的PCR反应管中混合而进行的:8μl(250ng/μL)尿嘧啶模板，8μL的10*退火缓冲液(200mM Tris pH7.0，20mM MgCl2，500mM NaCl)，3.33μl的激酶化单链重链插入物(100ng/μL)，3.1μl的激酶化单链轻链插入物(100ng/μL)，和无菌水至80μl。在GeneAmp(R)9600热循环仪中使用下列热配置使DNA退火:94℃下20秒，85℃60秒，在30分钟中从85℃斜降至55℃，在55℃保持15分钟。程序结束后将DNA转移至冰上。如下进行延伸/连接：加入8μl的10*合成缓冲液(5mM的每种dNTP，10mM ATP，100mM Tris pH7.4，50mM MgCl2，20mM DTT)，8μL T4DNA连接酶(1U/μL，BoehringerMannheim，Indianapolis，Ind.)，8μL经稀释的T7DNA聚合酶(1U/μL，New England BioLabs，Beverly，Mass.)，并在37℃孵育30分钟。用300μL的诱变停止缓冲液(10mM Tris pH8.0，10mM EDTA)使反应停止。诱变DNA用经平衡的酚(pH>8):氯仿:异戊醇(50:49:1)提取一次、用氯仿:异戊醇(49:1)提取一次，并且用乙醇在-20℃使DNA沉淀至少30分钟。如上文所述，使DNA粒状沉淀并小心地移除上清液。简短地再次离心样品并且用自动移液器(pipetman)移除所有痕量的乙醇。使粒状沉淀在真空干燥。将DNA重悬于4μL无菌水中。
使用电穿孔，将1微升诱变DNA(500ng)转移到40μl电感受态大肠杆菌DH12S(Gibco/BRL，Gaithersburg，Md.)中。将经转化的细胞与大约1.0ml的过夜XL-1细胞混合，用2*YT培养液将其稀释到60%的原始体积。然后将此混合物转移到15ml的无菌培养管中，并加入9ml的上层琼脂用于在150mm LB琼脂板上铺板。将板在37℃温育4小时，然后转移至20℃过夜。如下制备第一轮的抗体噬菌体：在10ml的2*YT中将噬菌体从这些板上洗脱下来，离心出碎片并取上清液。这些样品是用于选择抗CDH17抗体的抗体噬菌体展示文库。如下测量电穿孔的效率：将10μl的悬浮细胞的10-4稀释物涂布在LB琼脂板上，然后在37℃过夜孵育。通过用10-4稀释板上的噬斑数目乘以106计算效率。通常，在这些条件下，文库电穿孔效率高于1*107噬菌体。
通过电穿孔转化大肠杆菌
在冰上融化电感受态大肠杆菌细胞。通过轻轻上下吹吸细胞2-3次而将DNA与40L的这些细胞混合，小心不要引入气泡。将细胞转移到在冰上经冷却的基因脉冲杯中(0.2cm间隙，BioRAD，Hercules，Calif.)，同样小心不要在转移中引入气泡。将所述杯置于大肠杆菌脉冲发生器中(BioRAD，Hercules，Calif.)并根据生产商的推荐用设置为1.88kV的电压进行电穿孔。将经转化的样品立即重悬于1ml的2*YT培养液或1ml的400μl2*YT/600μl过夜XL-1细胞的混合物中，如所示的程序进行处理。
将经抗体噬菌体-展示载体诱变反应转化的M13噬菌体或细胞涂板。
在无菌的15ml培养管中，将噬菌体样品加入200μL的大肠杆菌XLl蓝的过夜培养物中(当在100mm LB琼脂板上涂布时)或加入600μL的过夜细胞中(当在150mm板上涂布时)。加入LB上层琼脂后(3ml用于100mm平板或9ml用于150mm平板，上层琼脂被储存在55℃(见Appendix Al，Sambrook et al，见上文))，混合物在LB琼脂板上均匀地分布，所述平板经过预热(37℃-55℃)以去除琼脂表面上任何过量的水分。在室温使平板冷却直至上层琼脂固化。将平板反转并如所示的在37℃温育。
制备生物素化的CDH17和生物素化的抗体
将浓缩的重组CDH17抗原(全长细胞外结构域)广泛透析到BBS(20mM硼酸盐，150mM NaCl，0.1%NaN3，pH8.0)中。透析后，使1mg CDH17(1mg/ml在BBS中)与15倍摩尔过量的生物素-XX-NHS酯(Molecular Probes，Eugene，Oreg.，储液为40mM在DMSO中)反应。将反应在室温下孵育90分钟，然后用终浓度为20mM的牛磺酸(SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo.)使反应结束。然后使生物素化的反应混合物在2-8℃对于BBS透析。透析之后，将生物素化的CDH17在淘选缓冲液(panning buffer)(40mM Tris，150mM NaCl，20mg/ml BSA，0.1%Tween20，pH7.5)中稀释，分成等份，并储存于-80℃直至需要。
利用位于重链羧基末端的自由半胱氨酸使抗体与3-(N-顺丁烯二酰亚氨基丙酰)生物胞素(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)反应。通过加入终浓度为1mM的DTT使抗体在室温被还原30分钟。使经还原的抗体通过Sephadex G50脱盐柱(在50mM磷酸钾、10mM硼酸，150mMNaCl，pH7.0中平衡的)。加入3-(N-顺丁烯二酰亚氨基丙酰)生物胞素，终浓度为1mM，并允许反应在室温进行60分钟。然后使样品对于BBS广泛透析并储存于2-8℃。
制备抗生物素蛋白磁性乳胶
使磁性乳胶(Estapor，10%固体，Bangs Laboratories，Fishers，Ind.)充分重悬并将2ml等分到15ml锥形管中。将磁性乳胶悬浮于12ml蒸馏水中并利用磁铁(PerSeptive Biosystems，Framingham，Mass.)使其与溶液分离10分钟。当用磁铁保持磁性乳胶的分离时，用10ml的无菌移液管将液体小心地移除。再重复此清洗过程3次。最后的清洗之后，将乳胶重悬于2ml蒸馏水中。在单独的50ml锥形管中，将10mg抗生物素蛋白-HS(亲和素，Pierce，Rockford，I11.)溶解到18ml的40mM Tris，0.15M氯化钠，pH7.5(TBS)中。振荡时，将2ml清洗过的磁性乳胶加入经稀释的抗生物素蛋白-HS中，将混合物再混合30秒。将此混合物在45℃孵育2小时，每30分钟摇动一次。使用磁铁将抗生物素蛋白磁性乳胶从溶液中分离并如上文所述用20ml BBS清洗3次。最后一次清洗之后，将乳胶重悬于10ml BBS中并储存在4℃。
临使用之前，使抗生物素蛋白磁性乳胶在淘选缓冲液(40mM Tris，150mM NaCl，20mg/ml BSA，0.1%Tween20，pH7.5)中平衡。将淘选实验所需的抗生物素蛋白磁性乳胶(200μl/样品)加入无菌的15ml离心管中并用淘选缓冲液加至10ml。将所述管子在磁铁上放置10分钟以分离乳胶。如上文所述，用10ml无菌的移液管将溶液小心地移除。将磁性乳胶重悬于10ml淘选缓冲液中以开始第二次清洗。用淘选缓冲液总共清洗磁性乳胶3次。最后一次清洗后，将乳胶重悬于淘选缓冲液中至初始体积。
实施例2:选择抗CDH17抗原的重组多克隆抗体
从噬菌体展示文库中选择特异性结合CDH17的结合试剂，所述噬菌体展示文库是如实施例1中所述从超免疫小鼠中产生的。
淘选
如实施例1中所述，使用BS45尿嘧啶模板来制备第一轮抗体噬菌体。进行诱变DNA的电穿孔，从而产生源自不同的经免疫小鼠的噬菌体样品。为了在重组多克隆文库中产生更多的多样性，对于每个噬菌体样品单独进行淘选。
在用生物素化的CDH17抗原进行第一轮功能性淘选之前，通过用7F11-磁性乳胶进行淘选(如美国专利6,555,310的实施例21和22中所描述的)，就在其表面上展示重链和轻链的噬菌体选择抗体噬菌体文库。原则上，如美国专利6,555,310的实施例16中所描述的，对这些富集的文库进行功能性淘选。具体地，将10μL的l*10-6M生物素化的CDH17抗原加入噬菌体样品中(CDH17的终浓度为大约l*10-8M)，并且允许混合物在2-8℃过夜达到平衡。
在达到平衡后，用抗生物素蛋白磁性乳胶淘选样品以捕获结合CDH17的抗体噬菌体。将经平衡的抗生物素蛋白磁性乳胶(实施例1)，以200μL乳胶/样品与噬菌体一起在室温孵育10分钟。10分钟之后，向每个噬菌体样品中加入大约9ml淘选缓冲液，并利用磁铁将磁性乳胶从溶液中分离。在分离10分钟之后，使用10ml的无菌移液管小心地移除未结合的噬菌体。然后将磁性乳胶重悬于10ml的淘选缓冲液中以开始第二次清洗。如上文所述对乳胶一共清洗三次。对于每一次清洗，使管子与磁铁接触10分钟以将未结合的噬菌体与磁性乳胶分离。在第三次清洗后，将磁性乳胶重悬于1ml的淘选缓冲液中并转移到1.5mL的管中。对于每一种样品，收集全部体积的磁性乳胶并重悬于200μl2*YT中，且如实施例1中所述涂板于150mm的LB平板上以扩增结合的噬菌体。将平板在37℃温育4小时，然后在20℃温育过夜。
将用于扩增结合的噬菌体的150mm平板用于产生下一轮的抗体噬菌体。在过夜温育之后，通过将10mL的2*YT培养基移液到菌苔上并在室温下轻轻摇动平板20分钟，而从150mm平板上洗脱第二轮抗体噬菌体。然后将噬菌体样品转移到15ml带有塞子密封盖的可丢弃无菌离心管中，通过以3500rpm将管子离心15分钟而沉淀来自LB板的碎片。然后，将含有第二轮抗体噬菌体的上清液转移到新的管中。
通过在15ml的可丢弃无菌离心管中，将100μL的每种噬菌体储液稀释到900μL的淘选缓冲液中而设置第二轮的功能性淘选。然后，如对于第一轮淘选所描述的，将生物素化的CDH17抗原加入每个样品中，并在室温下将噬菌体样品温育1小时。然后如上文所述，用抗生物素蛋白磁性乳胶淘选噬菌体样品。此时，如下监控淘选的进展：将每一个乳胶样品的等份涂板到100mm LB琼脂板上以确定κ阳性的百分比。将来自每次淘选的大多数乳胶(99%)涂板到150mm的LB琼脂板上以扩增结合到乳胶上的噬菌体。在37℃将所述100mm的LB琼脂板温育6-7小时，之后将平板转移到室温并将硝化纤维素滤器(孔大小0.45mm，BA85Protran，Schleicher and Schuell，Keene，N.H.)覆盖到噬斑之上。
将带有硝化纤维素滤器的平板在室温过夜温育，然后用山羊抗-小鼠κ碱性磷酸酶缀合物显色(develop)以如下文所述确定κ阳性的百分比。在用大约2*10-9M的生物素化的CDH17抗原、于2-8℃过夜进行第三轮功能性淘选之前，使在群体中含有较低百分比(<70%)的κ阳性的噬菌体样品经历一轮用7Fl1-磁性乳胶进行的淘选。同样就κ阳性监测此轮淘选。汇集具有大于80%的κ阳性百分比的单个噬菌体样品并使其经历在2-8℃、以5*10-9M CDH17过夜进行的最后一轮淘选。将包含在来自此第四轮功能性淘选的被洗脱的噬菌体内的抗体基因亚克隆到表达载体pBRncoH3中。
亚克隆的过程一般性地如美国专利6,555,310的实施例18中所描述的进行。亚克隆之后，将表达载体电穿孔到DHl0B细胞中并使混合物在含有1%的甘油和10μg/ml四环素的2*YT中过夜生长。在第二轮生长和在四环素中选择之后，将细胞等份冷冻在-80℃，作为用于产生CDH17多克隆抗体的来源。通过将混合物样品涂板在含有10μg/ml四环素的LB琼脂板上并筛选识别CDH17的抗体，而从这些多克隆混合物中选择单克隆抗体。
表达和纯化抗CDH17的重组抗体
在设置为37℃、300rpm的Innova4330培养摇床(New BrunswickScientific，Edison，N.J.)中、从-70℃的细胞库过夜产生摇瓶接种物。将此接种物用于接种20L的发酵罐(Applikon，Foster City，Calif.)，所述发酵罐含有确定的培养基(Pack et al.(1993)Bio/Technology11:1271-1277)，其中补充了3g/L的L-亮氨酸，3g/L的L-异亮氨酸，12g/L酪蛋白消化物(Difco，Detroit，Mich.)，12.5g/L甘油和10μg/ml四环素。将发酵罐的温度、pH和溶解的氧分别控制在26℃、6.0-6.8和25%饱和。通过加入聚丙二醇(Dow，Midland，Mich.)而控制泡沫。以补料批次的方式将甘油加入发酵罐中。通过在对数生长晚期加入L(+)-阿拉伯糖(Sigma，St.Louis，Mo.)至2g/L而诱导Fab的表达。通过UV-1201分光光度计(Shimadzu，Columbia，Md.)中600nm处的光密度来测量细胞密度。在运行终止以及将pH调整至6.0后，使培养物以17000psi两次通过M-210B-EH Microfluidizer(Microfluidics，Newton，Mass.)。细胞的高压均质化将Fab释放到培养物上清液中。
纯化中的第一步是扩展的床固定化金属亲和色谱(EB-IMAC)。使StreamlineTM螯合树脂(Pharmacia，Piscataway，N.J.)负荷0.1MNiCl2，然后在以向上的方向流动的50mM乙酸盐，200mM NaCl，10mM咪唑，0.01%NaN3，pH6.0的缓冲液中使其扩展并平衡。使用储液来使培养物匀浆达到10mM咪唑，然后在平衡缓冲液中将其稀释两倍或更多倍以将湿的固体含量减少到少于5%按重量。然后将其加载到Streamline柱上，其中以300cm/hr的表面速度在向上的方向上流动。细胞碎片不受阻碍地通过，但是Fab介由镍与Fab重链上六组氨酸标签之间的高亲和力相互作用而被捕获。清洗之后，扩展的床被转化为填充床并且用以向下的方向流动的20mM硼酸盐，150mM NaCl，200mM咪唑，0.01%NaN3，pH8.0的缓冲液洗脱Fab。
纯化的第二步使用离子交换色谱(IEC)。在20mM硼酸盐，37.5mMNaCl，0.01%NaN3，pH8.0中平衡Q琼脂糖FastFlow树脂(Pharmacia，Piscataway，N.J.)。将来自EB-IMAC步骤的Fab洗脱集合在20mM硼酸盐，0.01%NaN3，pH8.0中稀释4倍并加载到IEC柱上。清洗后，用37.5-200mM NaCl的盐梯度洗脱Fab。在汇集之前，用Xcell IITMSDS-PAGE系统(Novex，San Diego，Calif.)评估洗脱级分的纯度。最后，将Fab集合浓缩并透析过滤到20mM硼酸盐，150mM NaCl，0.01%NaN3，pH8.0的缓冲液中用于储存。这是通过配以10,000MWCO盒(Sartorius，Bohemia，N.Y.)的Sartocon SliceTM系统实现的。最终的纯化产率通常为50%。通过280nm处的UV吸光度来测量经纯化的Fab的浓度，假设对于1mg/ml溶液的吸光度为1.6。
实施例3:选择抗来自肿瘤膜制备物的CDH17抗原的抗体
针对肿瘤膜制备物进一步筛选在实施例2中选择的抗体以分离优先结合癌细胞上而非正常肠上皮细胞上的CDH17的抗体。
使用来自配对的结肠直肠癌和正常临近组织样品的生物素化的质膜制备物，用抗生物素蛋白磁性乳胶淘选噬菌体样品以如实施例2中所述捕获结合CDH17的抗体噬菌体。通过筛选优先结合结肠直肠癌细胞上而非正常肠上皮细胞上的CDH17的抗体而从这些多克隆混合物中选择抗体。然后如实施例4中所述将这些抗体分离并分析其与CDH17的结合。
实施例4:从重组多克隆抗体混合物中选择抗CDH17的单克隆抗体
通过将混合物的稀释样品涂板在含有10μg/ml四环素的LB琼脂板上而从含有重组多克隆混合物(实施例3)的克隆中分离抗CDH17的单克隆抗体。然后，使用表面等离激元(BIACORE)(BIACORE，Uppsala，Sweden)，就产生识别重组CDH17的抗体的能力测试单个集落。使用Ni-螯合物批次结合法(见下文)来实现这些单克隆抗体的小规模生产。由此方法分离的抗体被1:3稀释于HBS-EP(0.01M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005%聚山梨酯20(v/v)中，用偶联至BIACORE CM5传感芯片的山羊抗-小鼠κ抗体(SouthernBiotechnology Associates，Inc，Birmingham，Ala.)捕获，并就其结合重组CDH17的能力进行测试。
通过Ni-螯合物批次结合法少量制备单克隆抗体
从重组多克隆混合物中(实施例3)分离单个的集落并将其用于接种3ml的2*YT培养基，所述2*YT培养基含有1%甘油并补充以10μg/ml的四环素。使这些培养物在设置为37℃、300rpm的Innova4330培养摇床(New Brunswick Scientific，Edison，N.J.)中生长。第二天早上将0.5ml的每种培养物用于接种含有50ml确定培养基(Pack etal.(1993)Bio/Technology11:1271-1277)的摇瓶，所述培养基中补充以3g/L L-亮氨酸，3g/L L-异亮氨酸，12g/L酪蛋白消化物(Difco，Detroit，Mich.)，12.5g/L甘油和10μg/ml四环素。在37℃、以300rpm将这些培养物摇动直至在600nm处达到4的光密度。然后通过加入L(+)-阿拉伯糖(Sigma，St.Louis，Mo.)至2g/L并将温度移至23℃并过夜摇动而诱导Fab的表达。第二天将下列加入50ml培养物中:0.55ml的1M咪唑，5ml B-PER(Pierce，Rockford，I11.)和2ml Ni-螯合树脂(螯合琼脂糖FastFlowTM树脂Pharmacia，Piscataway，N.J.)。在23℃、以300rpm将混合物摇动1小时，之后停止摇动并允许树脂沉降到烧瓶的底部15分钟。
然后倒掉上清液并将树脂重悬于40ml含有10mM咪唑的BBS(20mM硼酸盐，150mM NaCl，0.1%NaN3，pH8.0)中。将此悬浮液转移到50ml锥形管中并用含有10mM咪唑的BBS一共清洗树脂3次。清洗伴随着低速离心(1100rpm，1分钟)，移除上清液和将树脂重悬于含有10mM咪唑的BBS中。在倒掉最后一次清洗的上清液后，向每一管中加入0.5ml的1M咪唑，简短振荡，并转移到无菌微量离心管中。然后以14krpm将样品离心1分钟并将上清液转移到新的微量离心管中。然后使用BIACORE(BIACORE，Uppsala，Sweden)就与CDH17的结合分析上清液中含有的抗体。
实施例5:通过流式细胞仪分析确定的单克隆抗体对于CDH17的特异性
通过流式细胞仪检测实施例4中所选择的抗CDH17的抗体的特异性。为了测试抗体结合细胞表面CDH17蛋白的能力，将抗体与下列表达CDH17的细胞孵育:LoVo和LS174T，人结肠直肠癌细胞系。在PBS中清洗和重悬细胞。将4微升悬浮物应用到8孔显微镜载玻片的孔中并允许其空气干燥。轻微地加热载玻片以将涂片固定至载玻片并覆盖以0.1mg/ml的抗体(在含有1%BSA的PBS中稀释)。在37℃、用抗体将涂片在保湿室中温育1小时。在通过每次于PBS中浸泡5分钟而清洗载玻片三次之后，用异硫氰酸荧光素缀合的兔抗-小鼠IgG(H&L)F(ab')2(Zymed Laboratories，Inc.，South San Francisco，Calif.)覆盖所述涂片，所述异硫氰酸荧光素缀合的兔抗-小鼠IgG(H&L)F(ab')2以1:80被稀释于PBS，1%BSA，0.05%Evans Blue(Sigma)中。于37℃、在保湿室中将载玻片温育1小时，然后如上所述进行清洗。最后一次在去离子水中清洗后，允许载玻片在黑暗中空气干燥。用90%甘油封固剂(含有10mg/ml对苯二胺)，pH8.0封固盖玻片。
图30显示CDH17_A4和对照抗体在不同的抗体浓度下对LoVo细胞的结合。流式细胞术分析的结果还显示，称为CDH17_A4的单克隆抗体和对照抗体有效地结合细胞表面人CDH17(图31)。
实施例6:抗CDH17单克隆抗体的结构表征
通过使用标准PCR技术获得了编码单克隆抗体CDH17_A4的重链和轻链可变区的cDNA序列，并使用标准的DNA测序技术对其进行了测序。
抗体序列可被诱变以在一个或多个残基处回复至种系残基。
CDH17_A4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1和SEQ ID NO:9和7中。
CDH17_A4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2和SEQ ID NO:10和8中。
CDH17_A4重链免疫球蛋白序列与已知的鼠种系免疫球蛋白重链序列的比较显示，CDH17_A4重链使用了来自鼠种系VHII区域VH105和VHII基因H17的VH区段。使用Kabat的CDR区决定系统进一步分析CDH17_A4VH序列，使得划出了重链CDRl，CDR2和CDR3区域，其显示于图1以及分别显示于SEQ ID NOs:1、2和3中。CDH17_A4CDRl VH序列与种系VHII基因H17序列的比对显示在图3a中并且CDH17_A4CDR2VH序列与种系VHII区域VH105的比对显示于图3b中。
CDH17_A4轻链免疫球蛋白序列与已知的鼠种系免疫球蛋白轻链序列的比较显示，CDH17_A4轻链使用了来自鼠种系VK8-30的VK区段。使用Kabat的CDR区决定系统进一步分析CDH17_A4VK序列，使得划出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区域，其显示于图2以及分别显示于SEQID NOs:4、5和6中。CDH17_A4CDR1、CDR2和CDR3VK序列与种系VK8-30序列的比对分别显示在图3c、3d和3e中。
实施例7:使用抗CDH17抗体在FFPE切片上进行的免疫组织化学
使用CDH17_A4抗-CDH17抗体在结肠直肠肿瘤和正常的临近组织的FFPE切片上进行免疫组织化学。
EX-De-Wax来自BioGenex，CA，USA。组织切片和阵列来自Biomax，MD，USA。
在50ml Falcon中、在水浴中无缓冲液时将载玻片于60℃加热2小时。每个Falcon具有一张载玻片或两张背对背的载玻片，其中两张载玻片之间有长的胶加载头以防止载玻片彼此粘结。在黑色的载玻片架上、在EZ-DeWax中将载玻片去石蜡化5分钟，然后使用1ml的移液管用相同的DeWax溶液好好冲洗，然后用洗瓶中的水冲洗。将载玻片置于装入了水的科普林氏缸中直至准备好加压蒸煮器；更换几次水。
将水更换为抗原回收溶液=1x柠檬酸盐缓冲液，pH6(DAKO)。通过加压蒸煮器法回收抗原。将塑料科普林氏缸内抗原回收溶液中的载玻片置于加压蒸煮器内，然后将所述加压蒸煮器加热至位置6(最高的设置)。温育15-20分钟后，将温度降低至位置3并使其在此位置(当加压蒸煮器内的温度为117℃时)再停留20-25分钟。然后将炉架(hob)关上并将加压蒸煮器置于冷的炉架上,并且通过将小心地将手柄移至“开放”和“关闭”之间的位置而释放压力。使整个系统释放压力并再冷却20分钟。打开盖子并将样品取出放置于台子上。用PBS-3T(0.5L PBS+3滴Tween-20)清洗载玻片1x5min，且置于PBS中。
回收抗原之后，在Shandon盖板系统中封固载玻片。通过将盖板置于装有PBS的科普林氏缸中并轻轻地将带有组织切片的载玻片滑入盖板中而防止在载玻片与塑料盖板之间捕捉到气泡。使载玻片与盖板紧紧结合而将载玻片拉出科普林氏缸。将经组装的载玻片置于架内，使被捕捉到漏斗中以及载玻片与盖板之间的PBS流过。用2x2ml(获4x1ml)PBS-3T，1x2ml PBS清洗载玻片，等待直到所有的PBS都流过载玻片并且实质上没有PBS留在漏斗中。
使用1-4滴过氧化物溶液/载玻片进行内源性过氧化物封闭;温育时间是5分钟。用水冲洗载玻片，然后用2ml PBS-3T冲洗一次，用2ml PBS冲洗一次;重要的是在加入新的一部分冲洗缓冲液之前，等待直至实质上没有液体留在漏斗中。
用抗体稀释试剂(DAKO)稀释一抗。最佳的稀释被确定为是1:400。向每张载玻片应用至多200μl经稀释的一抗并且在室温下温育45分钟。用2x2ml(或4x1ml)PBS-3T然后用1x2ml PBS清洗载玻片。
以2x2滴/载玻片应用山羊抗小鼠κHRP二抗(1mg/ml，cat.1050-05，Southern Biotech)并在室温温育35分钟。如上所述清洗载玻片。
在稀释缓冲液中制备DAB底物;包含2滴底物的2ml对于10张载玻片是足够的。通过一次施用几滴并放置10分钟而将DAB试剂施用到载玻片上。用1x2ml(或2x1ml)PBS-3T和1x2ml(或2x1ml)PBS清洗载玻片。
施用苏木精(DAKO)，1ml对于10张载玻片是足够的，并在室温下将载玻片温育1分钟。将Shandon盖板系统的漏斗装入2ml水并使其流过。当载玻片没有过量的苏木精时，拆开系统，用来自洗瓶的水清洗组织切片和/或阵列并置于黑色的载玻片架中。通过在EZ-DeWax中温育5分钟、然后在95%乙醇中温育2-5分钟而使组织脱水。
使载玻片在室温下在台子上干燥，然后在封固剂中封固并用盖玻片覆盖。
对于抗体CDH17_A4进行的免疫组织化学分析显示出在所有的情形中，对于结肠直肠癌中的肿瘤细胞有特异性的膜染色而对于正常的临近组织没有可感知到的染色。抗体CDH17_A4显示出对于肿瘤细胞的清楚的特异性膜染色。
实施例8:使用抗CDH17抗体在冷冻切片上的免疫组织化学
使用抗CDH17抗体CDH17_A4对冷冻配对的肿瘤和正常临近组织进行免疫组织化学。
组织切片来自BioChain Institute Inc.，CA，USA。
用PBS清洗冷冻切片两次，每次3分钟，然后置于PBS中。
使用过氧化物酶封闭剂(S2001,DAKO)进行对内源性过氧化物的封闭。向每张载玻片上加入1-4滴过氧化物酶封闭剂并且温育5分钟。用3ml PBS冲洗载玻片3次。
用抗体稀释试剂(DAKO)稀释一抗。向每张载玻片施用150μl经稀释的一抗并在室温下温育45分钟。用PBS-3T(500ml PBS+3滴Tween-20)清洗载玻片两次3分钟，然后用PBS清洗一次3分钟。
以1:1000施用山羊抗小鼠κHRP二抗(1mg/ml，cat.1050-05，Southern Biotech)并在室温下温育35分钟。如上文所述清洗载玻片。
在稀释缓冲液中制备DAB底物;包含2滴底物的2ml对于10张载玻片是足够的。通过一次施用几滴并温育10分钟而将DAB试剂施用到载玻片上。将载玻片用PBS-3T清洗一次3分钟和用水清洗两次，3分钟。
施用苏木精(DAKO)，1ml对于10张载玻片是足够的，并在室温下将载玻片温育1分钟。
使载玻片在室温下在台子上干燥，然后在基于水的封固剂(来自Vector)中封固并用盖玻片覆盖。
在三个结肠直肠癌样品以及配对的正常临近组织样品上对于抗体CDH17_A4的免疫组织化学分析显示出，对于结肠直肠癌中肿瘤细胞的强的特异性膜染色和对于正常临近组织的一些弱的染色。抗体CDH17_A4显示出对于肿瘤细胞的清楚的特异性膜染色。
实施例9:抗CDH17抗体的内吞作用
免疫荧光显微测定显示出，在与细胞结合后，CDH17_A4被LoVo细胞内吞。免疫荧光显微测定通过与异硫氰酸荧光素缀合的抗人IgG二抗(GamK-FITC)的结合显示出抗CDH17单克隆抗体的内吞。首先，CDH17_A4结合到LoVo细胞的表面。然后，与异硫氰酸荧光素缀合的二抗结合到一抗上。接下来，CDH17_A4/二抗FITC缀合物复合物被细胞内吞。
如下进行免疫荧光显微测定。将LoVo细胞在37℃下温育12小时，使细胞彼此粘附。系列稀释CDH17_A4和与异硫氰酸荧光素缀合的二抗，用FACS缓冲液(PBS，2%FBS)清洗，然后加入培养基中。然后用FACS缓冲液(PBS，2%FBS)再次清洗培养基并以37%温育，然后加入200μl2%PFA。使用9μl水性封固剂封固盖玻片然后使用莱卡荧光显微镜以有规律的时间间隔观察细胞。图6a和图6b显示出60分钟的温育之后CDH17_A4/二抗FITC缀合物复合物与LoVo细胞的表面结合以及120分钟后CDH17_A4/二抗FITC缀合物复合物的内吞。
使用MabZap测定显示了单克隆抗体CDH17_A4在与细胞结合后被LS147T和LoVo细胞内吞。MabZAP测定通过与毒素皂草素缀合的抗人IgG二抗(Advanced Targeting System，San Diego，CA，IT-22-100)的结合而显示出抗CDH17单克隆抗体的内吞。首先，CDH17_A4结合到LS147T和LoVo细胞的表面。然后，MabZAP抗体与一抗结合。接下来，MabZAP复合物被细胞内吞。皂草素进入细胞引起蛋白质合成的抑制并最终引起细胞死亡。
如下进行MabZAP测定。以5x103细胞/孔的密度接种每种细胞。系列稀释抗CDH17单克隆抗体或同种型对照人IgG，然后加入细胞。然后以50μg/ml的浓度加入MabZAP并允许将平板温育48和72小时。通过发光细胞存活测定试剂盒(Promega，G7571)检测平板中的细胞存活，并且用Luminomitor(Tuner BioSystems，Sunnyvale，CA)在490nM处读取平板。用Prism(Graphpad)分析数据。细胞的死亡与CDH17_A4和单克隆抗体的浓度成比例。图8a和8b显示，抗CDH17单克隆抗体相较于抗人IgG同种型对照抗体分别被LS174T和LoVo细胞高效地内吞。
实施例11:CDH17_A4的人源化
为了设计CHD17_A4VH和VL的人源化序列，使用三维模型鉴定对于CDR结构的形成是重要的框架氨基酸。与CHD17_A4具有高源性的人VH和VL序列也选自GenBank数据库。在CDR区中对CHD17进行赖氨酸置换，从而产生两个用于人源化的序列。一个序列包含赖氨酸，称为‘CDH17_A4_4K’(SEQ ID No:26和31)，一个序列不具有赖氨酸置换，称为‘CDH17_A4_4R’(SEQ ID No:44和46)。使用标准方法将CDR序列与鉴定的框架氨基酸残基一起从CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R移植至人框架序列并且进行表达。图9和10显示CDH17_A4的重链和轻链与人种系的比对。
实施例12:使用CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R的免疫组织化学
通过使用下列参考方案，使用CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R对FFPE肿瘤和正常组织进行免疫组织化学。
材料和方法
EnVision plus试剂盒(K4006and K4010)来自DAKO,CA,USA。
EZ-De-Wax来自BioGenex,CA,USA。
组织切片和阵列来自Biomax,MD,USA。
脱蜡和再水化
在无缓冲液的情况下，将载玻片于50ml Falcon中在水浴中于60℃下加热2小时。每一个Falcon具有一张载玻片或两张背靠背的载玻片(在其之间置有长凝胶上样尖头，以防止载玻片彼此粘在一起)。将载玻片在黑色载玻片架(slide rack)中于EZ-DeWax中进行脱蜡，进行5分钟，随后使用1ml移液器利用相同DeWax液充分漂洗，然后用水充分漂洗。将载玻片置于充满水的科谱林氏缸中直至准备好高压蒸锅；更换水数次。
抗原修复
将水更换成抗原修复液=1x柠檬酸盐缓冲液，pH6(DAKO)。通过微波法修复抗原。将塑料科普林氏缸中的抗原修复液中的载玻片置于800W微波炉中，随后以满功率加热直至抗原修复液沸腾。随后使抗原修复液在低功率下徐沸，再进行10分钟，然后从微波炉取出塑料科普林氏缸，将其冷却至室温，再进行另外20分钟。打开盖子，将样品取出放在台子。用PBS-3T(0.5L PBS+3滴Tween-20)洗涤载玻片1次(5分钟)，将载玻片置于PBS中。
染色
使用与EnVision plus试剂盒一起提供的溶液进行内源过氧化物封闭。从科普林氏缸取出载玻片，擦掉组织周围的PBS。通过将载玻片向一侧倾斜并且用纸巾浸沾积聚在组织切片边缘的PBS液滴来除去组织顶上的过量PBS。将过氧化物溶液滴盖在整个组织上。当利用过氧化物覆盖封闭所有样品时，将时间设置至5分钟。用水漂洗载玻片，随后用PBS-3T漂洗1次(5分钟)，然后用PBS漂洗1次(5分钟)。随后将它们置于科普林氏缸中的PBS中。用抗体稀释试剂(DAKO)将一抗稀释至20μg/ml的最佳浓度。从载玻片擦除过量的PBS，取出组织切片。将50-200μl的稀释的一抗施加至每一张切片和/或组织微阵列；小心地覆盖整个组织。轻轻叩打载玻片以将抗体均匀地分布在切片上方或在切片顶部上方使用吸管端(pipette tip)。将载玻片在室温下于湿盒中温育45分钟。用PBS漂洗除去抗体，并在台子上处理载玻片，或将其架在Shandon Coverplate系统中。通过将盖板置于充满PBS的科普林氏缸中并且轻轻地将具有组织切片的载玻片滑入盖板来防止载玻片与塑料盖板之间的气泡。将载玻片拉出科普林氏缸，同时使其与盖板紧密地保持在一起。将组合的载玻片置于支架内，让PBS流过。用PBS-3T洗涤载玻片2次，每次2ml(或4次，每次1ml)，用PBS洗涤1次，每次2ml，随后等待直至所有PBS都已通过载玻片，以及确实没有PBS留在漏斗中。将二抗(相应的过氧化物酶聚合物)施用至载玻片上(2次，每次每载玻片2滴)，在室温下温育35分钟。随后如上洗涤载玻片。在稀释缓冲液中制备DAB底物；2ml(包含2滴底物)足以用于10张载玻片。通过一次施加数滴将DAB试剂施用于载玻片。将载玻片温育10分钟。随后用PBS-3Tl洗涤载玻片1次，每次2ml(或2次，每次1ml)，然后用PBS洗涤1次，每次2ml(或2次，每次1ml)，直至所有PBS流过载玻片并且确实无PBS留在漏斗中。随后施用苏木精(DAKO)(1ml足以用于10张载玻片)，将载玻片在室温下温育1分钟。用2ml的水充满漏斗，并且让水流过。当清除载玻片上过量的苏木精后，拆卸系统，用水洗涤组织切片和/或阵列，将其置于黑色载玻片架中。在EZ-DeWax中进行5分钟；随后在95%乙醇中进行2-5分钟。使载玻片干燥，随后在封固剂中进行封固，然后盖上盖玻片。
结果
免疫组织化学分析显示，在结肠直肠癌和胃癌中CDH17被两种抗体CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R特异性染色。在高放大倍数下，癌细胞很明显地显示质膜中的染色。此外，CDH17_A4_4K或CDH17_A4_4R对CDH17的染色强度没有下降，这表明此类抗体可具有作为这类癌症和显示CDH17的表达的其它癌症类型的治疗剂和诊断剂的效用。
实施例13:通过流式细胞术分析测定的抗CDH17的人源化单克隆抗体的特异性
通过流式细胞术测试实施例11中选择的抗CDH17抗体的特异性。为了测试抗体结合细胞表面CDH17蛋白的能力，将抗体与表达CDH17的细胞：LoVo，人结肠直肠癌细胞系一起温育。在PBS中洗涤和悬浮细胞。将4微升悬浮物施加至8孔显微镜载玻片的孔中，使其风干。将载玻片略微加热以将涂片固定至载玻片，随后用0.1mg/ml的在含有1%BSA的PBS中稀释的抗体进行覆盖。将涂片在湿盒中于37℃下用抗体温育1小时。在通过浸渍在PBS中而洗涤载玻片3次(每次5分钟)后，用以1:80稀释于PBS,1%BSA,0.05%伊文思蓝(Sigma)中的缀合有荧光素异硫氰酸酯的兔抗-小鼠IgG(H&L)F(ab')2(Zymed Laboratories,Inc.,SouthSan Francisco,Calif.)覆盖涂片。将载玻片在湿盒中于37℃温育1小时，随后如上所述进行洗涤。在于去离子水中进行最终的洗涤后，使载玻片在黑暗中风干。使用含有10mg/ml对-苯二胺,pH8.0的90%的甘油封固剂封固盖玻片。
图12显示在不同抗体浓度下CDH17_A4和对照抗体对LoVo细胞的结合。流式细胞术分析的结果还显示，称为CDH17_A4的人源化单克隆抗体和对照抗体有效地结合细胞表面人CDH17。
实施例14:人源化抗-CDH17抗体的内吞
通过使用HumZAP测定，已显示，人源化单克隆抗体CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R，在与细胞结合后，被LS147T和LoVo细胞内吞。HumZAP测定通过缀合至毒素皂草素的抗-人IgG二抗的结合显示抗-CDH17单克隆抗体的内吞。(Advanced Targeting System,San Diego,CA,IT-22-100)。首先，CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R都结合至LoVo细胞的表面。然后，HumZAP抗体结合至一抗。然后HumZAP复合物被细胞内吞。皂草素至细胞的进入导致蛋白质合成的抑制并最终导致细胞死亡。
如下进行HumZAP测定。以5x103个细胞/孔的密度接种每一种细胞。连续稀释抗-CDH17单克隆抗体或同种型对照人IgG，随后将其添加至细胞。随后以50μg/ml的浓度添加HumZAP，使平板温育48和72小时。利用
Figure BDA00003070674101031
Luminescent细胞存活测定试剂盒(Promega,G7571)检测板中的细胞存活，并且用Luminomitor(Tuner BioSystems，Sunnyvale，CA)在490nM处读取平板。用Prism(Graphpad)分析数据。细胞的死亡与CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R以及单克隆抗体的浓度成比例。图13a显示抗CDH17单克隆抗体，相较于抗人IgG同种型对照抗体，被LoVo细胞高效地内吞。图13b显示抗CDH17单克隆抗体，相较于抗人IgG同种型对照抗体，被SNU-1细胞高效地内吞。
实施例15:Flag标记的人CDH17和食蟹猴CDH17的HEK293瞬时转染的FACS分析
将人CDH17和食蟹猴CDH17转染入HEK293以测试实施例11中选择的人源化抗-CDH17单克隆抗体的交叉反应性。
对于每一种抗原，制备2个混合物(参见表2)，将其在室温下温育5分钟。随后将用于每一种抗原的混合物1和2一起添加，并且再次在室温下温育另外10分钟。
表2.Flag标记的抗原的转染混合物
Figure BDA00003070674101032
然后从两个单独的HEK293细胞的T175培养瓶(在转染前一天铺板的，处于30至50%的靶汇合度)除去生长培养基，并用上述两种混合物进行替换。随后将这两个培养瓶在室温下温育4小时，之后用生长培养基替换用于每一种抗原的两个单独的脂质/Optimem/DNA混合物。
2天后，将装有两个单独的抗原构建体的两个培养瓶以1100xg瞬时离心(spin down)，随后吸取上清液并将其贮存。然后将余下的细胞重悬浮于0.005M EDTA中，进行5分钟，以取下粘附于培养瓶的贴壁细胞。
随后将所述细胞与来自瞬时离心的上清液的细胞组合，用FACS缓冲液进行漂洗，随后将其二次瞬时离心，然后重悬浮于FACS缓冲液，随后以约150,000个细胞/孔添加至FACS板。
将人源化单克隆抗体CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R与细胞一起在冰上温育1小时，随后用冷FACS缓冲液洗涤2次，重悬浮于100ul FACS缓冲液/孔。将二抗以1ug/ml的浓度与山羊抗-小鼠H+L PE(SouthernBiotech)(对于抗-flag和小鼠同种型对照)和山羊抗-人H+L PE(Southern Biotech)(对于人同种型对照)一起添加。随后将平板温育1小时，然后用FACS缓冲液洗涤3次，将其重悬浮于150ul FACS缓冲液/孔。随后添加50ul4%的多聚甲醛以固定细胞，然后将平板在4℃下贮存过夜。随后在Guava EasyCyte流式细胞仪HT plus上运行样品，使用Guava Cytosoft软件套分析数据。
结果显示，2种人源化单克隆抗体，CDH17_A4_4K和CDH17_A4_4R都结合人CDH17和食蟹猴CDH17(图14a和14b)，这显示了这两种抗体在人与食蟹猴CDH17同源物之间的交叉反应性。这些结果显示，食蟹猴可用于毒理学模型。
序列表
Figure BDA00003070674101041
Figure BDA00003070674101071
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Figure IDA00003070674900221
Figure IDA00003070674900231

Claims (13)

1.一种特异性结合钙粘素-17的分离的抗体，其包含:
a)包含下列的重链可变区:
i)含有与SEQ ID NO:46具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:47具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第二CDR;
iii)含有与SEQ ID NO:48具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第三CDR；和
b)包含下列的轻链可变区:
i)含有与SEQ ID NO:49具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:50具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第二CDR；和
iii)含有与SEQ ID NO:51具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列的第三CDR。
2.权利要求1所述的分离的抗体，其中:
(a)重链框架区包含与SEQ ID NO:26具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列；和/或
(b)轻链框架区包含与SEQ ID NO:31具有至少85%的序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1-2的任一项中所述的分离的抗体，其中所述抗体选自全长抗体、抗体片段、单链抗体、双特异性抗体、迷你抗体、结构域抗体、合成的抗体和抗体融合物，以及其片段。
4.权利要求1-3的任一项中所述的分离的抗体，其中所述抗体还包括Fc结构域，优选其中所述Fc结构域为人的或变异的人Fc结构域。
5.权利要求1-4的任一项中所述的分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求1-5的任一项中所述的分离的抗体，其中所述抗体包含或缀合于治疗性部分，优选细胞毒素、药物或放射性毒素。
7.权利要求1-6的任一项中所述的分离的抗体，其中所述抗体引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
8.一种药物组合物，其包含任选地与药学上可接受的载体一起的权利要求1-7的任一项中所述的抗体。
9.权利要求1-7的任一项中所述的抗体或权利要求8中所述的药物组合物，其用作药剂或用于治疗或诊断。
10.一种治疗或预防与钙粘素17相关的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的权利要求1至7的任一项中所述的分离的抗体。
11.权利要求10中所述的方法，其中所述疾病为癌症。
12.权利要求11中所述的方法，其中所述癌症选自胃癌、胰腺癌和结肠癌。
13.一种治疗胃癌、胰腺癌或结肠癌的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的特异性结合钙粘素-17(CDH17)的分离的抗体，所述抗体包含:
a)包含下列的重链可变区:
i)含有与SEQ ID NO:36具有至少80%的同一性的序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:2具有至少82%的同一性的序列的第二CDR;
iii)含有与SEQ ID NO:39具有至少90%的同一性的序列的第三CDR；和
b)包含下列的轻链可变区:
i)含有与SEQ ID NO:4具有至少80%的同一性的序列的第一CDR;
ii)含有与SEQ ID NO:40具有至少90%的同一性的序列的第二CDR；和
iii)含有与SEQ ID NO:41具有至少90%的同一性的序列的第三CDR。
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