CN103529204B - 检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，制备试剂盒的方法及其应用。该试剂盒由乳胶凝集颗粒，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，载玻片和刻度吸管组成；采用该试剂盒检测奶牛是否患乳房炎，方法简便快速，特异性强，灵敏度高，不需要仪器设备，适合于基层兽医检测。

Description

检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒

技术领域

本发明涉及动物疫病检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种检测奶牛无乳链球菌抗体的试剂盒及试剂盒在无乳链球菌抗体检测中的应用。

技术背景

长期以来，奶牛乳房炎一直是影响奶牛养殖业发展与奶制品食品安全的头号疾病，此病易得、易复发、难治、难根除。我国现有奶牛群中，临床乳房炎发病率达9.7%～55.6%，隐性乳房炎阳性率达到61.03%～79.62%（冯万宇等，生物制剂在奶牛乳房炎防治中的应用，畜牧兽医杂志，2010，4:31-33）。引起奶牛乳房炎的病原菌中，无乳链球菌所占比例较大。国内学者的调查结果显示，我国因无乳链球菌引起的奶牛乳房炎约占总发病率的20%～40%（李宏胜等，奶牛乳房炎病原菌区系分布及发病规律研究，动物医学进展，2005，26（6）：146-149）。因此，控制无乳链球菌的传播和感染是奶牛乳房炎防控的重要内容之一。

无乳链球菌为革兰氏阳性球菌，无荚膜，无鞭毛，直径0.5～1.0μm，是引起牛和羊的急性、慢性乳房炎的最常见病原菌（陆承平，兽医微生物学（第三版），北京：中国农业出版社，2001：208～209）。为了预防和控制奶牛乳房炎，国内多家单位相继开发了含有无乳链球菌成分的奶牛乳房炎疫苗（李宏胜等，奶牛乳房炎多联疫苗的研制及应用，中国农学通报（2005年专刊）：151～156；杨定兴等，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法：中国，CN201010547036[P].2010-12-28.），为奶牛乳房炎的防控提供了有效的武器。虽然国内已有奶牛乳房炎疫苗，但是对于疫苗免疫效果的评价，特别是免疫后抗体水平监测，尚缺乏简便快速的检测技术。这导致免疫是否合格、是否需要加强免疫等情况无法快速查明，给奶牛乳房炎的防控带来了不便。

目前，已有针对奶牛无乳链球菌的病原学检测技术，如生化鉴定、PCR和乳胶法（胡瑞萍等，无乳链球菌检测及其奶牛乳腺炎防治的研究进展，中国兽药杂志，2008,42（6）：54-57），但对于该菌的抗体检测方法，则只报道有ELISA检测方法（张捷等，间接ELISA检测奶牛乳房炎疫苗保护效果方法的建立，中国奶牛，2009，11：38-41；郎景民等，牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立，中国预防兽医学报，2011，33（1）：37-40）。ELISA方法检测抗体耗时较长，仅检测过程就花费2小时以上，且需要借助酶标仪等设备，因此该方法在临床使用上受到一定限制。乳胶凝集法由于迅速、简单和无须专门的技能和仪器设备而具有巨大的优势，适合基层推广。

研究表明无乳链球菌表面有许多保守性蛋白，具有良好的免疫原性（沈定树等，无乳链球菌表面蛋白的研究进展，中国微生态学杂志，2007，19（5）：472～473）。目前建立的奶牛无乳链球菌抗体检测方法均以菌体总蛋白或大肠杆菌表达的蛋白作为抗原。菌体总蛋白成分复杂，针对性不强，容易导致建立的检测方法特异性下降；从大肠杆菌中纯化表达的抗原成本高，且抗原活性难以保证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，该试剂盒能在不借助任何仪器设备的情况下快速检测奶牛血清中的无乳链球菌抗体，简单实用。

本发明的另一个目的是无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒在检测奶牛无乳链球菌抗体中的应用以及乳胶凝集试剂盒在奶牛乳房炎疫苗免疫抗体检测中的应用。

本发明的另一个目的是提供无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒检测奶牛乳房炎的方法。

本发明的另一个目的是提供无乳链球菌cvcc1886菌株在检测奶牛乳房炎中的应用。

本发明公开了一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，该试剂盒包括a)乳胶凝集颗粒，b)阳性对照血清，c)阴性对照血清，d)样品稀释液，e)载玻片和刻度吸管，其特征在于：a)乳胶凝集颗粒为无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒，b)阳性对照血清是无乳链球菌表面抗原免疫的奶牛产血清，c)阴性对照血清是未免疫的奶牛产血清；其中的无乳链球菌是cvcc1886菌株。

本发明公开了无乳链球菌表面抗原的制备方法，无乳链球菌表面抗原通过下列步骤制备：

(1)将无乳链球菌CVCC1886株接种于含5%胎牛血清的TSB培养基中，37℃恒温振荡培养；

(2)离心收集菌体，用由10mMTris，1mMEDTA，pH值8.0组成的TE缓冲液重悬；

(3)超声波破碎，5000转/分离心15min，上清液再超速离心，收集沉淀，用含1.5%triton-X100的TE缓冲液重悬，室温放置30min使之溶解；

(4)加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃下沉淀2小时；

(5)离心收集蛋白质沉淀，用TE缓冲液重悬，装入透析袋中透析3天，其间更换透析液3次；

(6)收集透析后的蛋白溶液，测定无乳链球菌表面抗原浓度，并浓缩到2mg/mL蛋白浓度，得无乳链球菌表面抗原。

本发明还公开了无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒制备方法，无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒通过下列步骤制备：

(1)无乳链球菌表面蛋白用BBS稀释至蛋白含量为600μg/mL，逐滴加入到等体积预处理的2%空白胶乳中，边滴加边摇动，使其充分混匀；

(2)置于25℃恒温箱中静置3小时；

(3)逐滴加入10%牛血清蛋白（BSA）至终浓度为1%，充分混合均匀后，再置于37℃恒温箱中静置30min；

(4)6000转/分离心15min，弃上清，沉淀用BBS重悬得无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒。

本发明公开了无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒在检测奶牛无乳链球菌抗体中的应用。

本发明公开了无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒检测奶牛乳房炎的方法，该方法包括下列步骤：

(1)采集奶牛静脉血液，室温放1小时，分离血清；

(2)滴加10微升待检血清样品，加入等体积的乳胶凝集试剂，用牙签搅拌均

匀，摇动30秒后观察结果，同时设置阳性血清和阴性血清作为对照；

（3）出现50%及以上的乳胶凝集现象时，即判为阳性结果，否则判为阴性。

本发明公开了无乳链球菌cvcc1886菌株在检测奶牛乳房炎中的应用。

本发明中的无乳链球菌标准株CVCC1886株登载于中国国家兽医微生物菌种保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。

本发明中，乳胶凝集试剂也叫乳胶凝集颗粒。

本发明公开的试剂盒中的乳胶凝集试剂，按下列步骤制备：

A、提取无乳链球菌表面蛋白抗原，方法如下：

(1)将无乳链球菌标准株（CVCC1886株，购自国家兽医微生物菌种保藏中心接种于含5%胎牛血清的TSB培养基中，37℃恒温振荡培养约6小时。

(2)离心收集菌体，用TE缓冲液（10mMTris，1mMEDTA，pH值8.0）重悬。

(3)超声波破碎，5000转/分离心15min，收集上清液。

(4)超速离心，收集沉淀，用含1.5%triton-X100的TE缓冲液重悬，室温放置30min使之溶解。

(5)加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃下沉淀2小时。

(6)离心收集蛋白质沉淀，用TE缓冲液重悬，装入透析袋中透析3天，其间更换透析液3次。

(7)收集透析后的蛋白溶液，用紫外分光光度计测定蛋白浓度，并浓缩到2mg/mL蛋白浓度。

(8)将抗原分装在1.5ml离心管里，置－20℃冻存备用。

B、制备乳胶颗粒悬浮液，方法如下：

(1)将10%的空白胶乳用pH值8.2的BBS（硼酸缓冲液）稀释至2%，并加入终浓度为1%的胰蛋白酶，充分混匀。

(2)放入50℃恒温水浴锅中静置12小时，其间应摇动5～6次。

(3)取出，6000转/分离心15min，沉淀用BBS洗涤2次，最后用BBS重悬至浓度为2%，4℃贮存备用。

C、抗原致敏乳胶颗粒，方法如下：

(1)将制备的无乳链球菌表面蛋白用BBS稀释至蛋白含量为600μg/mL，逐滴加入到等体积的上述乳胶颗粒悬浮液中，边滴加边摇动，使其充分混匀。

(2)混合物置于25℃恒温箱中静置3小时。

(3)逐滴加入10%牛血清蛋白（BSA）至终浓度为1%，充分混合均匀后，再置于37℃恒温箱中静置30min。

(4)取出，6000转/分离心15min，弃上清，沉淀用BBS重悬至离心前的体积。

(5)最后室温放置1小时，即为乳胶凝集试剂，贮存于4℃。

上述乳胶凝集试剂盒在检测奶牛无乳链球菌抗体中的应用，其步骤是：

(1)采集奶牛血液，室温放1小时，离心分离血清；

(2)滴加10微升待检血清样品，加入等体积的乳胶凝集试剂，用牙签搅拌均匀，摇动30秒后观察结果。同时设阳性对照血清和阴性对照血清。

(3)出现50%及以上的乳胶凝集现象时，即判为阳性结果，否则判为阴性。

本发明提供的奶牛无乳链球菌抗体检测试剂盒可以对血清样品中的无乳链球菌抗体进行定性检测。若样品中含有无乳链球菌抗体，则在2分钟内出现明显的凝集现象，即可判为阳性；如果样品中不含无乳链球菌抗体，则在2分钟内不会出现明显的凝集，即判为阴性。本试剂盒也可以通过检测稀释后的血清样品来判断血清的抗体效价。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.不需要酶标二抗，能同时检测IgG和IgM抗体，特异性、灵敏度高。

2.检测时间短，2分钟即可出结果。

3.检测过程不需要任何仪器设备，简单易行，适合于基层兽医人员和奶牛养殖户使用，且检测成本低。

4）无乳链球菌cvcc1886菌株抗原特异性强，通过提取无乳链球菌表面蛋白作为抗原，以聚苯乙烯乳胶作为载体，建立了检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集方法并制备试剂盒。本试剂盒方法快速、简便，2～3分钟即可得出结果，特异性强，灵敏度高，且不需要借助仪器设备，适合于兽医临床应用。

附图说明

图1是无乳链球菌表面抗原与全菌抗原活性的Dot-blotting检测图

A表示无乳链球菌表面抗原的Dot-blotting检测，效价可达1:320

B表示无乳链球菌全菌抗原的Dot-blotting检测，效价为有1:80

图2是试剂盒检测阳性对照样品和阴性对照样品的结果图

A表示实验阳性结果

B表示实验阴性结果

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1无乳链球菌表面抗原的提取

(1)将无乳链球菌cvcc1886接种于含5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）中，37℃恒温振荡培养约6小时。

(2)10000转/分离心5min离心收集菌体，用预冷的TE缓冲液（10mMTris，1mMEDTA，pH值8.0）重悬。

(3)超声波破碎，5000转/分离心15min，收集上清液。

(4)上清液在4℃下18000转/分超速离心90min，收集沉淀，用少量含1.5%triton-X100的TE缓冲液重悬，室温放置30min使之溶解。

(5)加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃下沉淀2小时。

(6)4℃下12000转/分离心30min收集蛋白质沉淀，用TE缓冲液重悬，装入透析袋中透析3天，其间更换透析液3次。

(7)收集透析后的蛋白溶液，测定蛋白浓度。用紫外分光光度计测定样品在280nm和260nm波长时的光吸收值（OD），按公式1.45×OD_280nm－0.74×OD_260nm计算蛋白浓度，并浓缩到2mg/mL蛋白浓度。

(8)将蛋白抗原分装在1.5ml离心管里，置－20℃冻存备用。

实施例2表面抗原活性的Dotblotting检测

用Dotblotting（朱材忠等，斑点印迹法检测抗-Jo-1抗体的临床研究.海南医学，2010,21（21）：3-5.）检测表面抗原的活性。将提取的表面抗原（浓度为600μg/ml）倍比稀释，取不同稀释度的抗原3μl点样于硝酸纤维素膜上，置37℃温箱中干燥30分钟。浸泡在封闭液（含1%BSA的PBST）中，37℃恒温箱中封闭30分钟，放PBST中洗涤2次。加1:20稀释的牛无乳链球菌阳性对照血清，37℃放置30分钟，PBST洗涤2次。加羊抗牛IgG-HRP，37℃放置30分钟。震荡洗涤3次，每次3分钟。滴加底物液(DAB-H₂O₂)显色。以出现明显棕色斑点判为阳性。设置相同浓度的无乳链球菌超声波破碎抗原（菌体总蛋白）作为对照。结果表明提取的表面抗原效价达到1:320，显示斑点明显；相同浓度的超声波抗原效价只能达到1:80，1:160稀释时显色模糊不清（结果见图2）。

实施例3阳性、阴性对照血清的制备

将提取的无乳链球菌表面抗原浓缩到2mg/mL，与等量的弗氏佐剂乳化。颈部肌肉注射的方式免疫奶牛，每次注射5ml，间隔15天后再免疫一次，共免疫3次。首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化，以后的加强免疫采用弗氏不完全佐剂乳化。血清抗体效价达到1:要求后，颈静脉采血，离心分离血清。采血并用本乳胶凝集方法检测抗体效价。抗体效价达到1:64时，用真空采血管采集颈静脉血，离心分离血清，按1000U/mL加入青霉素和链霉素，0.22μm滤膜除菌，作为阳性对照。

选择未免疫过无乳链球菌疫苗且抗体检测为阴性的健康奶牛，颈静脉采血并分离血清，按1000U/mL加入青霉素和链霉素，用0.22μm滤膜过滤除菌，作为阴性对照。

实施例4无乳链球菌抗体乳胶凝集检测方法的建立

（1）乳胶颗粒悬浮液的配制

将10%的聚苯乙烯乳胶用pH值8.2的BBS（硼酸缓冲液，即0.05mol/L硼砂溶液350ml兑0.2mol/L硼酸溶液650ml）稀释至2%，并加入终浓度为1%的胰蛋白酶，充分混匀。放入50℃恒温水浴锅中静置12小时，其间应摇动5～6次。取出，6000转/分离心15min，沉淀用BBS洗涤2次，最后用BBS重悬至浓度为2%，置于4℃贮存备用。

（2）最佳致敏浓度的确定

采用方阵滴定法确定抗原的最佳致敏浓度。在1ml2%的乳胶悬浮液中，加入等体积不同浓度的无乳链球菌表面抗原，从200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml递增至1200μg/ml，于25℃恒温水浴锅中放置2小时，然后加入终浓度为1%的牛血清白蛋白封闭。用致敏后的乳胶分别检测阳性对照血清，以能与最高稀释倍数的阳性对照血清发生凝集反应的抗原浓度作为抗原最佳致敏浓度。结果显示，在抗原浓度在600μg/ml以上时，致敏效果最好，检测阳性对照血清能达到最高效价。具体结果见表1。

表1最佳致敏浓度的确定

注：出现50%及以上的乳胶凝集现象时，即判为阳性结果，否则判为阴性。

（3）最佳致敏时间的选择

在确定最佳致敏浓度的基础上，改变在25℃恒温水浴锅中作用的时间，经检测阳性对照血清的效价确定最佳致敏时间。经试验发现，乳胶与抗原作用3小时时，达到最佳致敏效果，检测阳性对照血清的效价最高。具体结果见表2。

表2最佳致敏时间的确定

（4）最适封闭剂的选择

在确定最佳致敏浓度和致敏时间基础上，分别用1%的卵清白蛋白（OVA）、1%的牛血清白蛋白（BSA）、1%的人血清白蛋白（HSA）和0.5%的酪蛋白（CS）作为封闭剂，检测致敏后乳胶的封闭效果。经试验发现，BSA和HAS封闭效果最好。考虑到BSA容易获得，且价格便宜，选用BSA作为封闭剂。具体结果见表3。

表3最佳封闭剂的选择

（5）最佳致敏温度的选择

在确定以上最佳致敏条件的基础上，分别在10℃、25℃、37℃、56℃下进行致敏，经检测阳性对照血清的效价确定最佳致敏时间。经试验发现，乳胶在25℃和37℃条件下致敏效果最好。因较低温度致敏对蛋白稳定性有利，选择25℃最为最佳致敏温度。具体结果见表4。

表4最佳致敏温度的选择

（6）乳胶凝集试剂稳定性试验

将乳胶凝集试剂分别于37℃和4℃环境中，测定乳胶凝集试剂的稳定性。其中37℃下放置3天，4℃下放置6个月。取出摇匀，观察有无自凝现象，并检测阴性、阳性对照血清，对比放置前后血清效价的变化。结果表明，37℃环境中放置3天或4℃下放置6个月，乳胶试剂没有发生自凝现象，其检测效果没有受到影响，稳定性较高。具体结果见表5。

表5乳胶凝集试剂的稳定性试验

(7)抗体检测方法的建立

a、将10%的空白胶乳用pH值8.2的BBS稀释至2%，并加入终浓度为1%的胰蛋白酶，充分混匀。

b、放入50℃恒温水浴锅中静置12小时，其间应摇动5～6次。

c、将无乳链球菌表面蛋白抗原用BBS（pH值8.2）稀释至蛋白含量为600μg/mL，逐滴加入到等体积2%已预处理的空白胶乳中，边滴加边摇动，使其充分混匀。

d、混合物置于25℃恒温箱中静置3小时。

e、逐滴加入10%牛血清蛋白（BSA）至终浓度为1%，充分混合均匀后，再置于37℃恒温箱中静置30min。

f、取出，6000转/分离心15min，弃上清，沉淀用BBS重悬至离心前的体积。

g、最后室温放置1小时，即为乳胶凝集试剂，贮存于4℃备用。

h、采集奶牛静脉血，室温放置1小时，离心分离血清。

i、分别取10μl待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清滴加于载玻片上，各加入等体积的乳胶凝集试剂，搅拌混匀并摇动30秒，于黑色背景下观察反应结果。

j、结果判定：检测样品出现50%及以上的乳胶凝集现象时，即判为阳性结果，否则判为阴性。试验成立的前提条件是：检测阳性对照血清100%凝集，检测阴性对照血清无凝集现象。

实施例5特异性试验

用该方法检测金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)免疫牛血清、大肠杆菌阳性血清、牛布氏杆菌病阳性血清、牛口蹄疫阳性血清、新生牛血清以及阴性、阳性对照血清，结果表明除阳性对照血清检测为阳性以外，其余血清均为阴性，表明该检测方法具有良好的特异性。结果见表6。

表6乳胶凝集法的特异性测试

备注：“++++”表示全部胶乳凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+++”表示大部分胶乳凝集，颗粒明显，液体稍混浊；“++”表示约50%胶乳凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“+”表示有少许凝集，液体混浊；“–”表示液滴呈原有均匀乳状。以出现“++”及以上凝集者判为阳性。

实施例6敏感性试验

将3份无乳链球菌免疫牛的血清倍比稀释，分别用乳胶凝集法进行检测，结果显示3份血清的效价均能达到1:64，说明该方法有较高敏感性。结果见表7。

表7乳胶凝集法的敏感性测试

实施例7试剂盒的组装

按照上述已建立的方法制备乳胶凝集试剂、阳性对照血清、阴性对照血清，配制BBS缓冲液作为血清稀释液。所有液体试剂用小瓶分装，盖上瓶盖。试剂盒组分包括：（1）乳胶凝集试剂，（2）阳性对照血清和阴性对照血清（3）血清稀释液（4）载玻片（5）10ul刻度吸管。

实施例8乳胶凝集抗体检测试剂盒的检验

试剂盒的阴阳性对照血清做无菌检验，应无菌；试剂盒的敏感性和特异性检验按实施例5和实施例6中的方法进行；试剂盒在4℃下放置6个月，每隔1个月检测一次阴阳性血清的效价，验证试剂盒的稳定性。结果显示：过滤除菌后的阴阳性对照血清无菌生长；试剂盒组装后检测血清样品，敏感性和特异性良好；在6个月的保存期内，检测阴阳性血清的效价没有发生变化，说明试剂盒具有较好的稳定性，具体见表8。

表8试剂盒的稳定性检验

实施例9乳胶凝集试剂盒方法与ELISA检测方法的比较

用该检测方法与ELISA检测方法（张捷，2009）同时检测20份无乳链球菌疫苗免疫牛血清和20份未免疫牛血清，对比两种方法的符合率。结果发现，两种方法符合率达95%。乳胶凝集试剂盒检测20份免疫牛血清均为阳性，检测20份未免疫牛血清均为阴性，检测结果与血清的免疫背景完全相符；间接ELISA法检测20份免疫牛血清均为阳性，检测20份未免疫牛血清出现2份阳性，其余为阴性（见表9）。这说明该乳胶凝集试剂盒方法具有与ELISA检测方法相当的敏感性，同时具有更高的特异性。

表9乳胶凝集试剂盒和ELISA的符合试验

实施例10：乳胶凝集抗体检测试剂盒在兽医临床检测中的应用

1乳胶凝集抗体检测试剂盒的应用方法

(a)采样与检测

采集待检奶牛尾静脉血，室温放1小时，分离血清；用刻度吸管吸取10μl待检血清样品滴于载玻片上，加入等体积的乳胶凝集试剂，用牙签搅拌均匀，摇动30秒后于黑色背景下观察检测结果。试验中设阳性血清对照和阴性血清对照，对照血清的处理方法与样品相同。

如果需要测定血清的抗体效价效价，可将血清样品用血清稀释液倍比稀释，取不同稀释度的血清按照上述方法检测。血清效价为出现阳性反应结果的血清最高稀释度。

（b）结果判定

试验成立的前提条件是：检测阳性对照血清凝集程度为“++++”(100%凝集），检测阴性对照血清无凝集现象。检测样品出现“++”(50%凝集）及以上的乳胶凝集现象时，即判为阳性结果，否则判为阴性。

2应用乳胶凝集抗体检测试剂盒检测临床样品

（a）临床样品

2011年6月至2011年8月从湖北武汉、黄冈等地采集奶牛血样34份，其中22份（编号1～22）来自乳房炎疫苗免疫牛，其余12份（编号23～34）来自未免疫牛。血液自然凝固后，收集析出的血清。

（b）样品检测

按照上述检测方法，将血清样品与等体积的乳胶凝集试剂混匀，摇动30秒使血清与乳胶颗粒反应完全，观察检测凝集程度，记录检测结果。同时设阴阳性血清对照。

（c）检测结果

经检测，22份免疫牛血清的检测结果均为阳性，说明疫苗免疫起到了效果；12份未免疫牛血清中有11份为阴性，1份为阳性。调查后得知，检测为阳性的这头未免疫牛有乳房炎病史，可能因感染获得了抗体。具体检测结果见表10。

表10临床血清检测结果

注：“++”及以上凝集者判为阳性。

上述试验可以说明，乳胶凝集抗体检测试剂盒方法准确性较高，检测时间短，仅需2分钟即可完成样品检测。ELISA检测方法因为有温育、洗涤和显色等步骤，通常需要2小时以上才能完成检测。此外，该试剂盒方法不需要酶标二抗、显色液等特殊试剂，检测过程中也不需要借助任何仪器设备，检测成本低，且简单易行，特别适合于基层兽医人员和奶牛养殖户使用。

Claims (1)

1.一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，该试剂盒包括a)阳性对照血清，b)阴性对照血清，c)乳胶凝集颗粒,d)样品稀释液，e)载玻片和刻度吸管，其特征在于：a)阳性对照血清是无乳链球菌表面抗原免疫的奶牛产血清，

b)阴性对照血清是未免疫的奶牛产血清，

c)乳胶凝集颗粒为无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒，其中无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒通过下列步骤制备：

1）将无乳链球菌cvcc1886接种于含5%胎牛血清的TSB培养基中，37℃恒温振荡培养；

2）离心收集菌体，用由10mMTris，1mMEDTA，pH值8.0组成的TE缓冲液重悬；

3）超声波破碎，5000转/分离心15min，上清液再超速离心，收集沉淀，用含1.5%triton-X100的TE缓冲液重悬，室温放置30min使之溶解；

4）加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃下沉淀2小时；

5）离心收集蛋白质沉淀，用TE缓冲液重悬，装入透析袋中透析3天，其间更换透析液3次；

6）收集透析后的蛋白溶液，测定无乳链球菌表面抗原浓度，并浓缩到2mg/mL蛋白浓度，得无乳链球菌表面抗原；

7）用BBS稀释无乳链球菌表面蛋白至蛋白含量为600μg/mL，逐滴加入到等体积预处理的2%空白胶乳中，边滴加边摇动，使其充分混匀；

8）置于25℃恒温箱中静置3小时；

9）逐滴加入10%牛血清蛋白（BSA）至终浓度为1%，充分混合均匀后，再置于37℃恒温箱中静置30min；

10）6000转/分离心15min，弃上清，沉淀用BBS重悬得无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒。