CN103525722B - 一种希氏乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种希氏乳杆菌，该菌株为希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii，于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8099，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株发酵24小时后发酵液pH可降低至4.7，收集发酵液，经HPLC检测发酵液中的乳酸含量达到14g/L，说明该菌株可用于黄酒酿造，有利于抑制杂菌的生长，并有助于改善黄酒的风味。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳杆菌及其应用，特别是一种希氏乳杆菌及其应用。
背景技术
黄酒主要是以谷物（南方主要是以糯米，北方是黍米和玉米）为原料，以麦曲为糖化剂，以黄酒酵母或活性干酵母为发酵剂，经浸米、蒸煮、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成的一种低酒度的发酵原酒。按照生产工艺可以分为传统黄酒和机械化黄酒生产工艺，而传统黄酒工艺的特色在于“冬浆冬水”和“长时间浸米”。
将浸米浆水加入到黄酒发酵醪中酿制黄酒是传统黄酒工艺的特色，但是长时间的浸米工艺却给黄酒生产带来了不少了难题。一方面，传统黄酒的浸米需要占用大量的浸米场地和浸米容器，并且浸米主要是在露天环境下进行的，这样在浸米过程会网罗空气中的所有微生物，在经过长时间的浸米后，浸米水的表面会呈现白膜，主要有霉菌、野生酵母菌和醋酸菌等多种细菌；此种方式导致浸米浆水中既存在有利的微生物，也存在有害的微生物，所以浸米浆水的好坏直接决定了黄酒发酵的成败，这也是导致传统黄酒发酵不易控制，黄酒品质不稳定的主要原因。另一方面，经过长时间浸米后，原料米表面的糊粉层会进入到米浆水中，并随米浆水进入发酵醪中，糊粉层中的蛋白质会在麦曲混合酶及其他酶系的作用下产生大量的氨基酸，而大量的氨基酸会使黄酒的口感粗糙，甚至影响风味，在追求黄酒“淡、干、爽”的趋势下，这一弊端会更加突出，所以胡普信提出应该降低浸米浆水的使用量，尤其是应该摒弃对陈米浸米浆水的使用。第三，长时间的浸米会产生大量的含有高浓度BOD5、CODCr的浸米浆水，据统计，生产1吨黄酒，将产生2吨浸米浆水，一个年产5万吨的黄酒企业，至少产生10万吨的米浆废水。而这些浸米浆水只有部分能被利用，其余的将作为污水排出，排出的废水会严重的污染水资源，导致鱼类大量死亡，还可能导致水的富营养化。据测定，绍兴某年产5万吨的黄酒厂生产过程中浸米浆水的BOD5达到25000mg/L，CODCr达到60000mg/L，属于高浓度的有机废水，不符合排放标准。若将这些浸米浆水进行处理，又会产生巨大的费用：每年对浸米浆水的处理费用高达22.5万元；处理设施投入需要200多万元；设备折旧加上运行费用，每年要支出40多万元。
所以，针对传统黄酒浸米浆水存在的上述问题，有必要通过一定的方式摒弃对传统黄酒浸米浆水的使用，但是目前无法解决在摒弃使用浸米浆水后能保证黄酒发酵顺利进行的问题。
发明内容
本发明提供了一种黄酒酿酒有益乳酸杆菌，分类学命名为希氏乳杆菌，于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8099，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
应用上述菌株希氏乳杆菌CGMCC No.8099开发的直投式发酵剂及其应用也属于本发明要求保护的范围。
本发明还提供一种应用上上述希氏乳杆菌在黄酒酿造中的应用方法，是将活化和扩大培养后的希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii应用于黄酒酿造，所述希氏乳杆菌接种量为0.1%-0.3%。
菌株16SrDNA基因，PCR产物送样测序，16SrDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株与Lactobacillus hilgardii IOEB0204有95%的同源性，可以认为是希氏乳杆菌Lactobacillushilgardii。
应用本发明提供的希氏乳杆菌发酵24小时后发酵液pH可降低至4.7，收集发酵液，经HPLC检测发酵液中的乳酸含量达到14g/L。
附图说明
图1为希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii在M17培养基培养基上的菌落特征
图2为希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii的菌体形态
具体实施方式
实施例1菌株筛选
从番茄汁碳酸钙培养基上挑选出具有溶钙圈，M17培养基上挑选出能使溴甲酚紫变黄，呈现白色或灰色、中间凸起的单菌落，进行接触酶实验，并结合革兰氏染色法，确定了黄酒发酵液中含有乳酸菌。随后在MRS固态培养基上经过多次分离纯化，最终分离得到接触酶实验呈阴性、革兰氏染色呈阳性的乳酸菌菌株，命名为。菌落形态和经革兰氏染色后在显微镜下观察的菌体形态分别如图1和图2所示。
实施例2菌株鉴定
（一）pH的测定
将筛选得到的希氏乳杆菌在MRS培养基中活化后，调整菌悬液OD600nm=0.5，按照2%的接种量接种于100mL的MRS培养基中，在30℃条件下培养2d，每6h测定一次pH值。
（二）乳酸含量的测定
将筛选得到的乳酸菌在MRS培养基中活化后，调整菌悬液OD600nm=0.5，按照2%的接种量接种于100mL的MRS培养基中，在30℃条件下培养2d，每6h取一定量的培养液，在8000r/min，4℃的条件下离心10min，收集上清液，经0.45μm的微孔滤膜过滤后采用HPLC对发酵液中的乳酸含量进行检测。
（三）16SrDNA分析
提取总DNA，采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增体系（25μL）：10×PCR Buffer2.5μL；25mM MgCl22μL；2.5mM dNTP1μL；10μM引物各0.5μL；模板（基因组）2.5μL；5U/μL TaqDNA聚合酶0.2μL，加水至25μL。
PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸5min，降温至12℃，取出产物。
序列测定工作由扩增后的PCR产物送样测序，测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成，16SrDNA测序结果与 NCBI中数据比对，菌株与 Lactobacillus hilgardii IOEB0204有95%的同源性，可以认为是希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii。
实施例3
将筛选到的希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii 扩大培养后调整菌悬液浓度为108CFU/mL，在不改变其它传统黄酒工艺的前提下（前发酵温度30℃，时间5-7d；后发酵温度20℃，时间23-25d），按照0.1-0.3%的比例接种到黄酒发酵醪液中，并对最终产品进行评价。
成品黄酒检测理化指标：
氨基酸态氮≥0.5g/L 糖（以葡萄糖计）13-45g/L
总氨基酸≥13mg/mL 总酸（以乳酸计）≤5.0g/L
酒精度（20℃）≥10%vol pH值3.5-4.5
非糖固形物≥15g/L
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)，于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8099，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.含有权利要求1所述的希氏乳杆菌的直投式发酵剂。
3.权利要求1所述的希氏乳杆菌在制备直投式发酵剂中的应用。
4.权利要求1所述的希氏乳杆菌在黄酒酿造中的应用。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于：是将活化和扩大培养后的权利要求1所述的希氏乳杆菌应用于黄酒酿造。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的希氏乳杆菌的接种量为0.1％-0.3％。
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